CN111454871B - 一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用 - Google Patents

一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111454871B
CN111454871B CN202010140954.8A CN202010140954A CN111454871B CN 111454871 B CN111454871 B CN 111454871B CN 202010140954 A CN202010140954 A CN 202010140954A CN 111454871 B CN111454871 B CN 111454871B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
androstenedione
mycobacterium
chom2
smo2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010140954.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111454871A (zh
Inventor
齐崴
尤生萍
张伟
常红星
钱建武
苏荣欣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University filed Critical Tianjin University
Priority to CN202010140954.8A priority Critical patent/CN111454871B/zh
Publication of CN111454871A publication Critical patent/CN111454871A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111454871B publication Critical patent/CN111454871B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01239—3Alpha(17beta)-hydroxysteroid dehydrogenase (NAD+) (1.1.1.239), i.e. testosterone 17beta-dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03006—Cholesterol oxidase (1.1.3.6)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用，构建方法为：将胆固醇氧化酶基因ChoM2、携带有RBS片段的甾酮C27单加氧酶基因Smo2和携带有RBS片段的17β‑羟固醇脱氢酶基因Hsd4A导入新金分枝杆菌(Mycobacterium sp.)CICC 21097中，得到高产雄烯二酮的重组分枝杆菌MNCSH；本发明的方法获得的重组菌株发酵主要产物为4‑雄烯二酮，收率90％以上，选择性达90％以上，降低副产物生成，提高雄烯二酮产量。与原始菌株相比，重组菌具有更好的催化转化性能，可以提高生产效率。工艺方法简便，效率高。

Description

一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术和生物化工领域，具体涉及一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用。
背景技术
甾体激素类药物是指分子结构中含有甾体结构的激素类药物，是临床上一类重要的药物，主要包括肾上腺皮质激素和性激素两大类。甾体激素类药物因具有众多药理作用，如抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等，而被广泛用于治疗各种疾病，如风湿病、心血管疾病、癌症、皮肤病以及内分泌失调等。甾体激素类药物经过几十年的研究开发，目前已经形成种类繁多、临床应用广泛和需求旺盛的一大类甾体药物，成为仅次于抗生素的第二大药物。
雄甾-4-烯-3,17-二酮(英文名称：androst-4-ene-3,17-dione，简称：雄烯二酮或4-AD)，其外观形状为近白色晶体粉末，无异味，无毒性，不溶于水。雄烯二酮最初是从***或尿中提取出的具有雄性激素作用的一种甾类化合物，后经研究发现其对机体起着重要的调节作用。雄烯二酮现已成为制备甾体激素类药物不可替代的中间体，几乎所有的甾体激素类药物都可以4-AD为原料进行生产，可用于生产性激素、孕激素以及蛋白同化激素，又可用于制备氢化可的松、氧化***及***等100余种药物。
雄烯二酮的全球市场约为800亿美元并且以每年20％的速度增长。我国制药企业每年对雄烯二酮的需求量约为6000吨，然而我国雄烯二酮的年生产能力仅为1000吨左右，与市场需求有很大差距。
目前，我国雄烯二酮的生产主要存在两种途径，一是薯蓣皂苷元途径，二是微生物转化途径，市场上两种途径生产的雄烯二酮大致各占一半。然而，其中薯蓣皂苷元途径(从薯蓣(黄姜)中分离皂苷生产雄烯二酮)生产过程复杂，成本较高，污染严重，许多地方已禁止生产。微生物转化途径(利用微生物转化植物甾醇或胆固醇生产雄烯二酮)具有生产成本低、生产步骤简化等优势，越来越受到广大厂商的关注和重视。随着生物技术的进一步发展，全球市场上微生物转化法生产雄烯二酮的比例将会快速增长，并且市场前景非常诱人。
由于目前有些微生物制甾药工艺的相对落后以及高效菌株和生产线的引进需要巨额开支，使得大多数企业长期依赖既有的传统生产模式。近年来，随着某些企业开始大力引进优秀甾药转化微生物及发酵工艺，激素类药物的生产模式已大为改观。从1998年以来便开始采用微生物转化植物甾醇生产雄烯二酮的工艺，而攻克微生物发酵生产激素的技术一直是本领域科技人员多年的努力方向，甾药微生物转化技术的改进和发展还有很长的路要走。
目前，微生物转化植物甾醇生产雄烯二酮存在的主要问题有：菌株转化能力较差，甾药在转化工程中易被降解，并有副产物产生等，严重影响生产效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可减少副产物产生，提高植物甾醇制备雄烯二酮的转化效率的一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌的构建方法。
本发明的第二个目的是提供一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌。
本发明的第三个目的是提供一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌发酵生产雄烯二酮的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌，用下述方法构建：将胆固醇氧化酶基因ChoM2、携带有RBS片段的甾酮C27单加氧酶基因Smo2和携带有RBS片段的17β-羟固醇脱氢酶基因Hsd4A导入新金分枝杆菌(Mycobacterium sp.)CICC 21097中，得到高产雄烯二酮的重组分枝杆菌MNCSH；
所述胆固醇氧化酶基因ChoM2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述RBS片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述甾酮C27单加氧酶基因Smo2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述17β-羟固醇脱氢酶基因Hsd4A的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌的构建方法，包括如下步骤：将胆固醇氧化酶基因ChoM2和质粒pMV261通过酶切，连接，构建单基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2；将携带有RBS片段的甾酮C27单加氧酶基因Smo2和重组质粒pMV261-ChoM2通过酶切，连接，构建双基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2-Smo2；将携带有RBS片段的17β-羟固醇脱氢酶基因Hsd4A和双基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2-Smo2通过酶切，连接，构建三基因过表达重组质粒pMv261-ChoM2-Smo2-Hsd4A；
将三基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2-Smo2-Hsd4A导入新金分枝杆菌感受态细胞中，获得的阳性转化子即为一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌，命名为MNCSH；
所述的三基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2-Smo2-Hsd4A中三个基因ChoM2、携带有RBS片段的甾酮C27单加氧酶基因Smo2和携带有RBS片段的17β-羟固醇脱氢酶基因Hsd4A的构建先后顺序互换。
上述一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌发酵生产雄烯二酮的应用。
实验证明一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌转化植物甾醇的主要产物为4-雄烯二酮，收率90％以上，选择性达90％以上，与原始菌株相比，重组菌通过过表达胆固醇氧化酶、甾酮C27单加氧酶以及17β-羟固醇脱氢酶，加大产物代谢流量，从而降低副产物生成，提高雄烯二酮产量。与原始菌株相比，重组菌具有更好的催化转化性能，可以提高生产效率。工艺方法简便，效率高。
附图说明
图1重组质粒pMv261-ChoM2-Smo2-Hsd4A示意图；
图2高产雄烯二酮的重组菌株MNCSH的构建；
图3发酵转化168小时后，提取发酵液检测的液相色谱(HPLC)图，图3中(A)为原始菌株(B)为重组菌株；
图4原始菌株及重组菌株阳性转化子MNCSH转化生产4-AD动力学曲线；
具体实施方式
宿主细胞优选新金分枝杆菌(Mycobacterium sp.)，该菌株于中国工业微生物菌种保藏管理中心(简称CICC 21097)购买获得，编号CICC 21097；
2018年9月20日；http://www.china-cicc.org/
pMV261(市售)
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明并不限定本发明，对本发明内容所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1
一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)构建三基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2-Smo2-Hsd4A：
①合成目的基因，根据胆固醇氧化酶基因ChoM2(SEQ ID NO.1)、携带有RBS片段的甾酮C27单加氧酶基因Smo2(RBS片段连接在基因Smo2的5'端，RBS片段的序列如SEQ IDNO.2所示，基因Smo2的序列如SEQ ID NO.3所示)以及携带有RBS片段的17β-羟固醇脱氢酶Hsd4A(RBS片段连接在基因Hsd4A的5'端，基因Hsd4A序列如SEQ ID NO.4所示)的核苷酸序列，将酶切位点BamHⅠ/EcoRⅠ添加于基因ChoM2序列两端，将酶切位点EcoRⅠ添加于携带有RBS片段的基因Smo2两端，将酶切位点HindⅢ添加于携带有RBS片段的基因Hsd4A两端，将所设计的序列交由金唯智公司进行基因合成；
②PCR扩增步骤①获得的目的基因片段ChoM2、携带有RBS片段的Smo2及携带有RBS片段的Hsd4A基因；
③将步骤②获得的目的基因片段ChoM2及质粒pMV261分别用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切，纯化，连接获得单基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2；
将步骤②获得的携带有RBS片段的目的基因片段Smo2及单基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2分别用EcoRⅠ酶切，纯化，连接获得双基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2-Smo2；
将步骤②获得的携带有RBS片段的目的基因片段Hsd4A及双基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2-Smo2分别用HindⅢ酶切，纯化，连接获得三基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2-Smo2-Hsd4A，如图1所示。
表1通过PCR获得过表达基因所需引物
Figure BDA0002399070660000041
(2)构建一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌，命名为MNCSH：
①分枝杆菌(CICC21097)感受态细胞制备：
一级种子培养至OD600为1.0左右，按10％接种量转接到种子培养基中进行二级种子培养；24h后加入2％甘氨酸继续培养24h。离心收集菌体，分四次用10％预冷甘油冲洗悬浮菌体并离心，最后加入甘油悬浮菌体，并分装保存；
种子培养基组成：0.5g/L K2HPO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，0.05g/L柠檬酸铁铵，2.0g/L柠檬酸，3.5g/L磷酸氢二铵，20g/L甘油，其余为水，pH 7.5。
②电转化：10μL步骤(1)所得三基因过表达重组质粒加入100μL感受态菌体中放置10min，1.5kV条件下电转两次，每次5ms；
③重组子筛选与验证：电转产物加入种子培养基复苏培养2h后，涂布于含有50mg/L卡那霉素的种子培养基平板上，30℃静置培养7d，挑取单菌落至种子培养基培养，利用引物ChoM2-f及Hsd4A-r进行菌液PCR验证，菌液PCR出现3840bp大小的条带，菌液PCR验证正确的阳性转化子即为一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌，命名为MNCSH，如图2所示。
实施例2
一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌，命名为MNCSH(简称重组菌株)发酵制备雄烯二酮的方法
以1％(v/v)接种量将重组分枝杆菌MNCSH菌种接种到5ml种子培养基中，30℃振荡培养(200rpm)48h，之后以10％接种量转接于200mL发酵转化培养基中，37℃，200rpm，转化培养168h。
发酵转化培养基组成为0.5g/L K2HPO4，0.5g/L MgSO4·7H2O，0.05g/L柠檬酸铁铵，2.0g/L柠檬酸，3.5g/L磷酸氢二铵，20g/L植物甾醇，60g/L甲基化-β-环糊精，其余为水，pH 8.0。
每24h取1mL发酵液，并用2倍体积乙酸乙酯提取，用高效液相色谱检测雄烯二酮产量。如图4所示，不同发酵时间，原始菌株与重组菌株转化生成的雄烯二酮产量对比，发酵转化168小时，重组菌株比原始菌株(CICC 21097)雄烯二酮产量提高31.9％，雄烯二酮浓度达到11.1g/L。
发酵168小时后取重组菌株的发酵液，用2倍体积乙酸乙酯提取并用高效液相色谱检测产物含量，结果如图3中(B)所示。原始菌株发酵168小时后采用同样的工艺条件进行提取并检测产物，结果如图3中(A)所示。通过对比可知，重组菌株与原始菌株发酵转化的主要产物均为4-AD，并且重组菌株的4-AD产量远高于原始菌株；此外，重组菌株发酵液中副产物2(21-羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮)的含量远低于原始菌株，并且重组菌株的收率和选择性远高于原始菌株。与原始菌株相比，重组菌具有更佳的性能，采用重组菌进行转化可以提高生产效率。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1617
<212> DNA
<213> 新金色分枝杆菌(Mycobacterium sp.)
<400> 1
atgctgacaa gacggcggtt cctgggtgtc gcgctcggtg cggcggccgg tgccggcgcc 60
gtggtggcgt gccagcggac cgagtccggc gagcgaccgg ccgatcgcgc gtttcaccag 120
gccatcgtgg tcggcagcgg gtacggcggg ggcgtcagcg cgttgcgttt gggggaggcc 180
ggcgtcgaaa cgctgatcct ggagcgcggt cggctctggg acaccccgga cgaggacggt 240
aagcggttca gcaaaatgtt gcccgccgac acccgggcgg gttggttccg cgatgtgcca 300
ccgagcctgg tgccctcatt cggcggcata tcggtcaacg cggtcgctgc ccagaatcct 360
ggttcgcagc cggtccaggc gggcatctgc gacaagatca cctacggcgc ccacgaggtc 420
ttccgcggga tagcggtcgg tggtggctcg atggtgaacg ccgcgatcgc cgcgataccc 480
acgccggatc aggtgcgggc ggccttcccg gacatcgacc ccaacgagtt cctcggcacc 540
tatgtcgagc gggccaagac cacgctgaag atcagctatc gcgatatggg ctggttcgag 600
cagaccccct acttccaata tgcgcgggtg gggcgcagtt atgccgaggc ggcaggctac 660
ggagtggact acaacggaag cgcctactcg ttcgattaca tggtctcgga ggccgccggc 720
caggcgccga agtcggcact ggactgggaa tgccagtacg gcaacaacta cggacgcttc 780
ggcagtgtgg atcagaccta catcgccgcg gcgttggcca ccggcaaggt gacgttgcgt 840
ccgctgaccg aggtgaccgg catccgccgc gaatcctccg gggagtacgt ggtgtccatc 900
cgcgagatcg atcggtgggg caaagagttg tcgcgcaacg agatcggttg cgagcagctg 960
tatctggcgg ccggcgtggt cgggacggct gagctgctac tgcgcgcgcg tgagaacggc 1020
gatcttgccg acctgtccga cgaggtcggt gagggttatg gcaacaacgg ggacatcatg 1080
gtggcccaca acaccgccga gcaggatccg gtgggtaccc tgcagtcgct gctgggcatg 1140
atcaacctgg acggtcgcaa cgatccggac aacccggtgt acgccagcat gttctcgcta 1200
ccgctgccgc tggagaccca tgcgctgggc tactacgcca tggtccgcac cggcgaccgc 1260
gcggtgatca gctatgaccg cgcgtccgac gccatctcca tcgactggcc acagagcaac 1320
accgaccgcc tgatcgagcg ggccaagctg gtcttcgaca aggtgaccca ggccaacggg 1380
gtggactacc gcgatgacct gttcgagggg aaagccttcg cgcccaatac tgttcaccca 1440
ctgggtgggt gtgtgcgggg tgttgccacc gatgccttcg ggcgggtcaa cgggtacgag 1500
aacctctacg tcaacgacgc gtcgctcgtt ccggggtata tcggctgcaa cccgtacatg 1560
tcgatcaccg cgctggccga acgcaatatc gaggcgatca tctcaggccg gcgttag 1617
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagaaggaga tata 14
<210> 3
<211> 1236
<212> DNA
<213> 新金色分枝杆菌(Mycobacterium sp. )
<400> 3
atgacgacga tggatgcgtg tccgttcggt gcggggtacg acttcaccga ccccgaggtg 60
ctgctgcagg ggcttccggt cacggagttc gcccacctgc gcaagaccgc accgatctgg 120
tggaacgccc agggtgagtc gatcttcgat gacggcggct attgggtgat cagccggcac 180
gaagacgtca agaccatctc ccgcaactcc cgcgacatct ggtccaccaa tgccaaggga 240
gcggtcatgc ggctgcccga cggcatcacc gccgaccaac tcgacctgac caaggccctg 300
ctgatcaatc acgacgcccc ggagcacacc cggctgcgca agctggtctc gcgcctgttc 360
acgccgcgct cggtggccgc gctcgaggag aagctggcgg tggcggcacg cgagatcgtg 420
gcacgggccg ccgaacgcgg ctccggcaat ttcgtcgatg acgtggcgat gccgctgccg 480
ctacaggcca tcgccgacct gatcggggtg cccgaggcgg accgggagaa gatattccac 540
tggtcgaact gcatcatgaa caccgacgac cccgatttcg acagcgaccc gacgaccgcc 600
aacgcggagc tgatgggtta cgcctacaac atggccgaac aacgccggaa gtgcccggcc 660
gatgacatcg tcacccgcct ggtccaggcc gatctgggcg gagaagaggg catcaccgaa 720
gtggagttcg ccttcttcgt gatcctgctg gccgtggcag gcaatgagac cacccgcaat 780
gcgatgaccc acgggatgaa cgccttcctc gaaaacccgg atcaatggga acttttcaag 840
cgtgagcgcc ccgataccgc catcgaggag atcatccggt gggccagccc ggtgcactgc 900
ttccagcgca cggcgctcca ggacaccgag atcggcgggg tcaccatcaa gcaaggccag 960
cgggtcgggc tgttctacag ctcggcaaac tacgacgaat ccgtgttcac cgacccgttc 1020
cggttcgaca tcctgcgcaa cccgaatccg catctggcct tcggtggcaa cggcgcacat 1080
ttctgcatcg gcgccaacct ggcccgcatg gagatcaagc tgatgttcaa cgagatcgcc 1140
aaccagatcc cggacatctc caaactggct gaaccgcagc gccttcgatc cggctggatc 1200
aacggcgtga aggaactgca ggtttcctac tcctga 1236
<210> 4
<211> 912
<212> DNA
<213> 新金色分枝杆菌(Mycobacterium sp. )
<400> 4
atgaacgaca acccgatcga cctgtccgga aaggttgccg tcgtcaccgg cgcggccgcc 60
ggcctgggcc gggccgaggc gataggcctg gcgcgggccg gcgcgacggt cgtggtcaac 120
gacatggccg gcgcgctgga caactccgac gtgctggccg agatcgaagc ggtcgggtcc 180
aagggcgtcg cggtcgccgg tgatatcagc gcgcgcagca ccgccgacga actcgtcgag 240
acagccgacc ggctcggggg actgggcatc gtggtgaaca acgccggcat cacccgggac 300
aagatgctgt tcaacatgtc cgacgaggac tgggacgcgg tgatcgccgt gcatctgcgc 360
ggacacttcc tgttgacgcg caatgctgcg gcgtactgga aggcgaaggc caaggagacc 420
gccgacggac gggtgtacgg acggatcgtc aacacctcct cggaggccgg gatcgccgga 480
ccggtgggtc aagccaatta cggtgccgcc aaggccggta tcacggcgtt gacgctgtcg 540
gcggcgcgcg ggttgagcag gtacggggtg cgggccaatg ccatcgcacc gcgggcccgc 600
accgccatga ccgccggcgt gttcggtgat gcaccggagc tggcggacgg acaggtcgat 660
gccctctcgc cggagcatgt cgtcacgctc gtcacctacc tgtcctcccc ggcgtccgag 720
gatgtcaacg ggcagctgtt catcgtgtac ggaccgacgg tcaccctggt tgcggcgccg 780
gttgccgccc accggttcga tgccgccggt gatgcctggg accccgcggc gttgagcgac 840
acgctcggtg acttctttgc taaaagggat ccgaatattg ggttctccgc aactgagctc 900
atgggttctt ga 912
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggatccatgc tgacaagacg g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaattcctaa cgccggcctg a 21
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaattcaaga aggagatata atgacgacga tggat 35
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaattctcag gagtaggaaa cctgca 26
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aagcttaaga aggagatata atgaacgaca acccg 35
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aagctttcaa gaacccatga gctcag 26

Claims (3)

1.一种产雄烯二酮的重组分枝杆菌，其特征是用下述方法构建：将胆固醇氧化酶基因ChoM2、携带有RBS片段的甾酮C27单加氧酶基因Smo2和携带有RBS片段的17β-羟固醇脱氢酶基因Hsd4A导入新金分枝杆菌（Mycobacterium sp.） CICC 21097中，得到产雄烯二酮的重组分枝杆菌MNCSH；
所述胆固醇氧化酶基因ChoM2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述RBS片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述甾酮C27单加氧酶基因Smo2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述17β-羟固醇脱氢酶基因Hsd4A的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述产雄烯二酮的重组分枝杆菌的构建方法，包括如下步骤：将胆固醇氧化酶基因ChoM2和质粒pMV261通过酶切，连接，构建单基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2；将携带有RBS片段的甾酮C27单加氧酶基因Smo2和重组质粒pMV261-ChoM2通过酶切，连接，构建双基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2-Smo2；将携带有RBS片段的17β-羟固醇脱氢酶基因Hsd4A和双基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2-Smo2通过酶切，连接，构建三基因过表达重组质粒pMv261-ChoM2-Smo2-Hsd4A；
将三基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2-Smo2-Hsd4A导入新金分枝杆菌感受态细胞中，获得的阳性转化子即为一种产雄烯二酮的重组分枝杆菌，命名为MNCSH。
2.根据权利要求1所述一种产雄烯二酮的重组分枝杆菌，其特征是所述的三基因过表达重组质粒pMV261-ChoM2-Smo2-Hsd4A中三个基因ChoM2、携带有RBS片段的甾酮C27单加氧酶基因Smo2和携带有RBS片段的17β-羟固醇脱氢酶基因Hsd4A的构建先后顺序互换。
3.权利要求1或2所述重组分枝杆菌在发酵生产雄烯二酮中的应用。
CN202010140954.8A 2020-03-03 2020-03-03 一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用 Active CN111454871B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010140954.8A CN111454871B (zh) 2020-03-03 2020-03-03 一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010140954.8A CN111454871B (zh) 2020-03-03 2020-03-03 一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111454871A CN111454871A (zh) 2020-07-28
CN111454871B true CN111454871B (zh) 2022-06-14

Family

ID=71676948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010140954.8A Active CN111454871B (zh) 2020-03-03 2020-03-03 一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111454871B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114672427A (zh) * 2021-10-26 2022-06-28 郑州大学 一种产雄甾-1,4二烯-3,17-二酮的分枝杆菌及其应用
CN115029368B (zh) * 2022-06-24 2023-10-31 中国科学院上海高等研究院 一种产双降醇的基因工程菌及其用途

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1586645A2 (en) * 1999-02-25 2005-10-19 Ceres Incorporated Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
CN101918436A (zh) * 2007-11-16 2010-12-15 维莱尼姆公司 制造雄烯二酮的组合物和方法
CN102168098A (zh) * 2011-01-21 2011-08-31 华东理工大学 胆固醇氧化酶基因和工程菌及应用
CN106282080A (zh) * 2016-08-10 2017-01-04 江南大学 一种新金色分枝杆菌来源的甾酮c27‑单加氧酶及其应用
CN107034150A (zh) * 2017-04-13 2017-08-11 天津大学 一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法与应用
WO2017139420A1 (en) * 2016-02-09 2017-08-17 Kembiotix Llc Biological fermentation using dihydroxyacetone as a source of carbon
CN107779423A (zh) * 2017-10-25 2018-03-09 天津科技大学 辅因子再生分枝杆菌及其在油水双液相发酵中的应用
CN108913643A (zh) * 2018-08-01 2018-11-30 天津科技大学 一种提高分枝杆菌辅酶再生同时促进雄烯二酮生产的方法
CN112592904A (zh) * 2020-12-31 2021-04-02 江南大学 一种分枝杆菌的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其异源表达

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003240010B2 (en) * 2002-02-01 2008-06-05 N.V. Organon Process for fermentation of phytosterols to androstadienedione
WO2007118329A1 (en) * 2006-04-19 2007-10-25 The University Of British Columbia Methods and agents for treating tuberculosis
CN103382445B (zh) * 2013-05-16 2014-08-27 湖北共同生物科技有限公司 用于制备雄烯二酮的微生物菌株及其应用
CN107099498B (zh) * 2017-07-04 2020-09-18 天津大学 一种重组菌株及其应用和制备9-氟甾体激素前体的方法
CN110791468B (zh) * 2019-10-14 2021-11-23 江南大学 一种分枝杆菌基因工程菌的构建方法与应用
CN111484964A (zh) * 2020-03-14 2020-08-04 天津大学青岛海洋技术研究院 一种高产9-ohad的分枝杆菌及其构建的方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1586645A2 (en) * 1999-02-25 2005-10-19 Ceres Incorporated Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
CN101918436A (zh) * 2007-11-16 2010-12-15 维莱尼姆公司 制造雄烯二酮的组合物和方法
CN102168098A (zh) * 2011-01-21 2011-08-31 华东理工大学 胆固醇氧化酶基因和工程菌及应用
WO2017139420A1 (en) * 2016-02-09 2017-08-17 Kembiotix Llc Biological fermentation using dihydroxyacetone as a source of carbon
CN106282080A (zh) * 2016-08-10 2017-01-04 江南大学 一种新金色分枝杆菌来源的甾酮c27‑单加氧酶及其应用
CN107034150A (zh) * 2017-04-13 2017-08-11 天津大学 一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法与应用
CN107779423A (zh) * 2017-10-25 2018-03-09 天津科技大学 辅因子再生分枝杆菌及其在油水双液相发酵中的应用
CN108913643A (zh) * 2018-08-01 2018-11-30 天津科技大学 一种提高分枝杆菌辅酶再生同时促进雄烯二酮生产的方法
CN112592904A (zh) * 2020-12-31 2021-04-02 江南大学 一种分枝杆菌的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其异源表达

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A combined strategy of metabolic pathway regulation and two-step bioprocess for improved 4-androstene-3,17-dione production with an engineered Mycobacterium neoaurum;Hongxing Chang等;《Biochemical Engineering Journal》;20200908;第164卷;全文 *
Mycobacterium neoaurum ATCC 25795 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase (hsd4A) gene,complete cds;Xu,L.Q.等;《Genbank Database》;20160302;KP642512.1 *
Mycolicibacterium neoaurum strain HGMS2 chromosome, complete genome;Yang,F.等;《Genbank Database》;20180808;CP031414 REGION: 317954..319189，REGION: 5253555..5255170 *
The steroid catabolic pathway of the intracellular pathogen Rhodococcus equi is important for pathogenesis and a target for vaccine development;R van der Geize等;《PLoS Pathogens》;20110825;第7卷(第8期);全文 *
The Sterol Carrier Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin Enhances the Metabolism of Phytosterols by Mycobacterium neoaurum;Su Liqiu等;《Applied and environmental microbiology》;20200720;第85卷(第15期);全文 *
甾类化合物微生物转化与分解代谢机制研究进展;阳飞等;《微生物学通报》;20190418;第46卷(第10期);第2749-2752页第3.3.2-3.3.3小节以及图3 *
重组大肠杆菌表达17β-羟基类固醇脱氢酶全细胞催化合成宝丹酮的研究;吴玉玲等;《化工学报》;20200325(第07期);全文 *
雄烯二酮高产菌新金分枝杆菌MN4的全基因组测序及序列分析;徐玲霞等;《微生物学报》;20160219(第08期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111454871A (zh) 2020-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6592101B2 (ja) ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子、遺伝子操作された株、およびそれらの使用
CN111454871B (zh) 一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用
JP2017537656A5 (zh)
WO2023173565A1 (zh) 一种同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法
CN111484961B (zh) 一种产5α-雄烷二酮的基因工程菌及其应用
US10774355B2 (en) Genetically-engineered mycobacterium strain and a use thereof in the preparation of steroidal compounds
CN111484962B (zh) 一种高效产5α-雄烷二酮的基因工程菌及其应用
CN112812983B (zh) 一种生产菜油甾醇的酿酒酵母工程菌及构建方法
CN106119180B (zh) 一种分枝杆菌重组基因工程菌及其应用
CN112029701B (zh) 一种基因工程菌及其在制备22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮中的应用
CN113136348B (zh) 高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌及其构建和应用
CN114717173B (zh) 一种用于生产甾醇侧链不完全降解产物的基因工程菌株及其构建方法以及应用
CN107267419B (zh) 一种生产4-hp的菌株及高产量4-hp的制备方法
CN109971817B (zh) 简单节杆菌与基因工程酵母菌株顺序转化制备宝丹酮
CN115029368B (zh) 一种产双降醇的基因工程菌及其用途
CN117402763B (zh) 一种产角鲨烯的酿酒酵母工程菌株及其构建方法和应用
CN114395494B (zh) 一株塞伯林德纳氏酵母t52及其应用
CN116286930A (zh) 一种产甾药前体的基因工程菌及其用途
CN112813041B (zh) 一种分枝杆菌的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体和工程菌及其应用
CN118147027A (zh) 一种通过加强胞内atp代谢提高甾药前体生产的方法、菌株和应用
CN118256458A (zh) 11-氧-β-香树脂醇氧化酶CYP72A63突变体、基因及应用
CN116254215A (zh) 一种用于生产制备9-ohad的基因工程菌株、及其制备方法和应用
CN115786288A (zh) 甾体化合物14α羟化酶及其应用
CN117821347A (zh) 一种通过增强侧链降解能力提高甾醇转化的方法
CN115838679A (zh) 一种高产甾药前体的基因工程菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant