CN112812983B - 一种生产菜油甾醇的酿酒酵母工程菌及构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产菜油甾醇的酿酒酵母工程菌及构建方法，属于基因工程和生物工程领域。本发明通过将7‑脱氢胆固醇还原酶的表达盒元件导入到酵母细胞体内，利用CRISPR/Cas9基因操作***整合至酵母基因组中，还敲除了C‑22甾醇去饱和酶，解除麦角固醇分支途径的竞争，实现了从葡萄糖到菜油甾醇的酵母合成。本发明的方法工艺简单，绿色环保，可用于发酵生产菜油甾醇。采用本发明提供酿酒酵母工程菌株BY4742‑Δerg5‑TEF1p‑dhcr7‑ADH1t制备得到的菜油甾醇的产量，在摇瓶阶段可达253.35mg/L，发酵罐水平产量可达916.88mg/L，比菌株在摇瓶阶段菜油甾醇的产量提升了2.6倍。

Description

一种生产菜油甾醇的酿酒酵母工程菌及构建方法
技术领域
本发明涉及一种生产菜油甾醇的酿酒酵母工程菌及构建方法，属于基因工程和生物工程领域。
背景技术
近年来，甾体药物因具备良好的抗炎、抗过敏和避孕等作用而备受生物医药行业的高度重视，甾体激素类药物的市场需求一直居高不下，成为仅次于抗生素的第二大药物。随着人们对甾体激素类药物的需求不断增加，全球甾体激素药物的生产工艺经历了数次变革，包括化学全合成、植物提取皂素加化学半合成、新型微生物合成等多个阶段，直至今日，甾体激素药物的合成工艺仍在不断探索与创新。菜油甾醇是甾体药物(孕酮、雄烯二酮、氢化可的松等)的一种重要合成前体，也是植物来源的主要甾醇之一。其与动物来源的主要甾醇(胆固醇)的结构仅在C24位多出一个甲基，与微生物来源的主要甾醇(麦角甾醇)的区别在于C7-8和C22-23位是饱和单键。因此，这为微生物催化法生产菜油甾醇提供了可行性的理论基础。
目前，甾体类药物主要通过化学合成和生物催化两种主要方式进行生产。由于化学合成法会造成严重的环境污染且中间步骤复杂，因此，生物催化因其绿色环保且反应过程简易而受到了极大的关注。然而，由于甾体类药物及其中间体水溶性较差，难以进出细胞被利用，造成了生物催化生产甾体类药物的较低生物转化率。虽然有添加助溶剂以及将底物溶解于有机溶剂中进行添加等方法来提高微生物对底物的利用率，但转化率仍然不是很高。随着合成生物学的发展，利用微生物合成菜油甾醇等具有高价值药物的前体化合物已成为一种发展趋势。微生物合成具有周期短，产量高，条件温和，环保和过程可控等特点，因此可作为新型的生产甾体药物的生产方式。
酵母细胞体内存在着一条天然的甾醇合成途径，因此可作为合成甾体药物的优良底盘细胞。现有技术当中，虽然存在采用酵母细胞生产菜油甾醇的报道，但是，由于途径中(如图3所示)的关键酶7脱氢胆固醇还原酶DHCR7的活性不高，进而限制了菜油甾醇的高效生产。因此，如何得到一种高效生产菜油甾醇的方法，成为研究的热点。
发明内容
技术问题
本发明要解决的技术问题是，提供一种高效生产菜油甾醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法，及利用酿酒酵母工程菌高效生产菜油甾醇的方法。
技术方案
为了解决上述问题，本发明提供了一种酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌敲除了C-22甾醇去饱和酶Erg5，并且含有来源于Pangasianodon hypophthalmus的7-脱氢胆固醇还原酶。
在本发明的一种实施方式中，所述7-脱氢胆固醇还原酶的氨基酸序列如SEQ IDNO 1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述7-脱氢胆固醇还原酶的核苷酸序列如SEQ IDNO 2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述C-22甾醇去饱和酶基因的氨基酸序列如SEQ IDNO 3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述C-22甾醇去饱和酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO 4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母BY4742为宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母工程菌还包括启动子，所述启动子为强化7-脱氢胆固醇还原酶的表达；所述启动子为PGK1p、GPM1p、TDH3p、TEF1p、TPI1p、GPD1p、TEF2p、ACT1p、GAL1p和TDH2p中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子PGK1p、GPM1p、TDH3p、TEF1p、TPI1p、GPD1p、TEF2p、ACT1p、GAL1p和TDH2p的核苷酸序列如SEQ ID NO 5～SEQ ID NO 14所示。
本发明还提供了一种构建上述酿酒酵母工程菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)表达盒的构建：将整合位点上游同源臂，酵母启动子，7-脱氢胆固醇还原酶基因，酵母终止子，整合位点下游同源臂构建得到7-脱氢胆固醇还原酶表达盒元件；将得到的7-脱氢胆固醇还原酶表达盒元件以及含有Cas9蛋白的敲除质粒通过酵母转化的方式导入到酵母细胞体内，通过酵母自身的同源重组完成元件的组装进而得到完整的表达盒；
(2)将上述表达盒***到酿酒酵母BY4742酵母染色体ChrXI上的1114a位点，并敲除C-22甾醇去饱和酶成功构建得到酿酒酵母工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述酵母启动子为PGK1p、GPM1p、TDH3p、TEF1p、TPI1p、GPD1p、TEF2p、ACT1p、GAL1p和TDH2p中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述所述酵母终止子为ADH1t。
本发明还提供了一种生产菜油甾醇的方法，所述方法为采用上述酿酒酵母工程菌制备菜油甾醇。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为：将酿酒酵母工程菌接种至种子培养基中，制备得到种子液；将种子液转接至发酵培养基中，收集培养后的细胞，加入皂化反应液，反应结束后加入正己烷萃取，制备得到菜油甾醇。
在本发明的一种实施方式中，所述皂化反应液为20％～30％KOH(或NaOH)和50％C2H5OH(或CH3OH)。
在本发明的一种实施方式中，向收集得到的细胞中加入2mL皂化反应液(20％～30％KOH或NaOH和50％C2H5OH或CH3OH)，且加入100μL 1g/L胆固醇作为内标，置于85℃-100℃条件下温浴2-3h。
在本发明的一种实施方式中，待反应结束后，加入6mL正己烷充分震荡萃取，取上层萃取液于氮吹仪中用氮气吹干，加入1mL色谱级甲醇复溶。
本发明还提供了上述酿酒酵母工程菌在制备菜油甾醇及含有菜油甾醇的产品中的应用。
有益效果
(1)本发明利用代谢工程与合成生物学技术，通过在酿酒酵母体内引入外源的7-脱氢胆固醇还原酶构建菜油甾醇合成途径，并通过敲除C-22甾醇去饱和酶来解除竞争途径，从而实现高效的菜油甾醇生物合成。整个生产过程方便、快捷、无污染，具有非常广阔的应用前景。本发明的生产菜油甾醇酿酒酵母工程菌株为甾体类药物的微生物生产提供了一种切实可行的方法。
(2)采用本发明提供的生产菜油甾醇酿酒酵母工程菌株BY4742-Δerg5-TEF1p-dhcr7-ADH1t制备得到的菜油甾醇的产量，在摇瓶阶段可达253.35mg/L，在5-L发酵罐水平，产量可达916.88mg/L，比菌株在摇瓶阶段菜油甾醇的产量提升了2.6倍。
(3)采用本发明中Pangasianodon hypophthalmus来源的7-脱氢胆固醇还原酶表现出最高的菜油甾醇产量216.93±9.42mg/L，比文献所报道的Danio rerio来源的7-脱氢胆固醇还原酶的菜油甾醇产量(167.91±6.00mg/L)提高了22.6％。
附图说明
图1：酿酒酵母工程菌发酵生产菜油甾醇的组分分析总离子色谱图。
图2：酿酒酵母工程菌发酵生产菜油甾醇的质谱图。
图3：酿酒酵母中菜油甾醇合成路径图。
图4：摇瓶阶段含有不同启动子的酿酒酵母工程菌制备得到菜油甾醇的产量。
图5：酿酒酵母工程菌5L发酵罐的补料分批发酵结果。
具体实施方式
下面通过合成菜油甾醇的优选实例并结合附图具体数明本发明的各方面的调整。本领域的技术人员应该理解，具体实验例的目的只是为了说明，而不是限制本发明的范围。在不被李权利要求书范围的条件下，本领域的技术人员可以针对本发明的各个方面进行修改，但是这些修改也属于本发明的保护范围。例如，将本实验例中所使用的启动子或终止子替换为本领域常用的其他启动子或终止子，是本领域的其他技术人员能够理解和实现的。
另外，需要注意的是，除非特别指出，以下具体实例中所采用的各种材料和试剂均为本领域常用材料和试剂。可以通过正常的商业途径获得；所采用的方法均为本领域技术人员供职的常规方法。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
YPD固体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，加入2％的琼脂粉。
液体YPD培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L。
液体YPG培养基：半乳糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L。
发酵罐发酵时的发酵培养基：葡萄糖50g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
葡萄糖含量的检测：用生物传感分析仪SBA-40E进行测定；
半乳糖含量用HPLC法进行检测：视察检测器RID，色谱柱为氰柱，柱温80℃，流动相为超纯水，流速0.6mL/min，检测温度55℃。
菜油甾醇含量的检测方法
将产物经0.22μm膜过滤后，通过ThermoFisher HPLC分析，色谱柱为DiamonsilC18，5μm，250mm×4.6mm，检测器为紫外检测器。在205nm处检测到菜油甾醇和胆固醇，流动相纯甲醇组成；流速为1mL/min，柱温为30℃。
气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定：色谱柱DB-5MS；分流比10:1，进样1μL，载气氦气的流速为1mL/min；升温程序80℃保持1min，以20℃/min升至300℃，保持20min；质谱范围为50-700m/z。
实施例1：菜油甾醇合成途径中相关基因的获得
(1)7-脱氢胆固醇还原酶基因的获得
根据来源于Pangasianodon hypophthalmus的7-脱氢胆固醇还原酶DHCR7氨基酸序列(Genbank注册序列号为XP_026786162)，通过酿酒酵母密码子优化，使7-脱氢胆固醇还原酶基因的密码子具有酵母偏好性，产生的优化基因序列，即编码7-脱氢胆固醇还原酶的基因dhcr7的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
(2)erg5基因位点的上下游同源臂的获得
根据酿酒酵母基因组中erg5基因位点的上有游同源臂与下游同源臂序列，设计引物5’-TGGGAATACTGTACCAGATAATCAAACAT-3’与5’-CAAAGTTCTGTTTTTCCCCATTTGTTAAAAGGTATTTATTGTCTATTGGAATAGC-3’，扩增erg5基因位点上游同源臂；设计引物5’-ATAAATACCTTTTAACAAATGGGGAAAAACAGAACTTTGTCCAGAC-3’与5’-TGACAGTGACGAACGCTTCAG-3’，扩增erg5基因位点下游同源臂，以BY4742基因组为模板，使用Extaq酶进行PCR扩增。
(3)整合位点上下游同源臂的获得
根据线上网站CASdesigner进行设计引物片段，选择酵母ChrXI上的1114a基因整合位点，输入相应的基因序列以及启动子进而自动生成能够克隆上下游同源臂的引物序列，其中上游引物5’-GAGAAATGTTGGGATCCAGAAGAATGA-3’与下游引物5’-TATACGCTATTATCAGCCAAATAGTAAATAGGCTTCGTCTTTATAAGATATATACAGC-3’，用以扩增1114a整合位点的上游同源臂，上游引物5’-TTCACCCAATTGTAGATATGCTAACTCCCATCATCTAACATCGTGAAACGAATCAG-3’与下游引物5’-AGATAAGAAGTGGGAAGGTAAAATCGAATAC-3’用以扩增1114a整合位点的下游游同源臂，以BY4742基因组为模板，使用Extaq酶进行PCR扩增。
(4)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO 5～SEQ ID NO 14所示启动子PGK1p、GPM1p、TDH3p、TEF1p、TPI1p、GPD1p、TEF2p、ACT1p、GAL1p和TDH2p。
实施例2：生产菜油甾醇菌的酿酒酵母工程菌株的获得
具体步骤如下：
(1)表达盒的构建：采用实施例1制备得到的整合位点上游同源臂，酵母启动子，7-脱氢胆固醇还原酶基因，酵母终止子，整合位点下游同源臂构建得到7-脱氢胆固醇还原酶表达盒元件；将得到的7-脱氢胆固醇还原酶表达盒元件以及含有Cas9蛋白的敲除质粒通过酵母转化的方式导入到酿酒酵母BY4742细胞体内，通过酵母自身的同源重组完成元件的组装进而得到完整的表达盒；
所涉及的遗传操作方法如下：
通过使用CASdesigner生成的引物来PCR扩增供体DNA片段，以构建一个整合的表达盒(通常包含两个1-kb侧翼同源区，启动子，基因序列和终止子)，该盒包含靶向所选基因组位点的1-kb侧翼同源区域，然后与靶向该基因的Cas9-gRNA质粒(pCut)共转化进入酵母细胞。此外，CASdesigner所设计的引物在片段之间会提供30-60bp的同源臂，因此，在酵母体1-5个单独的片段可以进行同源重组自组装。靶向基因组基因座的pCut质粒是从线性骨架和包含新gRNA序列的线性PCR片段体内组装而成的。新的sgRNA由在线sgRNA设计工具所产生。
采用醋酸锂法进行的酵母转化具体转化方法如下：
将新鲜过夜培养的酵母细胞接种到2×YPD培养基至OD600nm为0.2，在30℃，200rpm条件下培养至OD600nm为1.0。然后，收集5mL培养液于8000rpm离心5min，加入2.5mL的H2O洗涤两次。使用含有供体DNA片段(2μg)和pCUT质粒(0.25ng)的50μL水溶液对细胞沉淀进行重悬，加入至转化反应液(260μL 50％PEG3350、36μL 1M LiOAc，10μL ssDNA，4μLH2O)中混合。将混合液在42℃温育40分钟，并通过以6000rpm离心1分钟收集沉淀。细胞沉淀重悬于500μL H2O中，然后取100μL H2O在选择性琼脂平板(SC-U)上涂布均匀。通过测序验证整合的结果，挑取正确的菌落在消除质粒后用于下游实验操作。
(2)将上述表达盒***到酿酒酵母BY4742酵母染色体ChrXI上的1114a位点，通过酵母自身的同源重组完成元件的组装，得到了整合含有7-脱氢胆固醇还原酶的酵母细胞BY4742-GAL1p-dhcr7-ADH1t；
(3)将C-22甾醇去饱和酶erg5基因的上下游同源臂，通过PCR克隆得到基因片段，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以及以步骤(1)中设计新的sgRNA能够定位到染色体erg5基因，并将上下游同源臂和含有Cas9蛋白以及新的sgRNA的敲除质粒通过步骤(1)所示得转化方法导入到酵母细胞中，最终以酵母自身的同源重组的方式替换掉erg5基因，实现步骤(2)得到的整合有7-脱氢胆固醇还原酶的酵母细胞BY4742-GAL1p-dhcr7-ADH1t中erg5基因的敲除，得到重组菌株BY4742-Δerg5-GAL1p-dhcr7-ADH1t；
(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以及按步骤(1)的方式设计能够定位到GAL1p启动子sgRNA，并将带有相应同源臂的启动子片段和含有Cas9蛋白以及新的sgRNA的敲除质粒通过步骤(1)所示得转化方法导入到酵母细胞中，最终以酵母自身的同源重组的方式将步骤(3)中所构建的酿酒酵母工程菌株BY4742Δerg5-GAL1p-dhcr7-ADH1t的启动子从GAL1p分别替换为PGK1p、GPM1p、TDH3p、TEF1p、TPI1p、GPD1p、TEF2p、ACT1p和TDH2p，分别得到酿酒酵母工程菌株：BY4742-Δerg5-PGK1p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-GPM1p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-TDH3p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-TEF1p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-TPI1p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-GPD1p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-TEF2p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-ACT1p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-TDH2p-dhcr7-ADH1t。
实施例3：生产菜油甾醇菌的酿酒酵母工程菌株的发酵
具体步骤如下：
(1)摇瓶阶段发酵：
分别将实施例2中制备得到的酿酒酵母工程菌BY4742-Δerg5-GAL1p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-PGK1p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-GPM1p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-TDH3p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-TEF1p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-TPI1p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-GPD1p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-TEF2p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-ACT1p-dhcr7-ADH1t、BY4742-Δerg5-TDH2p-dhcr7-ADH1t在YPD固体培养基上划线活化，生长48h后，得到单菌落；
挑取单菌落接入10mL/50mL的小瓶液体YPD培养基中，在30℃，200rpm条件下培养24h，得到种子液。将制备得到的种子液以2％(v/v)的接种量转接至50mL/250mL的液体YPD培养基中，在30℃，200rpm条件下发酵48h，接着将培养在YPD液体培养基中的酵母菌体至于50mL无菌离心管中，8000rpm离心5min，去上清，收集细胞转移至50mL/250mL的液体YPG培养基中进一步发酵96h。收集细胞，进行菜油甾醇的提取与检测。
(2)5L发酵罐阶段的发酵
挑取步骤(1)中得到的单菌落接种于10mL液体YPD培养基中，30℃、200rpm培养24h，得到一级种子液；将一级种子液以5％(v/v)的接种量接入至100mL液体YPD培养基中，30℃，200rpm培养24h，得到二级种子液；将二级种子液10％(v/v)的接种量接种于2L发酵培养基中。
控制5L发酵罐中发酵参数，将温度、pH值、溶氧量及通气量分别控制在30℃、5.5、>30％和2vvm。监测发酵液中残糖量，待培养基中葡萄糖消耗完毕，开始补加半乳糖，待半乳糖快消耗完时立即补加至40g/L，直至发酵结束取10mL发酵液于50mL离心管中，8000rpm离心5min，去上清，收集菌体，进行菜油甾醇的提取与检测。
实施例4：生产菜油甾醇的酿酒酵母工程菌发酵产物的提取与检测
具体步骤如下：
(1)测定发酵液的OD600，保持每mL液体含有小于10OD600的菌体量(若超出则进行稀释)；
(2)取1mL步骤(1)中已稀释好的实施例3中在摇瓶阶段和发酵罐阶段制备得到的菌体细胞，加入2mL皂化反应液(20％KOH-50％C2H5OH)后，分别加入100μL 1g/L胆固醇作为内标，置于85℃温浴2h。
待反应结束后，加入6mL正己烷充分震荡萃取，取上层萃取液于氮吹仪中用氮气吹干，加入1mL色谱级甲醇复溶。分别检测制备得到的菜油甾醇的含量(结果如图1～2，图4～5所示)，如表1和表2所示：
表1：摇瓶阶段含有不同启动子的酿酒酵母工程菌制备得到菜油甾醇的含量
Figure BDA0002939926350000081
表2：发酵罐阶段含有不同启动子的酿酒酵母工程菌制备得到菜油甾醇的含量
Figure BDA0002939926350000082
由表1可知，当采用不同的启动子携带编码7-脱氢胆固醇还原酶的基因dhcr7构建得到的酿酒酵母工程菌时，菜油甾醇的产量差异十分明显，且初始启动子GAL1p表现出较高的菜油甾醇产量216.93mg/L，但其中启动子TEF1p表现出了最高的菜油甾醇产量253.35mg/L，较原始启动子提高了18.74％。
由表2可知，采用补料分批发酵的策略对工程菌株进行5L发酵罐高密度发酵时，能够进一步实现菜油甾醇的产量的提升，采用重组菌株BY4742-Δerg5-TEF1p-dhcr7-ADH1t最终可达到最高的菜油甾醇产量916.88mg/L，比菌株在摇瓶阶段菜油甾醇的产量提升了2.6倍。
对比例1
具体实施方式同实施例1～4，区别在于，将本申请的来源于Pangasianodonhypophthalmus7-脱氢胆固醇还原酶分别调整为来源于Labeo rohita(其氨基酸序列如SEQID NO.15所示，其GENBANK注册号为RXN17635.1)，来源于Triplophysa ***a(其氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，其GENBANK注册号为KAA0723749.1)、来源于Carassius auratus(其氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，其GENBANK注册号为XP_026124274.1)，及来源于Danio rerio的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示(其GENBANK注册号为NP_958487.2)的7-脱氢胆固醇还原酶(来源于Danio rerio的7-脱氢胆固醇还原酶记载于Zhang Y,Wang Y,YaoM,et al.Improved campesterol production in engineered Yarrowia lipolyticastrains.Biotechnol Lett.2017.39(7):1033-1039论文当中)，将启动子调整为TEF1p，结果如表3所示：
表3：摇瓶阶段含有不同来源的7-脱氢胆固醇还原酶的酿酒酵母工程菌制备得到菜油甾醇的含量
Figure BDA0002939926350000091
由表3可知，本申请中Pangasianodon hypophthalmus来源的7-脱氢胆固醇还原酶表现出最高的菜油甾醇产量216.93±9.42mg/L，比文献所报道的Danio rerio来源的7-脱氢胆固醇还原酶的菜油甾醇产量(167.91±6.00mg/L)提高了22.6％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种生产菜油甾醇的酿酒酵母工程菌及构建方法
<130> BAA210044A
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Thr Ser Glu Gly Val Arg Lys Arg His Lys Val Gln Pro Ser
1 5 10 15
Gly Thr Asn Val Gly Arg Lys Glu Arg Lys Ala Glu Thr Gly Gln Trp
20 25 30
Gly Arg Ala Trp Glu Val Asp Trp Phe Ser Leu Thr Gly Val Ile Leu
35 40 45
Leu Leu Cys Leu Ala Pro Phe Ile Val Phe Phe Phe Val Met Ala Cys
50 55 60
Asp Gln Tyr Gln Cys Ser Val Ser Leu Val Leu Leu Asp Met Tyr Asn
65 70 75 80
Gly Asp Ala Ser Pro Leu Ser Ile Trp Lys Gln Ala Pro Ser Phe Thr
85 90 95
Trp Thr Ala Ala Lys Ile Tyr Ala Thr Trp Val Thr Phe Gln Met Val
100 105 110
Leu Tyr Met Cys Ile Pro Asp Val Thr His Lys Val Leu Pro Gly Tyr
115 120 125
Val Gly Gly Val Gln Glu Gly Ala Arg Thr Pro Ala Gly Leu Ile Asn
130 135 140
Lys Tyr Gln Ile Asn Gly Leu Gln Cys Trp Ile Ile Thr His Ala Leu
145 150 155 160
Trp Val Ala Asn Ala Tyr His Phe His Trp Phe Ser Pro Thr Ile Ile
165 170 175
Phe Asp Asn Trp Ile Pro Leu Leu Trp Cys Thr Asn Ile Leu Gly Tyr
180 185 190
Thr Val Ser Ile Phe Val Phe Ile Lys Ala Tyr Leu Phe Pro Thr Asn
195 200 205
Pro Glu Asp Cys Lys Phe Thr Gly Asn Leu Phe Tyr Asp Phe Met Met
210 215 220
Gly Ile Glu Phe Asn Pro Arg Ile Arg Lys Trp Phe Asp Phe Lys Leu
225 230 235 240
Phe Phe Asn Gly Arg Pro Gly Ile Val Ala Trp Thr Leu Ile Asn Leu
245 250 255
Ser Tyr Ala Ala Lys Gln Gln Glu Leu Tyr Gly His Val Thr Asn Ser
260 265 270
Met Ile Leu Val Asn Val Leu Gln Ala Ile Tyr Val Leu Asp Phe Phe
275 280 285
Trp Asn Glu Ala Trp Tyr Leu Lys Thr Ile Asp Ile Cys His Asp His
290 295 300
Phe Gly Trp Tyr Leu Gly Trp Gly Asp Cys Val Trp Leu Pro Phe Leu
305 310 315 320
Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Asn Pro Ile Gln Leu Ser
325 330 335
Thr Pro Tyr Ala Trp Ala Val Leu Val Leu Gly Leu Val Gly Tyr Tyr
340 345 350
Ile Phe Arg Ser Ala Asn His Gln Lys Asp Leu Phe Arg Arg Thr Gln
355 360 365
Gly Glu Cys Lys Ile Trp Gly Ser Lys Pro Thr Phe Ile Glu Cys Ser
370 375 380
Tyr Arg Ser Ala Asp Gly Gly Ile His Lys Ser Lys Leu Leu Thr Ser
385 390 395 400
Gly Phe Trp Gly Ala Ala Arg His Leu Asn Tyr Thr Gly Asp Leu Leu
405 410 415
Gly Ala Leu Ala Tyr Cys Met Ala Cys Ser His Gly His Leu Leu Pro
420 425 430
Tyr Phe Tyr Ile Val Tyr Met Thr Ile Leu Leu Leu His Arg Cys Ile
435 440 445
Arg Asp Glu His Arg Cys Ser Ser Lys Tyr Gly Lys Asp Trp Lys Arg
450 455 460
Tyr Thr Ala Thr Val Arg Tyr Arg Leu Leu Pro Gly Ile Phe
465 470 475
<210> 2
<211> 1436
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtctacct ctgaaggtgt tagaaaaaga cataaagttc aaccatctgg taccaatgtt 60
ggtagaaaag aaagaaaagc tgaaaccggt caatggggta gagcttggga agttgattgg 120
ttttctttga ccggtgtgat cttgttgttg tgtttggctc catttattgt atttttcttt 180
gtgatggctt gtgatcaata tcaatgttct gtttctttgg ttttgttgga tatgtataat 240
ggtgatgctt ctccattgtc tatttggaaa caagctccat cttttacctg gaccgctgct 300
aaaatttatg ctacctgggt tacctttcaa atggttttgt atatgtgtat tccagatgtt 360
acccataaag ttttgccagg ttatgttggt ggtgttcaag aaggtgctag aaccccagct 420
ggtttgatta ataaatatca aattaatggt ttgcaatgtt ggattattac ccatgctttg 480
tgggttgcta atgcttatca ttttcattgg ttttctccaa ccattatttt tgataattgg 540
attccattgt tgtggtgcac caatattttg ggatacaccg tttctatatt tgtgttcatt 600
aaggcttatt tgtttccaac caatcccgaa gattgcaagt ttactggtaa cctcttttac 660
gactttatga tgggaataga gtttaatcca aggattagaa agtggtttga ttttaaattg 720
ttttttaatg gtagaccagg tattgttgct tggaccttga ttaatttgtc ttatgctgct 780
aaacaacaag aattgtatgg tcatgttacg aacagtatga ttctcgtgaa cgtcttgcaa 840
gctatttatg tattggactt tttctggaat gaggcttggt atttgaaaac cattgatatt 900
tgtcatgatc attttggttg gtatttgggt tggggtgatt gtgtttggtt gccatttttg 960
tataccttgc aaggtttgta tttggtttat aatccaattc aattgtctac cccatatgct 1020
tgggctgttt tggttttggg tttggttggt tattatattt ttagatctgc taatcatcaa 1080
aaagatttgt ttagaagaac ccaaggtgaa tgtaaaattt ggggttctaa accaaccttt 1140
attgaatgtt cttatagatc tgctgatggt ggtattcata aatctaaatt gttgacctct 1200
ggtttttggg gtgctgctag acatttgaat tataccggtg atttgttggg tgctttggct 1260
tattgtatgg cttgttcgca tggacatctg ctgccatatt tttatatcgt ttatatgacg 1320
atattgttgt tgcatagatg tattagagat gaacatagat gttcttctaa atatggtaaa 1380
gattggaaaa gatataccgc taccgttaga tatagattgt tgccaggtat ttttta 1436
<210> 3
<211> 538
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ser Ser Val Ala Glu Asn Ile Ile Gln His Ala Thr His Asn Ser
1 5 10 15
Thr Leu His Gln Leu Ala Lys Asp Gln Pro Ser Val Gly Val Thr Thr
20 25 30
Ala Phe Ser Ile Leu Asp Thr Leu Lys Ser Met Ser Tyr Leu Lys Ile
35 40 45
Phe Ala Thr Leu Ile Cys Ile Leu Leu Val Trp Asp Gln Val Ala Tyr
50 55 60
Gln Ile Lys Lys Gly Ser Ile Ala Gly Pro Lys Phe Lys Phe Trp Pro
65 70 75 80
Ile Ile Gly Pro Phe Leu Glu Ser Leu Asp Pro Lys Phe Glu Glu Tyr
85 90 95
Lys Ala Lys Trp Ala Ser Gly Pro Leu Ser Cys Val Ser Ile Phe His
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115 120 125
Gln Ser Ser Lys Phe Val Lys Pro Cys Val Val Asp Val Ala Val Lys
130 135 140
Ile Leu Arg Pro Cys Asn Trp Val Phe Leu Asp Gly Lys Ala His Thr
145 150 155 160
Asp Tyr Arg Lys Ser Leu Asn Gly Leu Phe Thr Lys Gln Ala Leu Ala
165 170 175
Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Glu Gln Ile Met Asp Lys Tyr Met Asp Lys
180 185 190
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Tyr Leu Val Thr Ala Ala Leu Glu Leu Val Asn Phe Pro Ile Ile Ile
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Pro Tyr Thr Lys Thr Trp Tyr Gly Lys Lys Thr Ala Asp Met Ala Met
260 265 270
Lys Ile Phe Glu Asn Cys Ala Gln Met Ala Lys Asp His Ile Ala Ala
275 280 285
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<211> 1617
<212> DNA
<213> 人工序列
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atgagttctg tcgcagaaaa tataatacaa catgccactc ataattctac gctacaccaa 60
ttggctaaag accagccctc tgtaggcgtc actactgcct tcagtatcct ggatacactt 120
aagtctatgt catatttgaa aatatttgct actttaatct gtattctttt ggtttgggac 180
caagttgcat atcaaatcaa gaaaggttcc atcgcaggtc caaagtttaa gttctggccc 240
atcatcggtc catttttgga atccttagat ccaaagtttg aagaatataa ggctaagtgg 300
gcatccggtc cactttcatg tgtttctatt ttccataaat ttgttgttat cgcatctact 360
agagacttgg caagaaagat cttgcaatct tccaaattcg tcaaaccttg cgttgtcgat 420
gttgctgtga agatcttaag accttgcaat tgggtttttt tggacggtaa agctcatact 480
gattacagaa aatcattaaa cggtcttttc actaaacaag ctttggctca atacttacct 540
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aactctttct gtggtaacta tattaccgaa gatcaagtca gaaagattgc tgatgattac 720
tatttggtta cagcagcatt ggaattagtc aacttcccaa ttattatccc ttacactaaa 780
acatggtatg gtaagaaaac tgcagacatg gccatgaaga ttttcgaaaa ctgtgctcaa 840
atggctaagg atcatattgc tgcaggtggt aagccagttt gtgttatgga tgcttggtgt 900
aagttgatgc acgatgcaaa gaatagtaac gatgatgatt ctagaatcta ccacagagag 960
tttactaaca aggaaatctc cgaagctgtt ttcactttct tatttgcttc tcaagatgcc 1020
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gtttgcaaaa agaacaaaac tgaaaaaacc cagacacgct cgacttcctg tcttcctatt 60
gattgcagct tccaatttcg tcacacaaca aggtcctagc gacggctcac aggttttgta 120
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ttacaacaaa tataaaacaa tg 502
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aagttacata tatatatata tatatatata tatatatata tagccatagt gatgtctaag 60
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acaaacacac atattacaat aa 502
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<400> 7
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tctaagtttt aattacaaaa tg 502
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cccttcgaga ttatatctag gaacccatca ggttggtgga agattacccg ttctaagact 120
tttcagcttc ctctattgat gttacacctg gacacccctt ttctggcatc cagtttttaa 180
tcttcagtgg catgtgagat tctccgaaat taattaaagc aatcacacaa ttctctcgga 240
taccacctcg gttgaaactg acaggtggtt tgttacgcat gctaatgcaa aggagcctat 300
atacctttgg ctcggctgct gtaacaggga atataaaggg cagcataatt taggagttta 360
gtgaacttgc aacatttact attttccctt cttacgtaaa tatttttctt tttaattcta 420
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ttcaaattaa cgaatcaaat taacaaccat aggatgataa tgcgattagt tttttagcct 300
tatttctggg gtaattaatc agcgaagcga tgatttttga tctattaaca gatatataaa 360
tggaaaagct gcataaccac tttaactaat actttcaaca ttttcagttt gtattacttc 420
ttattcaaat gtcataaaag tatcaacaaa aaattgttaa tatacctcta tactttaacg 480
tcaaggagaa aaaactataa tg 502
<210> 14
<211> 502
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctaattcaat aagtatgtca tgaaatacgt tgtgaagagc atccagaaat aatgaaaaga 60
aacaacgaaa ctgggtcggc ctgttgtttc ttttctttac cacgtgatct gcggcattta 120
caggaagtcg cgcgttttgc gcagttgttg caacgcagct acggctaaca aagcctagtg 180
gaactcgact gatgtgttag ggcctaaaac tggtggtgac agctgaagtg aactattcaa 240
tccaatcatg tcatggctgt cacaaagacc ttgcggaccg cacgtacgaa cacatacgta 300
tgctaatatg tgttttgata gtacccagtg atcgcagacc tgcaattttt ttgtaggttt 360
ggaagaatat ataaaggttg cactcattca agatagtttt tttcttgtgt gtctattcat 420
tttattattg tttgtttaaa tgttaaaaaa accaagaact tagtttcaaa ttaaattcat 480
cacacaaaca aacaaaacaa aa 502
<210> 15
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Met Gly Arg Val Lys Trp Arg Ser Ile Thr Thr Tyr Asn Tyr Ile Met
1 5 10 15
Thr Thr Gly Glu Ala Val Arg Lys Arg His Lys Gly Ser Ser Asn Gly
20 25 30
Ala Arg Ala Gly Val Lys Asn His Ala Lys Glu Pro Val Gln Trp Gly
35 40 45
Arg Ala Trp Glu Val Asp Trp Phe Ser Leu Thr Gly Val Ile Leu Leu
50 55 60
Leu Cys Phe Ala Pro Phe Ile Val Phe Phe Phe Ile Met Ala Cys Asp
65 70 75 80
Gln Tyr Gln Cys Ser Ile Thr His Pro Leu Leu Asp Leu Tyr Asn Gly
85 90 95
Asp Ala Thr Leu Leu Thr Ile Trp Asn Arg Ala Pro Ser Phe Thr Trp
100 105 110
Ala Ala Ala Lys Ile Tyr Ala Ile Trp Val Thr Phe Gln Val Val Leu
115 120 125
Tyr Met Cys Val Pro Asp Phe Met His Lys Ile Leu Pro Gly Tyr Val
130 135 140
Gly Gly Val Gln Glu Gly Ala Arg Thr Pro Ala Gly Leu Ile Asn Lys
145 150 155 160
Tyr Glu Val Asn Gly Leu Gln Cys Trp Ile Ile Thr His Val Leu Trp
165 170 175
Val Ala Asn Ala Gln Tyr Phe His Trp Phe Ser Pro Thr Ile Ile Ile
180 185 190
Asp Asn Trp Ile Pro Leu Leu Trp Cys Thr Asn Ile Leu Gly Tyr Ala
195 200 205
Val Ser Thr Phe Ala Phe Ile Lys Ala Tyr Leu Phe Pro Thr Asn Pro
210 215 220
Glu Asp Cys Lys Phe Thr Gly Asn Ile Phe Tyr Asn Tyr Met Met Gly
225 230 235 240
Ile Glu Phe Asn Pro Arg Ile Gly Lys Trp Phe Asp Phe Lys Leu Phe
245 250 255
Phe Asn Gly Arg Pro Gly Ile Val Ala Trp Thr Leu Ile Asn Leu Ser
260 265 270
Tyr Ala Ala Lys Gln Gln Glu Leu Tyr Gly His Val Thr Asn Ser Met
275 280 285
Ile Leu Val Asn Val Leu Gln Ala Ile Tyr Val Leu Asp Phe Phe Trp
290 295 300
Asn Glu Ala Trp Tyr Leu Lys Thr Ile Asp Ile Cys His Asp His Phe
305 310 315 320
Gly Trp Tyr Leu Gly Trp Gly Asp Cys Val Trp Leu Pro Phe Leu Tyr
325 330 335
Thr Leu Gln Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Asn Pro Val Gln Leu Ala Thr
340 345 350
Pro His Ala Thr Gly Val Leu Ile Leu Gly Leu Ala Gly Tyr Tyr Ile
355 360 365
Phe Arg Ser Gly Asn His Gln Lys Asp Leu Phe Arg Arg Thr Glu Gly
370 375 380
Asn Cys Lys Ile Trp Gly Lys Lys Pro Thr Phe Ile Glu Cys Ser Tyr
385 390 395 400
Arg Ser Ala Asp Gly Arg Ile His Lys Ser Lys Leu Met Thr Ser Gly
405 410 415
Phe Trp Gly Val Ala Arg His Met Asn Tyr Thr Gly Asp Leu Met Gly
420 425 430
Ser Leu Ala Tyr Cys Leu Ala Cys Gly Gly Glu His Leu Leu Pro Tyr
435 440 445
Phe Tyr Ile Val Tyr Met Thr Ile Leu Leu Val His Arg Cys Ile Arg
450 455 460
Asp Glu His Arg Cys Ser Asn Lys Tyr Gly Lys Asp Trp Glu Arg Tyr
465 470 475 480
Thr Ala Ala Val Pro Tyr Arg Leu Leu Pro Asn Ile Phe
485 490
<210> 16
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Met Ala Cys Asp Gln Tyr Gln Cys Ser Val Thr His Pro Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Tyr Asn Gly Asp Ala Thr Leu Leu Thr Ile Trp Asn Arg Ala Pro
20 25 30
Ser Phe Thr Trp Thr Ala Ala Lys Ile Tyr Ala Thr Trp Val Thr Phe
35 40 45
Gln Val Val Leu Tyr Met Phe Ile Pro Asp Ile Leu His Lys Ile Leu
50 55 60
Pro Gly Tyr Val Gly Gly Val Gln Asp Gly Ala Arg Thr Pro Ala Gly
65 70 75 80
Leu Ile Asn Lys Tyr Glu Ile Asn Gly Leu Gln Cys Trp Ile Ile Ser
85 90 95
His Val Leu Trp Val Ala Asn Ala Gln Tyr Phe His Trp Phe Ser Pro
100 105 110
Thr Ile Ile Ile Asp Asn Trp Ile Pro Leu Leu Trp Cys Thr Asn Ile
115 120 125
Leu Gly Tyr Phe Val Ser Thr Phe Val Phe Phe Lys Ala Tyr Leu Phe
130 135 140
Pro Thr Asn Pro Glu Asp Cys Lys Phe Thr Gly Asn Ile Phe Tyr Asn
145 150 155 160
Tyr Met Met Gly Ile Glu Phe Asn Pro Arg Ile Gly Lys Trp Phe Asp
165 170 175
Phe Lys Leu Phe Phe Asn Gly Arg Pro Gly Ile Val Ala Trp Thr Leu
180 185 190
Ile Asn Leu Ser Tyr Ala Ala Lys Gln Gln Glu Leu Tyr Gly Tyr Val
195 200 205
Thr Asn Ser Met Ile Leu Val Asn Val Leu Gln Val Ile Tyr Val Leu
210 215 220
Asp Phe Phe Trp Asn Glu Ala Trp Tyr Leu Lys Thr Ile Asp Ile Cys
225 230 235 240
His Asp His Phe Gly Trp Tyr Leu Gly Trp Gly Asp Cys Val Trp Leu
245 250 255
Pro Phe Leu Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Asn Pro Val
260 265 270
Gln Leu Ser Thr Pro His Ala Ala Gly Val Leu Ile Leu Gly Leu Leu
275 280 285
Gly Tyr Tyr Ile Phe Arg Ala Thr Asn His Gln Lys Asp Leu Phe Arg
290 295 300
Arg Thr Glu Gly Asn Cys Lys Ile Trp Gly Lys Lys Pro Thr Phe Ile
305 310 315 320
Glu Cys Ser Tyr Arg Ser Ser Asp Gly Gly Ile His Lys Ser Lys Leu
325 330 335
Met Thr Ser Ala Phe Trp Gly Met Ala Arg His Met Asn Tyr Thr Gly
340 345 350
Asp Leu Met Gly Ser Leu Ala Tyr Cys Met Ala Cys Gly Gly Ala His
355 360 365
Val Leu Pro Tyr Phe Tyr Ile Ile Tyr Met Thr Ile Leu Leu Val His
370 375 380
Arg Cys Ile Arg Asp Glu His Arg Cys Ser Ser Lys Tyr Ser Lys Asp
385 390 395 400
Trp Glu Arg Tyr Thr Ala Ala Val Pro Tyr Arg Leu Leu Pro Gly Ile
405 410 415
Phe
<210> 17
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Met Thr Thr Ala Asp Ala Val Arg Lys Arg His Lys Gly Ser Ser Ser
1 5 10 15
Gly Ala Arg Ala Gly Val Lys Asp Gln Ala Lys Glu Pro Val Gln Trp
20 25 30
Gly Arg Ala Trp Glu Val Asp Trp Phe Ser Leu Thr Gly Val Ile Leu
35 40 45
Leu Leu Cys Phe Ala Pro Phe Ile Val Phe Phe Phe Ile Met Ala Cys
50 55 60
Asp Gln Tyr Gln Cys Ser Ile Ser His Pro Leu Leu Asp Leu Tyr Asn
65 70 75 80
Gly Asp Thr Thr Leu Leu Thr Ile Trp Ser Arg Ala Pro Ser Phe Thr
85 90 95
Trp Ala Ala Ala Lys Ile Tyr Ala Val Trp Val Thr Phe Gln Val Val
100 105 110
Leu Tyr Met Cys Val Pro Asp Ile Met His Lys Ile Leu Pro Gly Tyr
115 120 125
Val Gly Gly Val Gln Asp Gly Ala Arg Thr Pro Ala Gly Leu Ile Asn
130 135 140
Lys Tyr Glu Val Asn Gly Leu Gln Cys Trp Ile Ile Thr His Val Leu
145 150 155 160
Trp Val Ala Asn Ala Gln Tyr Phe His Trp Phe Ser Pro Thr Ile Ile
165 170 175
Ile Asp Asn Trp Ile Pro Leu Leu Trp Cys Thr Asn Ile Leu Gly Tyr
180 185 190
Ala Val Ser Thr Phe Ala Phe Ile Lys Ala His Leu Phe Pro Thr Asn
195 200 205
Pro Glu Asp Cys Lys Phe Thr Gly Asn Ile Phe Tyr Asn Tyr Met Met
210 215 220
Gly Ile Glu Phe Asn Pro Arg Ile Gly Lys Trp Phe Asp Phe Lys Leu
225 230 235 240
Phe Phe Asn Gly Arg Pro Gly Ile Val Ala Trp Thr Leu Ile Asn Leu
245 250 255
Ser Tyr Ala Ala Lys Gln Gln Glu Leu Tyr Gly Tyr Val Thr Asn Ser
260 265 270
Met Ile Leu Val Asn Val Leu Gln Ala Ile Tyr Val Leu Asp Phe Phe
275 280 285
Trp Asn Glu Ala Trp Tyr Leu Lys Thr Ile Asp Ile Cys His Asp His
290 295 300
Phe Gly Trp Tyr Leu Gly Trp Gly Asp Cys Val Trp Leu Pro Phe Leu
305 310 315 320
Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Asn Pro Ile Gln Leu Ser
325 330 335
Thr Pro His Ala Ala Gly Val Leu Ile Leu Gly Leu Val Gly Tyr Tyr
340 345 350
Ile Phe Arg Ser Thr Asn His Gln Lys Asp Leu Phe Arg Arg Thr Glu
355 360 365
Gly Asn Cys Lys Ile Trp Gly Lys Lys Pro Thr Phe Ile Glu Cys Ser
370 375 380
Tyr Arg Ser Ala Asp Gly Gly Ile His Lys Ser Lys Leu Met Thr Ser
385 390 395 400
Gly Phe Trp Gly Val Ala Arg His Met Asn Tyr Thr Gly Asp Leu Met
405 410 415
Gly Ser Leu Ala Tyr Cys Leu Ala Cys Gly Gly Gly His Leu Leu Pro
420 425 430
Tyr Phe Tyr Ile Val Tyr Met Thr Ile Leu Leu Val His Arg Cys Ile
435 440 445
Arg Asp Glu His Arg Cys Ser Asn Lys Tyr Ser Lys Asp Trp Glu Arg
450 455 460
Tyr Thr Ala Ala Val Pro Tyr Arg Leu Leu Pro Asn Ile Phe
465 470 475
<210> 18
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Met Met Ala Ser Asp Arg Val Arg Lys Arg His Lys Gly Ser Ala Asn
1 5 10 15
Gly Ala Gln Thr Val Glu Lys Glu Pro Ser Lys Glu Pro Ala Gln Trp
20 25 30
Gly Arg Ala Trp Glu Val Asp Trp Phe Ser Leu Ser Gly Val Ile Leu
35 40 45
Leu Leu Cys Phe Ala Pro Phe Leu Val Ser Phe Phe Ile Met Ala Cys
50 55 60
Asp Gln Tyr Gln Cys Ser Ile Ser His Pro Leu Leu Asp Leu Tyr Asn
65 70 75 80
Gly Asp Ala Thr Leu Phe Thr Ile Trp Asn Arg Ala Pro Ser Phe Thr
85 90 95
Trp Ala Ala Ala Lys Ile Tyr Ala Ile Trp Val Thr Phe Gln Val Val
100 105 110
Leu Tyr Met Cys Val Pro Asp Phe Leu His Lys Ile Leu Pro Gly Tyr
115 120 125
Val Gly Gly Val Gln Asp Gly Ala Arg Thr Pro Ala Gly Leu Ile Asn
130 135 140
Lys Tyr Glu Val Asn Gly Leu Gln Cys Trp Leu Ile Thr His Val Leu
145 150 155 160
Trp Val Leu Asn Ala Gln His Phe His Trp Phe Ser Pro Thr Ile Ile
165 170 175
Ile Asp Asn Trp Ile Pro Leu Leu Trp Cys Thr Asn Ile Leu Gly Tyr
180 185 190
Ala Val Ser Thr Phe Ala Phe Ile Lys Ala Tyr Leu Phe Pro Thr Asn
195 200 205
Pro Glu Asp Cys Lys Phe Thr Gly Asn Met Phe Tyr Asn Tyr Met Met
210 215 220
Gly Ile Glu Phe Asn Pro Arg Ile Gly Lys Trp Phe Asp Phe Lys Leu
225 230 235 240
Phe Phe Asn Gly Arg Pro Gly Ile Val Ala Trp Thr Leu Ile Asn Leu
245 250 255
Ser Tyr Ala Ala Lys Gln Gln Glu Leu Tyr Gly Tyr Val Thr Asn Ser
260 265 270
Met Ile Leu Val Asn Val Leu Gln Ala Val Tyr Val Val Asp Phe Phe
275 280 285
Trp Asn Glu Ala Trp Tyr Leu Lys Thr Ile Asp Ile Cys His Asp His
290 295 300
Phe Gly Trp Tyr Leu Gly Trp Gly Asp Cys Val Trp Leu Pro Phe Leu
305 310 315 320
Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Asn Pro Ile Gln Leu Ser
325 330 335
Thr Pro His Ala Ala Gly Val Leu Ile Leu Gly Leu Val Gly Tyr Tyr
340 345 350
Ile Phe Arg Val Thr Asn His Gln Lys Asp Leu Phe Arg Arg Thr Glu
355 360 365
Gly Asn Cys Ser Ile Trp Gly Lys Lys Pro Thr Phe Ile Glu Cys Ser
370 375 380
Tyr Gln Ser Ala Asp Gly Ala Ile His Lys Ser Lys Leu Met Thr Ser
385 390 395 400
Gly Phe Trp Gly Val Ala Arg His Met Asn Tyr Thr Gly Asp Leu Met
405 410 415
Gly Ser Leu Ala Tyr Cys Leu Ala Cys Gly Gly Asn His Leu Leu Pro
420 425 430
Tyr Phe Tyr Ile Ile Tyr Met Thr Ile Leu Leu Val His Arg Cys Ile
435 440 445
Arg Asp Glu His Arg Cys Ser Asn Lys Tyr Gly Lys Asp Trp Glu Arg
450 455 460
Tyr Thr Ala Ala Val Ser Tyr Arg Leu Leu Pro Asn Ile Phe
465 470 475

Claims (10)

1.一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌敲除了C-22甾醇去饱和酶Erg5，并且表达来源于Pangasianodonhypophthalmus的7-脱氢胆固醇还原酶。
2.如权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述7-脱氢胆固醇还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
3.如权利要求1或2所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母BY4742为宿主细胞。
4.如权利要求3所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌还包括启动子，所述启动子为强化7-脱氢胆固醇还原酶的表达；所述启动子为PGK1p、GPM1p、TDH3p、TEF1p、TPI1p、GPD1p、TEF2p、ACT1p、GAL1p和TDH2p中的一种或多种。
5.权利要求1~4任一所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）表达盒的构建：将整合位点上游同源臂，酵母启动子，7-脱氢胆固醇还原酶基因，酵母终止子，整合位点下游同源臂构建得到7-脱氢胆固醇还原酶表达盒元件；将得到的7-脱氢胆固醇还原酶表达盒元件以及含有Cas9蛋白的敲除质粒通过酵母转化的方式导入到酵母细胞体内，通过酵母自身的同源重组完成元件的组装进而得到完整的表达盒；
（2）将上述表达盒***到酿酒酵母BY4742酵母染色体ChrXI上的1114a位点，并敲除C-22甾醇去饱和酶成功构建得到酿酒酵母工程菌。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酵母启动子为PGK1p、GPM1p、TDH3p、TEF1p、TPI1p、GPD1p、TEF2p、ACT1p、GAL1p和TDH2p中的一种或多种。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述酵母终止子为ADH1t。
8.一种生产菜油甾醇的方法，其特征在于，采用权利要求1~4任一所述的酿酒酵母工程菌制备菜油甾醇。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，将酿酒酵母工程菌接种至种子培养基中，制备得到种子液；将种子液转接至发酵培养基中，收集培养后的细胞，加入皂化反应液，反应结束后加入正己烷萃取，制备得到菜油甾醇。
10.权利要求1~4任一所述的酿酒酵母工程菌在制备菜油甾醇及含有菜油甾醇的产品中的应用。
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