CN114107104B - 一种保加利亚乳杆菌冻干粉及其制备方法 - Google Patents

一种保加利亚乳杆菌冻干粉及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114107104B
CN114107104B CN202111403454.XA CN202111403454A CN114107104B CN 114107104 B CN114107104 B CN 114107104B CN 202111403454 A CN202111403454 A CN 202111403454A CN 114107104 B CN114107104 B CN 114107104B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactobacillus bulgaricus
dried powder
freeze
preparation
parts
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111403454.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN114107104A (zh
Inventor
方曙光
费腾
汪欣
马春燕
朱建国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WeCare Probiotics Co Ltd
Original Assignee
WeCare Probiotics Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WeCare Probiotics Co Ltd filed Critical WeCare Probiotics Co Ltd
Priority to CN202111403454.XA priority Critical patent/CN114107104B/zh
Publication of CN114107104A publication Critical patent/CN114107104A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114107104B publication Critical patent/CN114107104B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种保加利亚乳杆菌冻干粉及其制备方法。所述制备方法包括以下步骤：将保加利亚乳杆菌种子液接种至发酵培养基中培养，得到菌泥；随后将菌泥与保护剂混合，得到重悬液，冷冻干燥，得到所述保加利亚乳杆菌冻干粉。所述保护剂包括小分子多元醇、多糖、高分子添加剂和缓冲物质。所述小分子多元醇优选山梨糖醇，所述多糖优选海藻糖，所述高分子添加剂优选牛奶蛋白，所述缓冲物质优选磷酸盐和游离氨基酸的组合。所述小分子多元醇和多糖的总质量与缓冲物质质量的比例为(20‑60):1。采用本发明提供的制备方法得到的保加利亚乳杆菌冻干粉具有较高的存活率，能够有效延长保加利亚乳杆菌冻干粉的保存时间。

Description

一种保加利亚乳杆菌冻干粉及其制备方法
技术领域
本发明属于保加利亚乳杆菌生产技术领域，具体涉及一种保加利亚乳杆菌冻干粉及其制备方法。
背景技术
保加利亚乳杆菌(lactic acid bacteria，LAB)是通过碳水化合物，在代谢过程中产生乳酸的革兰氏阳性、无芽孢且厌氧的细菌统称，其作为人体肠道极为重要的生理菌群，与人体健康息息相关。有研究表明，保加利亚乳杆菌能够调节胃肠道菌群维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能，提高食物消化率和生物效价，同时还具有降低血清胆固醇，控制内毒素，抑肠道内腐败菌生长和提高机体免疫力医学价值。因此保加利亚乳杆菌不仅能够用于提高食品风味、改善食品品质，且能够用于疾病预防，被广泛应用于医药、食品和生物技术等领域。
保加利亚乳杆菌常被应用于发酵乳制品当中，为达到理想的应用效果，保加利亚乳杆菌在应用过程中要保持高活性。然而，保加利亚乳杆菌目前存在着活菌期时间短的缺点，在温度小于10℃时，两年保加利亚乳杆菌存活率＞80％，而在室温及以上温度保存过程中，保加利亚乳杆菌存活率将严重衰减，两年保加利亚乳杆菌存活率一般<40％，故在培养和贮藏期间保证其生物活性是保加利亚乳杆菌制品面临的最核心的问题。
CN103194512A公开了一种促进保加利亚乳杆菌增殖和提高存活性的大豆多肽及制备方法与应用。所述大豆多肽成本低廉，制备方法简单，能够有效提高储存期间保加利亚乳杆菌的存活率，但所述保加利亚乳杆菌在储存期超过24天后，其存活率呈明显的下降趋势，有待进一步的提高。
CN107354097A公开了一种在常温下提高液态保加利亚乳杆菌存活率的保加利亚乳杆菌保存剂及其应用。通过在保加利亚乳杆菌体及营养物质悬浮技术和缓释技术及培养基中添加奶油、亚油酸和卵磷脂、单硬脂酸甘油酯，添加稳定剂及调节pH值来延长液态保加利亚乳杆菌高活菌量的存放期，解决了由于营养物质含量减少及常温贮存带来的活菌量迅速下降的问题。但该研究并没有解决室温以上时保加利亚乳杆菌存活率较低的问题。
CN110804553A公开了一种提高保加利亚乳杆菌保存存活率的培养基及其应用。所述培养基是将保加利亚乳杆菌液体培养基中的碳源由葡萄糖替换为蔗糖，还可以包含碳酸钙，能够提高培养基pH，进而提高保加利亚乳杆菌的冷藏保存率。结果表明，以蔗糖代替葡糖的改良MRS培养基，对能利用蔗糖的保加利亚乳杆菌培养效果无不良影响，却能显著降低其冷藏保存的死亡率。培养时培养液添加1％的碳酸钙，其保存效果更佳。但该研究中所述保加利亚乳杆菌的储存期不超过30天，且在超过12天后，存活率呈明显下降的趋势，有待进一步提高。
基于以上研究，可以看到，通过在保加利亚乳杆菌的制备过程中添加外源物质能够有效提高其存活率，保证生物活性，但仍然存在着保存期短、保存温度低的局限性。因此，找到一种在较高温度下能够有效延长保加利亚乳杆菌存活率的方法是目前亟需解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种保加利亚乳杆菌冻干粉及其制备方法。采用所述制备方法得到的保加利亚乳杆菌冻干粉具有较高的存活率，能够有效延长保加利亚乳杆菌冻干粉的保存时间。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将保加利亚乳杆菌种子液接种至发酵培养基中培养，得到菌泥；
(2)将菌泥与保护剂混合，得到重悬液，冷冻干燥，得到所述保加利亚乳杆菌冻干粉；
所述保护剂包括小分子多元醇、多糖、高分子添加剂和缓冲物质。
本发明通过培养基与保护剂搭配使用，能够协同提高保加利亚乳杆菌冻干粉的存活率。另外，保护剂中的小分子多元醇能够维持蛋白质的三级结构，多糖能够保护蛋白分子不变性失活，维持生命体生命过程，高分子添加剂能够用于稳定细胞膜成分，减少细胞损伤，缓冲物质能够维持pH相对稳定，防止因pH剧烈变化导致菌体活力下降，通过将小分子多元醇、多糖、高分子添加剂和缓冲物质搭配使用，能够协同提高保加利亚乳杆菌的存活率，保证保加利亚乳杆菌的生物活性。
优选地，所述小分子多元醇和多糖的总质量与缓冲物质质量的比例为(20-60):1，例如可以是20:1、22:1、25:1、28:1、30:1、32:1、35:1、40:1、42:1、45:1、50:1、55:1或60:1等，范围内的其他点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选为(20-40):1，进一步优选为(28-32):1。
本发明通过优选小分子多元醇和多糖的总质量与缓冲物质质量的比例，能够获得更高的保加利亚乳杆菌存活率。
优选地，所述菌泥与保护剂的质量比为(1.5-2.5):1，例如可以是1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1或2.5:1等，范围内的其他点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明中，所述发酵培养基包括葡萄糖、酵母浸膏、蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、磷酸二氢钾、柠檬酸氢二铵、硫酸镁和吐温。
优选地，所述发酵培养基按重量份计包括葡萄糖20-40份，例如可以是20份、22份、24份、26份、28份、30份、32份、34份、36份、38份或40份等。
所述蛋白胨10-20份，例如可以是10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份或20份。
所述磷酸氢二钾2-4份，例如可以是2份、2.2份、2.5份、2.8份、3份、3.2份、3.5份、3.6份、3.8份或4份等。
所述磷酸二氢钾2-4份，例如可以是2份、2.2份、2.5份、2.8份、3份、3.2份、3.5份、3.6份、3.8份或4份等。
所述氯化钠1-4份，例如可以是1份、1.2份、1.5份、1.6份、1.8份、2份、2.5份、2.8份、3份、3.5份或4份等。
所述柠檬酸氢二铵2-4份，例如可以是2份、2.2份、2.5份、2.8份、3份、3.2份、3.5份、3.6份、3.8份或4份等。
所述硫酸镁0.1-0.5份，例如可以是0.1份、0.2份、0.3份、0.4份或0.5份等。
所述吐温1-2份，例如可以是1份、1.1份、1.2份、1.3份、1.4份、1.5份、1.6份、1.7份、1.8份、1.9份或2份等。
上述范围内的其他点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述发酵培养基的pH值为6-7，例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7等，范围内的其他点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选为6.2-6.5。
本发明中所述发酵培养基的pH值为6.2-6.5，使其在适宜的pH下生长。
本发明中，所述小分子多元醇包括山梨糖醇和/或甘露醇，优选为山梨糖醇。
所述山梨糖醇能够维持蛋白质的三级结构。
本发明中，所述多糖包括海藻糖、乳糖、蔗糖或麦芽糊精中的任意一种或至少两种的组合，组合例如可以是海藻糖与乳糖的组合或乳糖与蔗糖的组合等，其余任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选为海藻糖。
所述海藻糖能够保护蛋白分子不变性失活，维持生命体生命过程。
本发明中，所述高分子添加剂包括牛奶蛋白、黄原胶、魔芋胶或羧甲基纤维素钠中的任意一种或至少两种的组合，组合例如可以是牛奶蛋白与黄原胶的组合或黄原胶与魔芋胶的组合等，其余任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选为牛奶蛋白。
所述牛奶蛋白能够稳定细胞膜成分，从而减少细胞的损伤。
本发明中，所述缓冲物质包括磷酸盐、游离氨基酸或游离氨基酸盐中的任意一种或至少两种的组合，组合例如可以是磷酸盐与游离氨基酸的组合或磷酸盐与游离氨基酸盐的组合等，其余任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选为磷酸盐与游离氨基酸的组合。
优选地，所述磷酸盐包括磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠中的任意一种或至少两种的组合，组合例如可以是磷酸二氢钾与磷酸二氢钠的组合或磷酸二氢钠与磷酸氢二钾的组合等，其余任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选为磷酸氢二钾与磷酸氢二钠的组合。
本发明中优选磷酸氢二钾与磷酸氢二钠的组合，能够维持pH相对稳定，防止因pH剧烈变化导致菌体活力下降。
优选地，所述游离氨基酸盐包括游离氨基酸钾和/或游离氨基酸钠。
优选地，所述游离氨基酸包括谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸、精氨酸或酪氨酸中的任意一种或至少两种的组合，组合例如可以是谷氨酸与脯氨酸的组合或甘氨酸与赖氨酸的组合等，其余任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选为组氨酸、精氨酸和赖氨酸的组合。
本发明优选组氨酸、精氨酸和赖氨酸的组合，在冻干过程中能够提高保加利亚乳杆菌冻干粉的塌陷温度，阻止因塌陷引起的蛋白质破坏，稳定保加利亚乳杆菌冻干粉的pH。
本发明中，所述保加利亚乳杆菌种子液由包括以下步骤的制备方法制得：将保加利亚乳杆菌保藏甘油管接种至种子培养基中，培养，得到所述保加利亚乳杆菌种子液。
优选地，所述种子培养基包括MRS液体培养基。
优选地，所述保加利亚乳杆菌保藏甘油管的接种质量为所述种子培养基的质量的1.8-2.3％，例如可以是1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％或2.3％等，范围内的其他点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述培养的温度为35-40℃，例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃等，范围内的其他点值均可选择，在此便不再一一赘述，所述培养的时间为15-20h，例如可以是15h、16h、17h、18h、19h或20h等，范围内的其他点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(1)包括以下步骤：将保加利亚乳杆菌种子液接种至发酵培养基中，控碱调节pH至4-6，培养，在发酵液残糖剩余0.5-1％时，降温至15-32℃，维持2-4h，离心，得到所述菌泥。
其中，所述pH可以是4、4.2、4.4、4.6、4.8、5、5.2、5.4、5.6、5.8或6等。
所述0.5-1％可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％等。
所述2-4h可以是2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8h、3h、3.2h、3.4h、3.6h、3.8h或4h等。
所述降温至15-32℃，例如可以是15℃、18℃、20℃、22℃、24℃、25℃、28℃、30℃或32℃等。
优选地，步骤(2)所述重悬液的pH为5-6.5，例如可以是5、5.2、5.5、5.6、5.8、6、6.1、6.2、6.3或6.5等。
上述范围内的其他点值均可选择，在此便不再一一赘述。
作为优选技术方案，本发明提供一种保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将保加利亚乳杆菌保藏甘油管按1.8-2.3％的接种量接种至装有种子液的培养基中，35-40℃，培养15-20h，得到所述保加利亚乳杆菌种子液；
(2)将保加利亚乳杆菌种子液接种至发酵培养基中，调碱至pH为4-6，培养，在发酵残糖剩余0.5-1％时，降温至15-32℃，随后维持2-4h，离心，得到菌泥；
(3)将菌泥与保护剂按(1.5-2.5):1的质量比混合，得到pH为5-6.5的重悬液，冷冻干燥，得到所述保加利亚乳杆菌冻干粉。
第二方面，本发明提供一种保加利亚乳杆菌冻干粉，所述保加利亚乳杆菌冻干粉采用如第一方面所述的保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法制得。
优选地，所述保加利亚乳杆菌冻干粉的初始活菌数为1×1010-1×1011cfu/g，例如可以是1×1010cfu/g、2×1010cfu/g、3×1010cfu/g、4×1010cfu/g、5×1010cfu/g、6×1010cfu/g、7×1010cfu/g、8×1010cfu/g、9×1010cfu/g或1×1011cfu/g等，范围内的其他点值均可选择，在此便不再一一赘述。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过培养基与保护剂搭配使用，能够协同提高保加利亚乳杆菌冻干粉的存活率，同时保护剂中小分子多元醇、多糖、高分子添加剂和缓冲物质的搭配使用，能够进一步协同提高保加利亚乳杆菌冻干粉的存活率，保证保加利亚乳杆菌冻干粉的生物活性，有效延长保加利亚乳杆菌冻干粉的保存时间。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
下述制备例、实施例和对比例中相应材料和原料的购买来源如下：
其中，蛋白胨购自安琪酵母股份有限公司；酵母粉购自安琪酵母股份有限公司；酵母浸膏购自安琪酵母股份有限公司；其余原料和试剂，无特殊说明，均可从商业途径获得。
制备例1
本制备例提供一种种子培养基及其制备方法，所述种子培养基为MRS液体培养基，包括蛋白胨10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠0.5g，酵母粉10g，柠檬酸氢二铵2g，K2HPO4·3H2O 2.6g，MgSO4·7H2O 0.1g，MnSO4·H2O 0.05g，吐温-80 1g，半胱氨酸盐酸盐0.5g。所述制备方法包括以下步骤：按配方量称取上述原料混合，加入纯水溶解，至总体积为1L，灭菌，冷却至25℃，备用。
制备例2
本制备例提供一种发酵培养基及其制备方法，所述发酵培养基包括葡萄糖20g，酵母浸膏20g，蛋白胨20g，K2HPO4·3H2O 2g，磷酸二氢钾2g，氯化钠1g，柠檬酸氢二铵3g，MgSO4·7H2O 0.3g，吐温-80 2g。所述制备方法包括以下步骤：按配方量称取上述原料混合，加入纯水溶解，至总体积为1L，灭菌，冷却至25℃，备用。
制备例3
本制备例提供一种发酵培养基及其制备方法，所述发酵培养基包括葡萄糖30g，酵母浸膏15g，蛋白胨15g，K2HPO4·3H2O 4g，磷酸二氢钾4g，氯化钠3g，柠檬酸氢二铵2g，MgSO4·7H2O 0.5g，吐温-80 2g。所述制备方法包括以下步骤：按配方量称取上述原料混合，加入纯水溶解，至总体积为1L，灭菌，冷却至25℃，备用。
制备例4
本制备例提供一种发酵培养基及其制备方法，所述发酵培养基包括葡萄糖40g，酵母浸膏10g，蛋白胨10g，K2HPO4·3H2O 2.5g，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠4g，柠檬酸氢二铵4g，MgSO4·7H2O 0.1g，吐温-80 1g。所述制备方法包括以下步骤：按配方量称取上述原料混合，加入纯水溶解，至总体积为1L，灭菌，冷却至25℃，备用。
制备例5
本制备例提供一种保护剂及其制备方法，所述保护剂包括海藻糖150g，山梨糖醇150g，牛奶蛋白50g，K2HPO4·3H2O 2g，Na2HPO4·12H2O 2g，组氨酸2g，精氨酸2g，赖氨酸2g。所述制备方法包括以下步骤：按配方量称取上述原料混合，加入纯水溶解，至总体积为1L，灭菌，冷却至25℃，备用。
制备例6
本制备例提供一种保护剂及其制备方法，与制备例5比，所述保护剂不包括组氨酸，将其减少的重量平分给精氨酸与赖氨酸，其余参数和步骤与制备例5持一致。
制备例7
本制备例提供一种保护剂及其制备方法，与制备例5比，所述保护剂不包括精氨酸，将其减少的重量平分给组氨酸与赖氨酸，其余参数和步骤与制备例5持一致。
制备例8
本制备例提供一种保护剂及其制备方法，与制备例5比，所述保护剂不包括赖氨酸，将其减少的重量平分给组氨酸与精氨酸，其余参数和步骤与制备例5持一致。
制备例9
本制备例提供一种保护剂及其制备方法，与制备例5比，所述保护剂不包括精氨酸与赖氨酸，将其减少的重量由组氨酸补足，其余参数和步骤与制备例5持一致。
制备例10
本制备例提供一种保护剂及其制备方法，与制备例5比，所述保护剂不包括组氨酸与赖氨酸，将其减少的重量由精氨酸补足，其余参数和步骤与制备例5持一致。
制备例11
本制备例提供一种保护剂及其制备方法，与制备例5比，所述保护剂不包括组氨酸与精氨酸，将其减少的重量由赖氨酸补足，其余参数和步骤与制备例5持一致。
制备例12
本制备例提供一种保护剂及其制备方法，与制备例5比，所述山梨糖醇和海藻糖的总质量与K2HPO4·3H2O、Na2HPO4·12H2O、组氨酸、精氨酸和赖氨酸总质量的比例为20:1，其余参数和步骤与制备例5持一致。
制备例13
本制备例提供一种保护剂及其制备方法，与制备例5比，所述山梨糖醇和海藻糖的总质量与K2HPO4·3H2O、Na2HPO4·12H2O、组氨酸、精氨酸和赖氨酸总质量的比例为60:1，其余参数和步骤与制备例5持一致。
制备例14
本制备例提供一种保护剂及其制备方法，与制备例5比，将所述牛奶蛋白等量替换为黄原胶，其余参数和步骤与制备例5持一致。
制备例15
本制备例提供一种保护剂及其制备方法，与制备例5比，所述保护剂不包括K2HPO4·3H2O、Na2HPO4·12H2O、组氨酸、精氨酸和赖氨酸，所述山梨糖醇、海藻糖和牛奶蛋白的质量比保持不变，其余参数和步骤与制备例5持一致。
实施例1
本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将保加利亚乳杆菌保藏甘油管按照按2％的接种量接种至制备例1得到的种子培养基中，37℃，培养16h，得到种子液；
(2)将种子液接种至装有制备例2得到的发酵培养基的发酵罐中，使用氢氧化钠控pH为5.2，42℃培养至发酵残糖剩余1％，同时开通冷水降低发酵罐的温度至32℃，随后维持2h，离心，得到菌泥；
(3)将菌泥与制备例5得到的保护剂按2:1的质量比混合，得到pH为5的重悬液，冷冻干燥，得到所述保加利亚乳杆菌冻干粉。
实施例2
本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将保加利亚乳杆菌保藏甘油管按照按1.9％的接种量接种至制备例1得到的种子培养基中，35℃，培养15h，得到种子液；
(2)将种子液接种至装有制备例3得到的发酵培养基的发酵罐中，使用氢氧化钠控pH为5，40℃培养至发酵残糖剩余0.8％，同时开通冷水降低发酵罐的温度至20℃，随后维持2h，离心，得到菌泥；
(3)将菌泥与制备例5得到的保护剂按1.8:1的质量比混合，得到pH为6的重悬液，冷冻干燥，得到所述保加利亚乳杆菌冻干粉。
实施例3
本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将保加利亚乳杆菌保藏甘油管按照按2.2％的接种量接种至制备例1得到的种子培养基中，40℃，培养20h，得到种子液；
(2)将种子液接种至装有制备例4得到的发酵培养基的发酵罐中，使用氢氧化钠控pH为5.6，42℃培养至发酵残糖剩余1％，同时开通冷水降低发酵罐的温度至25℃，随后维持3h，离心，得到菌泥；
(3)将菌泥与制备例5得到的保护剂按2.2:1的质量比混合，得到pH为5的重悬液，冷冻干燥，得到所述保加利亚乳杆菌冻干粉。
实施例4-12
本实施例4-12提供9种保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1相比，将制备例5得到的保护剂等量替换为制备例6-14得到的保护剂，其余参数和步骤均与实施例1保持一致。
实施例13
本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1相比，所述种子液42℃培养至发酵残糖剩余1％时，不开通冷水进行降温操作，其余参数和步骤均与实施例1保持一致。
对比例1
本对比例提供一种保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，与实施例1相比，将制备例5得到的保护剂等量替换为制备例15得到的保护剂，其余参数和步骤均与实施例1保持一致。
测试例1
本测试例对实施例1-13和对比例1制得的保加利亚乳杆菌冻干粉进行冻干存活率和货架期存活率的检测，检测方法如下：
(1)冻干前总活菌数检测：称量1g实施例1-13和对比例1得到的菌泥，加入到9mL含有玻璃珠的生理盐水中，振荡30min，取1mL菌液至9mL生理盐水中进行梯度稀释，取1mL稀释液于培养皿内，倾注MRS固体培养基，摇匀，倾注3个梯度，每个梯度3个平行，将凝固后的培养皿放于37℃恒温培养箱中培养48h后取出计数，再乘以菌泥重量，得到冻干前总活菌数；
(2)冻干后总活菌数检测：称量1g实施例1-13和对比例1得到的保加利亚乳杆菌冻干粉，加入到9mL含有玻璃珠的生理盐水中，振荡30min，取1mL菌液至9mL生理盐水中进行梯度稀释，取1mL稀释液于培养皿内，倾注MRS固体培养基，摇匀，倾注3个梯度，每个梯度3个平行，将涂布后的培养皿放于37℃恒温培养箱中培养48h后取出计数，得到冻干后总活菌数；
(3)菌泥水分含量测定：称量10g实施例1-13和对比例1得到的菌泥，烘箱里105℃烘干至恒重，计算水分含量；
(4)货架期活菌数检测：将1g实施例1-13和对比例1得到的保加利亚乳杆菌冻干粉分别放置于25℃和37℃的培养箱中，6个月后取出计数，得到货架期总活菌数。
存活率计算公式如下：
冻干存活率＝(冻干后每克菌粉的活菌数×菌泥水分含量)/冻干前总活菌数×100％；
货架期存活率＝货架期每克菌粉的活菌数/冻干后每克菌粉的活菌数。
检测结果统计如下表1所示：
表1
Figure BDA0003371906380000141
Figure BDA0003371906380000151
由上表数据可知，实施例1提供的制备方法能够使得保加利亚乳杆菌冻干粉具有较高的存活率，与对比例1相比，缓冲物质的添加会对所述保加利亚乳杆菌冻干粉的存活率造成影响，与实施例4-9相比，缓冲物质的选择会对所述保加利亚乳杆菌冻干粉的存活率造成影响，与实施例10-11相比，所述小分子多元醇和多糖的总质量与缓冲物质总质量的比例会对所述保加利亚乳杆菌冻干粉的存活率造成影响，与实施例12相比，高分子添加剂的选择会对所述保加利亚乳杆菌冻干粉的存活率造成影响，与实施例13相比，种子液发酵培养过程中是否进行降温操作会对所述保加利亚乳杆菌冻干粉的存活率造成影响。
综上所述，采用本发明的制备方法得到的保加利亚乳杆菌冻干粉具有较高的冻干存活率，同时能够保证较高的货架期存活率，培养基与保护剂搭配使用，能够协同提高保加利亚乳杆菌冻干粉的存活率，同时保护剂中小分子多元醇、多糖、高分子添加剂和缓冲物质的搭配使用，能够进一步协同提高保加利亚乳杆菌冻干粉的存活率，保证保加利亚乳杆菌冻干粉的生物活性，有效延长了保加利亚乳杆菌的存活时间和生物活性。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将保加利亚乳杆菌种子液接种至发酵培养基中，控碱调节pH至4-6，培养，在发酵液残糖剩余0.5-1%时，降温至15-32℃，维持2-4 h，离心，得到菌泥；
（2）将菌泥与保护剂混合，得到重悬液，冷冻干燥，得到所述保加利亚乳杆菌冻干粉；
所述保护剂由山梨糖醇、海藻糖、牛奶蛋白和缓冲物质组成；
所述山梨糖醇和海藻糖的总质量与缓冲物质质量的比例为30:1；
所述缓冲物质为磷酸盐和游离氨基酸的组合；
所述游离氨基酸为组氨酸、精氨酸和赖氨酸的组合。
2.根据权利要求1所述的保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述菌泥与保护剂的质量比为(1.5-2.5):1。
3.根据权利要求1所述的保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括葡萄糖、酵母浸膏、蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、磷酸二氢钾、柠檬酸氢二铵、硫酸镁和吐温。
4.根据权利要求3所述的保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基按重量份计包括葡萄糖20-40份，酵母浸膏10-20份，蛋白胨10-20份，磷酸氢二钾2-4份，磷酸二氢钾2-4份，氯化钠1-4份，柠檬酸氢二铵2-4份，硫酸镁0.1-0.5份和吐温1-2份。
5.根据权利要求1所述的保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH值为6-7。
6.根据权利要求5所述的保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH值为6.2-6.5。
7.根据权利要求1所述的保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐包括磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠中的任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求7所述的保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐为磷酸氢二钾和磷酸氢二钠的组合。
9.根据权利要求1所述的保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述保加利亚乳杆菌种子液由包括以下步骤的制备方法制得：将保加利亚乳杆菌保藏甘油管接种至种子培养基中，培养，得到所述保加利亚乳杆菌种子液。
10.根据权利要求9所述的保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括MRS液体培养基。
11.根据权利要求9所述的保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述保加利亚乳杆菌保藏甘油管的接种质量为所述种子培养基的质量的1.8-2.3%。
12.根据权利要求9所述的保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述培养的温度为35-40℃，所述培养的时间为15-20 h。
13.根据权利要求1所述的保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述重悬液的pH为5-6.5。
14.根据权利要求1所述的保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将保加利亚乳杆菌保藏甘油管按1.8-2.3%的接种量接种至装有种子液的培养基中，35-40℃，培养15-20 h，得到所述保加利亚乳杆菌种子液；
（2）将保加利亚乳杆菌种子液接种至发酵培养基中，调碱至pH为4-6，培养，在发酵残糖剩余0.5-1%时，降温至15-32℃，随后维持2-4 h，离心，得到菌泥；
（3）将菌泥与保护剂按(1.5-2.5):1的质量比混合，得到pH为5-6.5的重悬液，冷冻干燥，得到所述保加利亚乳杆菌冻干粉。
15.一种保加利亚乳杆菌冻干粉，其特征在于，所述保加利亚乳杆菌冻干粉采用如权利要求1-14中任一项所述的保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法制得。
16.根据权利要求15所述的保加利亚乳杆菌冻干粉，其特征在于，所述保加利亚乳杆菌冻干粉的初始活菌数为1×1010~1×1011 cfu/g。
CN202111403454.XA 2021-11-24 2021-11-24 一种保加利亚乳杆菌冻干粉及其制备方法 Active CN114107104B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111403454.XA CN114107104B (zh) 2021-11-24 2021-11-24 一种保加利亚乳杆菌冻干粉及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111403454.XA CN114107104B (zh) 2021-11-24 2021-11-24 一种保加利亚乳杆菌冻干粉及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114107104A CN114107104A (zh) 2022-03-01
CN114107104B true CN114107104B (zh) 2023-06-23

Family

ID=80371896

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111403454.XA Active CN114107104B (zh) 2021-11-24 2021-11-24 一种保加利亚乳杆菌冻干粉及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114107104B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115558620B (zh) * 2022-09-30 2023-10-20 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113652359B (zh) * 2021-07-05 2023-07-07 上海商学院 一种乳酸菌冻干粉、制备方法及其冻干保护剂

Also Published As

Publication number Publication date
CN114107104A (zh) 2022-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9848615B2 (en) Storage stable frozen lactic acid bacteria culture
CN113652359B (zh) 一种乳酸菌冻干粉、制备方法及其冻干保护剂
CN111647510A (zh) 一种婴儿双歧杆菌冻干粉、制备方法及其所用复合保护剂
CN102763726A (zh) 一种益生菌酸奶粉及其制备方法
WO2020083119A1 (zh) 一种哈尔滨乳杆菌及其应用
CN110305811A (zh) 一种植物乳杆菌菌剂及其高密度发酵制备方法以及应用
CN114107104B (zh) 一种保加利亚乳杆菌冻干粉及其制备方法
CN112251371B (zh) 一种乳酸乳球菌及微生态制剂和应用
CN112694976A (zh) 一种高活菌数嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法
CN115851535A (zh) 具有调节免疫力作用的鼠李糖乳酪杆菌wfp52及应用
CN116445321A (zh) 降核苷降血尿酸罗伊氏乳杆菌a21160及其应用
JP2023073258A (ja) 乳酸菌の凍結保護のためのシステインまたはその塩の用途（ｕｓｅ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｏｒ ｓａｌｔ ｔｈｅｒｅｏｆ ｆｏｒ ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）
CN108018248B (zh) 一种具有调节抗生素引起的菌群结构紊乱的干酪乳杆菌
CN111621443B (zh) 一种冻干保护剂及其在冻干罗伊氏乳杆菌中的应用
CN111286469A (zh) 一种副干酪乳杆菌冻干菌粉的制备方法
CN113151115A (zh) 一种提高双歧杆菌冻干存活率及储藏稳定性的方法
CN107802604A (zh) 一种双辅料注射用拉氧头孢钠冻干粉针剂
CN115558620B (zh) 一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和应用
CN108902314B (zh) 一种富含活性植物乳杆菌的双蛋白发酵乳饮品及制备方法
CN116590357A (zh) 罗伊氏粘液乳杆菌在产γ-氨基丁酸及助睡眠产品中的应用
CN110742124A (zh) 一种提高牛奶酒发酵液综合抑菌能力的方法
CN112401243B (zh) 预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂及制备方法
CN113995015A (zh) 一种控制酸奶后酸化的方法
CN110373351B (zh) 一种冻干保护剂及其在制备乳酸菌冻干粉中应用
KR100493354B1 (ko) 레반 및 알기네이트 비드로 코팅되어 생존율이 향상된유산균 분말 및 그의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant