CN114703077B - 一种生产7-脱氢胆固醇的重组酵母工程菌株及应用 - Google Patents

一种生产7-脱氢胆固醇的重组酵母工程菌株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产7‑脱氢胆固醇的重组酵母工程菌株及应用，属于基因工程和生物工程技术领域。本发明敲除了酿酒酵母内源基因ERG5和ERG6，表达了Gallus gallus来源的δ(24)‑固醇还原酶，并通过调节内源相关途径的基因的表达，促进7‑脱氢胆固醇的合成，发酵72h的7‑脱氢胆固醇产量为440.92mg/L，发酵96h时7‑脱氢胆固醇产量为520.03mg/L，为后续的甾体类化合物生物合成奠定了基础，对于合成生物学的发展具有潜在的价值和意义。

Description

一种生产7-脱氢胆固醇的重组酵母工程菌株及应用
技术领域
本发明涉及一种生产7-脱氢胆固醇的重组酵母工程菌株及应用，属于基因工程及生物工程技术领域。
背景技术
7-脱氢胆固醇是一种广泛存在于动物体内的甾醇，经紫外照射后可直接转化为维生素D3。维生素D3广泛应用于生物医药、饲料养殖等领域，可用于佝偻病等骨骼疾病的预防与治疗，也可以提高机体免疫能力、降低心血管疾病等风险。7-脱氢胆固醇的C25位可经相关羟化酶转化为25-羟基-7-脱氢胆固醇，25-羟基-7-脱氢胆固醇在一定的紫外照射后生成25-羟基维生素D3，25-羟基维生素D3是维生素D3的活性形式，经常被用于患有严重肝病和肾病的人的治疗。目前，国内外25-羟基维生素D3和25-羟基-7-脱氢胆固醇的价格仍然昂贵，生产率低，因此，提高前体7-脱氢胆固醇的供应对后续25-羟基维生素D3和25-羟基-7-脱氢胆固醇等药物的生产具有重要意义。
7-脱氢胆固醇是动物体内维生素D3代谢路径的产物，7-脱氢胆固醇与酵母体内的麦角甾醇类似，可通过对酵母体内麦角甾醇路径的修饰来实现7-脱氢胆固醇在酵母体内的合成，因此，酵母是甾体类等药物生产的优良宿主。可通过敲除麦角甾醇合成途径中的ERG5和ERG6，并引入外源基因DHCR24可以实现在酿酒酵母中生产7-脱氢胆固醇。另外，传统化学方法制备7-脱氢胆固醇的价格昂贵，步骤繁琐，耗能高等特点，微生物代谢方法生产7-脱氢胆固醇污染小、效率高，能够降低生产成本。本研究通过采用敲除相关抑制基因、加强前体供应、引导前体向目标产物的转化、降低胞质中活性氧和扩张关键基因锚定的细胞器等策略，对于后续甾体类药物的开发具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一株高效合成7-脱氢胆固醇的酿酒酵母工程菌，是对酿酒酵母出发菌株，进行了如下至少一种改进：
(1)敲除或沉默酿酒酵母内源基因ERG5和ERG6；
(2)表达Gallus gallus来源的δ(24)-固醇还原酶；
(3)用启动子PTEF和/或PTDH1启动DHCR24基因的表达；
(4)敲除了酿酒酵母内源基因MOT3；
(5)敲除了酿酒酵母内源基因NEM1；
(6)强化7-脱氢胆固醇生物合成途径。
在一种实施方式中，所述强化7-脱氢胆固醇生物合成途径是过表达ERG2、ERG3、tHMG1、IDI、CTT1、DHCR24中至少一种基因。
在一种实施方式中，编码所述δ(24)-固醇还原酶的基因DHCR24的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述基因DHCR24整合在被敲除的位点ERG5和ERG6上。
在一种实施方式中，所述过表达ERG2、ERG3是将酿酒酵母内源基因ERG2、ERG3整合在被敲除的位点MOT3。
在一种实施方式中，所述基因ERG2、ERG3、DHCR24、CTT1还整合在酿酒酵母Ty2位点上。
在一种实施方式中，所述基因tHMG1、IDI整合在酿酒酵母Ty12位点上。
在一种实施方式中，用启动子PTEF和启动子PTDH1起始不同整合位点上DHCR24基因的表达，所述启动子PTEF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述启动子PTDH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在一种实施方式中，用启动子PPGK1和启动子PGAL7起始不同整合位点上ERG2基因的表达；所述启动子PPGK1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述启动子PGAL7的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
在一种实施方式中，用启动子PTDH3和启动子PGAL7起始不同整合位点上ERG3基因的表达；所述启动子PTDH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在一种实施方式中，启动子PGAL1/10为双向启动子；用PGAL10起始CTT1基因的表达；所述启动子PGAL10的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在一种实施方式中，用PGAL1起始tHMG1基因的表达；所述启动子PGAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
在一种实施方式中，用PGAL10起始IDI基因的表达。
在一种实施方式中，以酿酒酵母CENPK2-1D为出发菌株。
本发明还提供了所述酿酒酵母工程菌在生产7-脱氢胆固醇中的应用。
在一种实施方式中，将所述酿酒酵母工程菌接种于YPD培养基中，于30℃发酵72～100h。
在一种实施方式中，所述应用是用于制备含有7-脱氢胆固醇的药物。
有益效果：本发明以酿酒酵母CENPK2-1D为宿主，完成竞争路径基因ERG5、ERG6的敲除(如图1所示)，对Gallus gallus来源的δ(24)-固醇还原酶基因DHCR24进行了双拷贝整合，初步实现在酿酒酵母体内7-脱氢胆固醇的合成。在此基础上，敲除了非路径基因MOT3、NEM1进一步提高酿酒酵母体内7-脱氢胆固醇的积累，通过qPCR验证关键基因ERG2表达上调。通过增加限速步骤基因tHMG1、IDI、ERG2、ERG3、DHCR24与细胞质过氧化氢酶基因CTT1的多拷贝整合，进一步提高了7-脱氢胆固醇积累量，使构建的酿酒酵母工程菌在YPD培养基中摇瓶发酵72h时7-脱氢胆固醇产量为440.92mg/L，发酵96h时7-脱氢胆固醇产量达520.03mg/L，该产量为报道以来摇瓶水平的最高产量，为后续的甾体类化合物的生物合成奠定了基础。
附图说明
图1为酿酒酵母中异源合成7-脱氢胆固醇的代谢示意图。
图2为工程菌株在YPD培养下的7-脱氢胆固醇质谱图。
图3为7-脱氢胆固醇标准品的质谱图。
图4为工程菌株在YPD培养下的7-脱氢胆固醇产量图。
具体实施方式
(一)培养基
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。加入20g/L琼脂粉，以配制LB固体培养基。
YNB培养基：Yeast Nutrition Base 67.4g/L，葡萄糖20g/L，氨基酸(5g/L尿嘧啶，10g/L色氨酸，10g/L亮氨酸，10g/L组氨酸，根据需要适当缺失相应氨基酸)。
YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。
(二)酿酒酵母的感受态制备：酿酒酵母感受态制备使用Frozen-EZ YeastTransformation II化转试剂盒，30℃，与10mL YPD培养基培养酿酒酵母菌至中数量级(OD600＝0.8-1.0)。以下步骤室温进行。
1、3500rpm离心细胞5min，吸掉上清液；
2、加入10mL EZ1溶液清洗沉淀，重新离心沉淀细胞，吸掉上清液；
3、加入1mL EZ2溶液重悬沉淀细胞。
(三)酿酒酵母的转化：
1、取50μL感受态细胞与0.2-1μg DNA(体积少于5μl)混合；加入500μL EZ3溶液，完全混合；
2、30℃孵育45min，孵育过程中用手指轻弹或低俗涡旋2-3次让其混匀；
3、从转化混合液中取50-150μL到适当营养缺陷型平板上。
4、30℃平板孵育3-5天长出转化子。
(四)7-脱氢胆固醇测定：使用高效液相色谱进行测定。条件：色谱柱：InertSustain C18 250mm×4.6mm column(particle size 5μm)；流动相B，含有1‰三氟乙酸的甲醇；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测器波长：280nm。
(五)菌株信息如表1所示。
表1本发明中涉及的菌株
表2引物序列
实施例1产7-脱氢胆固醇重组酿酒酵母菌株的构建
选择酿酒酵母CENPK2-1D的ERG5、ERG6作为δ(24)-固醇还原酶基因DHCR24的整合位点，使用引物TEF1p-F/TEF1p-R扩增启动子PTEF1，引物TEF1t-F/TEF1t-R扩增终止子TTEF1，用引物DHCR24-F/DHCR24-R扩增SEQ ID NO.1所示的基因DHCR24，用引物ERG5/6-armup-F/ERG5/6-armup-R和ERG5/6-armdown-F/ERG5/6-armdown-R分别扩增出ERG5/6位点的上下游同源臂，利用融合PCR的方法将同源臂与DHCR24基因连接成一条片段名为DHCR24-1。利用引物4-1-ERG5-PAM-1-F/4-1-ERG5-PAM-1-R，4-2-ERG5-PAM-2-F/4-2-ERG5-PAM-2-R，4-3-ERG6-PAM-1-F/4-3-ERG6-PAM-1-R，4-4-ERG6-PAM-2-F/1-4-R，参照《CRISPR-Cas9***:应用于酿酒酵母的一步多靶点基因编辑技术》构建ERG5、ERG6基因敲除质粒4-1，其中，用于敲除ERG5的20nt为atttcatggaaaaagacctg和tcttagctaagacatctgga，用于敲除ERG6的20nt为cgtcgacatggaacatcttt和ccaggtcttcgctaacgagg；将质粒4-1与片段DHCR24-1一同转进酿酒酵母CENPK2-1D内，最后通过菌落PCR验证，获得正确的工程菌株命名为7-DHC-1。将工程菌7-DHC-1在YPD培养基中，30℃，220rpm条件下发酵72h，收集发酵液，检测发酵液中的7-脱氢胆固醇。结果显示，发酵液中可检测到7-脱氢胆固醇(图2～3)，如图4，酿酒酵母7-DHC-1发酵72h的7-DHC产量为106.7mg/L。
实施例2敲除7-脱氢胆固醇合成路径中的抑制基因
在实施例1构建的菌株7-DHC-1的基础上，敲除酿酒酵母内源基因MOT3，并在此位点整合酿酒酵母内源基因ERG2、ERG3的单拷贝表达框达到解除对ERG2等路径基因的表达限制的同时加强ERG2、ERG3的表达。使用引物PGK1p-F/PGK1p-R扩增启动子PPGK1，引物TDH3p-F/TDH3p-R扩增启动子PTDH3，引物TEF1t-F/TEF1t-R扩增终止子TTEF1，用引物ERG2-F/ERG2-R扩增出基因ERG2，用引物ERG3-F/ERG3-R扩增出基因ERG3，用引物MOT3-armup-F/MOT3-armup-R和MOT3-armdown-F/MOT3-armdown-R分别扩增出MOT3位点的上下游同源臂。PCR产物通过乙醇沉淀法回收，利用吉布森组装上述片段与载体pY26。引物MOT3-armup-F/MOT3-armdown-R从吉布森组装后获得的重组质粒上获取片段。敲除MOT3的20nt为cacaacaacctcaacaatgg，cctggttggaaaataaacac，cactgcgaatatgccaatac和cgacgttatggtgaactctg利用引物5-1-MOT3-PAM-1-R/5-2-MOT3-PAM-2-F/5-2-MOT3-PAM-2-R/5-3-MOT3-PAM-3-F/5-3-MOT3-PAM-3-R/5-4-MOT3-PAM-4-F/1-4-R构建MOT3基因敲除质粒MOT3-QC。约10μg的整合片段MOT3up-PPGK1-ERG2-TTEF1-ERG3-PTDH3-MOT3down与约500ng的敲除质粒MOT3-QC利用酿酒酵母高效转化法转化至酿酒酵母工程菌株7-DHC-1，涂布于筛选YNB固体培养基上，30℃培养3-5天，直至出现菌落，正确克隆命名为7-DHC-2。挑取单菌落转接于5mL YPD培养基中，17-24h后按1％接种量转接于25mL YPD培养基中，在发酵72h时7-DHC的产量为220.2mg/L。
实施例3：参与脂质代谢基因NEM1的敲除
在实施例2构建的菌株7-DHC-2的基础上敲除酿酒酵母内源基因NEM1，利用NEM1-armup-F/NEM1-armup-R和NEM1-armdown-F/NEM1-armdown-R分别扩增出NEM1位点的上下游同源臂。PCR产物通过乙醇沉淀法回收，利用融合PCR的方法将同源臂融合，获得基因敲除整合片段命名为片段NEM1-1。NEM1的20nt为cgacgttatggtgaactctg,cgacgttatggtgaactctg。利用引物7-3-NEM1-PAM-1-F/7-3-NEM1-PAM-1-R，7-4-NEM1-PAM-2-F/1-4-R获得基因敲除质粒7-3-3。将敲除质粒7-3-3与片段NEM1-1高效转化至实施例2构建的菌株7-DHC-2中，获得基因NEM1被敲除的菌株7-DHC-3，按照实施例2相同的方法进行摇瓶发酵，结果显示，发酵72h的7-脱氢胆固醇平均产量为275.05mg/L，此菌株命名为7-DHC-3。
表3引物序列
实施例4：过表达酿酒酵母内源基因tHMG1、IDI加强前体的供应
为促进前体角鲨烯的供给，过表达酿酒酵母内源基因tHMG1(核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示)、IDI(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，用引物tHMG1-F/tHMG1-R从酿酒酵母基因组上扩增出基因tHMG1，用引物IDI1-F/IDI1-R扩增基因IDI1。用引物GAL1/10p-F、GAL1/10p-R扩增双向启动子PGAL1/10。用引物Ty12-armup-F/Ty12-armdown-R从质粒Pct125(公开于公开号为CN113403334A的专利申请文件中)上获取整合片段。将约10μg的整合片段利用酿酒酵母高效转化法转化至实施例3构建的酿酒酵母工程菌株7-DHC-3，涂布于筛选YNB固体培养基上，30℃培养3-5天，直至出现菌落，验证正确的克隆命名为7-DHC-4。挑取单菌落转接于5mL YPD培养基中，17-24h后按1％接种量转接于25mL YPD培养基中，在发酵72h时7-DHC的产量为317.29mg/L。
表4引物序列
实施例5：加强后路径基因的表达
为促进前体向目标产物7-脱氢胆固醇的转化，过表达酿酒酵母内源基因ERG2(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)、ERG3(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)、CTT1(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)以及外源基因DHCR24(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)、，用引物GAL7p-F/GAL7p-R扩增启动子PGAL7。用引物ERG2-F/ERG2-R从酿酒酵母基因组上扩增出基因ERG2，用引物TEF1t-F/TEF1t-R扩增终止子TTEF1。用引物ERG3-F/ERG3-R从酿酒酵母基因组上扩增出基因ERG3，用引物GAL1/10p-F、GAL1/10p-R扩增双向启动子PGAL1/10。用引物CTT1-F/CTT1-R从酿酒酵母基因组上扩增出基因CTT1，用引物TER22t-F/TER22t-R扩增终止子TTER22，用引物DHCR24-F/DHCR24-R扩增外源基因DHCR24，用引物TDH1p-F/TDH1p-R扩增启动子PTDH1，PCR产物通过乙醇沉淀法回收，利用吉布森组装上述片段与载体Pct23(公开于公开号为CN113403334A的专利申请文件中)，转化进大肠杆菌，提取的质粒命名为Ty2-1。引物Ty2-armup-F/Ty2-armdown-R从构好的质粒Ty2-1上获取整合片段。约10μg的整合片段利用酿酒酵母高效转化法转化至实施例4构建的酿酒酵母工程菌株7-DHC-4，涂布于筛选YNB固体培养基上，30℃培养3-5天，直至出现菌落，验证正确的克隆命名为7-DHC-5。将菌株7-DHC-5挑取单菌落转接于5mL YPD培养基中，17-24h后按1％接种量转接于25mL YPD培养基中，发酵72h的7-脱氢胆固醇产量为440.92mg/L，如图4所示，发酵96h时7-脱氢胆固醇产量为520.03mg/L。
表5引物序列
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种生产7-脱氢胆固醇的重组酵母工程菌株及应用
<130> BAA220218A
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<213> 人工序列
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atgtctgctg tttggtcttt aggtgctggt ttattattat tgttgttgtg ggttagacat 60
agaggtttag aagctgtttt agttcatcat agatggattt ttgtttgttt ctttttaatg 120
ccattatcaa ttttatttga tgtttattat caattaagag cttgggcagt tagaagaatg 180
catagtgctc caagattaca tggtcaaaga gttagacata tacaagaaca agttagagaa 240
tggaaagaag aaggtggtag aagatatatg tgtactggta gacctggttg gttaacagtt 300
tctttgagag ttggtaaata taagaaaact cataagaata ttatgattaa cttaatggat 360
gttttagaag ttgattctga aagacaagtt gttagagttg aaccattagt tactatgggt 420
caattaactg cttatttgaa tccaatgggt tggacaattc cagttgttcc agaattagat 480
gatctaactg ttggtggttt aataatgggt actggtattg aatcttcctc tcatatctat 540
ggtttatttc aacatacatg tatggcttat gaattagttt tggcagatgg atcattagtt 600
agatgttccc ctacagaaaa ttccgatttg ttttacgcag ttccatggtc ttgcggtacc 660
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cattatgaac cagtaagagg attgagaagt atttgtgaaa agtttactga agaatctaaa 780
aataaggaaa atagttttgt tgaaggttta gtttatagtt tagaagaagc agttattatg 840
actggtgttt taactgatga agctgaacca tctaaaatta atagaattgg taattattat 900
aaaccatggt ttttcaaaca tgttgaaaaa tacttaaaag ctaacaaaac aggtattgaa 960
tatattccat ctagacatta ttatcataga catactagat ctattttctg ggaattacaa 1020
gatattattc catttggtaa taatccagtg tttagatatt tgtttggttg gatggttcct 1080
ccaaagattt cattgttaaa attaactcaa ggtgaagcta ttaggaaatt atatgaacaa 1140
catcatgtag ttcaagatat gttggttcca atgaaatctt tagaaaaatc tattcaaaca 1200
tttcatgttg atttgaatgt atatccttta tggttgtgtc ctttcttgtt acctaataat 1260
cctggaatgg ttcatcctaa aggagatgaa actgaattat atgttgatat aggtgcttat 1320
ggtgaaccaa aaacaaaaca atttgaagct agagcttcta tgagacaaat ggaaaaattt 1380
gttagatctg ttcatggttt tcaaatgtta tatgctgatt gttatatgac tagagaagaa 1440
ttctgggata tgtttgatgg ttctttatat catagtttaa gagaacaaat gaactgtaaa 1500
gatgcatttc ctgaagttta tgataaaatt tgtaaagcag caagacatta a 1551
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<212> DNA
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aactcggtga ttagcaaaca caacgcagca gaaggtttat ccactgaaga cctgttacag 180
gatgtcagag acgcacttgc ctctcattac ggggacgaat acatcaacaa gtacgtcaaa 240
gaagaatggg tcttcaacaa tgctggtggt gcgatgggcc aaatgatcat cctacacgct 300
tccgtatccg agtacttaat tctattcgga accgctgttg gtactgaagg gcacacaggt 360
gttcactttg ctgacgacta ttttaccatc ttacatggta cgcaaatcgc agcattgcca 420
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gcatcgctat tgcctcgttc cagcatcttg agagaattcc tctcactatg ggttattgtt 300
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caatatgggg aattgatcaa gaactgcatc aaagagggcc agattgtccc tcaagagatt 240
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ataaaaaaca cgctttttca gttcgagttt atcattatca atactgccat ttcaaagaat 60
acgtaaataa ttaatagtag tgattttcct aactttattt agtcaaaaaa ttagcctttt 120
aattctgctg taacccgtac atgcccaaaa tagggggcgg gttacacaga atatataaca 180
tcgtaggtgt ctgggtgaac agtttattcc tggcatccac taaatataat ggagcccgct 240
ttttaagctg gcatccagaa aaaaaaagaa tcccagcacc aaaatattgt tttcttcacc 300
aaccatcagt tcataggtcc attctcttag cgcaactaca gagaacaggg gcacaaacag 360
gcaaaaaacg ggcacaacct caatggagtg atgcaacctg cctggagtaa atgatgacac 420
aaggcaattg acccacgcat gtatctatct cattttctta caccttctat taccttctgc 480
tctctctgat ttggaaaaag ctgaaaaaaa aggttgaaac cagttccctg aaattattcc 540
cctacttgac taataagtat ataaagacgg taggtattga ttgtaattct gtaaatctat 600
ttcttaaact tcttaaattc tacttttata gttagtcttt tttttagttt taaaacacca 660
agaacttagt ttcgaataaa cacacataaa caaacaaa 698
<210> 12
<211> 668
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60
ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 120
tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 180
attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccta tggttgttaa 240
tttgattcgt taatttgaag gtttgtgggg ccaggttact gccaattttt cctcttcata 300
accataaaag ctagtattgt agaatcttta ttgttcggag cagtgcggcg cgaggcacat 360
ctgcgtttca ggaacgcgac cggtgaagac gaggacgcac ggaggagagt cttccgtcgg 420
agggctgtcg cccgctcggc ggcttctaat ccgtacttca atatagcaat gagcagttaa 480
gcgtattact gaaagttcca aagagaaggt ttttttaggc taagataatg gggctcttta 540
catttccaca acatataagt aagattagat atggatatgt atatggtggt aatgccatgt 600
aatatgatta ttaaacttct ttgcgtccat ccaaaaaaaa agtaagaatt tttgaaaatt 660
caatataa 668
<210> 13
<211> 668
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60
ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 120
tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 180
attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccta tggttgttaa 240
tttgattcgt taatttgaag gtttgtgggg ccaggttact gccaattttt cctcttcata 300
accataaaag ctagtattgt agaatcttta ttgttcggag cagtgcggcg cgaggcacat 360
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agggctgtcg cccgctcggc ggcttctaat ccgtacttca atatagcaat gagcagttaa 480
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catttccaca acatataagt aagattagat atggatatgt atatggtggt aatgccatgt 600
aatatgatta ttaaacttct ttgcgtccat ccaaaaaaaa agtaagaatt tttgaaaatt 660
caatataa 668

Claims (11)

1.一株合成7-脱氢胆固醇的酿酒酵母工程菌，其特征在于，对酿酒酵母出发菌株进行了如下改进：
（1）敲除或沉默酿酒酵母内源基因ERG5和ERG6；
（2）表达Gallus gallus来源的δ(24)-固醇还原酶；编码所述δ(24)-固醇还原酶的基因DHCR24的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（3）用启动子PTEF和/或PTDH1启动DHCR24基因的表达；所述启动子PTEF的核苷酸序列如SEQID NO.7所示；所述启动子PTDH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
（4）敲除了酿酒酵母内源基因MOT3；
（5）敲除了酿酒酵母内源基因NEM1；
（6）强化7-脱氢胆固醇生物合成途径；所述强化7-脱氢胆固醇生物合成途径是过表达ERG2、ERG3、tHMG1、IDI、CTT1、DHCR24中至少一种基因；基因ERG2的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，ERG3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，IDI的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CTT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，DHCR24的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述基因DHCR24整合在被敲除的位点ERG5和ERG6上。
3.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述过表达ERG2、ERG3是将酿酒酵母内源基因ERG2、ERG3整合在被敲除的位点MOT3，和/或将基因ERG2、ERG3整合在酿酒酵母Ty2位点上。
4.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述基因DHCR24、CTT1整合在酿酒酵母Ty2位点上；所述基因tHMG1、IDI整合在酿酒酵母Ty12位点上。
5.根据权利要求3所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述基因DHCR24、CTT1整合在酿酒酵母Ty2位点上；所述基因tHMG1、IDI整合在酿酒酵母Ty12位点上。
6.根据权利要求1，2，5任一所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，用启动子PTEF、PTDH1、PPGK1、PGAL7、PTDH3、PGAL10或PGAL1起始基因的表达；所述启动子PPGK1的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；所述启动子PGAL7的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述启动子PTDH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述启动子PGAL10的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述启动子PGAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
7.根据权利要求1，2，5任一所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，以酿酒酵母CENPK2-1D为出发菌株。
8.根据权利要求6所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，以酿酒酵母CENPK2-1D为出发菌株。
9.权利要求1~8任一所述的酿酒酵母工程菌在生产7-脱氢胆固醇中的应用。
10.一种产7-脱氢胆固醇的方法，其特征在于，将权利要求1~8任一所的述酿酒酵母工程菌在发酵培养基中，于28~30℃发酵72~100 h。
11.权利要求1~8任一所述的酿酒酵母工程菌或权利要求10所述的方法在食品、医药、化工领域生产含7-脱氢胆固醇的产品方面的应用。
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