CN107722133A - 一种提高猴头菇多糖免疫活性的羟乙基化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高猴头菇多糖免疫活性的羟乙基化方法，先将猴头菇多糖溶于氢氧化钠和氯化钠的混合溶液中，搅拌溶解；将所得溶液冷却至0℃，并通入氮气排出空气，然后逐滴加入环氧乙烷，在冰浴条件下搅拌反应；反应后将所得溶液升温至室温，搅拌过夜；次日用醋酸中和至中性，然后加入乙醇和丙酮，出现白色沉淀后，离心分离，水溶解沉淀，再经透析、冷冻干燥后得到羟乙基化猴头菇多糖。本发明通过对猴头菇多糖进行羟乙基化修饰，从而提高了猴头菇多糖免疫活性，所制得的羟乙基化猴头菇多糖能显著提高DCs的抗原递呈能力，促进DCs细胞分泌IL‑12、IL‑18、IL‑15。
Description
技术领域
本发明属于动物医学领域,具体涉及一种提高猴头菇多糖免疫活性的羟乙基化方法。
背景技术
多糖是一种重要的生物大分子，其参与体内各种生理代谢，在调节免疫功能、细胞识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等都有重要的作用。研究发现，多糖具有的多种生物活性与其结构、构像等有着密切的关系。通过分子修饰的手段，改变多糖的官能团，可以有针对的提高多糖的活性。目前修饰的方法主要有硫酸化、乙酰化、磺酰化、羧甲基化和磷酸化等，均可提高多糖的活性。
国内外有关羟乙基化猴头菇多糖提高免疫活性的研究应用文献很少，仅见张健等（2003）报道了羟乙基化牛膝多糖的合成方法，未见应用响应曲面对反应条件优化，也未见羟乙基化多糖提高免疫活性的报道。
检索到国内有羟乙基茯苓多糖硫酸酯及其制备方法技术的发明专利申请，未见羟乙基化猴头菇多糖提高免疫活性技术的发明专利申请。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种提高猴头菇多糖免疫活性的羟乙基化方法。本发明通过对猴头菇多糖进行羟乙基化修饰，从而提高了猴头菇多糖免疫活性，所制得的羟乙基化猴头菇多糖能显著提高DCs的抗原递呈能力，促进DCs细胞分泌IL-12、IL-18、IL-15。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高猴头菇多糖免疫活性的羟乙基化方法，具体包括以下步骤：
（1）将500 mg猴头菇多糖溶于25 mL氢氧化钠和氯化钠的混合溶液（氢氧化钠的浓度为3wt%，氯化钠的浓度为3wt%）中，室温搅拌至溶解，得到混合溶液A；
（2）将步骤（1）所得混合溶液A在冰浴条件下冷却至0 ℃，向容器中充入氮气以排除空气，得到混合溶液B；
（3）往步骤（2）所得混合溶液B中逐滴加入2.5 mL环氧乙烷，然后冰浴条件下搅拌反应2h，反应完成后，再使反应液自然升至室温，搅拌过夜；
（4）次日用1 mol/L醋酸中和至中性得到混合溶液C，然后往混合溶液C加入乙醇后，再加入丙酮，所加入的丙酮体积为混合溶液C体积的4倍；出现白色沉淀后，离心分离，水溶解沉淀，透析袋透析24 h，冷冻干燥，得到羟乙基化猴头菇多糖。
本发明的有益效果在于：本发明通过对猴头菇多糖进行羟乙基化修饰，从而提高了猴头菇多糖免疫活性，所制得的羟乙基化猴头菇多糖能显著提高DCs的抗原递呈能力，促进DCs细胞分泌IL-12、IL-18、IL-15。
附图说明
图1为未羟乙基化猴头菇多糖和羟乙基化猴头菇多糖对DCs抗原递呈能力的影响；
图2为HEP（猴头菇多糖）和HE-HEP（羟乙基化猴头菇多糖）对DC细胞IL-12分泌量的影响；
图3为未羟乙基化猴头菇多糖和羟乙基化猴头菇多糖对DCs分泌IL-18的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
一种提高猴头菇多糖免疫活性的羟乙基化方法，具体包括以下步骤：
（1）将500 mg猴头菇多糖溶于25 mL氢氧化钠和氯化钠的混合溶液（氢氧化钠的浓度为3wt%，氯化钠的浓度为3wt%）中，室温搅拌至溶解，得到混合溶液A；
（2）将步骤（1）所得混合溶液A在冰浴条件下冷却至0 ℃，向容器中充入氮气以排除空气，得到混合溶液B；
（3）往步骤（2）所得混合溶液B中逐滴加入2.5 mL环氧乙烷，然后冰浴条件下搅拌反应2h，反应完成后，再使反应液自然升至室温，搅拌过夜；
（4）次日用1 mol/L醋酸中和至中性得到混合溶液C，然后往混合溶液C加入乙醇后，再加入丙酮，所加入的丙酮体积为混合溶液C体积的4倍；出现白色沉淀后，离心分离，水溶解沉淀，透析袋透析24 h，冷冻干燥，得到羟乙基化猴头菇多糖。
免疫活性测试
1. 羟乙基化猴头菇多糖对DC抗原摄取能力的影响
由图1可知在未有多糖刺激DCs时，在DCs中加入NKs后，DCs的抗原递呈能力增加。猴头菇多糖在单独刺激DCs时，HEP浓度为250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL、15.625 μg/mL时，DCs的抗原递呈能力显著增加（P＜0.05），这五个浓度内，DCs的抗原递呈能力变化不显著（P＞0.05）。HE-HEP浓度为31.25 μg/mL、15.625 μg/mL时，DCs的抗原递呈能力显著增加（P＜0.05），其它浓度与空白组相比均不显著（P＞0.05）。在NKs与DCs相互作用后加入未修饰的猴头菇多糖刺激，在浓度为250 μg/mL和125 μg/mL时，与空白组差异性显著（P＜0.05）。并且随着多糖浓度的升高，DCs的抗原递呈能力随着增强。羟乙基化修饰后的猴头菇多糖单独刺激DCs时，浓度为31.25 μg/mL和15.625 μg/mL时，DCs的抗原递呈能力有显著性提高（P＜0.05）。随着HE-HEP浓度的升高，DCs的抗原递呈能力下降。从实验结果可以得出在低浓度时，HE-HEP对DCs的抗原递呈能力有提高的作用，高浓度时，HEP的作用更强。
2.羟乙基化猴头菇多糖对DCs分泌IL-12的影响
由图2可知在未有多糖刺激DCs时，在DCs中加入NKs会增加DCs对IL-12的分泌。猴头菇多糖在单独刺激DCs时，浓度为250 μg/mL、31.25 μg/mL、15.625 μg/mL时，IL-12的含量显著增加（P＜0.05），浓度为125 μg/mL，62.5 μg/mL时，IL-12的含量与空白组相比差异性不显著（P＞0.05）；在NKs与DCs相互作用后加入未修饰的猴头菇多糖刺激，只有浓度为62.5 μg/mL时，与对照组差异性显著（P＜0.05）羟乙基化修饰后的猴头菇多糖单独刺激DCs时，只有浓度为62.5 μg/mL时，IL-12的含量有显著性提高（P＜0.05）。在NKs与DCs相互作用后，加入羟乙基化修饰后的猴头菇多糖，各实验组均与对照组差异性显著，IL-12含量明显提高（P＜0.05）。从实验结果可以看出猴头菇多糖修饰前后在一定浓度时可以提高DCs分泌IL-12，并且在多糖和NKs共同刺激DCs时，发现羟乙基化修饰后多糖的作用有明显提高。
3.羟乙基化多糖对DCs分泌IL-18的影响
图3可得用NK细胞刺激DC细胞后，IL-18的分泌高于未用NK细胞刺激组。单独用猴头菇多糖刺激DCs，发现只有在多糖浓度为15.625 μg/mL时，IL-18的含量显著增加（P＜0.05）。单独用羟乙基化修饰过的猴头菇多糖作用DC细胞，在浓度为15.625 μg/mL和31.25 μg/mL时，IL-18的含量显著增加（P＜0.05），其它三个浓度组与空白组相比差异不显著（P＞0.05），但总体上羟乙基化修饰后的多糖的效果比未修饰猴头菇多糖好。用多糖和NKs共同刺激DCs后，各个浓度均与空白组差异性不显著（P＞0.05），羟乙基化修饰后的多糖与NKs共同作用DCs，多糖浓度在250 μg/mL到15.625 μg/mL之间时，IL-18含量均与空白组差异性显著（P＜0.05），从以上结果得出，在影响DC细胞分泌IL-18的作用上，羟乙基化修饰后的猴头菇多糖的效果更好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.一种提高猴头菇多糖免疫活性的羟乙基化方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
（1）将500 mg猴头菇多糖溶于25 mL氢氧化钠和氯化钠的混合溶液中，室温搅拌至溶解，得到混合溶液A；
（2）将步骤（1）所得混合溶液A在冰浴条件下冷却至0 ℃，向容器中充入氮气以排除空气，得到混合溶液B；
（3）往步骤（2）所得混合溶液B中逐滴加入2.5 mL环氧乙烷，然后冰浴条件下搅拌反应，反应完成后，再使反应液自然升至室温，搅拌过夜；
（4）次日用1 mol/L醋酸中和至中性得到混合溶液C，然后往混合溶液C加入乙醇后，再加入丙酮，所加入的丙酮体积为混合溶液C体积的4倍；出现白色沉淀后，离心分离，水溶解沉淀，透析袋透析24 h，冷冻干燥，得到羟乙基化猴头菇多糖。
2.根据权利要求1所述的提高猴头菇多糖免疫活性的羟乙基化方法，其特征在于：步骤（1）所述的氢氧化钠和氯化钠的混合溶液中，氢氧化钠的浓度为3wt%，氯化钠的浓度为3wt%。
3. 根据权利要求1所述的提高猴头菇多糖免疫活性的羟乙基化方法，其特征在于：步骤（3）中，反应时间为2 h。
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