CN113234632A - 一种通过发酵控制提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过发酵控制提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率的方法，属于微生物技术领域。本发明为了解决罗伊氏乳杆菌受环境因素的影响降低活性的问题。本发明提供了一种提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率的方法，步骤为将罗伊氏乳杆菌接种至包含丙氨酸的培养基中进行高渗、低pH培养，收菌时发酵液的渗透压达到1600mOsm/kg～2000mOsm/kg以上，将发酵液离心获得的菌泥与冻干保护剂混合得到混合液，混合液冷冻干燥后，罗伊氏乳杆菌的冻干存活率能提高50％～70％。

Description

一种通过发酵控制提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率的方法
技术领域
本发明涉及一种通过发酵控制提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，属于乳酸菌中的乳杆菌属，专性异型发酵，糖代谢能产生乳酸、乙酸、CO2和乙醇等，最适宜的培养温度是35～40℃，最适生长pH是5.0～6.5。罗伊氏乳杆菌具有平衡肠道菌群组成、治疗腹泻、促进伤口愈合、减少炎症、提高饲料转化率等功能，在乳制品、食品卫生、疾病治疗、仔猪饲养等方面均有研究。1989年被美国FDA列为GRAS的微生物菌种，20世纪90年代，日本、美国、西班牙、瑞典等国已经生产有添加罗伊氏乳杆菌的酸奶和奶酪等乳制品。2003年、2010年和2014年我国也先后批准了罗伊氏乳杆菌可用于保健食品、食品和婴幼儿食品。由于具有显著的益生功效，罗伊氏乳杆菌越来越成为人们研究、开发、生产的重点。目前，罗伊氏乳杆菌已被广泛地应用于食品、医药等领域。
目前市场上的罗伊氏乳杆菌菌粉是采用冷冻干燥获得的，具有保藏期长、不易污染、便于运输等优点。但是，在冷冻干燥过程中，罗伊氏乳杆菌易发生低温胁迫、冻结应力损伤等导致的细胞膜通透性改变、蛋白质变性失活、pH动态平衡被破坏等状况，而这些状况都会导致罗伊氏乳杆菌的活性降低。目前多采用添加冻干保护剂的方法来提高菌株的冻干存活率，如低聚异麦芽糖、海藻糖、脱脂乳、胶原蛋白等都被证明对乳酸菌有较好的保护作用。但是现有的针对益生菌研发的效果较好的冻干保护剂在提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率方面的效果已经无法再提升，并且保护剂的价格昂贵，为了节约成本，需要寻找能够在制备菌粉的过程中减少保护剂的使用并且还能提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率的方法。
发明内容
本发明的目的是为了在节约成本的前提下提高罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)菌粉的冻干存活率，解决了罗伊氏乳杆菌受环境因素的影响降低活性的问题。
本发明提供了一种提高罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)冻干存活率的方法，所述方法是将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)接种在含有丙氨酸的发酵培养基中，在pH为5.0～5.5和渗透压为1600mOsm/kg～2000mOsm/kg的条件下培养。
在一种实施方式中，所述丙氨酸的浓度为3g/L～5g/L。
在一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌的培养时间为12h-16h。
本发明还提供了一种制备罗伊氏乳杆菌菌粉的方法，所述方法步骤如下：
(1)将罗伊氏乳杆菌接种在含有丙氨酸的发酵培养基中，在pH为5.0～5.5、渗透压为1600mOsm/kg～2000mOsm/kg的条件下培养12h-16h；
(2)收集步骤(1)的罗伊氏乳杆菌细胞，与保护剂按质量比为1:1混合，再进行冻干处理后获得罗伊氏乳杆菌菌粉。
在一种实施方式中，所述保护剂的成分为：低聚异麦芽糖、蔗糖、海藻糖、胶原蛋白、脱脂乳中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述保护剂的成分为：70-80g/L低聚异麦芽糖和10-20g/L胶原蛋白的混合溶液。
本发明还提供了一种罗伊氏乳杆菌菌粉，所述罗伊氏乳杆菌菌粉由上述制备罗伊氏乳杆菌菌粉的方法得到的。
本发明还提供了上述罗伊氏乳杆菌菌粉在制备食品、药品和保健品中的应用。
本发明还提供了一种提高罗伊氏乳杆活菌数的培养基，所述培养基成分为：碳源、氮源、硫酸镁、硫酸锰、吐温80和丙氨酸，pH5.0～5.5。
在一种实施方式中，所述碳源包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、***糖、低聚糖中的一种或多种；所述氮源包括酵母浸粉FM528、酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、牛肉浸粉中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述培养基成分为：20～40g/L酵母浸粉FM528，20～100g/L葡萄糖，0.1～0.175g/L硫酸镁，0.05～0.175g/L硫酸锰，0.5～1mL/L吐温80，3～5g/L丙氨酸，pH＝5.0。
本发明还提供了上述提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率的方法或上述培养基在制备罗伊氏乳杆菌菌粉和提高罗伊氏乳杆菌活菌数中的应用。
在一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌包括罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60515、罗伊氏乳杆菌CGMCC No.14394、罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60735、罗伊氏乳杆菌CGMCC No.15021。
有益效果：本发明提供了一种通过发酵控制提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率的方法，此方法可显著提高罗伊氏乳杆菌的冻干存活率；利用此方法将罗伊氏乳杆菌接种至包含丙氨酸的培养基中进行高渗、低pH培养，收菌时发酵液的渗透压达到1600mOsm/kg～2000mOsm/kg以上，罗伊氏乳杆菌的冻干存活率能提高50％～70％。
附图说明
图1为罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60515绘制菌株的耐渗透压生长曲线；其中，时间为横坐标，Lg(OD600)为纵坐标；
图2为罗伊氏乳杆菌CGMCC No.14394绘制菌株的耐渗透压生长曲线；其中，时间为横坐标，Lg(OD600)为纵坐标；
图3为罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60735绘制菌株的耐渗透压生长曲线；其中，时间为横坐标，Lg(OD600)为纵坐标；
图4为罗伊氏乳杆菌CGMCC No.15021绘制菌株的耐渗透压生长曲线；其中，时间为横坐标，Lg(OD600)为纵坐标。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的葡萄糖、胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、K2HPO4、硫酸镁、硫酸锰、Tween 80、丙氨酸均购自国药集团化学试剂有限公司，酵母浸粉FM528购自安琪酵母股份有限公司，低聚异麦芽糖、胶原蛋白均购自创赛生物科技有限公司；
罗伊氏乳杆菌包括罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60515来自公开于公开号为CN109628359B的专利、罗伊氏乳杆菌CGMCC No.14394来自公开于公开号为CN107523526B的专利、罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60735来自公开于公开号为CN110643542B的专利、罗伊氏乳杆菌CGMCC No.15021来自公开号为CN201910688809.0的专利申请。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：葡萄糖：20g/L、胰蛋白胨：10g/L、牛肉膏：10g/L、酵母粉：5g/L、乙酸钠：2g/L、K2HPO4：2g/L、柠檬酸氢二铵：2g/L、硫酸镁：0.1g/L、硫酸锰：0.05g/L、Tween 80：1mL/L。
MRS固体培养基：与MRS液体培养基配方相同，另加20g/L的琼脂粉。
高密度分批培养基：酵母浸粉FM528：40g/L、葡萄糖：110g/L、硫酸镁：0.2g/L、硫酸锰：0.2g/L、Tween 80：1mL/L、丙氨酸：5g/L。
高密度补料培养基：酵母浸粉FM528：35g/L、葡萄糖：20g/L、硫酸镁：0.2g/L、硫酸锰：0.2g/L、Tween 80：1mL/L、丙氨酸：5g/L，补料液为碳氮比3:1的葡萄糖和酵母浸粉FM528(安琪酵母公司)，葡萄糖300g/L，酵母浸粉FM528 100g/L。高密度补料培养方式：利用发酵罐是自动反馈补料，该装置会通过流加的碱液量自动向罐中补充补料液，设置pH为5.0，低于pH5.0装置会自动补充碱液维持pH5.0，设置发酵罐工作参数将补充的碱液与补料液体积设置为1:3，即只要补了1mL碱液，发酵罐会自动补充3mL的补料液。
低渗分批培养基：酵母浸粉FM528：25g/L、葡萄糖：20g/L、硫酸镁：0.1g/L、硫酸锰：0.05g/L、吐温80：1mL/L、丙氨酸：5g/L，添加的NaCl溶液为1mol/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
罗伊氏乳杆菌活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
Figure BDA0003086366580000041
实施例1.控制不同培养时间制备罗伊氏乳杆菌冻干粉
1.配制提高罗伊氏乳杆菌的活菌数量的培养基：
称取30～40g酵母浸粉FM528、110g葡萄糖、0.175g硫酸镁、0.175g硫酸锰、1mLTween 80和5g丙氨酸，加入1L蒸馏水，搅拌后使各成分溶解，pH5.0，即得到提高罗伊氏乳杆菌的活菌数量的培养基。
2.罗伊氏乳杆菌菌粉的制备
用接种环从保菌管中蘸取少量罗伊氏乳杆菌菌液，在MRS固体培养基上划线，平板置于37℃培养24～36h。挑取单菌落，接入5mL MRS液体培养基中，37℃培养12h。以4％的接种量将培养液接种到新鲜的MRS液体培养基中，培养12h后得到活化的种子液。以4％的接种量将活化好的种子液接种至装有MRS液体培养基的三角瓶中，37℃培养12h。
采用高密度分批培养方式，将添加有5g/L丙氨酸的高密度分批培养基置于发酵罐中，灭菌后将扩培好的罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60515种子液按4％的接种量接种至发酵罐中培养，37℃，恒pH5.0高密度分批培养8h、10h、12h、14h、15h、16h，得到发酵液A1、A2、A3、A4、A5、A6。将发酵液A1、A2、A3、A4、A5、A6在6000rpm，4℃离心20min，得菌体沉淀A1、A2、A3、A4、A5、A6。将菌体沉淀A1、A2、A3、A4与保护剂溶液1:1充分混合均匀后，取1mL分装至冻干瓶冷冻干燥，得到罗伊氏乳杆菌菌粉A1～A6。
保护剂为75g/L低聚异麦芽糖和25g/L胶原蛋白的混合溶液。
3.检测发酵液A1～A6的渗透压，检测罗伊氏乳杆菌菌粉A1～A6中罗伊氏乳杆菌的活菌数，并且，计算罗伊氏乳杆菌菌粉A1～A6中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率(检测结果见表1)。
结果：在高渗、低pH(pH5.0)条件下培养罗伊氏乳杆菌，即当发酵液的渗透压值达到1600mOsm/kg～2000mOsm/kg时(罗伊氏乳杆菌在发酵终点时的渗透压约为2000mOsm/kg)，罗伊氏乳杆菌粉A4～A6的冻干存活率和活菌数均有显著提高，其冻干存活率能达到99.13±2.47％，活菌数能达到9.0×1011CFU/g。
4.发酵乳杆菌菌粉应用：将步骤1得到的发酵杆菌菌粉做为药品、食品和保健品的有效成分。
表1罗伊氏乳杆菌菌粉A1～A6中罗伊氏乳杆菌的活菌数和冻干存活率
Figure BDA0003086366580000042
Figure BDA0003086366580000051
4.罗伊氏乳杆菌菌粉应用：将步骤1得到的罗伊氏乳杆菌菌粉作为药品、食品和保健品的有效成分。
实施例2.控制不同罗伊氏乳杆菌菌株制备罗伊氏乳杆菌冻干粉
1.罗伊氏乳杆菌菌粉的制备
在实施例1的基础上，将罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60515替换为罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.14394、罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60735、罗伊氏乳杆菌CGMCC No.15021，得到罗伊氏乳杆菌菌粉B1～B6、C1～C6、D1～D4。
2.检测发酵液B1～B6、C1～C6、D1～D6的渗透压，检测罗伊氏乳杆菌菌粉B1～B6、C1～C6、D1～D6中罗伊氏乳杆菌的活菌数，并且，计算罗伊氏乳杆菌菌粉B1～B6、C1～C6、D1～D6中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率(检测结果见表2)。
结果：由表1和表2可知，在高渗、低pH条件下培养罗伊氏乳杆菌，即当最终发酵液的渗透压值达到1600mOsm/kg～2000mOsm/kg，罗伊氏乳杆菌粉A4～A6、B4～B6、C4～C6、D4～D6的冻干存活率和活菌数有显著提高，其冻干存活率能达到97.46±5.32％，活菌数能达到8×1011CFU/g。
表2罗伊氏乳杆菌菌粉B1～D6中罗伊氏乳杆菌的活菌数和冻干存活率
Figure BDA0003086366580000052
Figure BDA0003086366580000061
实施例3.控制不同培养方式制备罗伊氏乳杆菌菌粉
1.罗伊氏乳杆菌菌粉的制备
在实施例1的基础上，将高密度分批培养方式替换为高密度补料培养方式，培养至培养体系pH低于5.0时补料，控制反应体系的pH为5.0，培养罗伊氏乳杆菌，得到罗伊氏乳杆菌菌粉E1～E6。
2.检测发酵液E1～E6的渗透压，检测罗伊氏乳杆菌菌粉E1～E6中罗伊氏乳杆菌的活菌数，并且，计算罗伊氏乳杆菌菌粉E1～E6中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率(检测结果见表3)。
结果：由表3可知，培养方式对罗伊氏乳杆菌的冻干存活率影响较小，而发酵环境的渗透压值对罗伊氏乳杆菌的冻干存活率影响很大，即需要确保在高渗(1600mOsm/kg～2000mOsm/kg)、低pH条件下培养罗伊氏乳杆菌，丙氨酸才能发挥作用(有效提高罗伊氏乳杆菌粉的活菌数和冻干存活率)。
表3罗伊氏乳杆菌菌粉E1～E6中罗伊氏乳杆菌的活菌数和冻干存活率
组别 发酵液渗透压 冻干后活菌数 冻干存活率
罗伊氏乳杆菌菌粉E<sub>1</sub> 1244±11mOsm/kg 5.0×10<sup>11</sup>CFU/g 36.15±0.77％
罗伊氏乳杆菌菌粉E<sub>2</sub> 1400±16mOsm/kg 5.8×10<sup>11</sup>CFU/g 41.43±3.12％
罗伊氏乳杆菌菌粉E<sub>3</sub> 1539±18mOsm/kg 6.6×10<sup>11</sup>CFU/g 46.21±1.51％
罗伊氏乳杆菌菌粉E<sub>4</sub> 1628±19mOsm/kg 7.1×10<sup>11</sup>CFU/g 71.11±3.69％
罗伊氏乳杆菌菌粉E<sub>5</sub> 1821±16mOsm/kg 7.3×10<sup>11</sup>CFU/g 84.26±0.67％
罗伊氏乳杆菌菌粉E<sub>6</sub> 1974±7mOsm/kg 7.6×10<sup>11</sup>CFU/g 98.88±0.32％
实施例4.控制不同培养方式制备罗伊氏乳杆菌菌粉
1.罗伊氏乳杆菌菌粉的制备
在实施例1的基础上，将高密度分批培养方式替换为相同体积的MRS添加1mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL的1mol/L的NaCl溶液培养罗伊氏乳杆菌，得到罗伊氏乳杆菌菌粉F1～F6。
2.检测发酵液F1～F6的渗透压，检测罗伊氏乳杆菌菌粉F1～F6中罗伊氏乳杆菌的活菌数，并且，计算罗伊氏乳杆菌菌粉F1～F6中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率(检测结果见表4)。
结果：由表4可知，培养方式对罗伊氏乳杆菌的冻干存活率影响较小，而发酵环境的渗透压值对罗伊氏乳杆菌的冻干存活率影响很大，即需要确保在高渗(1600mOsm/kg～2000mOsm/kg)、低pH条件下培养罗伊氏乳杆菌，丙氨酸才能发挥作用(有效提高罗伊氏乳杆菌粉的活菌数和冻干存活率)。
表4罗伊氏乳杆菌菌粉F1～F6中罗伊氏乳杆菌的活菌数和冻干存活率
组别 发酵液渗透压 冻干后活菌数 冻干存活率
罗伊氏乳杆菌菌粉F<sub>1</sub> 1301±14mOsm/kg 3.3×10<sup>11</sup>CFU/g 30.52±1.48％
罗伊氏乳杆菌菌粉F<sub>2</sub> 1444±10mOsm/kg 4.5×10<sup>11</sup>CFU/g 34.88±2.82％
罗伊氏乳杆菌菌粉F<sub>3</sub> 1543±6mOsm/kg 5.0×10<sup>11</sup>CFU/g 43.03±1.99％
罗伊氏乳杆菌菌粉F<sub>4</sub> 1622±25mOsm/kg 5.5×10<sup>11</sup>CFU/g 66.56±1.17％
罗伊氏乳杆菌菌粉F<sub>5</sub> 1868±20mOsm/kg 5.7×10<sup>11</sup>CFU/g 80.22±2.23％
罗伊氏乳杆菌菌粉F<sub>6</sub> 1980±11mOsm/kg 5.7×10<sup>11</sup>CFU/g 97.71±3.01％
3.分别接入含NaCl的MRS液体培养基中，加5g/L丙氨酸和控制pH5.0，使培养基的初始渗透压分别为400mOsm/kg、600mOsm/kg、800mOsm/kg、1000mOsm/kg、1200mOsm/kg、1400mOsm/kg、1600mOsm/kg、1700mOsm/kg、1800mOsm/kg、1900mOsm/kg、2000mOsm/kg、2100mOsm/kg、2200mOsm/kg。其中添加3g/L NaCl平均增加100mOsm/kg，根据实验要求计算所需添加的NaCl含量。每2h取样，测定OD600，以时间为横坐标，Lg(OD600)为纵坐标，绘制菌株的耐渗透压生长曲线。结果如图1-图4所示，2000mOsm/kg是罗伊氏乳杆菌的耐渗最大值。
实施例5.控制不同pH培养条件制备罗伊氏乳杆菌菌粉
1.罗伊氏乳杆菌菌粉的制备
在实施例1的基础上，将高密度分批培养方式中pH分别替换为5.0、5.5、6.0、6.5，培养罗伊氏乳杆菌16h，得到罗伊氏乳杆菌菌粉G1～G4。
2.检测罗伊氏乳杆菌菌粉G1～G4中罗伊氏乳杆菌的活菌数，并且，计算罗伊氏乳杆菌菌粉G1～G4和G1～G4中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率(检测结果见表5)。
结果：由表4可知，pH对罗伊氏乳杆菌菌粉的活菌数和冻干存活率影响很大，低pH培养能够显著提高菌体的活菌数及存活率，即需要确保在高渗、低pH条件下(1600mOsm/kg～2000mOsm/kg)培养罗伊氏乳杆菌，丙氨酸才能发挥作用(有效提高罗伊氏乳杆菌粉的活菌数和冻干存活率)。
表5罗伊氏乳杆菌菌粉G1～G4中罗伊氏乳杆菌的活菌数和冻干存活率
组别 冻干后活菌数 冻干存活率
罗伊氏乳杆菌菌粉G<sub>1</sub> 9.0×10<sup>11</sup>CFU/g 98.27±1.59％
罗伊氏乳杆菌菌粉G<sub>2</sub> 7.3×10<sup>11</sup>CFU/g 68.21±1.27％
罗伊氏乳杆菌菌粉G<sub>3</sub> 5.3×10<sup>11</sup>CFU/g 46.16±1.63％
罗伊氏乳杆菌菌粉G<sub>4</sub> 5.1×10<sup>11</sup>CFU/g 36.34±0.79％
实施例6.控制不同丙氨酸的浓度制备罗伊氏乳杆菌菌粉
1.罗伊氏乳杆菌菌粉的制备
在实施例1的基础上，将高密度分批培养基中的丙氨酸浓度分别替换为0g/L、1g/L、3g/L、5g/L培养罗伊氏乳杆菌，得到罗伊氏乳杆菌菌粉H1～H4。
2.检测罗伊氏乳杆菌菌粉H1～H4中罗伊氏乳杆菌的活菌数，并且，计算罗伊氏乳杆菌菌粉H1～H4中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率(检测结果见表6)。
结果：由表5可知，丙氨酸的添加与添加量对罗伊氏乳杆菌粉的活菌数和冻干存活率影响很大，将丙氨酸的添加量控制为5g/L效果最佳。
表6罗伊氏乳杆菌菌粉H1～H4中罗伊氏乳杆菌的活菌数和冻干存活率
组别 冻干后活菌数 冻干存活率
罗伊氏乳杆菌菌粉H<sub>1</sub> 6.3×10<sup>11</sup>CFU/g 30.22±2.16％
罗伊氏乳杆菌菌粉H<sub>2</sub> 6.8×10<sup>11</sup>CFU/g 38.91±2.61％
罗伊氏乳杆菌菌粉H<sub>3</sub> 8.0×10<sup>11</sup>CFU/g 79.15±2.22％
罗伊氏乳杆菌菌粉H<sub>4</sub> 8.8×10<sup>11</sup>CFU/g 98.65±2.94％
对比例1.控制不同培养条件制备罗伊氏乳杆菌菌粉
1.罗伊氏乳杆菌菌粉制备：
在实施例1的基础上，采用两种方式培养罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60515。
一种方式为普通培养，即MRS静置培养伊氏乳杆菌16h得到罗伊氏乳杆菌菌粉I1；另一种方式为实施例1所述的高渗、低pH培养，即在高密度培养基中添加5g/L的丙氨酸，恒pH5.0培养罗伊氏乳杆菌16h，得到罗伊氏乳杆菌菌粉J1。
2.检测罗伊氏乳杆菌菌粉I1和J1中罗伊氏乳杆菌的活菌数，并且，计算罗伊氏乳杆菌菌粉I1和J1中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率(检测结果见表7)。
结果：由表7可知，采用实施例1所述的发酵控制手段相较于普通培养方式而言，能够显著提高罗伊氏乳杆菌菌粉的活菌数和冻干存活率，其冻干存活率能提高约60％。
表7罗伊氏乳杆菌菌粉I1和J1中罗伊氏乳杆菌的活菌数和冻干存活率
组别 冻干后活菌数 冻干存活率
罗伊氏乳杆菌菌粉I<sub>1</sub> 3.6×10<sup>11</sup>CFU/g 40.55±4.83％
罗伊氏乳杆菌菌粉J<sub>1</sub> 8.8×10<sup>11</sup>CFU/g 98.36±3.31％
对比例2.控制不同培养基添加物制备罗伊氏乳杆菌菌粉
1.罗伊氏乳杆菌菌粉的制备
在实施例1的基础上，将高密度分批培养基中的丙氨酸分别替换为5g/L的油酸、甜菜碱、海藻糖和蔗糖培养罗伊氏乳杆菌，得到罗伊氏乳杆菌菌粉K1、L1、M1、N1。
2.检测罗伊氏乳杆菌菌粉K1、L1、M1和N1中罗伊氏乳杆菌的活菌数，并且，计算罗伊氏乳杆菌菌粉K1、L1、M1和N1中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率(检测结果见表8)。
结果：由表1和表8可知，添加丙氨酸、油酸、甜菜碱、海藻糖、蔗糖均能提高罗伊氏乳杆菌粉的活菌数和冻干存活率，但是丙氨酸的效果更为显著。因此，使用实施例1中的发酵控制手段效果最佳。
表8罗伊氏乳杆菌菌粉K1～N1中罗伊氏乳杆菌的活菌数和冻干存活率
组别 冻干后活菌数 冻干存活率
罗伊氏乳杆菌菌粉K<sub>1</sub> 7.5×10<sup>11</sup>CFU/g 64.14±3.11％
罗伊氏乳杆菌菌粉L<sub>1</sub> 8.6×10<sup>11</sup>CFU/g 75.45±3.33％
罗伊氏乳杆菌菌粉M<sub>1</sub> 8.6×10<sup>11</sup>CFU/g 73.77±1.58％
罗伊氏乳杆菌菌粉N<sub>1</sub> 8.4×10<sup>11</sup>CFU/g 77.61±2.33％
对比例3.控制不同预处理条件制备罗伊氏乳杆菌菌粉
1.罗伊氏乳杆菌菌粉的制备
在实施例1的基础上，将高密度分批培养基中的丙氨酸浓度替换为0g/L，收集发酵液离心的菌体沉淀，将菌体沉淀与保护剂溶液1:1充分混合均匀后，分别在-40℃、-20℃、25℃、45℃中放置3h，之后进行冷冻干燥，或立即进行冷冻干燥(对照组)，得到罗伊氏乳杆菌菌粉O1～O5。
2.检测罗伊氏乳杆菌菌粉O1～O5中罗伊氏乳杆菌的活菌数，并且，计算罗伊氏乳杆菌菌粉O1～O5中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率(检测结果见表9)。
结果：由表1和表9可知，将菌体进行冷(-40℃、-20℃)、热(45℃)处理能够在一定范围内提高罗伊氏乳杆菌粉的活菌数和冻干存活率，但是冷、热胁迫处理的效果远不如在高渗、低pH条件下添加丙氨酸。因此，使用实施例1中的发酵控制手段效果最佳。
表9罗伊氏乳杆菌菌粉O1～O5中罗伊氏乳杆菌的活菌数和冻干存活率
组别 冻干后活菌数 冻干存活率
罗伊氏乳杆菌菌粉O<sub>1</sub> 7.3×10<sup>11</sup>CFU/g 72.41±2.94％
罗伊氏乳杆菌菌粉O<sub>2</sub> 6.5×10<sup>11</sup>CFU/g 64.49±2.62％
罗伊氏乳杆菌菌粉O<sub>3</sub> 6.0×10<sup>11</sup>CFU/g 23.44±1.29％
罗伊氏乳杆菌菌粉O<sub>4</sub> 7.0×10<sup>11</sup>CFU/g 48.52±2.70％
罗伊氏乳杆菌菌粉O<sub>5</sub> 6.2×10<sup>11</sup>CFU/g 30.36±3.10％
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提高罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)冻干存活率的方法，其特征在于，所述方法是将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)接种在含有丙氨酸的发酵培养基中，在pH为5.0～5.5和渗透压为1600mOsm/kg～2000mOsm/kg的条件下培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述丙氨酸的浓度为3g/L～5g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌的培养时间为12h-16h。
4.一种制备罗伊氏乳杆菌菌粉的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
(1)将罗伊氏乳杆菌接种在含有丙氨酸的发酵培养基中，在pH为5.0～5.5、渗透压为1600mOsm/kg～2000mOsm/kg的条件下培养12h-16h；
(2)收集步骤(1)的罗伊氏乳杆菌细胞，与保护剂按质量比为1:1混合，再进行冻干处理后获得罗伊氏乳杆菌菌粉。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述保护剂的成分为低聚异麦芽糖、蔗糖、海藻糖、胶原蛋白、脱脂乳中的一种或多种。
6.一种罗伊氏乳杆菌菌粉，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌菌粉由权利要求4或5所述的方法得到的。
7.权利要求6所述的罗伊氏乳杆菌菌粉在制备食品、药品和保健品中的应用。
8.一种提高罗伊氏乳杆活菌数的培养基，其特征在于，所述培养基成分为：碳源、氮源、硫酸镁、硫酸锰、吐温80和丙氨酸，pH5.0～5.5。
9.根据权利要求8所述的培养基，其特征在于，所述培养基成分为：20～40g/L酵母浸粉FM528、20～100g/L葡萄糖、0.1～0.175g/L硫酸镁、0.05～0.175g/L硫酸锰、0.5～1mL/L吐温80和3～5g/L丙氨酸，pH5.0。
10.权利要求1-3任一项所述的方法或权利要求8或9所述的培养基在制备罗伊氏乳杆菌菌粉和提高罗伊氏乳杆菌活菌数中的应用。
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