CN114317470B

CN114317470B - 化合物oxalicine B生物合成基因簇和C-15羟基化酶OxaL以及应用

Info

Publication number: CN114317470B
Application number: CN202111627219.0A
Authority: CN
Inventors: 余利岩; 张涛; 张德武; 谷国威; 苏静
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2024-04-30
Anticipated expiration: 2041-12-28
Also published as: CN114317470A

Abstract

本发明公开了化合物oxalicine B生物合成基因簇和C‑15羟基化酶OxaL以及应用。本发明提供了序列3所示OxaL蛋白或其相关生物材料的应用：作为羟化酶的应用；(a2)在制备羟化酶中的应用。本发明还保护序列1所示15‑deoxyoxalicine B生物合成基因簇。本发明还保护所述15‑deoxyoxalicine B生物合成基因簇在合成化合物oxalicine B中的应用。本发明所提供的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解a‑吡喃酮类杂萜家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

Description

化合物oxalicine B生物合成基因簇和C-15羟基化酶OxaL以及应用

技术领域

本发明属于微生物基因资源、基因工程和生物酶开发领域，具体涉及抗艾滋病病毒(HIV-1)的化合物oxalicine B生物合成基因簇和C-15羟基化酶OxaL以及应用。

背景技术

Oxalicine B具有独特的化学结构，是由吡啶基-α-吡喃酮单元和二萜单元聚合而成的六环系骨架的新颖结构化合物，分子式为C₃₀H₃₃NO₇，分子量为519。

Oxalicine B属于含a-吡喃酮类杂萜化合物家族(含a-吡喃酮类杂萜化合物家族的结构示意图见图1)。随着该家族其他化合物的发现和鉴定，这一独特的化学结构吸引了许多有机化学家从事其化学合成研究。Oxalicines是真菌的次生代谢产物，主要分离自青霉属，此类化合物最早是由Ubillas于1989年首次从草酸青霉(Penicillium oxalicum)的菌丝体中提取到。至今为止，研究者已经陆续从青霉菌P.thiersii，P.decaturense和一株曲霉菌中分离得到了oxalicines类分子。oxalicines类化合物主要有抗虫活性，研究发现，化合物oxalicine B对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda具有很强的杀虫活性，该类化合物还有一定的细胞毒活性。同时，实验室前期研究发现oxalicine类化合物具有抗病毒活性，oxalicine B具有抗艾滋病病毒(HIV-1)活性，oxalicine A具有良好的抗甲型流感病毒(H1N1)活性。

2015年，Yaegashi,J等从青霉菌P.canescens ATCC 10419中鉴定到15-deoxyoxalicine B的生物合成基因簇(olc)，并利用生物信息学与基因敲除策略对15-deoxyoxalicine B生物合成途径进行了阐述和解析。15-deoxyoxalicine B的生物合成基因簇的生物合成途径如图2所示。杂萜分子15-deoxyoxalicine B生物合成中非萜部分(a-吡喃酮和烟酰胺元件)的来源和pyripyropene A相同，但在生成中间体化合物分子4-hydroxyl-6-(3-pyridinyl)-2H-pyran-2-one(HPPO)后发生显著差异。以牻牛儿基焦磷酸(GGPP)为供体，在UbiA类蛋白异戊烯基转移酶OlcH的作用下，将其与HPPO进行连接，GGPP由olcC基因编码的二萜合酶完成。继而，依赖黄素FAD的单加氧酶OlcE与二萜环化酶OlcD联合发挥作用形成关键的五元环中间体化合物分子predecaturin E，其中，OlcE参与长链二萜末端双键氧化形成三元氧环，萜环化酶OlcD将长链二萜环化。P450氧化酶OlcG参与15-deoxyoxalicine B分子右侧螺环形成，生成decaturin E中间体。此后，多个氧化还原酶参与的级联反应***包括P450氧化酶(OlcJ)和短链脱氢酶/还原酶(OlcF)的作用下，生成具有半缩醛结构的中间体化合物decaturin C。最后，在依赖Fe²⁺的a-KG双加氧酶(OlcK)、跨膜蛋白耐药泵(OlcL)和P450氧化酶(OlcB)的联合作用下，生成目标化合物分子15-deoxyoxalicine B。

发明内容

本发明的目的是提供化合物oxalicine B生物合成基因簇和C-15羟基化酶OxaL以及应用。

本发明提供了OxaL蛋白或OxaL蛋白相关生物材料的应用，为如下(a1)或(a2)：

(a1)OxaL蛋白或OxaL蛋白相关生物材料作为羟化酶的应用；

(a2)OxaL蛋白或OxaL蛋白相关生物材料在制备羟化酶中的应用；

所述OxaL蛋白为序列表的序列3所示的蛋白质；

所述OxaL蛋白相关生物材料为编码所述OxaL蛋白的基因、表达所述OxaL蛋白的表达盒、表达所述OxaL蛋白的表达载体或表达所述OxaL蛋白的重组微生物。

示例性的，所述羟化酶具有如下功能：将化合物3转换为化合物8。

示例性的，所述羟化酶具有如下功能：将化合物2转换为化合物9。

示例性的，所述羟化酶具有如下功能：将化合物4转换为化合物oxalicine B。

本发明还保护15-deoxyoxalicine B生物合成基因簇，其中具有如下13个基因：oxaM基因、oxaE基因、oxaD基因、oxaC基因、oxaF基因、oxaG基因、oxaL基因、oxaH基因、oxaA基因、oxaI基因、oxaJ基因、oxaK基因和oxaB基因；

所述oxaM基因(编码链)如序列表的序列1中第409-1287位所示；所述oxaE基因(模板链)具有四个外显子，依次对应于序列表的序列1第1819-1889位、第1966-2227位、第2280-2650位、第2717-3392位；所述oxaD基因(模板链)具有两个外显子，依次对应于序列表的序列1第3699-3900位、第3965-4476位；所述oxaC基因(编码链)具有四个外显子，依次对应于序列表的序列1第4847-4897位、第4956-5110位、第5165-5491位、第5551-6001位；所述oxaF基因(模板链)具有四个外显子，依次对应于序列表的序列1第6024-6250位、第6311-6397位、第6453-6891位、第6945-6971位；所述oxaG基因(编码链)具有五个外显子，依次对应于序列表的序列1第7344-7568位、第7620-7736位、第7800-7971位、第8033-8647位、第8706-9145位；所述oxaL基因(模板链)具有三个外显子，依次对应于序列表的序列1第9903-10063位、第10112-10563位、第10625-11535位；所述oxaH基因(编码链)具有两个外显子，依次对应于序列表的序列1第11801-11912位、第11971-12911位；所述oxaA基因(编码链)如序列表的序列1中第13529-20836位所示；所述oxaI基因(编码链)具有两个外显子，依次对应于序列表的序列1第21517-21729位、第21798-23435位；所述oxaJ基因(模板链)具有两个外显子，依次对应于序列表的序列1第23483-24757位、第24824-25174位；所述oxaK基因(模板链)如序列表的序列1中第25296-26171位所示；所述oxaB基因(编码链)，具有两个外显子，依次对应于序列表的序列1第26443-27567位、第27628-27975位。

所述15-deoxyoxalicine B生物合成基因簇具体如序列表的序列1所示。

本发明还保护所述15-deoxyoxalicine B生物合成基因簇在合成化合物oxalicine B中的应用。

所述应用中，合成化合物oxalicine B是在青霉中进行的。

所述应用中，合成化合物oxalicine B是在草酸青霉中进行的。

所述应用中，合成化合物oxalicine B是在P.oxalicum 114-2中进行的。

本发明还保护OxaL蛋白，如序列表的序列3所示。

本发明还保护编码所述OxaL蛋白的基因。

编码所述OxaL蛋白的基因具体可如序列表的序列2所示。

编码所述OxaL蛋白的基因(模板链)具有三个外显子，依次对应于序列表的序列1第9903-10063位、第10112-10563位、第10625-11535位。

本发明还保护表达所述OxaL蛋白的重组微生物。

所述重组微生物具体是将编码所述OxaL蛋白的基因导入宿主微生物得到的重组微生物。

所述宿主微生物可为酵母，具体可为酿酒酵母，更具体可为S.cerevisiae RC01。

编码所述OxaL蛋白的基因具体可以通过表达所述OxaL蛋白的表达载体导入所述宿主微生物。

所述表达所述OxaL蛋白的表达载体具体可为oxaL基因过表达载体。

所述表达所述OxaL蛋白的表达载体具体可为：将酵母表达质粒pXW06的NdeI和PmeI酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列2所示的DNA分子得到的重组质粒pXW06-oxaL。

本发明还保护所述OxaL蛋白在参与化合物oxalicine B的合成中的应用。

本发明还保护所述重组微生物的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)在将化合物3转换为化合物8中的应用；

(b2)在将化合物2转换为化合物9中的应用；

(b3)在将化合物4转换为化合物oxalicine B中的应用。

本发明还保护所述重组微生物的总蛋白。

所述总蛋白为微粒体形式的总蛋白。

所述总蛋白的制备方法依次包括如下步骤：

(1)培养所述重组微生物，然后离心收集菌体，用微粒体提取液重悬；

(2)进行细胞壁破碎；

(3)离心并收集含有总蛋白的上清液；

(4)离心收集沉淀，即为总蛋白。

步骤(1)中，培养所述重组微生物采用液体YPD培养基。

步骤(1)中，培养所述重组微生物的条件为：28℃、200rpm振荡培养2天。

步骤(2)中，通过加入玻璃珠并涡旋振荡进行细胞壁破碎。

步骤(3)中，所述离心的条件为：4℃、4000rpm离心5min。

步骤(4)中，所述离心的条件为：4℃、17000rpm离心50min。

微粒体提取液：含10g/L牛血清蛋白，2mMβ-巯基乙醇，余量为pH7.5的TES缓冲液。

本发明还保护所述总蛋白的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)在将化合物3转换为化合物8中的应用；

(b2)在将化合物2转换为化合物9中的应用；

(b3)在将化合物4转换为化合物oxalicine B中的应用。

化合物3如式Ⅰ所示。化合物8如式Ⅱ所示。

化合物2如式Ⅲ所示。化合物9如式Ⅳ所示。

化合物4如式Ⅴ所示。化合物oxalicine B如式Ⅵ所示。

本发明的发明人以草酸青霉来源的oxalicine B化合物为目标分子，结合基因组挖掘定位oxalicine B生物合成基因簇oxa。对比发现，oxa基因簇中的oxaL(编码P450氧化酶)和oxaM(编码NADPH依赖的P450氧化还原酶)是15-deoxyoxalicine B的生物合成基因簇olc中不存在的。结合生物信息学比对分析，推测OxaL可能负责oxalicine B化合物分子中C-15位羟基化反应。同时，采用分子遗传学、生物信息学、生物化学及天然产物化学相结合的方法研究其生物合成。通过对该家族天然产物的生物合成研究，从基因及酶催化两个层次进行探讨可以帮助人们理解自然界是如何合成如此众多结构复杂而且类似的化合物。在阐明了自然界的生物合成途径、理解自然界a-吡喃酮类杂萜化合物天然组合生物合成机理的基础上，人们可以利用组合生物合成的方法，生产很多自然界不存在的结构类似物，为新活性“非天然”产物的发现和药物开发提供分子和活性多样性。

本发明的贡献如下：提供了草酸青霉P.oxalicum 114-2中产生具有抗HIV-1活性的抗生素－oxalicine B的生物合成基因簇、对其中编码的OxaL蛋白进行了功能研究和应用。本发明首次报道了oxalicine B的生物合成基因簇oxa，并第一次对oxalicines类化合物分子中C-15羟基化反应酶－P450氧化酶OxaL的功能、酶催化机制做了阐明解析。本发明所提供的包含oxalicine B生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解a-吡喃酮类杂萜家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

附图说明

图1为含a-吡喃酮类杂萜化合物家族的结构示意图。

图2为15-deoxyoxalicine B的生物合成基因簇的生物合成途径示意图。

图3为15-deoxyoxalicine B生物合成基因簇与oxalicine B生物合成基因簇的元件示意图。

图4为实施例2和实施例3中PCR扩增产物的电泳图。

图5为实施例4的HPLC谱图。

图6为实施例5制备得到的各个化合物的结构式。

图7为实施例6的结果图。

图8为实施例7中推测的oxalicine B生物合成后期从decaturin C到目标化合物oxalicine B的可能的4种生物合成途径。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。酵母转化试剂盒(Frozen-EZ Yeast Transformation IIKit)：ZYMO公司；cat.no.T2001。Solution I、Solution II和Solution III均为酵母转化试剂盒的组件。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

草酸青霉(Penicillium oxalicum)114-2，又称为P.oxalicum 114-2，记载于如下文献：Production of a high-efficiency cellulase complex viaβ-glucosidaseengineering in Penicillium oxalicum；Guangshan Yao,Ruimei Wu,Qinbiao Kan,LiweiGao,Meng Liu,Piao Yang,Jian Du,Zhonghai Li，Yinbo Qu；Yao et al.BiotechnolBiofuels(2016)9:78。

酵母表达质粒pXW06(Yeast expression plasmid pXW06)记载于如下文献：Biosynthesis of Heptacyclic Duclauxins Requires Extensive Redox Modificationsof the Phenalenone Aromatic Polyketide；Shu-Shan，Gao，Tao，Zhang，Marc，Garcia-Borràs，Yiu-Sun，Hung，John，M；10.1021/jacs.8b03705；2018。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)RC01，又称为S.cerevisiae RC01，记载于如下文献：Genome Mining and Assembly-Line Biosynthesis of the UCS1025APyrrolizidinone Family of Fungal Alkaloids；Li Li,Man-Cheng Tang,Shoubin Tang,Shushan Gao,Sameh Soliman,Leibniz Hang,Wei Xu,Tao Ye,Kenji Watanabe,YiTang.J.Am.Chem.Soc.2018,140,6,2067–2071。

MEPA培养基(100ml)：malt extract 1.5g，黄豆饼粉0.2g，琼脂2g，余量为水。二氯甲烷-甲醇：由1体积份二氯甲烷和1体积份甲醇混合得到。

液体Trp-营养缺陷型培养基(100mL)：含Difco^TM酵母基础氮源(BD，239210)0.67g，Yeast synthetic Drop-out Medium supplements(Sigma，Y2001)0.14g，L-亮氨酸0.02g，尿嘧啶0.02g，葡萄糖0.8g，余量为水。固体Trp-营养缺陷型培养基与液体Trp-营养缺陷型培养基的区别仅在于加入了琼脂。

实施例1、从P.oxalicum114-2中发现oxalicine B生物合成基因簇

利用15-deoxyoxalicine B生物合成关键聚酮合酶(OlcA)编码基因，从P.oxalicum 114-2的基因组DNA中筛选获得一段contig区域。利用基因组和微生物次级代谢产物合成基因簇预测。通过antiSMASH和Softberry(http://www.softberry.com/)数据库在线工具进行分析。蛋白功能注释借助BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blastp/)在GenBank蛋白数据库中进行氨基酸序列的同源性搜索。用Clustalx程序进行氨基酸序列比对。从P.oxalicum 114-2中发现了oxalicine B生物合成基因簇。oxalicine B生物合成基因簇具有13个基因，如序列表的序列1所示(序列1中，部分基因为编码链，部分基因为模板链)。

15-deoxyoxalicine B生物合成基因簇与本发明获得的oxalicine B生物合成基因簇的元件示意图见图3。

oxalicine B生物合成基因簇中的13个基因为：oxaM基因、oxaE基因、oxaD基因、oxaC基因、oxaF基因、oxaG基因、oxaL基因、oxaH基因、oxaA基因、oxaI基因、oxaJ基因、oxaK基因、oxaB基因。

各个基因编码的蛋白见表1。

表1oxalicine B生物合成基因簇的基因及功能注释

oxaM基因，如序列表的序列1中第409-1287位核苷酸所示(编码链；无内含子)；oxaM基因编码NADPH-P450氧化还原酶。oxaE基因，如序列表的序列1中第1819-3392位核苷酸所示(模板链；具有内含子；外显子：1819-1889，1966-2227，2280-2650，2717-3392)；oxaE基因编码FAD依赖的单加氧酶。oxaD基因，如序列表的序列1中第3699-4476位核苷酸所示(模板链；具有内含子；外显子：3699-3900，3965-4476)；oxaD基因编码萜环化酶。oxaC基因，如序列表的序列1中第4847-6001位核苷酸所示(编码链；具有内含子；外显子：4847-4897，4956-5110，5165-5491，5551-6001)；oxaC基因编码二萜合酶。oxaF基因，如序列表的序列1中第6024-6971位核苷酸所示(模板链；具有内含子；外显子：6024-6250，6311-6397，6453-6891，6945-6971)；oxaF基因编码短链脱氢酶/还原酶。oxaG基因，如序列表的序列1中第7344-9145位核苷酸所示(编码链；具有内含子；外显子：7344-7568，7620-7736，7800-7971，8033-8647，8706-9145)；oxaG基因编码P450氧化酶。oxaL基因，如序列表的序列1中第9903-11535位核苷酸所示(模板链；具有内含子；外显子：9903-10063，10112-10563，10625-11535)；oxaL基因编码序列表的序列3所示的P450氧化酶。oxaH基因，如序列表的序列1中第11801-12911核苷酸所示(编码链；具有内含子；外显子：11801-11912，11971-12911)；oxaH基因编码异戊烯基转移酶。oxaA基因，如序列表的序列1中第13529-20836位核苷酸所示(编码链；无内含子)；oxaA基因编码聚酮合酶。oxaI基因，如序列表的序列1中第21517-23435核苷酸所示(编码链；具有内含子；外显子：21517-21729，21798-23435)；oxaI基因编码CoA连接酶。oxaJ基因，如序列表的序列1中第23483-25174位核苷酸所示(模板链；具有内含子；外显子：23483-24757，24824-25174)；oxaJ基因编码P450氧化酶。oxaK基因，如序列表的序列1中第25296-26171位核苷酸所示(模板链；无内含子)；oxaK基因编码Fe(Ⅱ)/a-KG依赖的双加氧酶。oxaB基因，如序列表的序列1中第26443-27975核苷酸所示(编码链；具有内含子；外显子：26443-27567,27628-27975)；oxaB基因编码P450氧化酶。

P.oxalicum114-2中oxalicine B的生物合成途径如下：①oxaA基因编码的聚酮合酶作用下，形成a-吡喃酮；②oxaI基因编码的CoA连接酶将尼克酰胺连接到a-吡喃酮，形成HPPO中间体化合物；③oxaC基因编码的二萜合酶负责从前体物质甲羟戊酸到长链二萜合成；④oxaH基因编码的异戊烯基转移酶负责将长链二萜转移到HPPO生物合成中间体；⑤oxaE基因编码的单加氧酶和oxaD基因编码的萜环化酶负责中间体长链二萜末端双键氧化形成三元氧环和二萜环化形成中间体predecaturin E；⑥oxaG基因、oxaJ基因和oxaF基因编码的三个氧化还原酶参与predecaturin E到decaturin C级联反应***，其中，P450氧化酶(OxaG)参与oxalicine B分子右侧螺环形成；⑦此后，在P450氧化酶(OxaL)、依赖Fe²⁺的a-KG双加氧酶(OxaK)和P450氧化酶(OxaB)的联合作用下，生成目标化合物分子oxalicine B，其中，OxaL负责C-15羟基化反应，OxaK负责C-23羟基基团引入，OxaB参与oxalicine B分子左侧螺环形成。oxaM编码的NADPH-P450氧化还原酶不参与oxalicineB分子生物合成途径中具体的骨架合成、连接或修饰反应，作为P450氧化酶的伴侣蛋白。

实施例2、制备oxaA基因敲除株

一、敲除载体的构建

oxaA基因敲除载体：是将酵母表达质粒pXW06的NdeI和PmeI酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列4所示的DNA分子得到的重组质粒pXW06-△oxaA。序列表的序列4所示的DNA分子中，第1-2200位核苷酸为oxaA基因上游同源臂oxaA-UP，第2201-3802位核苷酸为潮霉素抗性基因，第3803-5926位核苷酸为oxaA基因下游同源臂oxaA-DN。

二、原生质体转化

1、取P.oxalicum 114-2的孢子，用Osmotic buffer清洗，然后用10mL木霉裂解酶溶液悬浮，30℃、120rpm振荡培养4h。

Osmotic buffer(pH5.8)：含1.2M MgSO₄和20mM磷酸钠，余量为水。10mL木霉裂解酶溶液：由10mg木霉裂解酶和10mL Osmotic buffer组成。木霉裂解酶(1U/mg)：Sigma，L1412-5G。

2、完成步骤1后，收集包含原生质体的上层液体，加入等体积的STC缓冲液，3000rpm离心5min，收集沉淀(沉淀即为原生质体)。

STC缓冲液(pH7.0)：含1.0M山梨醇和0.1M Tris-HCl，余量为水。

3、将步骤2得到的沉淀悬浮于200-500μL STC缓冲液，然后加入50μL oxaA基因敲除载体，冰上静置20min，然后加入1.0mL 60％PEG₆₀₀₀缓冲液，然后涂布于筛选培养基平板上，28℃正置培养。

60％PEG₆₀₀₀缓冲液(pH7.5)：含5mM CaCl₂、50mM Tris-HCl和60g/100mL PEG₆₀₀₀，余量为水。

筛选培养基：含200μg/ml潮霉素B的PDA培养基。

4、将步骤3中可以正常生长的克隆一一转接至新的筛选培养基平板上，28℃正置培养。

完成步骤4后，筛选到130个可以正常生长的潮霉素抗性转化子。

三、筛选重组菌

从步骤二的4获得的潮霉素抗性转化子中随机挑取10个，将P.oxalicum 114-2作为野生株对照(WT)，分别进行分子鉴定。

1、提取基因组DNA。

2、以基因组DNA为模板，采用hph-for和hph-rev组成的引物对(靶序列位于潮霉素抗性基因)进行PCR扩增，然后将扩增产物进行测序。10个转化子均显示预期大小(515bp)的扩增产物，测序结果显示确实为目标扩增产物。

hph-for：TCGTTATGTTTATCGGCACT；hph-rev：TGTTGGCGACCTCGTATT。

3、以基因组DNA为模板，采用Check ALs for和Check hph rev组成的引物对进行PCR扩增。Check ALs for来源于左侧同源臂上游区域，Check hph rev来源于潮霉素抗性基因区域。oxaA基因敲除株能扩增出PCR片段(3065bp)，野生株无法实现扩增。

Check ALs for：GCAGATTTGATGCGAAGG；Check hph rev：GAACCCGCTCGTCTGGCTAAG。

4、以基因组DNA为模板，采用Check hph for和Check ARs rev组成的引物对进行PCR扩增。Check hph for来源于潮霉素抗性基因区域，Check ARs rev来源于右侧同源臂下游区域。oxaA基因敲除株能扩增出PCR片段(2524bp)，野生株无法实现扩增。

Check hph for：TGGCTGTGTAGAAGTACTCGC；Check ARs rev：TTCCTATCACGGGTCAGC。

5、以基因组DNA为模板，采用Check ALs for和Check ALs rev组成的引物对进行PCR扩增。野生株能扩增出PCR片段(2467bp)，oxaA基因敲除株无法实现扩增。

Check ALs rev：CTGTGGACTGGCATTGATA。

各个扩增产物的电泳图见图4的A。图4的A中，泳道1和泳道5均为采用Check ALsfor和Check hph rev组成的引物对进行PCR扩增的扩增产物，泳道2和泳道6均为采用Checkhph for和Check ARs rev组成的引物对进行PCR扩增的扩增产物，泳道3和泳道7均为采用Check ALs for和Check ALs rev组成的引物对进行PCR扩增的扩增产物。

实施例3、制备oxaL基因敲除株

一、敲除载体的构建

oxaL基因敲除载体：是将酵母表达质粒pXW06的NdeI和PmeI酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列5所示的DNA分子得到的重组质粒pXW06-△oxaL。序列表的序列5所示的DNA分子中，第1-2090位核苷酸为oxaL基因上游同源臂oxaL-UP，第2091-3692位核苷酸为潮霉素抗性基因，第3693-至5716位为oxaL基因下游同源臂oxaL-DN。

二、原生质体转化

用oxaL基因敲除载体代替oxaA基因敲除载体，其他同实施例2的步骤二。

完成步骤4后，筛选到120个可以正常生长的潮霉素抗性转化子。

三、筛选重组菌

1、提取基因组DNA。

hph-for：TCGTTATGTTTATCGGCACT；hph-rev：TGTTGGCGACCTCGTATT。

3、以基因组DNA为模板，采用Check LLs for和Check hph rev组成的引物对进行PCR扩增。Check LLs for来源于左侧同源臂上游区域，Check hph rev来源于潮霉素抗性基因区域。oxaL基因敲除株能扩增出PCR片段(2994bp)，野生株无法实现扩增。

Check LLs for：TCACGCTATACGAAACGA；Check hph rev：GAACCCGCTCGTCTGGCTAAG。

4、以基因组DNA为模板，采用Check hph for和Check LRs rev组成的引物对进行PCR扩增。Check hph for来源于潮霉素抗性基因区域，Check LRs rev来源于右侧同源臂下游基因区域。oxaL基因敲除株能扩增出PCR片段(2607bp)，野生株无法实现扩增。

Check hph for：TGGCTGTGTAGAAGTACTCGC；Check LRs rev：TGGGCTGATGCTGAAGAAA。

5、以基因组DNA为模板，采用Check LRs for和Check LRs rev组成的引物对进行PCR扩增。野生株能扩增出PCR片段(2532bp)，oxaL基因敲除株无法实现扩增。

Check LRs for：TGCGGTAGGATGACGACG。

结果见图4的B。图4的B中，泳道1和泳道5均为采用Check LLs for和Check hphrev组成的引物对进行PCR扩增的扩增产物，泳道2和泳道6均为采用Check hph for和CheckLRs rev组成的引物对进行PCR扩增的扩增产物，泳道3和泳道7均为采用Check LRs for和Check LRs rev组成的引物对进行PCR扩增的扩增产物。

实施例4、代谢谱HPLC分析

供试株：分别为P.oxalicum 114-2(WT)、实施例2制备的oxaA基因敲除株(△oxaA)或实施例3制备的oxaL基因敲除株(△oxaL)。

将供试株接种至MEPA培养基平板(平板直径为3cm)，28℃静置培养6天。然后将所有培养物(含培养基在内的整个培养体系)收集至15ml离心管中，加入5ml乙酸乙酯室温超声提取30min(超声波频率25KHz，超声波功率800W)。然后5000rpm离心10min，收集上清液，用溶剂蒸发工作站(GeneVac EZ-2)蒸干溶剂，然后加入500μL乙腈(色谱纯)以溶解残留物，然后13000rpm离心10min，收集上清液。

将上清液上样于安捷伦1290进行HPLC检测分析。

色谱仪：高效液相色谱仪(Agilent1290串联液相蒸发光散射检测器ELSD)；

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18,5μm,4.6×250mm；流速1mL/min。

洗脱过程：洗脱时间为30min；洗脱液由乙腈和水组成；初始时刻至终止时刻，洗脱液中乙腈所占的体积分数由5％线性上升至99％。

结果见图5。P.oxalicum 114-2可以产生目标化合物分子oxalicine B(对应峰标注为1)。oxaA基因敲除株不能产生oxalicine B，进一步证实了本发明实施例1发现的基因簇为oxalicine B生物合成基因簇。oxaL基因敲除株同样不能产生oxalicine B，同时积累中间体化合物分子(对应峰标注为2、3、和4；2即实施例5中的化合物2，3即实施例5中的化合物3，4即实施例5中的化合物4)。

实施例5、oxaL基因敲除株产生的中间体化合物的分离纯化和结构鉴定

一、化合物的制备和分离纯化

1、实施例3制备的oxaL基因敲除株(△oxaL)，收集孢子，用无菌水悬浮，得到孢子浓度为(1-2)×10⁶个/ml的孢子悬液；将300-400μl孢子悬液接种至MEPA培养基平板(直径为15cm)，28℃静置培养6天。设置至少150个重复处理。

2、将150个平板完成步骤1的所有培养物(含培养基在内的整个培养体系)混合，加入5L乙酸乙酯室温超声提取3h，收集有机相；剩余物加入5L乙酸乙酯室温超声提取3h，收集有机相；剩余物加入5L乙酸乙酯室温超声提取3h，收集有机相；将三次提取获得的有机相合并，40℃减压浓缩至恒重，得到12g浸膏。超声提取的超声参数：超声波频率25KHz，超声波功率800W。

3、将步骤2得到的浸膏溶于二氯甲烷-甲醇中，用20g正相硅胶(60-100目)拌匀，然后采用旋转蒸发仪浓缩至恒重，得到固体样品，将固体样品填充至样品柱，然后连接色谱柱，用色谱仪进行分离。

色谱柱为正相硅胶色谱柱，填充介质为柱层析硅胶(200-300目，330g)。

色谱仪为美国TELEDYNE ISCO公司Combiflash Rf200制备型色谱仪。

流动相A：二氯甲烷；流动相B：丙酮。流动相流速：30mL/min。检测波长：230nm。

洗脱过程：0-5min，流动相全部为流动相A；5-80min，流动相B占流动相的体积分数由0％线性上升至100％，相应的流动相A占流动相的体积分数由100％线性下降至0％；80-105min，流动相全部为流动相B。

整个洗脱过程持续收集过柱后的洗脱液，每150mL收集1瓶，共收集21瓶。第1-4瓶合并作为流份Fr.1,第5-9瓶合并作为流份Fr.2,第10-12瓶合并合并作为流份Fr.3,第13-14瓶合并作为流份Fr.4,第15-19瓶合并作为流份Fr.5,第20-21瓶合并作为流份Fr.6。

将各个流份分别采用旋转蒸发仪浓缩至恒重，得到干物质。

4、将步骤3中得到的流份Fr.2的干物质(79mg)溶于二氯甲烷-甲醇中，然后上样并通过凝胶柱层析分离。凝胶柱层析的柱子规格为30×1700mm(直径×长度)，填充介质为Sephadex LH-20(80g)。流动相为：二氯甲烷-甲醇。整个洗脱过程持续收集过柱后的洗脱液，第1-100mL收集1瓶(即流份Fr.2-1)，之后每20mL收集1瓶共收集10瓶(依次为流份Fr.2-2至Fr.2-11)。

将各个流份分别采用旋转蒸发仪浓缩至恒重，得到干物质。

5、将步骤4中得到的流份Fr.2-5的干物质(16mg)溶于0.5mL甲醇，然后采用色谱仪进行分离纯化。

色谱仪：汉邦NP7000。

色谱柱：SunFire C18，10mm*250mm，孔径5μm，Waters公司。

流动相：由45体积份乙腈和55体积份水组成。流动相流速：6mL/min。检测波长：230nm。

收集峰值对应的保留时间为12.1min的洗脱峰的过柱后洗脱液，采用旋转蒸发仪浓缩至恒重，得到2.3mg黄色固体状产物，即为化合物3。

6、将步骤3中得到的流份Fr.3的干物质(117.8mg)溶于二氯甲烷-甲醇中，然后上样并通过凝胶柱层析分离。凝胶柱层析的柱子规格为30×1700mm(直径×长度)，填充介质为Sephadex LH-20(80g)。流动相为：二氯甲烷-甲醇。整个洗脱过程持续收集过柱后的洗脱液，第1-100mL收集1瓶(即流份Fr.3-1)，之后每20mL收集1瓶共收集11瓶(依次为流份Fr.3-2至Fr.3-12)。

将各个流份分别采用旋转蒸发仪浓缩至恒重，得到干物质。

7、将步骤6中得到的流份Fr.3-5的干物质(20mg)溶于0.5mL甲醇，然后采用色谱仪进行分离纯化。

色谱仪：汉邦NP7000。

色谱柱：SunFire C18，10mm*250mm，孔径5μm，Waters公司。

收集峰值对应的保留时间为8.7min的洗脱峰的过柱后洗脱液，采用旋转蒸发仪浓缩至恒重，得到8.7mg黄色固体状产物，即为化合物4。

8、将步骤3中得到的流份Fr.5的干物质(115mg)溶于二氯甲烷-甲醇中，然后上样并通过凝胶柱层析分离。凝胶柱层析的柱子规格为30×1700mm(直径×长度)，填充介质为Sephadex LH-20(80g)。流动相为：二氯甲烷-甲醇。整个洗脱过程持续收集过柱后的洗脱液，第1-100mL收集1瓶(即流份Fr.5-1)，之后每20mL收集1瓶共收集14瓶(依次为流份Fr.5-2至Fr.5-15)。

将各个流份分别采用旋转蒸发仪浓缩至恒重，得到干物质。

9、将步骤8中得到的流份Fr.5-5的干物质(26.5mg)溶于0.7mL甲醇，然后采用色谱仪进行分离纯化。

色谱仪：汉邦NP7000。

色谱柱：SunFire C18，10mm*250mm，孔径5μm，Waters公司。

流动相：由40体积份乙腈和60体积份水组成。流动相流速：6mL/min。检测波长：230nm。

收集峰值对应的保留时间为7.0min的洗脱峰的过柱后洗脱液，采用旋转蒸发仪浓缩至恒重，得到13.9mg黄色固体状产物，即为化合物2。

10、将步骤3中得到的流份Fr.6的干物质(185.8mg)溶于二氯甲烷-甲醇中，然后上样并通过凝胶柱层析分离。凝胶柱层析的柱子规格为30×1700mm(直径×长度)，填充介质为Sephadex LH-20(80g)。流动相为：二氯甲烷-甲醇。整个洗脱过程持续收集过柱后的洗脱液，第1-100mL收集1瓶(即流份Fr.6-1)，之后每20mL收集1瓶共收集10瓶(依次为流份Fr.6-2至Fr.6-11)。

将各个流份分别采用旋转蒸发仪浓缩至恒重，得到干物质。

11、将步骤10中得到的流份Fr.6-6的干物质(15mg)溶于0.5mL甲醇，然后采用色谱仪进行分离纯化。

色谱仪：安捷伦1100。

色谱柱：YMC-C18，10mm*250mm，孔径5μm，日本YMC公司。

流动相：由35体积份乙腈和65体积份水组成。流动相流速：4mL/min。检测波长：230nm。

收集峰值对应的保留时间为17.4min的洗脱峰的过柱后洗脱液，采用旋转蒸发仪浓缩至恒重，得到1mg淡黄色固体状产物，即为化合物7。

12、将步骤3中得到的流份Fr.1的干物质(138.1mg)溶于二氯甲烷-甲醇中，然后上样并通过凝胶柱层析分离。凝胶柱层析的柱子规格为30×1700mm(直径×长度)，填充介质为Sephadex LH-20(80g)。流动相为：二氯甲烷-甲醇。整个洗脱过程持续收集过柱后的洗脱液，第1-100mL收集1瓶(即流份Fr.1-1)，之后每20mL收集1瓶共收集11瓶(依次为流份Fr.1-2至Fr.1-12)。

将各个流份分别采用旋转蒸发仪浓缩至恒重，得到干物质。

13、将步骤12中得到的流份Fr.1-3的干物质(0.8mg)溶于0.3mL甲醇，采用色谱仪进行分离纯化。

色谱仪：汉邦NP7000。

色谱柱：SunFire C18，10mm*250mm，孔径5μm，Waters公司。

流动相：由50体积份乙腈和50体积份水组成。流动相流速：6mL/min。检测波长：230nm。

收集峰值对应的保留时间为22.5min的洗脱峰的过柱后洗脱液，采用旋转蒸发仪浓缩至恒重，得到0.4mg黄色固体状产物，即为化合物6。

14、将步骤12中得到的流份Fr.1-5的干物质(22.8mg)溶于0.5mL甲醇，采用色谱仪进行分离纯化。

色谱仪：汉邦NP7000。

色谱柱：SunFire C18，10mm*250mm，孔径5μm，Waters公司。

收集峰值对应的保留时间为17.4min的洗脱峰的过柱后洗脱液，采用旋转蒸发仪浓缩至恒重，得到4.5mg产物，即为产物Fr.1-5-1。

15、将步骤14中得到的全部产物Fr.1-5-1溶于0.3mL甲醇，采用色谱仪进行分离纯化。

色谱仪：安捷伦1100。

色谱柱：YMC-C18，10mm*250mm，孔径5μm，日本YMC公司。

流动相A：水；流动相B：乙腈。流动相流速：4mL/min。检测波长：230nm。

洗脱程序：0-10min，流动相B占流动相的体积分数由70％线性上升至100％，相应的流动相A占流动相的体积分数由30％线性下降至0％。

收集峰值对应的保留时间为4.1min的洗脱峰的过柱后溶液，采用旋转蒸发仪浓缩至恒重，得0.9mg黄色固体状产物，即为化合物5。

二、化合物的鉴定

步骤一中分离得到1个oxalicine类化合物(化合物4)和5个decaturin类似物(化合物2、化合物3、化合物7、化合物5和化合物6)。通过核磁共振和质谱分析，鉴定出3种主要化合物为15-deoxyoxalicine B(化合物4)、decaturin C(化合物3)和decaturin A(化合物2)，它们都是化合物oxalicine B生物合成的中间体。通过核磁共振和质谱分析，确定了另外3个化合物，分别为decaturin H(化合物5)、decaturin I(化合物6)和decaturin F(化合物7)。decaturin I(化合物6)和decaturin F(化合物7)为新的decaturin衍生物。

各个化合物的鉴定数据如下：

化合物5的HRESIMS离子峰为M/Z 504.2369[M+H]+，对应于不饱和度为15的分子式C₃₀H₃₃NO₆。化合物5的¹H、¹³C和HSQC NMR数据显示存在4个甲基[δ_H 0.84(3H,s),δ_C17.1；δ_H1.04(3H,s),δ_C 26.1；δ_H 1.05(3H,s),δ_C 15.5；δ_H 1.64(3H,s),δ_C 18.0],一个烯次甲基[δ_H5.72(1H,d,J＝5.4Hz),δ_C 128.4],以及典型的吡啶-α-吡咯烷基团[δ_H 7.27(1H,s),δ_C94.1；δ_H 7.56(1H,br s),δ_C 124.1；δ_H 8.23(1H,d,J＝7.8Hz),δ_C 133.1；δ_H 8.71(1H,brs),δ_C 151.4；δ_H 9.10(1H,br s),δ_C 146.7；δ_C 169.8,159.6,159.5,127.3,and 101.3]。化合物5的¹H和¹³C NMR谱相似于decaturin C(化合物3)，明显的区别在于化合物3中的羰基信号(δ_C 173.5),而不是像化合物3中有一个含氧亚甲基信号[(δ_H 4.07(1H,dd,J＝9.0,3.0Hz),3.73(1H,d,J＝9.0Hz)；δ_C 66.3]。通过HMBC中C-29/H-19、H-23和H-25的相关性进一步证实了羰基的位置。通过对DEPT,¹H-¹H COSY,HSQC,HMBC谱的详细分析建立了化合物5的完整的赋值。通过分析¹H和¹³C NMR数据、NOESY相关性和ECD谱以及生物遗传学基础，化合物5的相对构型和绝对构型与化合物3相同。总之，化合物化合物5可能不是oxalicine B的前体，而明显其它途径的产物。

化合物6的HRESIMS离子峰为M/Z 518.2528[M+H]⁺，与C₃₁H₃₅NO₆的分子式一致，表明与化合物5相比，可能引入了一个甲基。化合物6的¹H和¹³C NMR数据类似于化合物5，除了甲氧基部分的存在(δ_H 3.30；δ_C 50.5)。从HMBC谱中H-34到C-27的相关证实了甲氧基的位置。根据核磁共振数据、NOESY实验和ECD光谱以及生物遗传学基础，化合物6的立体化学与化合物5类似。

化合物5和化合物6的¹H-NMR和¹³C-NMR数据见表3。

表3化合物5和化合物6的¹H-NMR和¹³C-NMR数据

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化合物2的波谱数据：(+)ESI-MS m/z 506.5[M+H]⁺；¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:9.09(1H,d,J＝2.4Hz),8.38(1H,dd,J＝4.8,1.8Hz),8.24(1H,ddd,J＝8.4,1.8,1.8Hz),7.55(1H,dd,J＝8.4,4.8Hz),7.35(1H,s),5.67(1H,d,J＝5.4Hz),3.98(1H,dd,J＝9.0,3.0Hz),3.73(1H,d,J＝9.0Hz),3.05(1H,d,J＝16.2Hz),2.84(1H,d,J＝16.2Hz),2.17(1H,dd,J＝12.6,5.4Hz),1.99(1H,m),1.95(1H,m),1.93(1H,m),1.84(1H,m),1.80(1H,m),1.69(1H,m),1.61(3H,s),1.54(1H,m),1.48(1H,m),1.46(1H,m),1.19(1H,m),0.93(3H,s),0.83(3H,s),0.81(3H,s)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ:170.1,159.6,159.5,151.4,146.7,133.0,131.0,128.2,127.2,124.0,101.2,99.7,97.5,94.1,72.9,66.4,46.3,40.0,38.9,37.7,29.1,28.5,27.7,24.7,24.5,22.6,21.1,20.0,18.4,15.3。

化合物3的波谱数据：(+)ESI-MS m/z 490.6[M+H]⁺；¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:9.09(1H,br s),8.70(1H,br s),8.25(1H,br d,J＝7.8Hz),7.56(1H,dd,J＝7.8,4.8Hz),7.30(1H,s),5.68(1H,br d,J＝5.4Hz),4.07(1H,dd,J＝9.0,2.4Hz),3.73(1H,d,J＝9.0Hz),3.04(1H,d,J＝16.2Hz),2.85(1H,d,J＝16.2Hz),2.10(1H,m),2.08(1H,m),1.99(1H,m),1.78(1H,m),1.67(1H,dd,J＝12.0,4.2Hz),1.64(1H,m),1.61(3H,s),1.55(1H,m),1.50(2H,m),1.25(1H,m),1.23(1H,m),1.12(1H,m),0.91(3H,s),0.88(3H,s),0.83(3H,s)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ:169.9,159.5,159.5,151.2,146.5,133.3,131.1,128.1,127.3,124.1,101.3,99.5,96.9,94.2,66.2,49.5,41.8,40.1,40.1,34.4,34.1,29.8,29.5(C-26),27.6,27.2,22.7,18.6,18.5,17.9,15.8。

化合物4的波谱数据：(+)ESI-MS m/z 504.5[M+H]⁺；¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:9.10(1H,br s),8.69(1H,d,J＝4.8Hz),8.27(1H,ddd,J＝8.4,2.4,1.8Hz),7.57(1H,dd,J＝8.4,4.8Hz),7.36(1H,s),5.71(1H,br d,J＝5.4Hz),5.09(1H,s),4.88(1H,s),4.48(1H,d,J＝12.6Hz),4.43(1H,d,J＝12.6Hz),3.07(1H,d,J＝16.2Hz),2.87(1H,d,J＝16.2Hz),2.61(1H,dd,J＝12.0,4.8Hz),2.42(1H,dd,J＝16.0,6.0,6.0Hz),2.33(1H,m),2.27(2H,m),2.17(1H,m),2.10(1H,m),1.94(1H,m),1.79(3H,s),1.65(3H,s),1.45(1H,m),1.41(1H,m),1.22(1H,m),0.85(1H,m)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ:173.5,170.1,159.5,159.4,151.1,150.5,146.4,133.3,130.7,127.8,127.3,124.1,114.3,101.2,99.9,94.2,75.0,66.9,43.6,41.6,40.1,29.6,27.9,27.6,25.7,24.8,23.5,21.6),18.1,15.2。

化合物7的波谱数据：(+)ESI-MS m/z 492.4[M+H]⁺；¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:9.08(1H,br s),8.68(1H,br s),8.24(1H,ddd,J＝8.4,1.8,1.8Hz),7.54(1H,dd,J＝8.4,4.8Hz),7.36(1H,s),5.65(1H,br s),3.79(1H,d,J＝12.0Hz),3.76(1H,d,J＝12.0Hz),3.04(1H,d,J＝16.2Hz),3.01(1H,dd,J＝11.4,4.8Hz),2.88(1H,d,J＝16.2Hz),2.65(1H,m),2.24(1H,ddd,J＝13.2,3.6,3.6Hz),2.05(1H,m),1.61(3H,s),1.60(1H,overlap),1.58(1H,m),1.55(1H,m),1.44(2H,m),1.42(1H,m),1.34(1H,m),1.02(3H,s),0.89(3H,s),0.78(1H,dd,J＝11.4,2.4Hz),0.71(3H,s),0.68(1H,dd,J＝13.2,3.6Hz)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ:170.0,159.6,159.5,151.4,146.7,133.1,130.3,129.4,127.2,123.9,101.1,100.6,94.3,77.1,59.3,54.7,48.1,40.5,40.5),38.4,32.7,32.1,29.0,27.9,27.5,24.6,18.1,17.2,16.5,16.4。

根据鉴定结果，各个化合物的结构式见图6。

实施例6、P450氧化酶OxaL的异源表达和功能鉴定

一、构建重组质粒

oxaL基因过表达载体：是将酵母表达质粒pXW06的NdeI和PmeI酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列2所示的DNA分子得到的重组质粒pXW06-oxaL。序列表的序列2所示的DNA分子编码序列表的序列3所示的OxaL蛋白。

二、P450氧化酶OxaL的异源表达和功能鉴定(Agilent1290串联液相蒸发光散射检测器ELSD检测分析)

1、将S.cerevisiae RC01用Solution I洗涤，然后用Solution II重悬，然后加入oxaL基因过表达载体，然后加入Solution III并涡悬混匀，然后30℃孵育1h(期间涡悬1～3次)，然后涂布Trp-营养缺陷型培养基平板上，30℃培养过夜。

2、收集平板上正常生长的克隆(酵母基因工程菌RC01-oxaL)，接种于100ml液体Trp-营养缺陷型培养基，30℃、150rpm振荡培养1天，即为种子液。

3、将2mL步骤2得到的种子液接种到20mL液体YPD培养基，28℃、200rpm振荡培养36h。

4、完成步骤3后，体系中加入0.1mg供试化合物，28℃、200rpm振荡培养1天。

供试化合物分别为：实施例5制备的化合物2、化合物3、化合物4或化合物7。

设置不加入供试化合物的对照。

5、完成步骤4后，收集所有培养物(含培养基在内的整个培养体系)，加入等体积乙酸乙酯室温超声提取1小时，收集有机相；剩余物加入等体积乙酸乙酯室温超声提取1小时，收集有机相；将两次提取获得的有机相合并，采用旋转蒸发仪浓缩至恒重，即为萃取物。超声提取的超声参数：超声波频率25KHz，超声波功率800W。

6、取步骤5的萃取物，加入500μL乙腈(色谱纯)以溶解，然后13000rpm离心10min，收集上清液；将上清液上样于安捷伦1290进行HPLC检测分析。

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18,5μm,4.6×250mm；流速1mL/min。

结果见图7的A。图7的A中：ⅰOxaL+3表示以上方法中加入化合物3的结果，ⅳOxaL+4表示以上方法中加入化合物4的结果，ⅴOxaL+2表示以上方法中加入化合物2的结果，ⅵOxaL+7表示以上方法中加入化合物7的结果，ⅱ8表示化合物8(标准品)，ⅲ表示化合物3(标准品)，ⅶOxaL表示以上方法中不加入化合物的对照的结果。结果表明，化合物3经过酵母基因工程菌RC01-oxaL生物转化可以完全生成化合物8；对比化合物3，化合物8在C-15位发生羟基化，表明OxaL蛋白为羟基化酶。从图7的A来看，化合物2、化合物4和化合物7未见明显转化。

三、P450氧化酶OxaL的异源表达和功能鉴定(UPLC-MS鉴定分析)

步骤1至5同步骤二的1至5。

6、将步骤5的产物溶于200μl乙腈，然后进行UPLC-MS鉴定分析。

仪器：超高效液相质谱检测仪(Waters ACQUITY UPLC-Class-MS串联Xevo-G2-SQ-TOF)。

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC-BEH-C18,1.7μm,2.1×100mm；

流动相A：含0.02％(体积比)甲酸的乙腈；流动相B：0.02％(体积比)甲酸水溶液。

流动相流速：0.5mL/min。

流动相：0-5min，流动相A占流动相的体积分数由10％线性上升至20％，相应的流动相B占流动相的体积分数由90％线性下降至80％；5-7min，流动相A占流动相的体积分数为20％，相应的流动相B占流动相的体积分数为80％；7-25min，流动相A占流动相的体积分数由20％线性上升至100％，相应的流动相B占流动相的体积分数由80％线性下降至0％。

ESI正负离子检测模式。

结果见图7的B。图7的B中：ⅰ表示以上方法中加入化合物3的结果，ⅴ表示以上方法中加入化合物2的结果，ⅳ表示以上方法中加入化合物4的结果。结果表明：化合物3经过酵母基因工程菌RC01-oxaL生物转化可以完全生成化合物8(m/z 504.2380[M-H]^-)，同时对比保留时间和紫外吸收光谱(λmax 205,235,335nm)，OxaL催化化合物3生成的产物与标准品化合物8相同，进一步证实OxaL为羟基化酶；化合物2经过酵母基因工程菌RC01-oxaL生物转化可以部分生成化合物9(m/z 564.2224[M+HCOOH-H]^-)；化合物4经过酵母基因工程菌RC01-oxaL生物转化可以部分生成化合物1(化合物1即oxalicine B)(m/z 566.2399[M+HCOOH-H]^-)；酵母基因工程菌RC01-oxaL不能对化合物7进行生物转化。

化合物8的波谱数据：(+)ESI-MS m/z 506.6[M+H]⁺；¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:9.13(1H,br s),8.74(1H,br s),8.27(1H,d,J＝7.8Hz),7.59(1H,dd,J＝8.4,4.8Hz),7.32(1H,s),5.74(1H,d,J＝5.4Hz),5.17(1H,s),4.08(1H,d,J＝8.4Hz),3.73(1H,overlap),2.60(1H,m),2.08(1H,m),2.04(1H,m),1.99(1H,m),1.86(1H,m),1.66(1H,m),1.63(1H,m),1.50(1H,m),1.42(1H,m),1.46(3H,s),1.15(1H,m),1.11(3H,s),0.92(3H,s),0.85(3H,s)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ:170.1,160.6,158.9,151.4,146.7,133.5,130.6,130.3,127.2,124.2,105.6,99.6,96.9,94.4,73.0,66.4,49.5,43.6,40.1,39.8,39.3,34.7,34.5,29.9,29.4,27.2,23.0,18.9,18.6,15.7。

化合物9的波谱数据：(+)ESI-MS m/z 522.4[M+H]⁺；¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:9.11(1H,d,J＝4.8Hz),8.70(1H,dd,J＝4.8,1.8Hz),8.27(1H,ddd,J＝8.4,2.4,1.8Hz),7.57(1H,dd,J＝8.4,4.8Hz),7.34(1H,s),5.72(1H,dd,J＝4.2,1.8Hz),5.16(1H,s),4.00(1H,dd,J＝9.0,2.4Hz),3.73(1H,d,J＝9.0Hz),2.25(1H,dt,J＝13.2,3.6Hz),2.14(1H,t,J＝9.0Hz),2.03(1H,m),1.98(1H,m),1.92(1H,m),1.91(1H,m),1.68(1H,m),1.53(1H,m),1.48(1H,m),1.47(3H,s),1.37(1H,dt,J＝14.4,3.6Hz),1.07(3H,s),0.93(3H,s),0.84(3H,s)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ:170.3,160.6,158.9,151.5,146.8,133.3,130.4,130.4,127.2,124.1,105.5,99.9,97.5,94.3,73.0,72.5,66.5,46.0,40.0,39.8,39.3,29.2,28.6,24.8,24.1,22.9,21.1,20.1,19.0,15.6。

化合物1(化合物1即oxalicine B)的波谱数据：(+)ESI-MS m/z 520.4[M+H]⁺；¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ:9.03(1H,br s),8.71(1H,d,J＝4.8Hz),8.13(1H,ddd,J＝7.8,1.8,1.8Hz),7.42(1H,dd,J＝8.4,4.8Hz),6.70(1H,s),5.82(1H,br d,J＝5.4Hz),5.52(1H,s),5.20(1H,s),5.08(1H,s),4.51(1H,d,J＝12.6Hz),4.41(1H,d,J＝12.6Hz),2.65(1H,dd,J＝12.6,4.8Hz),2.53(1H,ddd,J＝14.4,14.4,4.8Hz),2.45(1H,m),2.43(1H,m),2.33(1H,m),2.33(1H,m),2.26(1H,ddd,J＝13.2,13.2,3.6Hz),2.16(1H,ddd,J＝18.0,5.4,5.4Hz),1.90(3H,s),1.61(1H,m),1.61(3H,s),1.45(1H,ddd,J＝14.4,3.6,3.6Hz),1.30(1H,m),1.20(1H,s)；¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃)δ:173.4,170.4,161.9,160.1,152.0,150.7,147.2,133.4,130.7,129.9,127.3,123.7,115.1,105.6,101.1,93.9,76.3,74.4,67.8,44.6,43.6,41.1,29.9,29.3,26.0,24.5,24.5,21.7,19.4,15.9。

四、UPLC-MS鉴定OxaL微粒体体外生化

3、将2mL步骤2得到的种子液接种到20mL液体YPD培养基，28℃、200rpm振荡培养2天。

4、完成步骤3后，4℃离心收集菌体，用2mL微粒体提取液重悬。

5、取2mL的Eppendorf离心管，加入1ml步骤4的重悬液，再加入2/3高度的玻璃珠(Sigma，G9268，425μm-600μm)，涡旋震荡(1min/次，共6次，每次震荡完置冰上冷却)以破碎细胞壁。

6、完成步骤5后，取750μl悬液，4℃、4000rpm离心5min，收集上清。

7、取步骤6得到的上清，4℃、17000rpm离心50min，弃上清，收集沉淀。

8、向步骤7获得的沉淀中加入适量TEG缓冲液，轻轻搅匀，分装于1.5ml Eppendorf离心管，100μl/管。

TEG缓冲液(pH7.5)：含50mM Tris-HCl、1mM EDTA、30％甘油，余量为水。

9、制备反应体系并进行反应。

反应体系：50μl步骤8得到的溶液，1μl供试化合物母液，49μl 50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)。

反应条件：30℃静置反应12小时。

将供试化合物溶于DMSO，得到化合物浓度为50mg/ml的供试化合物母液。

10、完成步骤9后，向体系中加入50μl甲醇，涡旋震荡1min，然后13000rpm离心10min，取30μl上清液进行UPLC-MS鉴定分析。

UPLC-MS鉴定分析的参数同步骤三的6。

结果见图7的C。结果与步骤三的结果一致。

结果表明：化合物3经过oxaL催化能生成化合物8(m/z 504.2392[M-H]^-)；化合物2经过oxaL催化能部分生成化合物9(m/z 564.2217[M+HCOOH-H]^-)；化合物4经过oxaL催化能部分生成化合物1(m/z 520.2348[M-H]^-)。OxaL不能催化化合物7生成其他化合物。

实施例7、Oxalicine B生物合成后期途径解析

结合基因敲除株ΔoxaL等中间体化合物的分离鉴定，通过对P450氧化酶OxaL、依赖Fe²⁺的a-KG双加氧酶OxaK和P450氧化酶OxaB酶功能的解析，推测了oxalicine B生物合成后期从decaturin C到目标化合物oxalicine B的可能的4种生物合成途径，但以第1种途径为主，如图8所示。OxaL负责C-15羟基化反应，OxaK负责C-23羟基基团引入，OxaB参与oxalicine B分子左侧螺环形成。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所

<120> 化合物oxalicine B生物合成基因簇和C-15羟基化酶OxaL以及应用

<130> GNCYX213577

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28137

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 1

cagggagatc acgaggaaga cacaggaaaa caaaagttgc gtgaatagac ccacaagcat 60

gatattttgt ccgacgtccg ccatcgatgc ttgggttatc atgccgccac cgccggcttg 120

gagaaggatg gcaataacgt caccgcatac aaagacttta gtcactcgag ccgaaggaat 180

catgcttgtc ttaggcgtgc tgacgaagag cgcaatacat ccgtacatca tatcatagag 240

agttgcagcg taaaggtggg tggggggggg gggggggtgg gcaggacgac gagcagagat 300

tcaatgcatg atgtatgggc ctaggtcgaa aggtgacttg gcggaaaaga tctcgcaatg 360

taaccggtgg tcatccctac ctaagaacag ggattatgag ctgcatcgat gggggagatt 420

caagacggac tcctcctgca tatggagttc gacacgagat ccggaggtca gactatccaa 480

tatgaaagcg aggatcacct tgcgacatgg caaatcaacc caaacggtga agtcattctc 540

atcgcaagcc tgttcaagtg ggacaagaag accttgaagg caaacattga aatcagaccg 600

catggttctg cccttgacgg ctccgtcgca gtcttcggcg ttgcaccaac cacaagggaa 660

acactgctac attatcagct cgacatctgc ggaccagtca ctcctgaaat gctggagctg 720

cttgccgcct atagcccggg gccagcagcc aagaagtatc taaatcgcta ccgattcgaa 780

tgcctgagta cctcggacat ctccagaaat ctcctcaccc gtgggcagct gatgaagcag 840

gctgccagca aagcagtgtg gcccgaggaa gaattctcta ccttgatctc cattatgccg 900

agactccgcc tgtggtattt ctccatcgtc tcctcgcctc gtgtgaaccc atcttccatc 960

gccatcaccg ctggtgtcct cgaaacaaca attgcacaca ctgatcgagg attcattggc 1020

ttgacggcgg gctacctgca ttctttgcac ctgaaagaaa accaactcaa ctcaagcgat 1080

gaacctgagt cttccaacaa ccttgaagga ccacgatcta tcgtgaaaga ccacaagcta 1140

ttcgcccaca tccgcaaatc aaggttcagg cttccagaca gtgatgagac tccaattatc 1200

ttcatcgctg ccggaagtgg catcacacca ttcagagcct ttgttcagaa gcggaagctt 1260

ctttcaagta agggtatcag tgggtaagat ggttcttttc tatgagtctc gctccgagga 1320

ggattgtctg taaaaggacg tctagatgga agtggaggcg atagggatct tagacaccca 1380

cttcgtgtac tcgtctcgat tggtggatgg aaagaatttc tacgtgcagg acaaaatgta 1440

cacattttgc agagaccatg aatcaattga ttcagacgga ggatgcgtca atttatgtct 1500

gcggaggctc tagcatggcc aatgatgtga aagccatcac ggtcactcga gtccttggcg 1560

gcatcggggc tgtccagcaa ttgaagagat ctagacggct ataggaaggt gtttgggggt 1620

agcaagtgtt tcattcatgc tatttgtttc tccgcaatga caagatctac atattgaaca 1680

aaaacgtatg gaaagtgtga ccttcatgac tcacatgagt ctgcatgtca ggctagcaag 1740

tcaaggcccg aattttgaac gctagagatc ttctagatgc tcatcctctc cgtgtccaaa 1800

ttagccctag tacaaacatc aatcccagaa taacgcccca tatttctttt ccactccctg 1860

tagtattttc agtccatcca ttggcggccc tagttggaat tggaatgaag ttcaaccttg 1920

cagcgccttt aattgcttgt gatgctcccc tggcttgtat tttaccggca tatggtaata 1980

catatcgggc gaaaaagcgg aggaagaaag tgtcccgcgc ttgtaaacgg acaaccagcc 2040

gcgcaacttt gtgaatttta tgcattcgtg cttttcgctc agccgtatac cgccttagcc 2100

tattgtccaa ttgttccgtg cttggtttgc tgcttgggct ggcaatgagg aattcatgaa 2160

gcagattggc taggccggcg gcatcttcaa tagcacaatt ggcgccttgt ccggtgttgg 2220

gggcgatcta cctggagtta gcttctgctt tgatgtagga aaattaaggt ggtatgtacc 2280

ttatgtatac tgtccccaat gcaaactatg cgcttatgat gccagttctc aaatacattc 2340

tcttcgagaa ctgtcatgtt atgccttgtt ctccgagtcc agaggtcgcg aaacgccacc 2400

tcgccccaga taatatcgtt tgcgtatttt tcaaccacgg atgccacatc ggttgttgcg 2460

aaacgaggca tatcgccatc ggaatagagc cgatcaagtt tccagatcaa aaaccaaaat 2520

gtgcgatcat ggtttccagg aaaggttaag aatgaccgtt tgtcgttgag gctggcaacg 2580

tgctcgccgg gtgggaatcc cggcactgcg gaggatatgc cgaaaacgca gccatactcc 2640

gctgtgagac ctgttcactg ttagctgcct tctttgatgt atgaagtata ttcaacaagg 2700

gacaattggc acaaaccgtc tctcccaaca ggttccataa tttctccgtc ttcggcagag 2760

attctccaca tttcccggcg gacaatgcta tgcaccccat cacaacccac cactagatct 2820

cccttatagt cttctccatc cttcgttctt accaagactc cttctcgctt tcctcccgaa 2880

tcagcaatga gctcaacccg tgcaacttcc ttatcacaga gaacctggct gccttcaccc 2940

ccgtctttag tcactttccc acgttgccca agaccaagcc tatcagcaag aatacacaat 3000

agcgtcctcc gctctaaaaa tgcaaagggg aacccaaagc tctcgccgat tacccgagga 3060

gagtcattcg tcagcacaaa cctatttgtg tccgggaagc gaagatgagc ggtatgtagg 3120

ggagcaatct ccttctcaac gcactcgaag agccctagct ggtcgagaat ccgaccgcca 3180

tgggggagaa tcccgatgga ggcaccttct tgtggtgtaa gtgacgtgcg cttttcgagc 3240

accgtgaatc gaatttttgc tctgtgtgtt tgggtgttgt cttggagaag agaggtattg 3300

agggcagtca gagcgtgtgc gagcgttaga ccagcgatgg agcctccaat aatgataata 3360

tgcagctcgt ctgatgcaga cttctcggtc atcgcgaatc atggattccc ccgcggagaa 3420

tggcacttat gatggtagtg cggcgtagag agttcgtaga ggcagtgtgc tattgcaagt 3480

aggtaaaaaa gtaacgctcc ttgattgact acagggatag ccattgtacg ttaggtctag 3540

ccgagaggcg taatagtagg atgatgtaag tcgtgtatta ttgtaagcat aaatttgatt 3600

taatacatcg gctcatcagg cgagactgta gatcttatcg ttacctaact cataccttgc 3660

ttaatgatga atcaatagca aacatgctct gtgaaatctc actcagtctt tttgccagcc 3720

tttgcttcag cctgtttcac aaaggcaaaa aacaagccgt acgccccatc aaagattaca 3780

aatgctgcgg tggaccagta gaacaacggg ttcatcgtcc acgcccacag ctcaggccag 3840

tagtgtgcac gaaaaaacac acctgcaagg gcacttcctg tcccagtcac acgagacgac 3900

ctatctctca gtcagcaagg caaggaagtt cgttgtcgaa gtcaggggga cggaagaaac 3960

gtaccagatg agccaactag caccacgcga ttggctcgat cgcacgagct cacacagcgc 4020

ggtcacactg gtcatgatct ggcagcccag tccaccatag tagaacgctg taaggggtcc 4080

cacgaggttt gcgagggaga catgtcccgc agcccagata gcggtgacga tgacgaaggt 4140

aagatagaag taatagccgc ggagcatcga atcatccccc aatgctaggg gatggtattt 4200

gagagccgca tatattgaag caaggttcag cataaaccat gcggtgacta ttggaaggcg 4260

gggcggggga tagagagtcg cgtagacgag ctcccaggcg aggttacagg atactgggac 4320

gatggggacc cagcaggctt tgtcgcggca agcggtgcga atcgtggcgg cgtagcaagt 4380

cagccagccc gctgccatgg cgaagagcag tgtgtcggat atccatttaa ccgattgaaa 4440

ggattcgggc gctttggtga aatccagtga gtccatagtc actttgaagg gtgagcgtgt 4500

tggtggctgc aagagggaat ggggttgatc cttgaaatat tatcctgcac aacacagtcg 4560

aagtggaacc aaaggcgccc tccaggagga actcatattt atgagaatgc gtacactttc 4620

aagtcgcaca ccgtcctcgc aaggaaatat gcaggggtac cgttgtggag ccctccttgc 4680

atcgcgtgct ccaacttgat aagccatagg tccaagctgt cacacctgac gagatgaagg 4740

gttgctcaca acgaaaaacc tttcacatcg atttcgaaga cccgtggcga atcttgcctc 4800

taggttcacc gtcacgacga ccccgagcat cgcagcgcct ctagctatga ctggtcaagg 4860

tgtcacccag cagaaggcga ctctaagtcc cgagaaggta tcgaagcata tcacttcacc 4920

ttatgtcttc gaattttaat actcacaaac aatagatcat agcagccccg atagactacc 4980

tcttatccca accaggaaag gacctccgca gccgcctaat cactgctttc aacgagtggc 5040

tgaatgtccc agaggagaag ctcgatctca tcagaagagt gattgagctt ctgcacacgg 5100

cctcactcct gtaggcttct ttaatcgttc gcacaagttg aaaatgccta attcagcgtc 5160

ctagaattga tgacattcag gactcctcta agctgcgccg gggtcaacca gtcgcccaca 5220

gtctatttgg gattccacag actatcaact ctgcgaacaa tgcatatttc gaagcgcaaa 5280

atgaactgca caagctgaat gacccgcgag cagtccagat cttcacagag gagcttctcc 5340

ggctgcatcg cgggcaggga atggatttgt actggcgaga ctccatgatc tgcccgtccg 5400

aagaagaata cctcgatatg gtagctgata agacgggagg tctgtttcga ctcgcgatca 5460

agttgatgca gtgttcaagc tttagtacat agtaagctgg cacgtctgac tctgggcaaa 5520

cggtttgaat gagctgacta gagataatag cgactacgtt cccctggttg acttgatggg 5580

cgtcatcttc cagattcggg acgactacca gaatctccag agcggaacat atattcagaa 5640

caaaggtttt ggagaggatt tgactgaggg aaagttttca ttcccaatca tccatggact 5700

caatcatggg acgcagagcc tgcagctttt caatatcctg aagcagaaga cggaggatgt 5760

gtctgtcaaa cgatacgcgc taagcatcat ggaagcagct ggaagctttg catattgccg 5820

cgcaaggctc gcggaactgg ggacggaggc gaggttgatg cttcaggaaa ttgagcgtac 5880

cacagaggga gcatgcgccg gtgacacaaa aggcaaagct gtcgccgaat ttttggattt 5940

gctcgagatc aaacaggaca gctcatgttc caactgtgct aattgcacac aaggcttatg 6000

aatgttctag tgtgcgagtg ttattaaata gtagaccagc catcgtcaat aggaagaaca 6060

gctccattta tccgcgaagc ctgatctgag cacatgaaca caataataga cgctacttcg 6120

tccggcatca tcatcgcgta tccatctctc cggttggcat acacagcgga aagaacaggc 6180

ttgattgtcg aagtggcttc cggatcaaac cttgatggat caacactgtt taatataccg 6240

gtcgccactc ctactgatag tgagtgcctg taacaaaata tgggcttaat ggaagaacaa 6300

gacatcttac ctcctgggca cagcacgttg catcgtatgt tctccccttt gaatctccag 6360

gccacgttct tcgtcgctcc gataaggcca tgcttaccta cgactggtta gaggtatctt 6420

ttaatgagac tgaccaagaa agagaaacgt actcgccgta tacgccacgc ctgctgcagc 6480

accgctcatt ccagctcgac tcgccatgtt caagatcaca ccagacttct gcatcctcat 6540

ctccccgata acctctctca tcagtctcac cggtgccgta aggttcacag ccatacaacg 6600

attccagtct gcgtctgtga ctgtgtccac actggcattg tgatcgagga ctccagcgat 6660

attcatgaga atgtcaatcc ggttaccgaa ggctgaaaga caagctttga caattgtctt 6720

agggatatct aggtctgtga ggtcacattg catcgtctga cagttctcgt tggcttccag 6780

gacggctgga aatggcgata tgtcaacggc gaatacattg gccccagcct ctaaagcagc 6840

ctcagcagca gccagcccaa tgcctgagga ggcgccggtg atgattgcga cctgccctga 6900

gtgttactat gccatcgatt ggcgattatt cgggcaatac taacacgatt ttgaagacag 6960

cctgattcca tcgtgatagt cattctgcct ctctgtgcag aggacgtgag ttacacgtag 7020

ctcaattctc acccaggtac tgagcgcaga tcatttcaca aaatgactta aagcttttct 7080

agaagtgaca ttgaccgccc agatggggcc agttcccatt tagttggcag acaccctaag 7140

aggaagttct ccatcaggta tgtggtgtat ctgatgcgga ctggacccct tgcattagtg 7200

ttacacaggg gaactacacc gcttcactag tgcagcgact acatattgat atcacaaata 7260

ttttcaagga cagtacaatg ctctttccag gccgtatatt ctacgctttg caaaggttgt 7320

ctacgtcgga tagacaagca atcatgattg caagtatact tgaaaagtcc cgagatgctg 7380

accacttcac tattatcatc gccgcatctt ttctcttgag cgtcgcgatt tctcttgtct 7440

ttttacgttc aactacgcct cagctgcctt tgttaaatgg acccaagcgt tgggaattca 7500

cgttcacgaa tgcgaagaag cgctattact tgaatgcgaa tcaaattata caagatggat 7560

tcaagaaggt ctttcctcca tctgcgacag aatactagca agatctcact aagccacagt 7620

ctaaagatgg gttttatgct gtcaccgaga atggaatcga gctgattctc gcaccgaaat 7680

atgctcacgc tatacgaaac gacaagagac tcgactttca cacttacagg acgcatgtaa 7740

gtatagtagc tatacttatc tggtcttttt gccctttctc atttaaaaat cactcacaga 7800

ctatgctccc caatgtcgca ggcctgaaag tctttgagat ggatcaggtc ggaagggaga 7860

taatgagtta catcatccgc caaaaactaa cacatcattt ggtcgatctc atcagaccgc 7920

tgtctgagga ggccgatgat tgtttacacc ggagttggac agataattca ggtactccaa 7980

atctccatgt cgtagctcgt ccatgaggat ccattcactt attaatcctt agattggcac 8040

gaaatttctc tcaaatccac cctcctcgac atgatatccc agcaatcggc ccacgtcttc 8100

ctcggccgca gcttttccca taacgtgagt tggctagcgc tgtcgcgcag cataaccttg 8160

caggccttcg gcgccgtccg cgagcttcgc gtatacccat ccttcatacg cccgcttgtt 8220

ggctggtttc tccccgcatg taaatcactt cgcggagaga ttgccaaagc ccggaagctt 8280

gttgagcccc ttatactagc tcgaagactc gaaagagagc gatgcatcgc cagtggccgg 8340

gaaccacccg tctatcatga cactattgca tgggcagagg aatgtgcacg tggacgaaaa 8400

tacgatccag ctcttattca gctcacgctc gcgctttcgg ctatgcacaa cacctctgac 8460

tttctcacgc aagtaatata tgacatagcg gcgaggccga aactcgtgga ggagttgagg 8520

aaagagatca tcgatgttcg gacgtgtgga gatgcaacag agtcatggaa taagggggcg 8580

gttcacaagt tgaagttgat ggatagtgtc atgaaagaaa gtcagcgatt gaagcctacg 8640

ggattgggta agttttgctg ggatcaacgc ttattctcta caaggctaat atgctaatca 8700

tatagtaaac atgcggcgct atgcaactga ggacatccag ctctcttccg tcattcccga 8760

gcacaaggaa ggcagcatca caatccgaaa gggggatctg gtcatgatat cgcaacacag 8820

ccactgggac gaggatattt accaagacgc ggcgtctttc aacccatacc gattctgcag 8880

gatgcgcgaa caacccacgc aggagcacac agcacacttt gtcgccacaa gtgtcaacca 8940

tatcggcttc gggcatgggg tgcatggctg tcctggtcga ttctttgccg ccgctgagac 9000

gaagcttgca atgtgtcaca ttttgatgaa atacgacatt aagcttatcg atcagcctaa 9060

ggtcctcaat gtaggttcgc ttatggttgc aaatcccgtt gcgaaggttg cagtgagaag 9120

gaggaaggag gaggtttcat tgtgattgtg aacagtgagc tcgcccacat ctcactcagc 9180

ccaaggagta ccaaaggtag gtggagatgg accgtaacca cattactgct ttcggacaaa 9240

ctcaatttac tacatacctc gtggaatact caccttcgcg taaatgaaag tctcccaacc 9300

tttgtaatca cagtatatat tgggcttcca agcttccgtc tatgtctgtg aattctaaag 9360

cgttactatc gtcccttgaa cctctgtccc aaacttgaat gatatccttt ctcgtccatc 9420

atgttgtcaa tgatcgtaag gggaagaatg ataaaataaa ttgaagtatg gttattcagt 9480

tgaatctctg gcagactcaa attcacctat tcaatctgaa ttctaacttg tccaggttcc 9540

atgtccgggt ggtttgtgac cgttgatata cctatcgagc atacgtaatc ttccaaagtt 9600

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acggctcata ttcgatcggt gtatcatata tgcctaggat aatggctaaa tgcagcctgc 9720

ctaagaagcg gtcgggagac ggtgctccac ctacctagta gtagtagtag gactaggtac 9780

tccctatgct acgtgtgtaa tgactcaaca ctttctcttg gctatgaccg cctctctgga 9840

tgcaggtgaa ttcacaatta ctaagtaagg tcaagaaagc ggacataatg caagagtgga 9900

cattatgctc ttcttcgcac tctcactacc acatccggag gcacagcatg ctctcccatg 9960

aaaaagttcg gaggccgtcc atcaatctct tcgatgtcgt aatgcaggac gatgtaagaa 10020

agcatcattt tcaatatgcg ggttgcaaac tgtcttccgg cgctacaaaa ccattagaat 10080

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aatgtgtcgc ttgtcgagac acaagactct gatttcccat cctgcacaaa acgaaaaggc 10200

ttgaattgtt ctgcattctc gtagaatctc ttatcgttat gaatgggaat tgaaggaaca 10260

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tccgatgggc ttctgcagca cccacccgat gacgcctcga aaaggggccg gcaaacattg 10860

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caggtggact ttgatcgcgg tgtgcagtat ctcacttgtg gctggtgtga agccaggcgc 11160

cacgtaccgc acgcccatcc gggagtatgc ggcgcggcgt gggcacagga ccgtgggcgg 11220

ttgatcgata atccattgta tgtgctcttg cggtaggatg acgacgggct caaaactaat 11280

caacggcata agaaaggctt tgccagtttt gttgaaggct ttgtagccgg cctcgaggat 11340

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gcgacctatc catgagatgt cctttggccg gcgttggaga ggaaaacagg ctcgggcgag 11460

atggtatagg ctgagtccca ggactaaggg agctatgagg atgagaatgg ttggggctga 11520

aagttggtac tgcatcttgg tcacggcggt catgggcacg ccacggagca aggaattacc 11580

actgtttagt atgagagact gaaaatatag atggtcgatc ccgattgccc tgattaaaga 11640

gcggtatgga tggtgtgacg tccttgcatc aagttttctt cgactttgca tgtaaggggt 11700

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tggaattatt tacaggccac agttctatcc cttcgtcaca atgatccgca gtcccactgc 11820

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gacttcgcga agaccctgag cacgtctccg ttcaatatat ccttagtcgt gcttttctgt 12060

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tagcaaccac agacggagaa agactcagct gagaccagcg gctatacagg aacaccagct 13200

actatttaca cgtgttatgc tagattgatg gatatttgag tcatttgtct ttgacatctg 13260

cgctcaagac ttgacgaaga aagggcaaat tcaaaaaccc acagagaccg aacaacaggc 13320

tgaaagccct gatgggagtt cataggttgg taatgagcag taaaactggt actgggcagt 13380

catatgcaat tattcctgta ggagtaaggg gctcgcctag cccaattgcc ttgcaagata 13440

agctagtcac caaataaata tagatcaatt cggttggttt ggactctcat ctccatttct 13500

tgtcttcatc atcctgtaga tatcgccaat gtccctcgag cccatagcta ttgttggaac 13560

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tccgcaaaat gtcgcctcca aagtccccag tgagcgcttc aacgtggact cattctacca 13680

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tataagagcc tttgacgcgc ctttcttcag catcagccca gcggaagcgg ctgccatgga 13800

tccacagcaa cgcttgcttc tggagacggt ttatcactcc ctcgaggccg gtggccatag 13860

acttgacgct ttgcagggct cggccacagg agtctactgt ggctttctcc ggactgatta 13920

cagccagata cagtttacag acccggactc gttgccaccg tacacggtta caggaaattc 13980

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ttatatcgcg gatgcaaaga cgggaatgtt gtcagctaca ggccgatcgc ggatgtggga 14220

tgcatccgcg gatggctacg cgcgcggaga aggggttgcg tcggtagtac tcaagcgatt 14280

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tgcggcattc tttgggaacg aagctgaaaa cgacagctct aacgtcctgc atgtcggttc 14580

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atctctgtgt ctacagcatg gggagatcac accgaacctt ctgttctcca cgcctaaccc 14700

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gggaatattc actggccagg gggcacagtg gccgcagatg agtctcgata ttatcaatgc 15240

cagtccacag gctcaaaggt ggatggctga tatgcagaaa gcccttgaca cgctccctca 15300

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aattcatgaa gctagaatct cacaggttct acgcactgct gttcagatcg tgcaaaccaa 15420

cctccttcgt acccttgggg tcaactttga tactgtgatt ggccactcat cgggcgaaat 15480

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ctttggtcct ggcgaactag atttccaggg ctatctccgc gcattcaata tcaatgcttc 16260

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ccgattgctt cccacctctg gccaaggaga acgacgctgg agaaattatt tgcgccccga 16440

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ttttcagact gtattagcaa cttcgatctc caaaacgagg gatcaggcca ccggctcgcg 17040

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ctacgctaca aatatgcaag acttcaaccc gtggtattac cgcttcgtgt cgctagtcaa 17700

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tcaggcgctt tacagcacaa agtcgttaga cgatgccttc aaaagactgc gccgaatgat 18000

caagcctggc ggctacctcc tcattcttga agatacaaac cccaacctca ttcatcggaa 18060

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ccatgaggag gagaaacagc taagacggtt gtttgctggg gccagcaaag ttctctgggt 18540

tgtttctcgc tctgatttca gaagccctgt ggctttgtcc aacgctgtta cagcgggaat 18600

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cgatctgcct tctaaggaaa atgtcgatgc tgtggtcacc cttctgatgc gcctggtgtt 18720

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ctctcatcgc atacggcaaa tgattccaca caaaaaagtt gtcagagccg ttgtttttga 19500

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ttccatactg tgtattcctg cagcggttca gagtgtagcg gggtggcttc accccgaaga 19680

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agcgacagat gcggtcaatt tgtcgcaaca aggcgcatat gttttgtggg agctgcccaa 19860

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agttgttatt gtgcctcctc aggaagatct cgttcacacg gttcttgcgc tccgagacca 20040

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tacgtttatc accaacaaaa gatggaatct gatccactca gctcatttga tgtagacatg 21120

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cgcctcccat cacaacgccc cagctgaggc aaaacggcgc tcggagaaga cttgaacgta 21300

aattgaacga gagttcctaa ggaatttcac gcaatggaaa gcgccgcccg ctcagcccag 21360

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ccgagatcac agaggaaggt gtcgaaattg acgcaagttc aaaaacccaa catggtcgaa 22380

tccgtcgcct tctcgccctt cccgcctacc attccttcgg tgacttctgg aataacctgt 22440

tcccgctccg ctatggcgag ccgctataca tcgtcccacg cttcgatctc gctgacttca 22500

tcgccgcggt cgagcgcttc cgcatcacgg agacctatct cgtccccgtc gcggtgcaga 22560

tgctcgcgca ggcgggccgg gcagccaatg gtgcgcgggt ccgcgagggt ctcgcctcgt 22620

tgcgatatat cggtgtgtcg ggggcgccgg tcgatgcggc ctctttgcaa agatgtgagg 22680

aggtcttgca tccagatgcg tgtgtgagtc agctgtgggg gatgaccgag gttggggtcg 22740

ttttccaaaa tcgctatggg gatcgcctgc atcctggaag tttgggaatg ctgcttgacc 22800

ggtacgaggt gcgattggtg gatcccgttg ggggtgaggg agttgatgga tcgcttggtg 22860

aacttgggtc agggcaacca gccacaggag agctgtatgt tcgtggaccg gggctcatgg 22920

ctgggtacaa aggacgaagt gaccccgttg tggatgcgga ggggtggttc ccgaccggag 22980

acatggtcta cgagaaagac ggacactggt ttattgtggg tcggaccaag gagctgatta 23040

aggtaagggg gtactcggtc gctccggcag agatcgaggc gcttctgctc gacaaggagg 23100

agggcatagc agacgtggct gttttaggag tcaaatcggg gaatggggac ggagaggaag 23160

tcccacgggc ctacgtggtc cgttcaaagg agcaaagtca aggcagtggt aagatagcaa 23220

cgtccggggt agtcaccgag gagcggattc gggcgatcat gcagcaacat ctggccagct 23280

acaaggcgtt ggaaggcggc gtggtctttg tcgacagcat tccacgcaca gacatcggga 23340

agccggctcg gtccaagctg gcgagattga atcagcagcg tgacgagctg gcagccttgc 23400

tccaggcgac ttgtacaagt gtcagagaga agtagaagat agaatggcac actctagcgg 23460

tggtttattc acttatatat gactacgttg atgagtttcg ccgcttcatc aagacttggg 23520

cctgcggatc cgccagaaga atctcatcga tcatcatatt cctcggtcgc tccttcccat 23580

caggcaagcg gaactcatac ccgaccaaca aatgggccag gatgatcttg atctcgttgg 23640

cagcaaagaa tctcccgggg caagcgtact tgccatggcc aaagtgaaga ctatttttgt 23700

cggttgtggc gaactgatgc cggtgtgctt ctgcgggatc gaccctacgc cgccgtgagt 23760

agcgatatcc gtcgaactcg gggtcataat ctgtgctatt ggtgatatct gcagcgggta 23820

ccgcgagatg tgtccccttg gggagaacgg tgccgtcaga tagggtaaga tcgcgcatga 23880

cgatgcgttg gaagctcact aaagcagggt tagatcggag ttggcccaaa gaactcggtg 23940

ggatgattaa agacttgggg ggtaacgaac gtagagcagg cgggttcaaa cgctgcactt 24000

ccttgatgaa gctgtcgaga tcccacatct tcgtcagagt cgtcttctta tattcgccgc 24060

catcttcgac gagggcctga agcacctctc gacgtaaggg ctcaatatag tcttggtgcg 24120

cgcagagatc gtatacagcc tgggttgccg aggcggtagt ggtgtggatt gctgccagac 24180

tgaggatgag ctgacgatgc gcgagttttt cgggctgact gtcatacgga ttcgccttgt 24240

ccatcatcca ctgcaggaga tcggctggct ttttcttctc cgcatcgcct gggctcgtgg 24300

attgctggga tcgtcgctca cgaaccaagg tgccgatgat tcgatttccc gtcgagagcc 24360

cgcggcggat cgccctgtat cgaggaataa gaggagcgat gagcgggcgc atccagcgtg 24420

gaaagcgacg caggatggcc agggtaagga aaacatcctc ggtaaaatgg atcgagagat 24480

tgagccattc ctcattacgg caggtaggga gcccgacaaa gacgcgtgcc gaaatgcgcg 24540

cgacgatgcg cagaatgacc tcgtagatac aaactggagt ccattcgtcg atagtgagat 24600

tgcttggccg gaactcctgc gcgaaagcaa agtctagctc ggatttgaca tcgtggatca 24660

gattgccgag tcgcggggtc aactcggttt gcaagacgtg tgtatgcagg gtcccctcat 24720

caaggatgtc gatggtcgaa tacctgccga gaagattctg cagagttcaa aattcaaggg 24780

gtcattgaca tgctcgatcg agagcaatat gtgtaagaag taccttcata tgtgccttga 24840

tcgcactcag ctgctcatcc ggcttggagt gtagctcgtc cacaaatcgc cttggaacga 24900

ccagaatgtt cgtgtccacg cgtgcgatcc tgaacatccc atccttgtat tgtcgacacc 24960

cctgcgtgat ctggtggagc gcatcttgcg aaaaacggac agcaaccagc cagcggggct 25020

cccagcgaga gcggaaacca acaaaaggcg cttgcaggcg atgtgagtgg aagaccaact 25080

tctgcaggaa tacaatgcct agggcgacca ggctgatttg gacgagggaa ctcgactcta 25140

cgagccagga agtggtgagg tccagtttcg tcatattcag tgaacgtgta ggtagctagc 25200

ggaagggaaa atggtaaaga gggcttgcca actatgccta catcgcatca aacgacttta 25260

taagaggcac acgctgaagc ctgcaagggg ctctatcagg cagacttcaa cgccagctca 25320

tcctccatcc tgcgatctct caccgtccac accggcactc catgataccc gcaccaactc 25380

cgccacgcga tcatcttctg cgcgaggggc gtcatttctt ccagaatatc tcgcgacagg 25440

tcaacatggg cctccatcgg ggtaaaatgc gcgggatgca tcgtcacact caacccacgg 25500

cggctctgca tggactgatt ctcgccagcc ccatgccaga cgcttcccaa gtacaagaca 25560

gcgtcacccg gccgcatcac cgcgcccact gtgttttctg gaactgcccc ggaaatctcg 25620

tctccactcc agcgatggct cccgggaatc agcctggtgg caccattatc ctcgcgaaat 25680

tcggtcagcg cgatgaaaaa gttcatcatg agttctggcg cgcccggtcc cagatacttc 25740

gtgaccccgt atagactgtc atcgcggtgc agaccctggg gtttctcacc gggttcaacc 25800

tggagaacgg cggctcggtt gacccaatag tcgccaaagg gtgcggtgaa gaaagagtcg 25860

gagacggcat gcatcatagg gtggttcagg atagtcgtgc ggtatgtcgg ggagatggcg 25920

gctaggtttc ccatatgctt cgtgcgcgag ccgacggtct ttttgtacaa ctcgccggat 25980

cttgcctggg ggccggtgat ggtggcattc aggtatgggt cgacttcttc attgagggca 26040

gcgacaaccg agattggaac aaactgtcgc acgatgacgg cgccgtcact cacgatgagc 26100

ttgctgattt cctctgtgga cgttgagggg tcgacagtac ggatggcctt tggagaaacc 26160

gagacagtca tggcgacgga gatcccagcg tgcacttctt tgaaatgagc tgatgcttgg 26220

attctttgaa cgagcttata acttagcttg atcgcaccaa atgcaatggt gaacggcggt 26280

gtgatgttga tctattagag gccatgttta tcccactgga aatgcaaggg gtagttagta 26340

gcgaaggggg cggatcaggg gagacagact tataatcatt gatgcaatca gggtcgtgac 26400

ggagagaagg aggcttgtcg taacagcgcc caccaaacca agatgatcgc ttttgtgctc 26460

tgtgcggtga tcacggtact gtatgtgatc ggaaccgccc ttcgagacct ttacctccac 26520

cctctgcgtc gagtcccttg ccactggcca tgggtggctt ttcctctgct ccgtcatata 26580

tccgccgtgc gcggcaacgt tgacctcgac atcaaacaat ggcacgaccg atacggcccg 26640

gtggtccggt tctctccaaa tgaggtctcc ttcaccacct ctgaagcctg gagtgaaatc 26700

tacggccgcc atggccgata ccaatgcctc ccaaagacca agttctcaaa cacgagcaca 26760

atagatctca tccacgcaaa cgatgcggat catgcccgat accgcaaggc tctcgcccat 26820

ggcttctcta ccaagggtgt tcgcgagcaa gagtccctaa ttcagggtta tatcgacaag 26880

ctcgtctccc aacttcaagc gtttgcagat gcacaccagc aggtagatct ggtgatttgg 26940

taccgactca ccactttcga tatcattggc gatttggcat ttggcgagca ctttggtggc 27000

ctcgacaagg ggcgctatca tccctgggtt accttcatga ccgggtacac gcgcatgatt 27060

cctttcttca aagcaatgga tgcgtatcca gctatctttc gcaccgcatt cgctttcatg 27120

tcatcctcat ctcaggcaat tgcgcagcag atgcagtaca gtcgggaact agtccagaaa 27180

cggatcaaat cggcctcatc gagccgtccg gactttgtgg actcgatcat gcgccagcag 27240

ggaaccaagg atgagctctc cgatgcggaa atcgaggcaa acgctagtgt cattataatt 27300

gctggaagtg agaccccggc tgatctgcta tgttcggtga catattggct cttacggact 27360

cccaacgttt ttgctcgtgt acggaatgag ttgcaagatg cgatcacctg cccagcggat 27420

ataacttttc agaccgtcac tcaaggacta cctctcctca cagcatgcct gaatgaggct 27480

ctgcggctct atccctctgt acctgggggc ctacagcgcg atacagtggg ctcggccacc 27540

ctctcgggat ataccatcgc tcccaatgtg aggaatccaa agatattggc catcagtgtc 27600

ctctgctgat cataaaaaaa acaacagacg caggtcggcc ttcatcaata cgcagcctac 27660

acttcgtcat ccaacttcca tctgcctgag tccttttgcc cagaacgctg ggacccagat 27720

gtgccgaata atccggcgtc cctgttttac aacgacaatc gtgacgtatt tcagcccttc 27780

tcggctggac cccggaattg tatcggcaag aacctggcgt acgcgatcat gcgaacggct 27840

ttagcaagag ttctatggga attcgaccta aagttgtgcc ctgaaagtga gaattggcat 27900

gtccagaaaa cttatgggct atgggacaag gggccgctgc tttgtcaact gagccgaagg 27960

gaatgcagaa agtgattctt gttggaagct ttacgtctca atgccagtag atcattgtcc 28020

aggagaatgt cccttcattc tggaattttc taatacaatc cgaacaagtt gttctattcg 28080

ttaacgctgg tatggtggct ttgacttgtt gtgtgaacac gcagtacaat ggtctag 28137

<210> 2

<211> 1524

<212> DNA

<213> Penicillium oxalicum

<400> 2

atgcagtacc aactttcagc cccaaccatt ctcatcctca tagctccctt agtcctggga 60

ctcagcctat accatctcgc ccgagcctgt tttcctctcc aacgccggcc aaaggacatc 120

tcatggatag gtcgcgagca gggcttgctc agcgcgttcc gtgcctgtct tgctcaatgg 180

cagtacaatc cggccatcct cgaggccggc tacaaagcct tcaacaaaac tggcaaagcc 240

tttcttatgc cgttgattag ttttgagccc gtcgtcatcc taccgcaaga gcacatacaa 300

tggattatcg atcaaccgcc cacggtcctg tgcccacgcc gcgccgcata ctcccggatg 360

ggcgtgcggt acgtggcgcc tggcttcaca ccagccacaa gtgagatact gcacaccgcg 420

atcaaagtcc acctgaacaa gaagtttgac aggttgcaac cggctatgta tgaccaactg 480

agttgggcga ttgatcgcag ttttggcacc gcaaactgtg tcagtaaggt gtcacttggc 540

gacgcgttgc gctacgccgt ttaccatacc ttggttcccg ttctggcggg tcgcgaattg 600

gccaaaaatg agcgctttgt agaggcgatc atatcgagct cacagtggtt tggggcggcc 660

tctacgataa cagggcaatg tttgccggcc ccttttcgag gcgtcatcgg gtgggtgctg 720

cagaagccca tcggatatgt ccagcgccgg tacctggctt acctgatgcc aattgtaaaa 780

gagagattga acaaattgca ggaggattca caggtcccgg aagacatggt cacttggctc 840

tgtcaagcca tcctcaagac acgcggccca gaaggagctg agggggtgtt cgctgacgct 900

tttaacttac tgcttggagc tgcatttaca agtaccgtat tgacggcgca ccatgccttg 960

ctcgacatac tcggctcgag cgaaaaggca gagatttacc aaattcttcg aagcgaggct 1020

gagtcggtgt ttgatggtcc tgctaaatgg gctgacccag ctactgttca tcgtttagga 1080

tacatcgata gcacccttcg agagagtctg cggcgggcgc cacccacctc gatggctctg 1140

ttgcgcgagg tcgttccccg agatgggctg gcgctgccaa atggacaact ccttaacaaa 1200

ggcagctggc tggctgttcc ttcaattccc attcataacg ataagagatt ctacgagaat 1260

gcagaacaat tcaagccttt tcgttttgtg caggatggga aatcagagtc ttgtgtctcg 1320

acaagcgaca catttctgtc ctttggacac ggtcgctcgg cctgcgccgg aagacagttt 1380

gcaacccgca tattgaaaat gatgctttct tacatcgtcc tgcattacga catcgaagag 1440

attgatggac ggcctccgaa ctttttcatg ggagagcatg ctgtgcctcc ggatgtggta 1500

gtgagagtgc gaagaagagc ataa 1524

<210> 3

<211> 507

<212> PRT

<213> Penicillium oxalicum

<400> 3

Met Gln Tyr Gln Leu Ser Ala Pro Thr Ile Leu Ile Leu Ile Ala Pro

1 5 10 15

Leu Val Leu Gly Leu Ser Leu Tyr His Leu Ala Arg Ala Cys Phe Pro

20 25 30

Leu Gln Arg Arg Pro Lys Asp Ile Ser Trp Ile Gly Arg Glu Gln Gly

35 40 45

Leu Leu Ser Ala Phe Arg Ala Cys Leu Ala Gln Trp Gln Tyr Asn Pro

50 55 60

Ala Ile Leu Glu Ala Gly Tyr Lys Ala Phe Asn Lys Thr Gly Lys Ala

65 70 75 80

Phe Leu Met Pro Leu Ile Ser Phe Glu Pro Val Val Ile Leu Pro Gln

85 90 95

Glu His Ile Gln Trp Ile Ile Asp Gln Pro Pro Thr Val Leu Cys Pro

100 105 110

Arg Arg Ala Ala Tyr Ser Arg Met Gly Val Arg Tyr Val Ala Pro Gly

115 120 125

Phe Thr Pro Ala Thr Ser Glu Ile Leu His Thr Ala Ile Lys Val His

130 135 140

Leu Asn Lys Lys Phe Asp Arg Leu Gln Pro Ala Met Tyr Asp Gln Leu

145 150 155 160

Ser Trp Ala Ile Asp Arg Ser Phe Gly Thr Ala Asn Cys Val Ser Lys

165 170 175

Val Ser Leu Gly Asp Ala Leu Arg Tyr Ala Val Tyr His Thr Leu Val

180 185 190

Pro Val Leu Ala Gly Arg Glu Leu Ala Lys Asn Glu Arg Phe Val Glu

195 200 205

Ala Ile Ile Ser Ser Ser Gln Trp Phe Gly Ala Ala Ser Thr Ile Thr

210 215 220

Gly Gln Cys Leu Pro Ala Pro Phe Arg Gly Val Ile Gly Trp Val Leu

225 230 235 240

Gln Lys Pro Ile Gly Tyr Val Gln Arg Arg Tyr Leu Ala Tyr Leu Met

245 250 255

Pro Ile Val Lys Glu Arg Leu Asn Lys Leu Gln Glu Asp Ser Gln Val

260 265 270

Pro Glu Asp Met Val Thr Trp Leu Cys Gln Ala Ile Leu Lys Thr Arg

275 280 285

Gly Pro Glu Gly Ala Glu Gly Val Phe Ala Asp Ala Phe Asn Leu Leu

290 295 300

Leu Gly Ala Ala Phe Thr Ser Thr Val Leu Thr Ala His His Ala Leu

305 310 315 320

Leu Asp Ile Leu Gly Ser Ser Glu Lys Ala Glu Ile Tyr Gln Ile Leu

325 330 335

Arg Ser Glu Ala Glu Ser Val Phe Asp Gly Pro Ala Lys Trp Ala Asp

340 345 350

Pro Ala Thr Val His Arg Leu Gly Tyr Ile Asp Ser Thr Leu Arg Glu

355 360 365

Ser Leu Arg Arg Ala Pro Pro Thr Ser Met Ala Leu Leu Arg Glu Val

370 375 380

Val Pro Arg Asp Gly Leu Ala Leu Pro Asn Gly Gln Leu Leu Asn Lys

385 390 395 400

Gly Ser Trp Leu Ala Val Pro Ser Ile Pro Ile His Asn Asp Lys Arg

405 410 415

Phe Tyr Glu Asn Ala Glu Gln Phe Lys Pro Phe Arg Phe Val Gln Asp

420 425 430

Gly Lys Ser Glu Ser Cys Val Ser Thr Ser Asp Thr Phe Leu Ser Phe

435 440 445

Gly His Gly Arg Ser Ala Cys Ala Gly Arg Gln Phe Ala Thr Arg Ile

450 455 460

Leu Lys Met Met Leu Ser Tyr Ile Val Leu His Tyr Asp Ile Glu Glu

465 470 475 480

Ile Asp Gly Arg Pro Pro Asn Phe Phe Met Gly Glu His Ala Val Pro

485 490 495

Pro Asp Val Val Val Arg Val Arg Arg Arg Ala

500 505

<210> 4

<211> 5926

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgacacaaat aaatattagc tgccagccca gcaagcgcag agcaagatca tgtgagactg 60

gatgaagcac ctgctagaaa tatcatggca tttgatcagg ttgaagtgag atcagtatcc 120

cagtagagta gcggggtgtt cttttccaaa ggaatgttcc accctggccg aacgttcttc 180

tcttccttgc ccgtgaatct ttaatgttct agcaaccaca gacggagaaa gactcagctg 240

agaccagcgg ctatacagga acaccagcta ctatttacac gtgttatgct agattgatgg 300

atatttgagt catttgtctt tgacatctgc gctcaagact tgacgaagaa agggcaaatt 360

caaaaaccca cagagaccga acaacaggct gaaagccctg atgggagttc ataggttggt 420

aatgagcagt aaaactggta ctgggcagtc atatgcaatt attcctgtag gagtaagggg 480

ctcgcctagc ccaattgcct tgcaagataa gctagtcacc aaataaatat agatcaattc 540

ggttggtttg gactctcatc tccatttctt gtcttcatca tcctgtagat atcgccaatg 600

tccctcgagc ccatagctat tgttggaaca ggatgccgct ttccgggttc ctcttcctca 660

ccgaatcgtc tctggcactt gcttcaaaat ccgcaaaatg tcgcctccaa agtccccagt 720

gagcgcttca acgtggactc attctaccac cctaatagcc agcagcatgg ctcgacaagc 780

gtggccgagt cttattttct tgaggaagat ataagagcct ttgacgcgcc tttcttcagc 840

atcagcccag cggaagcggc tgccatggat ccacagcaac gcttgcttct ggagacggtt 900

tatcactccc tcgaggccgg tggccataga cttgacgctt tgcagggctc ggccacagga 960

gtctactgtg gctttctccg gactgattac agccagatac agtttacaga cccggactcg 1020

ttgccaccgt acacggttac aggaaattct cccgcaatca tggcaaaccg catctcatac 1080

tttttcaact ggactgggcc atcgttcgcg gtggataccg ggtgctcttc gagcttgctg 1140

gcagttcacc tggctgttga atcgttgagg aaaagagact gtgatttggc tgtcgcggtg 1200

gggagtaatc tgcttctatc gcccaaccct tatatcgcgg atgcaaagac gggaatgttg 1260

tcagctacag gccgatcgcg gatgtgggat gcatccgcgg atggctacgc gcgcggagaa 1320

ggggttgcgt cggtagtact caagcgattg agcgacgccg tcgctgcagg ggacgagatt 1380

gagtgtgtaa ttcgagctac agggatgaac agcgacggcc ggacaatggg tatcaccatg 1440

cccagtggag aggcacagcg gaaactgatt gagtcgacct atgccagtat tggacttgat 1500

cccaaaaatg ctcaggacag atgtcaatat ttcgaggcgc acgggacggg aacgcaggcg 1560

ggagatccac aagaggccag tgcgattcat gcggcattct ttgggaacga agctgaaaac 1620

gacagctcta acgtcctgca tgtcggttca atcaagacag taatcggtca tacggaagca 1680

actgctggcc tggctggctt gatcaaggca tctctgtgtc tacagcatgg ggagatcaca 1740

ccgaaccttc tgttctccac gcctaaccct cgcataacac cgcatcttac tcgactccag 1800

gtgccgagtg agtctgtagc atggcctacc ctgccgcccg gggcaccacg tagggcttcg 1860

gtgaactcgt ttggctttgg cggtgctaat gttcatgcca tcctggaaag ctatgaaccc 1920

ccttcttcat ctcgccgagg ctcagaagat gcagaggcgg attgtttgct tcttcccttt 1980

gtggtttcag cggcatcaga accctcattg aggacagcac tggagaggct tttccaattc 2040

cttgaggatc agccggtgac aaacatgatc gactttgctc agaccctctt gacgcggcgt 2100

tcgtgccata aacatcgtat agtatttatc gctagctcat cggacgagct cagagacaag 2160

attctgcatg aaatatccta cccatccagt ggccagatat ggaggtcaac acatcaatgc 2220

ctattttggt ttagtcgtcc aggcggtgag cacaaaattt gtgtcgtttg acaagatggt 2280

tcatttaggc aactggtcag atcagcccca cttgtagcag tagcggcggc gctcgaagtg 2340

tgactcttat tagcagacag gaacgaggac attattatca tctgctgctt ggtgcacgat 2400

aacttggtgc gtttgtcaag caaggtaagt ggacgacccg gtcatacctt cttaagttcg 2460

cccttcctcc ctttatttca gattcaatct gacttaccta ttctacccaa gcatccaaat 2520

gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt ctgatcgaaa agttcgacag 2580

cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt 2640

aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct acaaagatcg 2700

ttatgtttat cggcactttg catcggccgc gctcccgatt ccggaagtgc ttgacattgg 2760

ggagttcagc gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt gcacagggtg tcacgttgca 2820

agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt tctccagccg gtcgcggagg ccatggatgc 2880

gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat 2940

cggtcaatac actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc atgtgtatca 3000

ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc gcgcaggctc tcgatgagct 3060

gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc gtgcatgcgg atttcggctc 3120

caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat 3180

gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa catcctcttc tggaggccgt ggttggcttg 3240

tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg gagcttgcag gatcgccgcg 3300

cctccgggcg tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc tatcagagct tggttgacgg 3360

caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc 3420

cgggactgtc gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg gccgtctgga ccgatggctg 3480

tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc actcgtccga gggcaaagga 3540

atagctcgag tttctccata ataatgtgtg agtagttccc agataaggga attagggttc 3600

ctatagggtt tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta tttgtatttg 3660

taaaatactt ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt actaaaatcc 3720

agatcccccg aattaattcg gcgttaattc agtacattaa aaacgtccgc aatgtgttat 3780

taagttgtct aagcgtcaat ttgtttccgc ggcgcaggaa gctgggttcc tagcgaatat 3840

agtggctgtc ttgatcgcga aagatatcct atccaagact gaacccgact cttcaatatt 3900

gcttttagaa cctgatgtga ccatcctgaa gatcctcgat tcactcgcgc ctttgcacaa 3960

gacaaagatt atatcggtca cacacaaggc aactgccaaa gccaacagaa agagtctgat 4020

ttatatcccc gagcgtacgc cctctcatcg catacggcaa atgattccac acaaaaaagt 4080

tgtcagagcc gttgtttttg attctaaccg cgtctgtaac ggacgaaatg atcgcatctg 4140

caacctcttt ccgaatgctc gacagcttga tatcgcgtcc ttctatcaaa ctgtgccgat 4200

gccaaactca ccagaacatg gttccatact gtgtattcct gcagcggttc agagtgtagc 4260

ggggtggctt caccccgaag attccacttt tgcagtaacc tcgatcacaa aacttatttc 4320

agaagaaatc gatctacgac caacctctgt gatcaaatgg tcatctgaga ctcagaaccc 4380

gatcaaagcg cagatacgtt cagcgacaga tgcggtcaat ttgtcgcaac aaggcgcata 4440

tgttttgtgg gagctgccca aggccttgag aaggaccgtt gccgattggc ttgtctccca 4500

tggagcgcag catcttgttt ttgttcagaa aattcccgat gatacccagt gggtgtccag 4560

cattacatgt ggtggtgcag aagttgttat tgtgcctcct caggaagatc tcgttcacac 4620

ggttcttgcg ctccgagacc actcgtctgt gccgcttgtt cggggtattg tatttactgg 4680

ggcactcgat aatgctgtgg ctgctgagac gatccaacgg gctaaatgct tgtcccaaca 4740

ttacgactct cccaatctag agatgttctt gagcattgac tgctgcccag cgataccgaa 4800

tccgcagcag tgcgctgtga ccgaatttct cgcagcacta gcacatcaac gagcaatgat 4860

caatcttgcg gcaagtgtcc tctgtcttgg acccgggttt gatctcgaca atccacacgg 4920

agatgatatt gcggagatac ttgcagaggc tgccttagcc ggccatccct ttgccggtgg 4980

cgatcgcgtg gttacagctg gcctctgtcc cggtactggc agtccagagt acaaggcgtg 5040

ggacactatc cactcgcgga acccagcaat gtcgaacatc cttgctttgt caaggaaagg 5100

tgggcaagaa gagactgctg gcgttgaggc agccacggag catatccctt tgaaagtcca 5160

actcgagcgt gctaaagaaa ccacatcggc agccttggct gtgcgggcta ttttgaatca 5220

gtactttacc agatacctcc ggatgcggct ccagtccacg gccgagatca atgagaatac 5280

cttattcaac gaacttggtg tggactcgat ggtcgcggca cagttggttg ggtggtttat 5340

gaaagaagtt ggcgtggagg tttcggttgt tttcattctc gctggcgcat ctgttggcga 5400

ggtcctccag gatgtcacgg agaagcttat cccttgaggt cgagattttt ctgtgtgaat 5460

aaatatagct ctcctgacgc gaccttagaa aaccacatgc gtaccagatg caaattttta 5520

ggtcattcaa tattaacatc tacatgcaga agcaattact tccttcatta tcagtctcat 5580

ttataatctg tgcactagac tgtaatagag gctgtgcagc atgactcaaa aactaggaaa 5640

aggtcacttc aacaggctag gtacgtttat caccaacaaa agatggaatc tgatccactc 5700

agctcatttg atgtagacat ggataaatat tggcaccgaa ggcatattta cactactgcc 5760

ggcgagattg agccaaacat aacaagctgc ccgaggtgcg gatttgcaat tgatccgtga 5820

catttccttg aaggacccaa ccgcctccca tcacaacgcc ccagctgagg caaaacggcg 5880

ctcggagaag acttgaacgt aaattgaacg agagttccta aggaat 5926

<210> 5

<211> 5716

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atcatccgcc aaaaactaac acatcatttg gtcgatctca tcagaccgct gtctgaggag 60

gccgatgatt gtttacaccg gagttggaca gataattcag gtactccaaa tctccatgtc 120

gtagctcgtc catgaggatc cattcactta ttaatcctta gattggcacg aaatttctct 180

caaatccacc ctcctcgaca tgatatccca gcaatcggcc cacgtcttcc tcggccgcag 240

cttttcccat aacgtgagtt ggctagcgct gtcgcgcagc ataaccttgc aggccttcgg 300

cgccgtccgc gagcttcgcg tatacccatc cttcatacgc ccgcttgttg gctggtttct 360

ccccgcatgt aaatcacttc gcggagagat tgccaaagcc cggaagcttg ttgagcccct 420

tatactagct cgaagactcg aaagagagcg atgcatcgcc agtggccggg aaccacccgt 480

ctatcatgac actattgcat gggcagagga atgtgcacgt ggacgaaaat acgatccagc 540

tcttattcag ctcacgctcg cgctttcggc tatgcacaac acctctgact ttctcacgca 600

agtaatatat gacatagcgg cgaggccgaa actcgtggag gagttgagga aagagatcat 660

cgatgttcgg acgtgtggag atgcaacaga gtcatggaat aagggggcgg ttcacaagtt 720

gaagttgatg gatagtgtca tgaaagaaag tcagcgattg aagcctacgg gattgggtaa 780

gttttgctgg gatcaacgct tattctctac aaggctaata tgctaatcat atagtaaaca 840

tgcggcgcta tgcaactgag gacatccagc tctcttccgt cattcccgag cacaaggaag 900

gcagcatcac aatccgaaag ggggatctgg tcatgatatc gcaacacagc cactgggacg 960

aggatattta ccaagacgcg gcgtctttca acccataccg attctgcagg atgcgcgaac 1020

aacccacgca ggagcacaca gcacactttg tcgccacaag tgtcaaccat atcggcttcg 1080

ggcatggggt gcatggctgt cctggtcgat tctttgccgc cgctgagacg aagcttgcaa 1140

tgtgtcacat tttgatgaaa tacgacatta agcttatcga tcagcctaag gtcctcaatg 1200

taggttcgct tatggttgca aatcccgttg cgaaggttgc agtgagaagg aggaaggagg 1260

aggtttcatt gtgattgtga acagtgagct cgcccacatc tcactcagcc caaggagtac 1320

caaaggtagg tggagatgga ccgtaaccac attactgctt tcggacaaac tcaatttact 1380

acatacctcg tggaatactc accttcgcgt aaatgaaagt ctcccaacct ttgtaatcac 1440

agtatatatt gggcttccaa gcttccgtct atgtctgtga attctaaagc gttactatcg 1500

tcccttgaac ctctgtccca aacttgaatg atatcctttc tcgtccatca tgttgtcaat 1560

gatcgtaagg ggaagaatga taaaataaat tgaagtatgg ttattcagtt gaatctctgg 1620

cagactcaaa ttcacctatt caatctgaat tctaacttgt ccaggttcca tgtccgggtg 1680

gtttgtgacc gttgatatac ctatcgagca tacgtaatct tccaaagttt aaggttgcga 1740

cccaccaata cctgaaccag ggcgtagatc acacctagat acgtgtacaa cggctcatat 1800

tcgatcggtg tatcatatat gcctaggata atggctaaat gcagcctgcc taagaagcgg 1860

tcgggagacg gtgctccacc tacctagtag tagtagtagg actaggtact ccctatgcta 1920

cgtgtgtaat gactcaacac tttctcttgg ctatgaccgc ctctctggat gcaggtgaat 1980

tcacaattac taagtaaggt caagaaagcg gacataatgc aagagtggac attatgctct 2040

tcttcgcact ctcactacca catccggagg cacagcatgc tctcccatga ggaggtcaac 2100

acatcaatgc ctattttggt ttagtcgtcc aggcggtgag cacaaaattt gtgtcgtttg 2160

acaagatggt tcatttaggc aactggtcag atcagcccca cttgtagcag tagcggcggc 2220

gctcgaagtg tgactcttat tagcagacag gaacgaggac attattatca tctgctgctt 2280

ggtgcacgat aacttggtgc gtttgtcaag caaggtaagt ggacgacccg gtcatacctt 2340

cttaagttcg cccttcctcc ctttatttca gattcaatct gacttaccta ttctacccaa 2400

gcatccaaat gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt ctgatcgaaa 2460

agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca 2520

gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct 2580

acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg catcggccgc gctcccgatt ccggaagtgc 2640

ttgacattgg ggagttcagc gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt gcacagggtg 2700

tcacgttgca agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt tctccagccg gtcgcggagg 2760

ccatggatgc gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag cgggttcggc ccattcggac 2820

cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc 2880

atgtgtatca ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc gcgcaggctc 2940

tcgatgagct gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc gtgcatgcgg 3000

atttcggctc caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga 3060

gcgaggcgat gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa catcctcttc tggaggccgt 3120

ggttggcttg tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg gagcttgcag 3180

gatcgccgcg cctccgggcg tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc tatcagagct 3240

tggttgacgg caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc 3300

gatccggagc cgggactgtc gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg gccgtctgga 3360

ccgatggctg tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc actcgtccga 3420

gggcaaagga atagctcgag tttctccata ataatgtgtg agtagttccc agataaggga 3480

attagggttc ctatagggtt tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta 3540

tttgtatttg taaaatactt ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt 3600

actaaaatcc agatcccccg aattaattcg gcgttaattc agtacattaa aaacgtccgc 3660

aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat tttgagaatg gttggggctg aaagttggta 3720

ctgcatcttg gtcacggcgg tcatgggcac gccacggagc aaggaattac cactgtttag 3780

tatgagagac tgaaaatata gatggtcgat cccgattgcc ctgattaaag agcggtatgg 3840

atggtgtgac gtccttgcat caagttttct tcgactttgc atgtaagggg tccctagcca 3900

cggactcgcc tgttctgaga atgctgatat aagaggcaca gctctctatc atggaattat 3960

ttacaggcca cagttctatc ccttcgtcac aatgatccgc agtcccactg ccccaagcag 4020

gcccctaggc cagatctcgt gggacctgat ccgcatctcg cgatttgaca agtacaactc 4080

atttctagcc ctctttgccg gaggttagtc cacccatccc aaattcatac actctaggca 4140

gtgggtgcta acaacacaca gtatggtcaa cccttcttgc ggggagcgca cgacttcgcg 4200

aagaccctga gcacgtctcc gttcaatata tccttagtcg tgcttttctg tgctccatag 4260

ccgcatatat attctctggg gcaggcatgg tgtggaatga ctgggttgac cgggacatcg 4320

atgctcgcgt ggcacgcacc aaggatcgtc ctttagctgc aggcagactg agcacagaag 4380

aagcaatgct ttggatgctg cttcaagctg gtgtagcaac gacatttttg tattggatga 4440

tggacggaca acatgtgttc gtgagcccct ggaaaagtca tctctctctc tctgctgtac 4500

caaggtcgac taacgaagcg gggctaccta gcttgcattc catgattcct ccaacattag 4560

gaacattgat atatccatat tgcaagcgtc ctctcgctcg ccgacttggt atctaccctc 4620

aatatgttct cggtctgaca gcttcctgcc ctgtcctctt tggccgtgct tcgatatacc 4680

ctgatataga atccttctct cgactcgtat cgtctagcct cccgctttgc ctagtggtgt 4740

ttacatggac tctctatttc aataccgcat acagctacca ggacatcgtt gatgacaaga 4800

aattgggggt gaactcacta tacaaccttg cgggaaagca catacatggc gtgcttgtgg 4860

ccctcgtgac aatcatggtg agcgcactgt ggtgggcact gtaccccttg ggatcagctt 4920

ggttgtggat ctcttggatg ggagtctgga tcgtgggatg tgtggaccaa atgcgcagat 4980

ttgatgcgaa ggatccttca agtggacagt acgtcttccg tagcaatgtc cttatggggc 5040

tctggacgat gcttgcttgt cttttggagg ttttttctac agggaagaga gtggctttgt 5100

gaacgaaatg gggaagacat agcgacacaa ataaatatta gctgccagcc cagcaagcgc 5160

agagcaagat catgtgagac tggatgaagc acctgctaga aatatcatgg catttgatca 5220

ggttgaagtg agatcagtat cccagtagag tagcggggtg ttcttttcca aaggaatgtt 5280

ccaccctggc cgaacgttct tctcttcctt gcccgtgaat ctttaatgtt ctagcaacca 5340

cagacggaga aagactcagc tgagaccagc ggctatacag gaacaccagc tactatttac 5400

acgtgttatg ctagattgat ggatatttga gtcatttgtc tttgacatct gcgctcaaga 5460

cttgacgaag aaagggcaaa ttcaaaaacc cacagagacc gaacaacagg ctgaaagccc 5520

tgatgggagt tcataggttg gtaatgagca gtaaaactgg tactgggcag tcatatgcaa 5580

ttattcctgt aggagtaagg ggctcgccta gcccaattgc cttgcaagat aagctagtca 5640

ccaaataaat atagatcaat tcggttggtt tggactctca tctccatttc ttgtcttcat 5700

catcctgtag atatcg 5716

Claims

1.OxaL蛋白或OxaL蛋白相关生物材料的应用，为如下（a1）或（a2）：

（a1）OxaL蛋白或OxaL蛋白相关生物材料作为羟化酶的应用；

（a2）OxaL蛋白或OxaL蛋白相关生物材料在制备羟化酶中的应用；

所述OxaL蛋白为序列表的序列3所示的蛋白质；

2.OxaL蛋白在参与化合物oxalicine B的合成中的应用；所述OxaL蛋白如序列表的序列3所示。

3.重组微生物的应用，为如下（b1）或（b2）或（b3）：

（b1）在将化合物3转换为化合物8中的应用；

（b2）在将化合物2转换为化合物9中的应用；

（b3）在将化合物4转换为化合物oxalicineB中的应用；

所述重组微生物为表达OxaL蛋白的重组微生物；

所述OxaL蛋白如序列表的序列3所示；

化合物3如式Ⅰ所示；化合物8如式Ⅱ所示；化合物2如式Ⅲ所示；化合物9如式Ⅳ所示；化合物4如式Ⅴ所示；化合物oxalicineB如式Ⅵ所示；

式Ⅰ；/>式Ⅱ；

式Ⅲ； />式Ⅳ；

式Ⅴ；/>式Ⅵ。