CN114717173B

CN114717173B - 一种用于生产甾醇侧链不完全降解产物的基因工程菌株及其构建方法以及应用

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Publication number: CN114717173B
Application number: CN202210281670.XA
Authority: CN
Inventors: 王风清; 魏东芝; 刘勇军; 宋璐
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2022-03-21
Filing date: 2022-03-21
Publication date: 2023-10-10
Anticipated expiration: 2042-03-21
Also published as: CN114717173A

Abstract

本发明公开了一种用于生产甾醇侧链不完全降解产物的基因工程菌株及其构建方法以及应用，构建方法包括：针对可降解转化甾醇的微生物中igr操纵子中的基因进行失活敲除，以及对甾醇代谢途径中的关键基因进行删除或/和过表达，从而获得一种基因工程菌株。采用这些菌株可选择性制备PDC、PDC‑M、△¹‑PDC、△¹‑PDC‑M、9α‑OHPDC、9α‑OHPDC‑M，进而用于肾上腺皮质激素等甾体药物的生产。本发明可大大提升甾体药物的生产效率和产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、简化生产步骤、提高药物前体的利用率，从而降低生产成本，整体反应条件温和、环境友好，具有较高的经济价值和社会价值。

Description

一种用于生产甾醇侧链不完全降解产物的基因工程菌株及其构建方法以及应用

技术领域

本发明涉及生物化工领域，一种用于生产甾醇侧链不完全降解产物的基因工程菌株及其构建方法以及应用。

技术背景

皮质类固醇是一类重要的甾体化合物，广泛用于治疗炎症、内分泌失调、癌症和病毒感染，尤其是危重病人的抢救。例如，低剂量的***和甲基强的松龙，已被证实能够降低重症COVID-19疾病患者的死亡率并且世界卫生组织高度评价***在COVID-19重症患者治疗中的应用初步结果。皮质类固醇的工业合成过程复杂，由于其结构复杂，产率极低，并且由于严重的环境污染问题和高生产成本而备受关注。孕-1,4,9(11),16(17)-四烯-3,20-二酮(简称四烯)或其衍生物21-乙酰氧基-四烯(醋酸四烯)是合成许多商业皮质类固醇的重要前体。目前，有两条生产四烯或醋酸四烯的半合成路线(不同厂家可能略有差异)：1)基于薯蓣皂苷元的半合成路线，从薯蓣皂素出发，合成关键中间体16α,17α-环氧-孕酮，再经过10-11步后可获得，产品收率小于10％。2)基于植物甾醇的生物转化路线，以植物甾醇为底物，通过微生物转化为9α-羟基雄甾烯二酮(9α-OHAD)，再经过8步化学反应可得，产率约为22.2％。总之，第二条路线在生产成本和环境友好方面比第一条路线具有明显的优势，近年来植物甾醇微生物转化为9α-OHAD的成功商业应用促进了以植物甾醇为基础的路线在工业上的推广。尽管如此，从9α-OHAD到四烯的转化仍然是一个复杂、低产率的过程。

9α-羟基雄甾烯二酮(9α-OHAD)、雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-双烯-3,17-二酮(ADD)是分支杆菌甾醇分解代谢途径中常见的17-酮产物。在工业中需要在这类甾体的C17位重建一个双碳孕烷侧链来合成皮质类固醇。由于C17-酮基具有独特的区域选择性，因此通常采用三步氰醇法将孕烷侧链引入到这些甾体化合物中。然而，该方法的立体选择性并不令人满意，因为第一步反应会不可避免地产生副产物17β-氰基中间体差向异构体，其有效收率一般低于70％。事实上，除了上述的17-酮甾体之外，植物甾醇的微生物分解代谢过程中还会产生其他有用的中间代谢物，对皮质类固醇的合成也很有价值。在这些代谢物中，C-22代谢物是具有潜力的，它来源于C17烷基侧链的部分降解，其丙基侧链可能更方便在C17位构建孕烷侧链。例如，从22-羟甲基孕甾-4烯-3酮(4-HBC)到孕酮，只需两步反应。然而，4-HBC不是合成四烯的最佳前体，因为很难在C16和C17之间引入双键。

进一步分析分枝杆菌对植物甾醇的分解代谢过程后，我们发现了侧链不完全降解的产物即孕二烯-20-羧酸代谢物及其对应的甲酯物(命名为PDC型代谢物)，在作为前体合成皮质类固醇的应用方面具有其结构上的优势。它们拥有的三碳烷基侧链和C17-C20位双键，为后续皮质类固醇合成所必须的侧链合成和C16-C17位的修饰提供了极大的便利。此外，我们9α-羟基-3-氧代-4,17(20)-孕二烯-20-羧酸及其甲酯物为例，9α羟基还有利于C9和C11之间双键的引入。迄今为止，仅有少数PDC型代谢物的制备案例报道。其中，9-OHPDC及其衍生物9-OHPDC-M都被证明是一些分支杆菌突变体转化植物甾醇的代谢产物，这些突变体主要通过处理理化诱变剂、原生质球融合或转座子诱变而获得。然而这些突变体的产品选择性和生产效率较低，目前还没有在工业规模上的应用。近年来，分支杆菌甾醇分解代谢途径和代谢适应性相关的一些重要机制已经得到了充分的证明。因此我们可以结合基因工程和代谢工程理性地将代谢途径导向目标甾体化合物。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于生产甾醇不完全降解产物的基因工程菌株及其构建方法以及应用，从而解决现有技术缺乏生产PDC型产物基因工程菌的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种用于生产甾醇侧链不完全降解产物的基因工程菌株的构建方法，所述基因工程菌株是通过对微生物进行代谢工程改造而成，所述基因工程菌株的构建方法包括以下步骤：1)选择可降解转化甾醇的微生物；2)针对微生物中igr操纵子，对其中的chsE1、chsE2、chsH1、chsH2、ltp2进行单个基因失活敲除或组合失活敲除；3)对甾醇代谢途径中的关键基因cyp125、hsd4A、fadA5、chsE1、chsE2、kshA1和ksdD1等进行不限定组合改造，包括删除和/或过表达；其中，经过代谢工程改造后的基因工程菌株，通过转化植物甾醇，可用于生产获得孕甾-4,17(20)-二烯-20-羧酸(PDC)及其对应的甲酯物PDC-M、孕甾-1,4,17(20)-三烯-20-羧酸(△¹-PDC)及其对应的甲酯物△¹-PDC-M、9α-羟基-PDC(9α-OHPDC)及其对应的甲酯物9α-OHPDC-M。

根据本发明，所述可降解转化甾醇的微生物为分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)非致病性微生物。

所述分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)非致病性微生物包括分枝杆菌属(Mycobacterium)、分枝菌酸杆菌属(Mycolicibacterium)、分枝菌酸棒杆菌属(Mycolicibacillus)、分枝菌酸菌属(Mycolicibacter)和拟分枝杆菌属(Mycobacteroides)。

优选地，所述可降解转化甾醇的微生物是能够转化植物甾醇生产雄甾-4-烯-3,20-二酮(AD)、雄甾-1,4-二烯-3,20-二酮(ADD)和/或9α-羟基-AD(9α-OHAD)的微生物菌株。

步骤2)包括针对igr操纵子中的chsE1、chsE2、chsH1、chsH2、ltp2基因进行单个基因失活、二者组合失活或三者组合失活，或对整个igr操纵子基因失活。

步骤2)包括对chsH2或/和ltp2进行基因失活。

步骤3)包括对甾醇代谢途径中的关键基因cyp125、hsd4A、fadA5、chsE1、chsE2、kshA、kstD1进行不限定组合改造，包括基因强化表达或基因失活。

步骤3)包括对甾醇代谢途径中的关键基因cyp125、chsE1、chsE2、hsd4A、fadA5基因进行不限定组合强化，对kshA、kstD1等不限定性强化表达或基因失活。

基因chsE1、chsE2、chsH1、chsH2、ltp2的核苷酸序列如SEQ ID No:1-5所示。

基因chsE1、chsE2、chsH1、chsH2、ltp2的核苷酸序列为如SEQ ID No:1-5所示序列的直系同源基因。

根据本发明的一个优选方案，所述基因工程菌株的构建方法包括以下步骤：1)：将***质粒pQC-H1H2或pQC-ltp2或pQC-igr电转导入NwIB-XII或NwIB-I菌株感受态，涂布卡那霉素和潮霉素的双抗性平板，挑取长出的克隆，利用相应的上游同源臂的UF引物和下游同源臂的DR引物进行PCR扩增筛选，选择条带大小2000bp左右的单克隆，即为NwIB-XIIΔH1H2，NwIB-XIIΔltp2，NwIB-XIIΔigr或NwIB-IΔH1H2，NwIB-IΔltp2，NwIB-IΔigr菌株；以及2)：分别将单基因过表达质粒pMV261-cyp125、pMV261-hsd4A、pMV261-fadA5、pMV261-chsE1-E2、pMV261-kshA、pMV261-kstD1和组合过表达质粒pMV261-hsd4A&kshA1、pMV261-kshA1&chsE1-E2、pMV261-hsd4A&chsE1-E2电转化导入NwIB-IΔltp2感受态，涂布卡那霉素平板长出单克隆，利用PMV261-YZ-F&R进行PCR扩增验证，如能扩增出1500bp左右的阳性条带，则为菌株NwIB-IΔltp2-Ocyp125；如能扩增出1500bp左右的阳性条带，则为菌株NwIB-XIIΔltp2-Ohsd4A；如能扩增出2000bp左右的阳性条带，则为菌株NwIB-XIIΔltp2-OchsE1-E2；如能扩增出2000bp左右的阳性条带，则为菌株NwIB-XIIΔltp2-OksdD1；如能扩增出1500bp左右的阳性条带，则为菌株NwIB-IΔltp2-OfadA5；如能扩增出2000bp左右的阳性条带，则为菌株NwIB-IΔltp2-OkshA1；如能扩增出3500bp左右的阳性条带，则为菌株NwIB-IΔltp2-Ohsd4A&kshA1；如能扩增出3500bp左右的阳性条带，则为菌株NwIB-IΔltp2-OkshA1&chsE1-E2；如能扩增出4000bp左右的阳性条带，则为菌株NwIB-IΔltp2-Ohsd4A&chsE1-E2。同理，将过表达质粒pMV261-kstD1电转导入NwIB-XII，如能扩增出2000bp左右的阳性条带，则为菌株NwIB-XII-OkstD1。

***质粒pQC-H1H2或pQC-ltp2或pQC-igr的构建包括以下步骤：

A1：以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用同源臂引物pQC-H1H2-U-F&R，pQC-H1H2-D-F&R；pQC-ltp2-U-F&R，pQC-ltp2-D-F&R；pQC-igr-U-F&R，pQC-igr-D-F&R分别扩增H1H2、ltp2和igr的上、下游同源臂序列，获得上、下游同源臂纯化产物；

A2：p2NIL质粒提取物采用HindIII和BamHI进行酶切，上游同源臂纯化产物利用HindIII和EcoRI进行酶切，下游同源臂纯化产物利用EcoRI和BamHI进行酶切，T4酶连接，获得重组质粒p2NIL-H1H2、p2NIL-ltp2、p2NIL-igr；

A3：将pGOAL19质粒产物、p2NIL的重组质粒分别用PacI酶切，T4酶连接，转入大肠杆菌DH5α感受态，扩大培养、抽提获得***质粒pQC-H1H2、pQC-ltp2、pQC-igr的纯化产物，电转，涂布蔗糖致死平板，筛选正确的双交换突变菌株，即可获得敲除菌株。

同源臂引物pQC-H1H2-U-F&R，pQC-H1H2-D-F&R；pQC-ltp2-U-F&R，pQC-ltp2-D-F&R；pQC-igr-U-F&R，pQC-igr-D-F&R的核苷酸序列如SEQ ID No:6-17所示。单基因过表达质粒pMV261-cyp125、pMV261-hsd4A、pMV261-fadA5、pMV261-chsE1-E2、pMV261-kshA和组合共表达质粒pMV261-hsd4A&kshA1、pMV261-kshA1&chsE1-E2、pMV261-hsd4A&chsE1-E2的构建包括以下步骤：

B1：单基因过表达质粒的构建：以hsd4A基因过表达质粒的构建为例：

1)以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用引物4A-F&R扩增获得hsd4A的基因序列；

2)将pMV261质粒产物、hsd4A的基因序列，用HindIII&EcoRI酶切纯化回收，T4酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，获得重组质粒pMV261-hsd4A；

B2：组合过表达质粒的构建：以pMV261-hsd4A&chsE1-E2组合过表达质粒的构建为例：

1)以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用引物4A1E1E2-F&R扩增获得chsE1-E2的基因序列片段；

2)重组质粒pMV261-hsd4A质粒采用HindIII和HpaI酶切，纯化回收得到质粒骨架，与chsE1-E2的基因序列片段进行T4连接，获得重组质粒连接产物pMV261-hsd4A&chsE1-E2；

3)将连接产物pMV261-hsd4A&chsE1-E2转化大肠杆菌DH5α，涂布卡那霉素抗性平板进行克隆筛选，经菌落PCR、质粒酶切和质粒测序验证，即可获得重组质粒pMV261-hsd4A&chsE1-E2；

所述新金色分枝杆菌的保藏号为ATCC 25795。

所述引物4A-F&R的核苷酸序列如SEQ ID No:18-19所示。所述引物4A1E1E2-F&R的核苷酸序列如SEQ ID No:20-21所示。

根据本发明的第二方面，提供一种用于生产甾醇侧链不完全降解产物PDC-M、△¹-PDC-M 9OHPDC-M的基因工程菌株，由上述构建方法构建得到。

根据本发明的第三方面，还提供一种甾醇侧链不完全降解产物的制备方法，包括以下步骤：将根据上述构建方法构建得到的基因工程菌株，接种于培养基中培养，即得。

根据本发明的一个优选方案，将根据上述构建方法构建得到的基因工程菌株，以发酵转化的方式，在培养生长的过程中投加植物甾醇进行转化，可获得PDC、PDC-M、△¹-PDC、△¹-PDC-M、9α-OHPDC、9α-OHPDC-M这六种产物中任一种。

根据本发明的一个优选方案，将根据上述构建方法构建得到的基因工程菌株，可以静息细胞转化的方式，转化植物甾醇获得PDC、PDC-M、△¹-PDC、△¹-PDC-M、9α-OHPDC、9α-OHPDC-M这六种产物中任一种。

根据本发明的一个优选方案，所述基因工程菌株可转化植物甾醇获得PDC-M和PDC、△¹-PDC-M和△¹-PDC、9α-OHPDC-M和9α-OHPDC这三种组合中的任一组合。

发明人通过研究发现，在分支杆菌转化植物甾醇的过程中，来自Cho区，与细胞生长相关的一个保守操纵子igr在甾醇C17烷基侧链降解的最后一轮β氧化过程中十分关键。该操纵子由六个基因组成，分别编码醛缩酶(Ltp2)、ChsH1和ChsH2组成的MaoC样水合酶(ChsH1-H2)、ChsE1和ChsE2组成的酰基辅酶A脱氢酶(ChsE1-E2)和一个细胞色素P450Cyp125(CYP125)。除了Cyp125是启动C17侧链降解的关键酶之外，其他酶都参与了C17侧链的最后一轮β-氧化。在这些酶中，酰基辅酶A脱氢酶是一种由ChsE1和ChsE2形成的功能性α2β2异四聚体酶，催化3-氧代-孕甾-4-烯-20-羧基-CoA(PC-CoA)的脱氢，接着再经过FadA5的硫解反应，从而产生代谢物3-oxo-pregna-1,17(20)-二烯-20-羧基-CoA(PDC-CoA)。随后，MaoC样水合酶，一种由ChsH1和ChsH2组装的功能性αβ异二聚体酶，被证明可以催化PDC-CoA的水合作用，生成17-羟基-3-氧代-孕甾-4-烯-20-羧酸-CoA(17-OHPC-CoA)。最后，与ChsH2中的DUF35结构域相关的醛缩酶Ltp2催化17-OHPC-CoA的逆醛醇裂解形成AD。因此，基于igr操纵子各个基因的功能，我们首先在NwIB-XII菌株中敲除ChsH1-H2，ltp2以及整个igr操纵子，发现主产物均为PDC-M。对比敲除菌的生长状况及产物积累，我们发现ltp2的敲除对菌株生长影响相对较小，且产物积累相对较高。ltp2基因的敲除为后续构建9OHPDC-M和△¹-PDC-M工程菌打下了基础。为了积累△¹-PDC-M，我们在NwIB-XII△ltp2菌株的基础上过表达3酮基△¹脱氢酶kstD1，构建了△¹-PDC-M工程菌NwIB-XII△ltp2-OkstD1。为了积累9OHPDC-M，我们首先要失活所有的3酮基△¹脱氢酶KstDs，并且保留9α羟基化酶KshA，因此我们选择在NwIB菌株中失活ltp2，构建出9OHPDC-M工程菌NwIB△ltp2。此外我们还发现过表达甾醇侧链降解关键基因hsd4A和ChsE1-E2能显著提高9OHPDC-M积累。因此，本发明首次创造性地通过敲除ltp2基因和对cyp125，hsd4A、fadA5、ChsE1、ChsE2、kshA1和ksdD1等进行单基因过表达或组合共表达，构建出了一系列生产甾醇侧链不完全降解产物的基因工程菌株。

根据本发明所提供的构建方法中，涉及一种用于敲除ltp2、ChsH1-H2、igr操纵子基因的重组***质粒pQC-H1H2、pQC-ltp2、pQC-igr，其包含pGOAL19的质粒骨架，以及ltp2、ChsH1-H2、igr基因上下游同源臂序列。该***质粒的构建方法及pGOAL19质粒骨架的获取，在文献(Xiong LB,Liu HH,Xu LQ,et al.Improving the production of 22-hydroxy-23,24-bisnorchol-4-ene-3-one from sterols in Mycobacterium neoaurum byincreasing cell permeability and modifying multiple genes.Microbial CellFactories,2017,16(1):89.)中有详细描述。

根据本发明所提供的构建方法中，还涉及一种用于构建cyp125、hsd4A、fadA5、chsE1、chsE2、kshA1和ksdD1基因过表达的重组质粒pMV261-genes，其主要由热休克蛋白启动子hsp60，目标基因编码区，以及卡那霉素抗性基因等组成。获取方式及重组质粒的构建方法在上段所述文献中也有详细描述。

本发明通过对自身可产生AD、ADD或9-OHAD的新金色分枝杆菌(Mycobacteriumneoaurum)进行代谢工程改造，构建出一系列甾醇侧链不完全降解产物PDC-M、Δ¹-PDC-M、9-OHPCD-M的工程菌。

根据本发明提供的用于生产一系列甾醇侧链不完全降解产物的工程菌株，这些菌株均敲除了ltp2，可获得甲酯化目标产物，然后根据各个产物的化学结构，理性开发具有不同甾体母核结构的PDC-M类甾体化合物。例如在积累9-OHAD的菌株中失活ltp2，可获得9OHPCD-M。在积累AD或ADD的菌株中失活ltp2，可积累PDC-M、Δ¹-PDC-M。除此之外，我们发现过表达ChsE1-E2和hsd4A可进一步的提高目标产物的积累。这些工程菌株可以大大提升甾体药物的生产效率和产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、简化生产步骤、提高药物前体的利用率，从而降低生产成本，与此同时，整体反应条件温和、环境友好，具有较高的经济效益和社会效益。

综上所述，本发明通过基因工程和代谢工程技术，通过在积累AD，ADD和9-OHAD的分支杆菌中敲除关键基因ltp2，以及过表达侧链降解途径基因从而获得一系列具备生产甾醇侧链不完全降解产物的工程菌株；这些菌株可以有选择的制备肾上腺皮质激素的重要甾体药物3-氧代-4,17(20)-孕二烯-20-羧酸及其甲酯物、3-氧代-1，4,17(20)-孕二烯-20-羧酸及其甲酯物和9α-羟基-3-氧代-4,17(20)-孕二烯-20-羧酸及其甲酯物等甾体化合物。上述这些工程菌株可以大大提升甾体药物的生产效率和产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、简化生产步骤、提高药物前体的利用率，从而降低生产成本，与此同时，整体反应条件温和、环境友好，具有较高的经济效益和社会效益。

附图说明

图1是ltp2基因敲除上下游同源臂的扩增结果；

图2是ltp2基因缺失菌株NwIB-XII，NwIB-I的PCR验证结果；

图3是构建成功的pMV261-hsd4A-ChsE1-E2质粒的PCR验证结果；

图4是构建成功的NwIB-IΔltp2-Ohsd4A&ChsE1-E2菌株PCR验证结果；

图5是构建成功的NwIB-XIIΔltp2-OkstD1菌株PCR验证结果；

图6是PDC-M的质谱图；

图7是Δ¹-PDC-M的质谱图；

图8是9-OHPDC的质谱图；

图9是PDC-M的液相图；

图10是Δ¹-PDC-M的液相图；

图11是9-OHPDC的液相图；

图12是PDC、PDC-M、△¹-PDC、△¹-PDC-M、9α-OHPDC、9α-OHPDC-M的结构式。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。

本文中涉及的溶液制备方法如下：

LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠(LB固体培养基，需额外添加20g/L琼脂粉)。

种子培养基：20.0g/L甘油，2.0g/L一水合柠檬酸，2.52g/L硝酸钾，0.5g/L七水硫酸镁，0.5g/L磷酸氢二钾，0.05g/L柠檬酸铁胺，pH 7.5。

发酵培养基：10.0g/L葡萄糖，2.0g/L一水合柠檬酸，3.5g/L磷酸氢二铵，0.5g/L七水硫酸镁，0.5g/L磷酸氢二钾，0.05g/L柠檬酸铁胺，pH 7.5。

甾醇侧链不完全降解产物的检测方法：

9OHPDC-M标准品的制备：从5L生物反应器中取9OHPDC-M工程菌NwIB-IΔltp2分批发酵15g/L植物甾醇7天后的发酵液。首先用磷酸将发酵液的pH值调至3左右。然后过滤去除发酵液中的菌体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次。将离心得到的有机相合并然后用蒸馏水洗涤2次和饱和盐水洗涤1次，最后用无水MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩。可获得9-OHPDC-M和其羧酸物9-OHPDC的混合物。用石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂进行硅胶柱层析分离纯化，最终回收9.86g 9-OHPDC-M和1.27g 9-OHPDC。

9OHPDC-M标准品溶液配制：称取10mg 9OHPDC-M，溶于甲醇溶液，定容于10mL容量瓶，标准品母液浓度为1mg/mL。

取发酵液样品500μl，用等体积的乙酸乙酯萃取，然后12000rpm离心10min，取300μl上层乙酸乙酯于新的1.5ml ep管中，置于通风橱挥干，准备用于液相色谱分析。

薄层色谱法：取10μL萃取后的乙酸乙酯，点样于薄层层析硅胶板，以石油醚：乙酸乙酯＝3:2(v/v)为展开剂。层析完成后，风干表面液体，用254nm紫外灯照射或喷撒10％的浓硫酸试剂，对比观察标准品及产物提取液的显色情况。

高效液相色谱法：如需准确测定9-OHPDC-M的含量，则需借助HPLC法。检测条件：Agilent 1100型色谱仪，色谱柱采用Eclipse Plus C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；柱温30℃，流动相为甲醇：水＝8:2(v/v)；流速1mL/min；检测波长254nm；进样量10μL。每个样品运行30min以确保全部样品全部通过检测器。

PDC-M和△¹-PDC-M产物标准品制备和薄层色谱法和9-OHPDC-M的方法一致，HPLC检测方法为：Agilent 1100型色谱仪，色谱柱采用Eclipse Plus C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；柱温30℃，流动相为甲醇：水＝7:3(v/v)；流速1mL/min；检测波长254nm；进样量10μL。每个样品运行40min以确保全部样品全部通过检测器。

新金色分枝杆菌的原始菌株Mycolicibacterium neoaurum购买于美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)，保藏号：ATCC 25795。改造的底盘菌株选择本实验室所构建的9-OHAD工程菌NwIB-I(K.Yao,L.Q.Xu,F.Q.Wang,D.Z.Wei,Characterization and engineering of 3-ketosteroid-big up tri,open1-dehydrogenase and 3-ketosteroid-9alpha-hydroxylase in Mycobacterium neoaurumATCC 25795to produce 9alpha-hydroxy-4-androstene-3,17-dione through thecatabolism of sterols,Metab Eng 24(2014)181-91.)和ADD或AD工程菌NwIB-XII(L.-Q.Xu,Y.-J.Liu,K.Yao,H.-H.Liu,X.-Y.Tao,F.-Q.Wang,D.-Z.Wei,Unraveling andengineering the production of 23,24-bisnorcholenic steroids in sterolmetabolism,Sci Rep 6(1)(2016)21928.)。甾醇侧链不完全降解产物的工程菌的构建过程主要包括关键基因ltp2的敲除以及组合过表达hsd4A和ChsE1-E2。若积累△¹-PDC-M产物还需在NwIB-XII△ltp2中过表达KstD1。所构建的工程菌可以大大提升甾体药物的生产效率和产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、简化生产步骤、提高药物前体的利用率，从而降低生产成本，具有较高的工业应用前景。

实施例1：PDC-M工程菌株的构建

发明人通过研究发现，在分支杆菌转化植物甾醇的过程中，来自Cho区，与细胞生长相关的一个保守操纵子igr甾醇C17烷基侧链降解的最后一轮β氧化过程中十分关键。该操纵子由六个基因组成，分别编码醛缩酶(Ltp2)、ChsH1和ChsH2组成的MaoC样水合酶(ChsH1-H2)、ChsE1和ChsE2组成的酰基辅酶A脱氢酶(ChsE1-E2)和一个细胞色素P450Cyp125(CYP125)。我们首先在实验室构建的AD工程菌NwIB-XII(Unraveling andengineering the production of 23,24-bisnorcholenic steroids in sterolmetabolism,Sci Rep 6(1)(2016)21928.)中敲除ChsH1-H2，ltp2以及整个igr操纵子，发现主产物均为PDC-M。因此将其相应的敲除菌株NwIB-XIIΔH12、NwIB-XIIΔltp2、NwIB-XIIΔigr命名为PDC-M系列工程菌。对比敲除菌的生长状况及产物积累，我们发现ltp2的敲除对菌株生长影响相对较小，且产物积累相对较高。因此锁定ltp2基因是积累PDC-M的关键基因。

新金色分枝杆菌中的ltp2基因(SEQ ID No:5)，其基因序列已上传NCBI数据库，GeneBank accession number:WP_019512512.1；Region:117577:118755:+，具体序列如下：

GTGACATCGTCCGGAAAGGCCGGCCTGTCCGGCAAAGCGGCGATCGCCGGTATCGGTGCCACCGATTTCTCCAAGAATTCCGGGCGCAGCGAGCTGCGACTGGCTGCCGAGGCGGTGCTCGACGCGCTCGATGACGCCGGGCTGGCGCCGTCCGATGTGGACGGTCTGGTCACCTTCACGATGGACTCCAACCTGGAGACCGCCGTCGCGCGGTCCACCGGCATCGGTGATCTGAAGTTCTTCAGCCAGATCGGTTATGGCGGCGGTGCGGCGGCGGCGACGGTGCAGCAGGCCGCGCTGGCCGTCGCGACCGGGGTGGCCGAGGTCGTGGTGGCCTACCGGGCCTTCAACGAGCGCTCCGAGTTCCGGTTCGGCCAGGTGATGACGGGGTTGACCGTCAACGCCGATTCGCGCGGCGTCGAGTACAGCTGGTCATACCCGCACGGCCTGAGCACACCCGCGGCGTCGGTGGCCATGATCGCGCAGCGCTATATGCACGAATACGGCGCCACCAGCGCCGATTTCGGTGCGGTATCGGTCGCCGATCGCAAGCACGCCGCAACCAACCCCAAGGCGCACTTCTACGGGAAGCCGATCACGATCGAGGATCACCAGAACTCCCGCTGGATCGCCGAACCGCTCCGGCTGCTGGACTGCTGCCAGGAGACCGACGGTGGCGTCGCGATCGTGGTCACCACCCCCGAGCGGGCCAAGGACCTCAAACATCGCCCGGCGGTCATCGAGGCGGCCGCGCAGGGGGCGGGGACCGATCAGTTCACCATGTACTCCTACTACCGCGAGGAGCTCGGGCTGCCCGAGATGGGCCTGGTCGGCCGCCAGCTGTGGGAGCAGAGCGGTCTGACGCCCGCGGATATCCAGACCGCGATCCTCTACGACCATTTCACCCCGTACACGCTGATCCAGCTCGAGGAGCTCGGCTTCTGCGGCAAGGGCGAGGCCAAGGATTTCATCGCCGGCGGGGCCATCGAGATCGGCGGGAAGCTACCCATCAACACCCACGGCGGACAGCTCGGCGAGGCGTATATCCACGGCATGAACGGGATCGCCGAAGGGGTGCGTCAGCTACGGGGAACGTCGGTCAACCAGGTTGACAATGTCGAACATGTGCTGGTCACGGCGGGTACCGGGGTGCCGACATCGGGTCTGATCCTCGGCTGA。

设计基因敲除同源臂引物序列如下：

pQC-ltp2-U-F(SEQ ID No:10):TATActgcagACCAGGCTCGCCATCAACGGGGTC

pQC-ltp2-U-R(SEQ ID No:11):GACCaagcttATCCACGGCATGAACGGGATCGCC

pQC-ltp2-D-F(SEQ ID No:12):GCGCaagcttGTCCATCGTGAAGGTGACCAGACC

pQC-ltp2-D-R(SEQ ID No:13):TATAgcggccgcGAGATGGACTGGCGCATCATGAAG。

引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，以无菌水溶解稀释至10μM使用，PCR扩增所用的高保真酶为Takara PrimerSTAR Max DNA。

上下游同源臂扩增：以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用同源臂引物pQC-ltp2-U-F&R和pQC-ltp2-D-F&R分别扩增上下游同源臂序列，PCR扩增体系如下。

PCR扩增条件：98℃预变性5min；98℃变性10s，(Tm-5)℃退火8s，72℃延伸1kb/min，反应30个循坏；72℃延伸5min。同源臂上游片段长度为1000bp，同源臂下游片段长度为996bp。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测条带单一，采用产物纯化试剂盒纯化回收，4℃保存备用。

p2NIL质粒及上下游同源臂酶切

取备用的p2NIL质粒(购自Addgene公司(www.addgene.org/20188/)编号：#20188)提取物和ltp2基因上下游同源臂纯化产物，p2NIL质粒提取物采用HindIII和BamHI进行酶切，上游同源臂利用HindIII和EcoRI进行酶切，下游同源臂利用EcoRI和BamHI进行酶切。内切酶均购自ThermoFisher Scientific公司，酶切体系及反应条件如下。

酶切反应条件：37℃，金属浴或水浴孵育1小时。酶切产物经纯化回收，-20℃保存备用。

T4酶连接：使用购买自ThermoFisher Scientific公司的T4连接酶体系，即连接酶，1μL；10×buffer，2μL；质粒载体和基因片段1：5比例，添加到T4连接酶体系，22℃孵育连接2h。随后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，使用卡那霉素(50μg/mL)抗性平板筛选，经菌落PCR扩增、测序验证后，获得重组质粒p2NIL-ltp2。

pQC-ltp2质粒的构建及电转化感受态：将pGOAL19质粒(购自Addgene公司(www.addgene.org/20190/)编号：#20190)产物、重组质粒p2NIL-Mn_hal分别用PacI酶切。pGOAL19质粒酶切产物回收长度为8900bp的片段，重组质粒p2NIL-Mn_hal酶切后直接纯化。将上述两个片段利用T4连接酶连接，转入大肠杆菌DH5α感受态，经菌落PCR扩增、测序验证，获得携带重组质粒pQC-ltp2的大肠杆菌DH5α转化菌株，扩大培养、抽提获得***质粒pQC-ltp2的纯化产物，经碱处理后，转移至分枝杆菌感受态细胞进行电转化(2.5kV，200欧姆，25μF，0.2cm电转化杯，电击时间5-6ms，电击两次)，孵育3-5h后的菌液，4500×g离心2min，弃上清保留100μL涂布卡那霉素和潮霉素抗性筛选平板。

待培养基长出蓝色菌落，挑菌转接LB培养基扩增，涂布蔗糖致死平板(2％蔗糖，200μL X-Gal(20mg/mL)及20μL IPTG(50mg/mL))，筛选正确的双交换突变菌株：

1)将蓝色菌落转接含50μg/mL卡那霉素、50μg/mL潮霉素的5mL液体LB试管，30℃振荡培养24-48h。

2)准备筛选平板：LB固体培养基，2％蔗糖，200μL X-Gal(20mg/mL)及20μL IPTG(50mg/mL)。

3)当菌液培养至OD＝1.5左右时，取50-100μL，涂布至上述平板。37℃倒置培养3-5d。

4)完成双交换基因删除的菌种不含筛选标记。待菌株长好后，挑取黄色单克隆，进行菌落PCR验证。

5)双交换验证引物为pQC-ltp2-U-F和pQC-ltp2-D-R，如能扩增出2000bp左右的单条带，此即为删除目标基因ltp2的正确转化子。

6)验证正确的单克隆，转接到5mL液体LB试管，30℃，220rpm振荡培养3天，保菌备用，即为工程菌NwIB-XII△ltp2。

应当理解的是，PDC-M工程菌NwIB-XII△H12、NwIB-XII△igr的构建方法同NwIB-XII△ltp2，其中，ChsH1-H2和igr的敲除引物序列如下所示：

pQC-H1H2-U-F(SEQ ID No:6)：TAGCAAGCTTGACGATACCCGGATGACCTGCGGC

pQC-H1H2-U-R(SEQ ID No:7)：TATAGCGGCCGCCGATCGAGCAGCAGATCTTCATCA

pQC-H1H2-D-F(SEQ ID No:8)：TAGCAAGCTTGACGATACCCGGATGACCTGCGGC

pQC-H1H2-D-R(SEQ ID No:9)：TATAGCGGCCGCCGATCGAGCAGCAGATCTTCATCA

pQC-igr-U-F(SEQ ID No:14)：GCACAAGCTTCGCGTTCTCGTCGACGTTCGGCCAC

pQC-igr-U-R(SEQ ID No:15)：TATAGAATTCCCGTCGCGCGGTCCACCGGCATCGG

pQC-igr-D-F(SEQ ID No:16)：GCGCGAATTCCATGTTGAGCAGGACGGCCTTCTGC

pQC-igr-D-R(SEQ ID No:17)：ATCGGGATCCCGTCGAGGTGGTAGTAGGTCTCGGC。

实施例2：△¹-PDC-M工程菌的构建

以实施例1中构建的初代PDC-M工程菌NwIB-XII△ltp2作为底盘菌株，过表达3酮基-△¹脱氢酶kstD1。

新金色分枝杆菌kstD1基因序列(SEQ ID No:22)，已上传NCBI数据库，GeneBankaccession number:WP_006246521.1；Region:121522:123153，具体序列如下。

TCAGGCCTTTCCAGCGAGATGCAATGCGGCGAGGTAGCCGAAGGTCATGGCGGGCCCGATTGTGCCACCCGGGCCGGGATAGGTGTGACCCATCACCGGCGAGCTGACATTGCCTGCCGCATAGAGGCCTTCGATCACCGAATTGTCATCGCGCAGCGCCCGGCCGTGCACGTCGGTGCGGATGCCACCCTTGGTGCCCAGGTCACCGGGCACCATCTTCGCGGCGTAGAACGGGCCGTGTTTGATCTCGCCGAGGTTCGGGTTCGGCTTGTTCGTCGGATCACCGTAGTAGCGGTCGTAGGCGCTCTCGCCGCGGTGGAAGTCCTCGTCGACGCCGGACCGTGCGAAACCGTTGAACCGTTCGATGGTGGCCTTCAGCGCGTCGGCGGCCACACCGGTCTTCTCGGCCAGCTCGGCCAGGCTATCGGCCTTGACGATGATGCCCGATTCCATCCACTTCTTCGGGATGCGTTGTCCGGGTTGCAATCCCGCAAAGATATAGCGATCGCGGTACTGCTGGTCGAAGATCATCCAGGCGGGCACGTTCTCGCCCGGCCCGGCGCCCTGGCCGTACTGACCGCCGTACATGTGGTGGCAGGCCTCCACGTAGGGCATCGATTCGTTCATGAACCGCTTACCGTTCATGTTGACGATGATCGACCCGGGGGAGTTGCGCTCGGAAAGGGCGAACCACGGGGCGCCCTCCAGCGGGACGGTCGGACCCCACCACGCGTCCTCCATGAGTTCCAGTGCCGCACCCAGCTTTTCGGCTGCCAGGATGCCGTCACCGGTGTTGGCGACGGCACCGACGGTCCACTCGGTGGTGATGGGCTGGCGCTGGTACTTGGTGCGCATCTCCTGGTTGTGTTCGAAACCGCCCGAACCGAGGATCACGCCCCTGCGGGCCCGGATCAGCTTCGGCTCGGCAGACTCGGGGGCACCGGCCTCGCGAACGTAGATTCCGCGCACCACCCCGTCCTCGATGTACAGGTCGGTCAGCGCGGTGTTCAGCAGCACCGGCACCCCGGCCTTCTGCAGACCGATGCGCAGCGGCGCGATGAGCGCCCGGCCCATGCCGACCAGGTTCTTGCCGGTGGCGTTGGCCCACACCGATCGCACACCCACCTTGATGCTGCGTAGCACGCCGCGCGGGTGACGCTTGAGCTGGTTGAGCCGGACATAGTCCTGTTGCAGTACCACCATGTTCAGCGGCACCTTGCCGTACGGCGGTTCGAGCCCCTTCTCGTCGGGACCGAGCTTCTTGGCGTTGAACGGCTTCGGCTCGACCGAGCGGCCGGTGGCCTTACCGCCCGGCGTCTCCGGGTAGTAGTCGGAGTAGCCGGGAACCCAGCACAGCTTCAGCGGCGAGTTCTTCAGCACGAACGACAACATCTCCGGACTGCGGTCCAGGTAGGTGTCGATCTTCTCGGCAGGCACCACATCGCCGATGATGGCGTGCAGGTACTTCCGTGCCTCCGCGGCGGTGTCTTTGACCCCGTCACGCTGAAGAACCTCGTTGTTGGGAATCCACAC

设计引物序列如下：

K1-F(SEQ ID No:23)：TGCAgaattc TCAGGCCTTTCCAGCGAGATGC

K1-R(SEQ ID No:24)：AGTAaagctt CCTCGTTGTTGGGAATCCACAC

261-YZ-F(SEQ ID No:25):GACAGGTAAAAGTCCTGGTAGACGC

261-YZ-R(SEQ ID No:26):ACGTCGCTTTGTTGGCTAGC

基因表达框扩增：以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用引物K1-F&R扩增序列kstD1的基因序列，PCR扩增体系配制、扩增条件、PCR产物纯化条件同实施例1。

pMV261-kstD1质粒的构建：

将pMV261质粒产物，基因表达框扩增产物，用BamHI&EcoRI酶切纯化回收，将两个片段通过连接酶连接转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布、菌落PCR扩增、测序验证，获得重组质粒。

取NwIB-XII△ltp2菌株制备感受态，随后将上述pMV261-kstD1质粒产物电转化导入NwIB-XII△ltp2菌株，获得基因型为NwIB-IΔltp2-O hsd4A&chsE1-E2的工程菌株，制备步骤如下：

1)向NwIB-XII△ltp2感受态(100μL)加入重组质粒pMV261-kstD1质粒产物，混匀，冰水浴20min。

2)将上述混悬菌液，转移至4℃预冷的电极杯，用Gene Pulser Xcell电穿孔仪电击两次(2.5kV，200欧姆，25μF，0.2cm电转化杯，电击时间5-6ms)，并迅速转入冰水浴，静置5min。

3)加入700μL的LB液体培养基，充分混悬，转移1.5mL无菌离心管，30℃摇床振荡培养3-4小时，取100μL涂布于抗性(卡那霉素50μg/mL)固体平板，在30℃培养箱倒置培养3天左右。

4)挑取单菌落，溶于10μL，卡那霉素50μg/mL的LB培养基，利用261-YZ-F&R进行PCR验证，即可获得基因型为NwIB-XII△ltp2-OkstD1的△¹-PDC-M菌株。

实施例3：9OHPDC-M工程菌株的构建

选择实验室所构建的一株积累9-OHAD的工程菌NwIB-I(K.Yao,L.Q.Xu,F.Q.Wang,D.Z.Wei,Characterization and engineering of 3-ketosteroid-big up tri,open1-dehydrogenase and 3-ketosteroid-9alpha-hydroxylase in Mycobacterium neoaurumATCC 25795to produce 9alpha-hydroxy-4-androstene-3,17-dione through thecatabolism of sterols,Metab Eng 24(2014)181-91)作为底盘菌株，首先敲除关键基因ltp2，敲除方法同实施例1，构建基因型为NwIB-I△ltp2的初代工程菌。为了提高甾醇侧链降解的代谢流指向9OHPDC-M，我们接下来组合过表达hsd4A和ChsE1-E2，优化NwIB-I△ltp2的生产性能。

新金色分枝杆菌hsd4A基因序列(SEQ ID No:27)，已上传NCBI数据库，GeneBankaccession number:KP642512.1；Region:1:912，具体序列如下：

ATGAACGACAACCCGATCGACCTGTCCGGAAAGGTTGCCGTCGTCACCGGCGCGGCCGCCGGCCTGGGCCGGGCCGAGGCGATAGGCCTGGCGCGGGCCGGCGCGACGGTCGTGGTCAACGACATGGCCGGCGCGCTGGACAACTCCGACGTGCTGGCCGAGATCGAAGCGGTCGGGTCCAAGGGCGTCGCGGTCGCCGGTGATATCAGCGCGCGCAGCACCGCCGACGAACTCGTCGAGACAGCCGACCGGCTCGGGGGACTGGGCATCGTGGTGAACAACGCCGGCATCACCCGGGACAAGATGCTGTTCAACATGTCCGACGAGGACTGGGACGCGGTGATCGCCGTGCATCTGCGCGGACACTTCCTGTTGACGCGCAATGCTGCGGCGTACTGGAAGGCGAAGGCCAAGGAGACCGCCGACGGACGGGTGTACGGACGGATCGTCAACACCTCCTCGGAGGCCGGGATCGCCGGACCGGTGGGTCAAGCCAATTACGGTGCCGCCAAGGCCGGTATCACGGCGTTGACGCTGTCGGCGGCGCGCGGGTTGAGCAGGTACGGGGTGCGGGCCAATGCCATCGCACCGCGGGCCCGCACCGCCATGACCGCCGGCGTGTTCGGTGATGCACCGGAGCTGGCGGACGGACAGGTCGATGCCCTCTCGCCGGAGCATGTCGTCACGCTCGTCACCTACCTGTCCTCCCCGGCGTCCGAGGATGTCAACGGGCAGCTGTTCATCGTGTACGGACCGACGGTCACCCTGGTTGCGGCGCCGGTTGCCGCCCACCGGTTCGATGCCGCCGGTGATGCCTGGGACCCCGCGGCGTTGAGCGACACGCTCGGTGACTTCTTTGCTAAAAGGGATCCGAATATTGGGTTCTCCGCAACTGAGCTCATGGGTTCTTGA

新金色分枝杆菌ChsE1、ChsE2基因序列(SEQ ID No:1，SEQ ID No:2)，已上传NCBI数据库，GeneBank accession number:WP_003419299.1、NP_218060.1；Region:114566:115564、115571:116734，具体序列如下。

ChsE1:GTGGACTTCACGCCGAAGCCCGAACAGCAGGCCGTCGCCGATGTGGTGACCTCGGTGCTGGAACGGGACAACAGCTGGGACGCACTGGTATCCGGTGGGGTGGCGGCGCTGGCGGTGCCCGAGCGCCTCGGTGGTGACGGGCTCGGACTGCCCGAGATCGCCACCGCGCTCACCGAGATCGGCAGGCGCGGTACGACCGGTGCGGCACTGGCCACGCTGGGTCTCGGGTTGCTGCCGCTGCTGGAGGTGGCCACCGATACCGAACAGGACCGCTATCTCGACGGGGTCGCCGGCGGGGCCGTGTTGTCGGCGGCGCTCAACGAGCCCGGAGTCTCGCTTCCCGAGCGCCCCTCGGTGACCCTGACCGACGGGAAGCTCACCGGAACCAAGATCGGTGTGCCCTATGCCGGCACCGCGCGATGGCTGTTGGTCACCGCGGACGGTGGGGTCGCGGTGATCGCTCCGACCGCGAGTGGGGTGACGCTGACCAAGACGCCGACCTCCAACGGCACCGACGAGTACGTGGTGGTCTTCGACGGCGCCGAGGTGGACGGAGTGCTCGCCAACGCCACGACCCGCCGAGTCAACCAGTTGGTGCTGGCCGCCACCGGAGCCTTCGCCGCGGGCCTGGTCGCCGGCGCGCTGCGACTTACCGCCGATTACGTGGCCACTCGCGAACAGTTCGGGCGTCCGCTGTCGACCTTCCAGACCGTCGCCGCGCAGCTCTCGGATGTCTATATCGCCTCGCGGACAATCGATCTCGCGGCCACGTCGGTGATCTACCGGTTGTCCGAGGGCCTCGATGCCGACGACGATCTGGCGCTGCTGGGCTATTGGATCACCTCGCAGGCGCCGCCGGCGATGCGGTTGTGTCATCATCTGCACGGCGGCATGGGAATGGATATCACCTATCCGATGGATCGGTATTTCTCCTCCATCAAGGACCTCACCCGCTTGCTGGGCGGGCCTGCGTATCGACTGGATCTGGTGGGAGCGTAA

ChsE2:ATGTACATCGAACTGACGCCGGAACAGCGCAAGCTGCAAGACGAATTCCGCGAGTACTTCTCGACGCTCATCACGCCGGAGGAAGCCGCGGCGATGGAGTCCGATCGCCACAACGAGGCCTATCGCGCGGTGATCAAGCGGATGGGCTCGGACGGCAAGCTGGGTGTGGGCTGGCCCAAGGAGTACGGCGGGCTCGGCTTCGGGCCGATCGAGCAGCAGATCTTCATCAACGAGGCCAACCGCGCCGATATCCCGCTGCCGATGGTCACGCTGCAGACGGTGGGCCCCACCCTGCAGGTGCACGGGACCGAACTGCAGAAGAAGAAGTTCCTGCCCGGGATCCTCGCCGGCGAGGTGCATTTCGCGATCGGTTACTCCGAGCCGGAGGCGGGCACCGATCTCGCCTCGCTGCGGACCACCGCGGTGCGCCACGGCGACGAGTACATCGTCAACGGCCAGAAGATGTGGACCACCGGCGCCCACGACGCCGACTACATCTGGCTGGCCTGCCGCACCGATCCGGAAGCCGCCAAGCACAAGGGCATTTCGATCCTGATCGTCGATACCAAGGATCCCGGCTACTCCTGGACGCCGATCATCCTCAGCGATGGGGCACACCACACCAACGCGTCGTATTACAACGACGTCCGGGTGCCCGCCGACATGCTGGTCGGCGAGGAACACGGCGGCTGGAAGCTCATCACGACCCAGCTCAACCACGAGCGCGTCGGGCTTGGCCCGGCCGGACGCATCGCCGGGATCTACGACGAGGTCCACGAGTGGGCGTGCATGCCCGGATCCGATGGTGTCGTGCCGATCGAACAGGACGACGCGCGTCGACTGCTGGCCCAGATCAAATCGATCTGGCGGATCAACGAGTTGCTGAACTGGCAGGTGGCCGCCTCGGGCGAGACCATCGCGGTGGCCGATGCGGCGGCGACGAAGGTCTTCTCCACCGAGCGCATCCAAGAGGTCGGCCGGCTGGCCGAAGAGGTCGTCGGCCGCTACGGCAACCCCGCCGATGCCCACACCGGCAGGCTGCTGGACTGGTTGGACAAGATGACCAAACGCAATCTGGTGATCACCTTCGGTGGCGGCGTCAACGAGGTCATGCGCGAAATGATCGCCGCGTCGGGGTTGAAGGTGCCGAGGGTGACCCGGTGA

设计引物序列如下：

4A-F(SEQ ID No:18)：TAGCCTGCAGAAATGAACGACAACCCGATCGACCTGT

4A-R(SEQ ID No:19)：GCGCAAGCTTTCAAGAACCCATGAGCTCAGTTGCG

4AE1E2-F(SEQ ID No:20)：GTGAAAGCTTGAGAAGGAGATATAATGAACGACAACCCGATC

4AE1E2-R(SEQ ID No:21)：AATTGTTAACTCAAGAACCCATGAGCTCAGTTGCGGAG

261-YZ-F(SEQ ID No:25)：GACAGGTAAAAGTCCTGGTAGACGC

261-YZ-R(SEQ ID No:26)：ACGTCGCTTTGTTGGCTAGC

基因表达框扩增：以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用引物4A-F&R扩增序列hsd4A的基因序列，PCR扩增体系配制、扩增条件、PCR产物纯化条件同实施例1。

pMV261-hsd4A质粒的构建：

将pMV261质粒产物，基因表达框扩增产物，用BamHI&EcoRI酶切纯化回收，将两个片段通过连接酶连接转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布、菌落PCR扩增、测序验证，重组质粒。

pMV261-hsd4A&ChsE1-E2质粒的构建：

重组质粒pMV261-hsd4A质粒采用HindIII和HpaI酶切，纯化回收得到质粒骨架，与chsE1-E2的基因序列片段进行T4连接，获得重组质粒连接产物pMV261-hsd4A&chsE1-E2；

3)将连接产物pMV261-hsd4A&chsE1-E2转化大肠杆菌DH5α，涂布卡那霉素抗性平板进行克隆筛选，经菌落PCR、质粒酶切和质粒测序验证，即可获得重组质粒pMV261-hsd4A&chsE1-E2。

取NwIB-IΔltp2菌株制备感受态，随后将上述pMV261-hsd4A&chsE1-E2质粒产物电转化导入NwIB-IΔltp2菌株，获得基因型为NwIB-IΔltp2-O hsd4A&chsE1-E2的工程菌株，制备步骤如下：

1)向NwIB-IΔltp2感受态(100μL)加入重组质粒pMV261-hsd4A&chsE1-E2质粒产物，混匀，冰水浴20min。

4)挑取单菌落，溶于10μL,卡那霉素50μg/mL的LB培养基，利用4A-F和4AE1E2-R进行PCR验证，即可获得基因型为NwIB-IΔltp2-O hsd4A&chsE1-E2的增强菌株。

实施例4：PDC-M、△¹-PDC-M、9OHPDC-M工程菌株的生产能力评估

将构建好的PDC的初代工程菌NwIB-XIIΔltp2、NwIB-XIIΔltp2-OkstD1、NwIB-IΔltp2，进行上罐放大。首先取50μl甘油菌转接5mL LB试管，30℃，220rpm培养3天，按10％(v/v)接种至30mL种子培养基，30℃，220rpm振荡培养2天，然后将一级种子培养液按10％(v/v)比例，再次转接150mL种子培养基，30℃，220rpm振荡培养1.5天。

发酵罐搅拌转速为300～800rpm，底物为15g/L的植物甾醇，植物甾醇由助溶剂羟丙基β环糊精溶解，植物甾醇：环糊精的质量比为1:4，溶氧偶联，溶氧控制在40％，温度为30℃，发酵168h。发酵结束后，对发酵液分别经过酸化，过滤，乙酸乙酯萃取，洗涤干燥，柱层析纯化等一系列操作，最终工程菌NwIB-XIIΔltp2可获得9.08g PDC-M和0.97g的羧酸物PDC，工程菌NwIB-XIIΔltp2-OkstD1可获得8.65g△¹-PDC-M和0.82g的羧酸物△¹-PDC，工程菌NwIB-IΔltp2可获得9.86g 9-OHPDC-M和1.27g的羧酸物9-OHPDC。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东理工大学

<120> 一种用于生产甾醇侧链不完全降解产物的基因工程菌株及其构建方法以及应

用

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> 新金色分枝杆菌（Mycolicibacterium neoaurum）

<400> 1

gtggacttca cgccgaagcc cgaacagcag gccgtcgccg atgtggtgac ctcggtgctg 60

gaacgggaca acagctggga cgcactggta tccggtgggg tggcggcgct ggcggtgccc 120

gagcgcctcg gtggtgacgg gctcggactg cccgagatcg ccaccgcgct caccgagatc 180

ggcaggcgcg gtacgaccgg tgcggcactg gccacgctgg gtctcgggtt gctgccgctg 240

ctggaggtgg ccaccgatac cgaacaggac cgctatctcg acggggtcgc cggcggggcc 300

gtgttgtcgg cggcgctcaa cgagcccgga gtctcgcttc ccgagcgccc ctcggtgacc 360

ctgaccgacg ggaagctcac cggaaccaag atcggtgtgc cctatgccgg caccgcgcga 420

tggctgttgg tcaccgcgga cggtggggtc gcggtgatcg ctccgaccgc gagtggggtg 480

acgctgacca agacgccgac ctccaacggc accgacgagt acgtggtggt cttcgacggc 540

gccgaggtgg acggagtgct cgccaacgcc acgacccgcc gagtcaacca gttggtgctg 600

gccgccaccg gagccttcgc cgcgggcctg gtcgccggcg cgctgcgact taccgccgat 660

tacgtggcca ctcgcgaaca gttcgggcgt ccgctgtcga ccttccagac cgtcgccgcg 720

cagctctcgg atgtctatat cgcctcgcgg acaatcgatc tcgcggccac gtcggtgatc 780

taccggttgt ccgagggcct cgatgccgac gacgatctgg cgctgctggg ctattggatc 840

acctcgcagg cgccgccggc gatgcggttg tgtcatcatc tgcacggcgg catgggaatg 900

gatatcacct atccgatgga tcggtatttc tcctccatca aggacctcac ccgcttgctg 960

ggcgggcctg cgtatcgact ggatctggtg ggagcgtaa 999

<210> 2

<211> 1164

<212> DNA

<213> 新金色分枝杆菌（Mycolicibacterium neoaurum）

<400> 2

atgtacatcg aactgacgcc ggaacagcgc aagctgcaag acgaattccg cgagtacttc 60

tcgacgctca tcacgccgga ggaagccgcg gcgatggagt ccgatcgcca caacgaggcc 120

tatcgcgcgg tgatcaagcg gatgggctcg gacggcaagc tgggtgtggg ctggcccaag 180

gagtacggcg ggctcggctt cgggccgatc gagcagcaga tcttcatcaa cgaggccaac 240

cgcgccgata tcccgctgcc gatggtcacg ctgcagacgg tgggccccac cctgcaggtg 300

cacgggaccg aactgcagaa gaagaagttc ctgcccggga tcctcgccgg cgaggtgcat 360

ttcgcgatcg gttactccga gccggaggcg ggcaccgatc tcgcctcgct gcggaccacc 420

gcggtgcgcc acggcgacga gtacatcgtc aacggccaga agatgtggac caccggcgcc 480

cacgacgccg actacatctg gctggcctgc cgcaccgatc cggaagccgc caagcacaag 540

ggcatttcga tcctgatcgt cgataccaag gatcccggct actcctggac gccgatcatc 600

ctcagcgatg gggcacacca caccaacgcg tcgtattaca acgacgtccg ggtgcccgcc 660

gacatgctgg tcggcgagga acacggcggc tggaagctca tcacgaccca gctcaaccac 720

gagcgcgtcg ggcttggccc ggccggacgc atcgccggga tctacgacga ggtccacgag 780

tgggcgtgca tgcccggatc cgatggtgtc gtgccgatcg aacaggacga cgcgcgtcga 840

ctgctggccc agatcaaatc gatctggcgg atcaacgagt tgctgaactg gcaggtggcc 900

gcctcgggcg agaccatcgc ggtggccgat gcggcggcga cgaaggtctt ctccaccgag 960

cgcatccaag aggtcggccg gctggccgaa gaggtcgtcg gccgctacgg caaccccgcc 1020

gatgcccaca ccggcaggct gctggactgg ttggacaaga tgaccaaacg caatctggtg 1080

atcaccttcg gtggcggcgt caacgaggtc atgcgcgaaa tgatcgccgc gtcggggttg 1140

aaggtgccga gggtgacccg gtga 1164

<210> 3

<211> 408

<212> DNA

<213> 新金色分枝杆菌（Mycolicibacterium neoaurum）

<400> 3

atgagtctga ccctgaccga cgtcgcggtc ggcaccacac tgcccgaact gcagatctac 60

ggtgacccga cgttcatcgt ctccaccgcc atcgccaccc gcgattacca ggatgtgcac 120

cacgaccggg acaaggcgca ggccaaggga tccaaggaca tcttcgtcaa catcctcacc 180

gataccggtc tggtcgggcg ttatgtcacc gactgggccg gtccggacgc gcgggtcaag 240

tccatcaagt tgcgccttgg ggtgccctgg tacgcctatg acaccatcac cttcagtggt 300

gaggtcaccg agatcgacgg cgatgtggtg accctgaaag tggtgggcgc caacagcctc 360

ggcaaccatg tcatcgccac ctcgacgctc accctggggg acaagtga 408

<210> 4

<211> 972

<212> DNA

<213> 新金色分枝杆菌（Mycolicibacterium neoaurum）

<400> 4

gtgagcgaac tgcaggcggg tatcgaggcg gtcctcgcgg cgggcagcag tagtccgacc 60

gtggcgcgcg acccggtgaa ccaacccatg atccatcact gggtcgatgc gatcggggac 120

aagaacccga tctacgtcga cgccgaggcg gcccgtgccg caggtcatcc gggtatcgtc 180

gccccgccgg cgatgatcca ggtgtggacc atgatggggc tggggcgttc ccgctccgat 240

gatgatccgc tcgcccgcgc catgaagctt ttcgatgacg ccggttatgt cggcgtcgtc 300

gccaccaact gcgaccagac ctatcaccgc tacctgcagc cgggggagca ggtggcgatg 360

agtgcggaga tcgtcggcat cgtcggtccc aaacagaccg cgctcggtga gggttacttc 420

atcaaccaga agatcagctg gcataccgtc ggggccggcg cggaggaact ggtcgccgag 480

atggactggc gcatcatgaa gttcctgccg gcagccaacg cggccaagac cgaaacggcc 540

gcgattcccg aggatctcga tcccgacaaa ctgatgcggc cgtcctcgtc gcgtgacacc 600

aagttcttct gggatggcgt caacgcacac gaactgcgta tccagcgccg cccggacggg 660

acgctgcagc acccaccggt ccccgcgatg tgggccgaca aagacgcacc cgccgattat 720

gtcgtctcct ccgggagggg cacggtgttc agctatgtcg tccaccatgc accgaaggtg 780

cccggccgca cgctgccctt cgtgatcgcc ctcgtcgaac tcgaggaggg cgttcggatg 840

ctcggcgagc tgcgtggggt ggatcccgag caggtgaaga tcggaatgcc ggtcaccgca 900

acctatatcg acttccccga cagtgaggtc agcccggcct ggacgttgta tgcatgggag 960

ccgcaagcat ga 972

<210> 5

<211> 1179

<212> DNA

<213> 新金色分枝杆菌（Mycolicibacterium neoaurum）

<400> 5

gtgacatcgt ccggaaaggc cggcctgtcc ggcaaagcgg cgatcgccgg tatcggtgcc 60

accgatttct ccaagaattc cgggcgcagc gagctgcgac tggctgccga ggcggtgctc 120

gacgcgctcg atgacgccgg gctggcgccg tccgatgtgg acggtctggt caccttcacg 180

atggactcca acctggagac cgccgtcgcg cggtccaccg gcatcggtga tctgaagttc 240

ttcagccaga tcggttatgg cggcggtgcg gcggcggcga cggtgcagca ggccgcgctg 300

gccgtcgcga ccggggtggc cgaggtcgtg gtggcctacc gggccttcaa cgagcgctcc 360

gagttccggt tcggccaggt gatgacgggg ttgaccgtca acgccgattc gcgcggcgtc 420

gagtacagct ggtcataccc gcacggcctg agcacacccg cggcgtcggt ggccatgatc 480

gcgcagcgct atatgcacga atacggcgcc accagcgccg atttcggtgc ggtatcggtc 540

gccgatcgca agcacgccgc aaccaacccc aaggcgcact tctacgggaa gccgatcacg 600

atcgaggatc accagaactc ccgctggatc gccgaaccgc tccggctgct ggactgctgc 660

caggagaccg acggtggcgt cgcgatcgtg gtcaccaccc ccgagcgggc caaggacctc 720

aaacatcgcc cggcggtcat cgaggcggcc gcgcaggggg cggggaccga tcagttcacc 780

atgtactcct actaccgcga ggagctcggg ctgcccgaga tgggcctggt cggccgccag 840

ctgtgggagc agagcggtct gacgcccgcg gatatccaga ccgcgatcct ctacgaccat 900

ttcaccccgt acacgctgat ccagctcgag gagctcggct tctgcggcaa gggcgaggcc 960

aaggatttca tcgccggcgg ggccatcgag atcggcggga agctacccat caacacccac 1020

ggcggacagc tcggcgaggc gtatatccac ggcatgaacg ggatcgccga aggggtgcgt 1080

cagctacggg gaacgtcggt caaccaggtt gacaatgtcg aacatgtgct ggtcacggcg 1140

ggtaccgggg tgccgacatc gggtctgatc ctcggctga 1179

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tagcaagctt gacgataccc ggatgacctg cggc 34

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tatagcggcc gccgatcgag cagcagatct tcatca 36

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tagcaagctt gacgataccc ggatgacctg cggc 34

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tatagcggcc gccgatcgag cagcagatct tcatca 36

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

tatactgcag accaggctcg ccatcaacgg ggtc 34

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gaccaagctt atccacggca tgaacgggat cgcc 34

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gcgcaagctt gtccatcgtg aaggtgacca gacc 34

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

tatagcggcc gcgagatgga ctggcgcatc atgaag 36

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gcacaagctt cgcgttctcg tcgacgttcg gccac 35

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

tatagaattc ccgtcgcgcg gtccaccggc atcgg 35

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

gcgcgaattc catgttgagc aggacggcct tctgc 35

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

atcgggatcc cgtcgaggtg gtagtaggtc tcggc 35

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

tagcctgcag aaatgaacga caacccgatc gacctgt 37

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

gcgcaagctt tcaagaaccc atgagctcag ttgcg 35

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

gtgaaagctt gagaaggaga tataatgaac gacaacccga tc 42

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

aattgttaac tcaagaaccc atgagctcag ttgcggag 38

<210> 22

<211> 1533

<212> DNA

<213> 新金色分枝杆菌（Mycolicibacterium neoaurum）

<400> 22

tcaggccttt ccagcgagat gcaatgcggc gaggtagccg aaggtcatgg cgggcccgat 60

tgtgccaccc gggccgggat aggtgtgacc catcaccggc gagctgacat tgcctgccgc 120

atagaggcct tcgatcaccg aattgtcatc gcgcagcgcc cggccgtgca cgtcggtgcg 180

gatgccaccc ttggtgccca ggtcaccggg caccatcttc gcggcgtaga acgggccgtg 240

tttgatctcg ccgaggttcg ggttcggctt gttcgtcgga tcaccgtagt agcggtcgta 300

ggcgctctcg ccgcggtgga agtcctcgtc gacgccggac cgtgcgaaac cgttgaaccg 360

ttcgatggtg gccttcagcg cgtcggcggc cacaccggtc ttctcggcca gctcggccag 420

gctatcggcc ttgacgatga tgcccgattc catccacttc ttcgggatgc gttgtccggg 480

ttgcaatccc gcaaagatat agcgatcgcg gtactgctgg tcgaagatca tccaggcggg 540

cacgttctcg cccggcccgg cgccctggcc gtactgaccg ccgtacatgt ggtggcaggc 600

ctccacgtag ggcatcgatt cgttcatgaa ccgcttaccg ttcatgttga cgatgatcga 660

cccgggggag ttgcgctcgg aaagggcgaa ccacggggcg ccctccagcg ggacggtcgg 720

accccaccac gcgtcctcca tgagttccag tgccgcaccc agcttttcgg ctgccaggat 780

gccgtcaccg gtgttggcga cggcaccgac ggtccactcg gtggtgatgg gctggcgctg 840

gtacttggtg cgcatctcct ggttgtgttc gaaaccgccc gaaccgagga tcacgcccct 900

gcgggcccgg atcagcttcg gctcggcaga ctcgggggca ccggcctcgc gaacgtagat 960

tccgcgcacc accccgtcct cgatgtacag gtcggtcagc gcggtgttca gcagcaccgg 1020

caccccggcc ttctgcagac cgatgcgcag cggcgcgatg agcgcccggc ccatgccgac 1080

caggttcttg ccggtggcgt tggcccacac cgatcgcaca cccaccttga tgctgcgtag 1140

cacgccgcgc gggtgacgct tgagctggtt gagccggaca tagtcctgtt gcagtaccac 1200

catgttcagc ggcaccttgc cgtacggcgg ttcgagcccc ttctcgtcgg gaccgagctt 1260

cttggcgttg aacggcttcg gctcgaccga gcggccggtg gccttaccgc ccggcgtctc 1320

cgggtagtag tcggagtagc cgggaaccca gcacagcttc agcggcgagt tcttcagcac 1380

gaacgacaac atctccggac tgcggtccag gtaggtgtcg atcttctcgg caggcaccac 1440

atcgccgatg atggcgtgca ggtacttccg tgcctccgcg gcggtgtctt tgaccccgtc 1500

acgctgaaga acctcgttgt tgggaatcca cac 1533

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

tgcagaattc tcaggccttt ccagcgagat gc 32

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

agtaaagctt cctcgttgtt gggaatccac ac 32

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

gacaggtaaa agtcctggta gacgc 25

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

acgtcgcttt gttggctagc 20

Claims

1.一种用于生产甾醇侧链不完全降解产物的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述基因工程菌株是通过对微生物进行代谢工程改造而成，所述基因工程菌株的构建方法包括以下步骤：

1）选择可降解转化甾醇的微生物，所述可降解转化甾醇的微生物是能够转化植物甾醇生产雄甾-4-烯-3,20-二酮、雄甾-1,4-二烯-3,20-二酮和/或9α-羟基-AD的新金色分枝杆菌；

2）针对微生物中igr操纵子，对其中的ltp2基因进行失活敲除；

3）对甾醇代谢途径中的关键基因hsd4A、chsE1、chsE2进行过表达；

其中，经过代谢工程改造后的基因工程菌株，通过转化植物甾醇，可用于生产获得孕甾-4,17(20)-二烯-20-羧酸及其对应的甲酯物PDC-M、孕甾-1,4,17(20)-三烯-20-羧酸及其对应的甲酯物△¹-PDC-M、9α-羟基-PDC及其对应的甲酯物9α-OHPDC-M。

2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，基因chsE1、chsE2、ltp2的核苷酸序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:5所示。

3.一种用于生产一系列甾醇侧链不完全降解产物的基因工程菌株，其特征在于，由根据权利要求1~2中任意一项所述的基因工程菌株的构建方法构建得到。

4.一种甾醇侧链不完全降解产物的制备方法，其特征在于，将按照权利要求1~2中任意一项所述的构建方法构建得到的基因工程菌株，通过以下两种方式：1）以发酵转化的方式，在培养生长的过程中投加植物甾醇，或者2）以静息细胞转化的方式，转化植物甾醇制备获得PDC、PDC-M、△¹-PDC、△¹-PDC-M、9α-OHPDC、9α-OHPDC-M这六种产物中任一种。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述基因工程菌株可转化植物甾醇获得PDC-M和PDC、△¹-PDC-M和△¹-PDC、9α-OHPDC-M和9α-OHPDC这三种组合中的任一组合。