CN106190881B - 菌株及其构建方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，特别涉及菌株及其构建方法、应用。本发明提供了高产菜油甾醇的菌株，在底盘菌株中导入外源功能基因DHCR7。本发明利用重组酿酒酵母及耶氏解脂酵母两种酵母底盘菌株生产菜油甾醇的方法相对于植物提取成本低、副产物少且污染小，为菜油甾醇的工业生产提供了一种切实可行的方法，并为下游孕酮、4AD等甾体激素类药物的生物合成打下基础，同时对其他种微生物高产菜油甾醇具有指导意义。

Description

菌株及其构建方法、应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及菌株及其构建方法、应用。
背景技术
目前，甾体激素类药物是仅次于抗生素的第二类药物，在制备保健品、治疗呼吸***疾病、内分泌失调、淋巴白血病、风湿病以及皮肤病等方面被广泛应用。菜油甾醇(campesterol)作为甾体激素类药物的重要中间体，可作为合成4AD、ADD、9α-OH-AD等重要甾体中间体和***、氢化可的松等重要甾体类药物的前体，在医药合成领域有重大应用。菜油甾醇的制备大多采用植物提取，但植物提取过程步骤多、收率低、副产物分离复杂，并且易对环境造成污染，极大的限制了菜油甾醇的生产和应用。而微生物合成以低成本、高产量和产品安全性等被认为是有前途的生产方法。
酿酒酵母作为公认的安全模式微生物，遗传背景清楚、基因操作简单、可进行大规模发酵生产。而耶氏解脂酵母是非常规酵母的一种，被认为是安全的，能用于药物和食品生产上。其适用于高密度发酵，异源蛋白表达量高，并且能够利用普通碳水化合物、油脂类、烷烃类物质为底物使之更适应工业化大规模生产。菜油甾醇在酵母细胞中的合成，需要将其内源生产麦角固醇的路径截断，同时引入外源基因进而获得菜油甾醇。
但是目前获得的重组菌株摇瓶发酵菜油甾醇的含量较低，无法满足工业化生产需求。
发明内容
有鉴于此，本发明提供菌株及其构建方法、应用。重组酿酒酵母及耶氏解脂酵母两种酵母底盘菌株生产菜油甾醇的方法相对于植物提取成本低、副产物少且污染小，为菜油甾醇的工业生产提供了一种切实可行的方法
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了高产菜油甾醇的菌株，在底盘菌株中导入外源功能基因DHCR7。
在本发明的一些具体实施方案中，所述外源功能基因包括斑马鱼(Danio rerio)来源的DHCR7基因或衣原体(Waddlia chondrophila WSU 86-1044)来源的DHCR7基因。
在本发明的一些具体实施方案中，所述斑马鱼(Danio rerio)来源的DHCR7基因的序列如SEQ ID No.1所示。
在本发明的另一些具体实施方案中，所述衣原体(Waddlia chondrophila WSU86-1044)来源的DHCR7基因的序列如SEQ ID No.2所示。
在本发明的一些具体实施方案中，所述底盘菌株为酵母。
在本发明的一些具体实施方案中，所述酵母包括酿酒酵母或耶氏解脂酵母。
在本发明的一些具体实施方案中，所述酿酒酵母为酿酒酵母CEN.PK2-1，所述耶氏解脂酵母为耶氏解脂酵母ATCC 201249。
在本发明的一些具体实施方案中，所述菌株的构建方法为：以酿酒酵母CEN.PK2-1为底盘菌株，利用CRISPR技术敲除内源ERG5基因，将所述外源功能基因整合至酿酒酵母底盘菌基因组。
在本发明的另一些具体实施方案中，所述菌株的构建方法为：以耶氏解脂酵母ATCC 201249为底盘菌株，在不敲除ERG5的基础上，利用整合型质粒pYLEX1在底盘菌基因组上整合所述外源功能基因。
本发明还提供了所述的菌株在发酵生产菜油甾醇中的应用。
本发明还提供了所述的菌株的构建方法，以酿酒酵母CEN.PK2-1为底盘菌株，利用CRISPR技术敲除内源ERG5基因，将所述外源功能基因整合至酿酒酵母底盘菌基因组。
本发明还提供了所述的菌株的构建方法，以耶氏解脂酵母ATCC 201249为底盘菌株，在不敲除ERG5的基础上，利用整合型质粒pYLEX1在底盘菌基因组上整合所述外源功能基因。
本发明还提供了发酵生产菜油甾醇的方法，以所述的菌株接种、发酵，收集菌液，提取获得菜油甾醇。
发酵方法：
将本发明提供的菌株SyBE_Sc00080017-SyBE_Sc00080027接种于2mL一级种子培养基中，在30℃、250rpm培养24h，以初始菌体浓度OD600＝0.2分别接种于二级种子培养基中，在30℃、250rpm培养12h，再以初始菌体浓度OD600＝0.2分别接种于50mL发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养，监测发酵过程中的菌体密度(OD600)，发酵72小时结束，取全部菌液提取菜油甾醇。
菜油甾醇提取方法：取42mL发酵液，6000rpm离心5min收集菌体，水洗两次。用液氮冷冻细胞并在研钵中研磨，直到细胞被研磨成白色极细粉末，转移至新10mL离心管中，加入2mL甲醇配制的1.5MKOH，60℃水浴皂化反应过夜。皂化后加入2mL分析纯正己烷涡旋震荡10min对产物进行萃取，5000rpm离心10min收集有机相真空冷冻干燥2小时，加入400μL正己烷溶解再次冷冻干燥4小时，加入400μL色谱甲醇溶解，用2μm有机滤膜过滤后使用高效液相色谱(HPLC)检测菜油甾醇含量，流动相为乙腈：异丙醇＝3:1，流速为1mL/min，检测波长205nm，柱温35℃，进样量10μL。
或
将本发明提供的菌株SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008接种于5mL一级种子培养基中，在30℃、250rpm培养24h，以初始菌体浓度OD600＝0.2分别接种于二级种子培养基中，在30℃、250rpm培养18h，再以初始菌体浓度OD600＝0.2分别接种于50mL发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养，监测发酵过程中的菌体密度(OD600)，发酵144小时结束，取10mL菌液提取菜油甾醇。
菜油甾醇提取方法：取10mL发酵液，6000rpm离心5min收集菌体，水洗两次。用液氮冷冻细胞并在研钵中研磨，直到细胞被研磨成白色极细粉末，转移至新10mL离心管中，加入2mL甲醇配制的1.5MKOH，60℃水浴皂化反应过夜。皂化后加入2mL分析纯正己烷涡旋震荡10min对产物进行萃取，5000rpm离心10min收集有机相真空冷冻干燥2小时，加入400μL正己烷溶解再次冷冻干燥4小时，加入400μL衍生化试剂N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)30℃水浴2小时，用2μm有机滤膜过滤后利用GC-TOF/MS检测菜油甾醇含量。
本发明提供了高产菜油甾醇的菌株，在底盘菌株中导入外源功能基因DHCR7。实施例1实验结果表明，发酵72小时，Sc_Dr_DHCR7的产量最高，达到24.66mg/L。由此可知，筛选最优的基因来源对于重组酿酒酵母生产菜油甾醇有积极意义。
实施例2实验结果表明，发酵144小时，在不截断ERG5基因基础上菌株也能够合成菜油甾醇，其中Yl_Dr_DHCR7的产量最高，达到73.07mg/L，而已报道的耶氏解脂酵母菜油甾醇生产最佳DHCR7基因来源Yl_Xl_DHCR7产量为16.43mg/L。由此可知，筛选最优的基因来源对于重组耶氏解脂酵母生产菜油甾醇有积极意义，并且在重组耶氏解脂酵母中斑马鱼(Danio rerio)来源DHCR7基因效果明显好于已报道最高产量的基因来源。
本发明利用重组酿酒酵母及耶氏解脂酵母两种酵母底盘菌株生产菜油甾醇的方法相对于植物提取成本低、副产物少且污染小，为菜油甾醇的工业生产提供了一种切实可行的方法，并为下游孕酮、4AD等甾体激素类药物的生物合成打下基础，同时对其他种微生物高产菜油甾醇具有指导意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示重组酿酒酵母及耶氏解脂酵母合成菜油甾醇的路径图；
图2示酿酒酵母ERG5基因CRISPR敲除质粒构建过程图；
图3示酿酒酵母游离多拷贝质粒构建过程图；
图4示重组酿酒酵母菌株11种来源DHCR7基因的菜油甾醇摇瓶产量比较图；
图5示耶氏解脂酵母整合型质粒构建过程图；
图6示重组耶氏解脂酵母菌株6种来源DHCR7基因的菜油甾醇摇瓶产量比较图；
图7示实施例1菜油甾醇标准曲线；
图8示实施例2菜油甾醇标准曲线。
具体实施方式
本发明公开了菌株及其构建方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的菌株及其构建方法、应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
重组酿酒酵母合成菜油甾醇外源功能基因dhcr7的来源筛选
本发明的生产菜油甾醇的重组酿酒酵母菌株的构建方法如下：
1、外源功能基因元件的获得
外源基因为用于合成菜油甾醇的关键酶C7位还原酶DHCR7基因：选取11种不同来源的功能基因筛选合成菜油甾醇最优的基因来源，DHCR7的基因来源包括褐家鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)、普通狨(Callithrix jacchus)、牛(Bos taurus)、原鸡(Gallus gallus)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、扁藻(Tetraselmissp.GSL018)、衣原体(Waddlia chondrophila WSU 86-1044)、(CandidatusProtochlamydia amoebophila UWE25)、斑马鱼(Danio rerio)等，依次简写为Sc_Rn_DHCR7、Sc_Mm_DHCR7、Sc_Hs_DHCR7、Sc_Cj_DHCR7、Sc_Bt_DHCR7、Sc_Gg_DHCR7、Sc_Xl_DHCR7、Sc_Ts_DHCR7、Sc_Wc_DHCR7、Sc_Cpa_DHCR7、Sc_Dr_DHCR7，具体基因序列见表1。上述基因均为经过酿酒酵母密码子优化并适当规避BsaⅠ限制性内切酶酶切位点，在基因两端额外添加5’端gcggccgcggtctcca；3’taaaggagaccgcggccgc通过人工合成得到。
表1
Figure BDA0001059963030000051
Figure BDA0001059963030000061
2、敲除ERG5基因的重组酿酒酵母的构建
利用CRSPR技术将实验已有质粒pCRCT及合成的ERG5基因敲除模块用Golden Gate方法进行构建，获得pCRCT-ERG5质粒，采用醋酸锂法将质粒转化到CEN.PK2-1底盘菌株中，利用Sc-URA固体平板(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖22g/L，缺尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提酵母基因组，对突变区域进行PCR及测序验证，将验证正确的重组菌株接入5mLYPD液体培养基中30℃、250rpm培养12h，再次转接液体YPD中一共转接三次，利用YPD及Sc-URA固体平板进行筛选，挑取YPD平板上生长并未在Sc-URA平板上生长的单菌落，对该重组菌株保存甘油菌并命名为SyBE_Sc00080007。
3、构建生产菜油甾醇的重组酿酒酵母菌株
首先，将实验室模块库中pRS425K-ENO2t-PDC1p-GPM1t质粒(可在http://synbioml.org/免费获取)及获得的外源DHCR7基因用Golden Gate方法进行构建，获得11种来源dhcr7的pRS425K-ENO2t-PDC1p-DHCR7-GPM1t酿酒酵母重组游离型多拷贝质粒，采用醋酸锂法将11种质粒分别转化到SyBE_Sc00080007底盘菌株中，采用Sc-LEU固体平板(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖22g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后进行菌落PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Sc00080017、SyBE_Sc00080018、SyBE_Sc00080019、SyBE_Sc00080020、SyBE_Sc00080021、SyBE_Sc00080022、SyBE_Sc00080023、SyBE_Sc00080024、SyBE_Sc00080025、SyBE_Sc00080026和SyBE_Sc00080027。其中，各菌株所含质粒如下
SyBE_Sc00080017：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Rn_DHCR7-GPM1t
SyBE_Sc00080018：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Mm_DHCR7-GPM1t
SyBE_Sc00080019：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Hs_DHCR7-GPM1t
SyBE_Sc00080020：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Cj_DHCR7-GPM1t
SyBE_Sc00080021：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Bt_DHCR7-GPM1t
SyBE_Sc00080022：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Gg_DHCR7-GPM1t
SyBE_Sc00080023：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Xl_DHCR7-GPM1t
SyBE_Sc00080024：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Ts_DHCR7-GPM1t
SyBE_Sc00080025：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Wc_DHCR7-GPM1t
SyBE_Sc00080026：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Cpa_DHCR7-GPM1t
SyBE_Sc00080027：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Dr_DHCR7-GPM1t
4、比较菌株SyBE_Sc00080017-SyBE_Sc00080027的菜油甾醇摇瓶产量
试验材料：菌株SyBE_Sc00080017-SyBE_Sc00080027
试验方法：
一级、二级种子培养基：20g/L葡萄糖、6.7g/L YNB(Yeast Nitrogen Base)、2g/L缺亮氨酸的混合氨基酸粉末、100mg/L腺嘌呤；
发酵培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉、100mg/L腺嘌呤
将上述菌株SyBE_Sc00080017-SyBE_Sc00080027接种于2mL一级种子培养基中，在30℃、250rpm培养24h，以初始菌体浓度OD600＝0.2分别接种于二级种子培养基中，在30℃、250rpm培养12h，再以初始菌体浓度OD600＝0.2分别接种于50mL发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养，监测发酵过程中的菌体密度(OD600)，发酵72小时结束，取全部菌液提取菜油甾醇。
菜油甾醇提取方法：取42mL发酵液，6000rpm离心5min收集菌体，水洗两次。用液氮冷冻细胞并在研钵中研磨，直到细胞被研磨成白色极细粉末，转移至新10mL离心管中，加入2mL甲醇配制的1.5MKOH，60℃水浴皂化反应过夜。皂化后加入2mL分析纯正己烷涡旋震荡10min对产物进行萃取，5000rpm离心10min收集有机相真空冷冻干燥2小时，加入400μL正己烷溶解再次冷冻干燥4小时，加入400μL色谱甲醇溶解，用2μm有机滤膜过滤后使用高效液相色谱(HPLC)检测菜油甾醇含量，流动相为乙腈：异丙醇＝3:1，流速为1mL/min，检测波长205nm，柱温35℃，进样量10μL。
试验结果：
标准曲线见图7。
由图7及图4菌株SyBE_Sc00080017-SyBE_Sc00080027的菜油甾醇产量来看，发酵72小时，Sc_Dr_DHCR7的产量最高，达到24.66mg/L。由此可知，筛选最优的基因来源对于重组酿酒酵母生产菜油甾醇有积极意义。
高效液相色谱(HPLC)检测原始数据见表2。
表2
Figure BDA0001059963030000081
Figure BDA0001059963030000091
实施例2
重组耶氏解脂酵母合成菜油甾醇外源功能基因dhcr7的来源筛选
本发明的生产菜油甾醇的重组耶氏解脂酵母菌株的构建方法如下：
1、外源功能基因元件的获得
外源基因为用于合成菜油甾醇的关键酶C7位还原酶DHCR7基因：选取6种不同来源的功能基因，筛选合成菜油甾醇最优的基因来源，其中含天津大学元英进课题组筛选菜油甾醇产量最高的非洲爪蟾(Xenopus laevis)DHCR7基因，DHCR7的基因来源包括非洲爪蟾(Xenopus laevis)、人(Homo sapiens)、原鸡(Gallus gallus)、斑马鱼(Danio rerio)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、衣原体(Waddlia chondrophila)等，依次简写为Yl_Xl_DHCR7、Yl_Hs_DHCR7、Yl_Gg_DHCR7、Yl_Dr_DHCR7、Yl_At_DHCR7、Yl_Wc_DHCR7，具体基因序列见表3。上述基因均为经过耶氏解脂酵母密码子优化通过人工合成得到。
表3
不同来源的dhcr7基因 序列编号
非洲爪蟾(Xenopus laevis) SEQ ID No.12
人(Homo sapiens) SEQ ID No.13
原鸡(Gallus gallus) SEQ ID No.14
斑马鱼(Danio rerio) SEQ ID No.15
拟南芥(Arabidopsis thaliana) SEQ ID No.16
衣原体(Waddlia chondrophila) SEQ ID No.17
2、构建生产菜油甾醇的重组耶氏解脂酵母菌株
在不截断ERG5基因基础上引入外源DHCR7基因。首先，将获得的外源DHCR7基因进行PCR扩增在基因两端分别引入BglII、KpnⅠ两个限制性内切酶酶切位点，经BglII、KpnⅠ双酶切后利用In-Fusion cloning reaction重组到经BamHⅠ、KpnⅠ线性化的pYLEX1质粒上，获得6种来源dhcr7的pYLEX1-DHCR7耶氏解脂酵母重组整合型单拷贝质粒，采用醋酸锂法将6种质粒分别转化到ATCC 201249底盘菌株中，整合于基因组pBR322platform位置，采用Sc-LEU固体平板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖22g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008。其中，各菌株基因组基因型如下
SyBE_Yl02060002：pBR322::Yl_Xl_DHCR7
SyBE_Yl02060004：pBR322::Yl_Hs_DHCR7
SyBE_Yl02060005：pBR322::Yl_Gg_DHCR7
SyBE_Yl02060006：pBR322::Yl_Dr_DHCR7
SyBE_Yl02060007：pBR322::Yl_At_DHCR7
SyBE_Yl02060008：pBR322::Yl_Wc_DHCR7
3、比较菌株SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008的菜油甾醇摇瓶产量
试验材料：菌株SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008
试验方法：
一级、二级种子培养基：22g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；
发酵培养基：50g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉
将上述菌株SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008接种于5mL一级种子培养基中，在30℃、250rpm培养24h，以初始菌体浓度OD600＝0.2分别接种于二级种子培养基中，在30℃、250rpm培养18h，再以初始菌体浓度OD600＝0.2分别接种于50mL发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养，监测发酵过程中的菌体密度(OD600)，发酵144小时结束，取10mL菌液提取菜油甾醇。
菜油甾醇提取方法：取10mL发酵液，6000rpm离心5min收集菌体，水洗两次。用液氮冷冻细胞并在研钵中研磨，直到细胞被研磨成白色极细粉末，转移至新10mL离心管中，加入2mL甲醇配制的1.5MKOH，60℃水浴皂化反应过夜。皂化后加入2mL分析纯正己烷涡旋震荡10min对产物进行萃取，5000rpm离心10min收集有机相真空冷冻干燥2小时，加入400μL正己烷溶解再次冷冻干燥4小时，加入400μL衍生化试剂N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)30℃水浴2小时，用2μm有机滤膜过滤后利用GC-TOF/MS检测菜油甾醇含量。
试验结果：
菜油甾醇标准曲线见图8。
由图8及图6菌株SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008的菜油甾醇产量来看，发酵144小时，在不截断ERG5基因基础上菌株也能够合成菜油甾醇，其中Yl_Dr_DHCR7的产量最高，达到73.07mg/L，而已报道的耶氏解脂酵母菜油甾醇生产最佳DHCR7基因来源Yl_Xl_DHCR7产量为16.43mg/L。由此可知，筛选最优的基因来源对于重组耶氏解脂酵母生产菜油甾醇有积极意义，并且在重组耶氏解脂酵母中斑马鱼(Danio rerio)来源DHCR7基因效果明显好于已报道最高产量的基因来源。
气质联用(GC-TOF/MS)检测原始数据见表4。
表4
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本发明揭示在重组酿酒酵母及耶氏解脂酵母两种模式菌株中，斑马鱼(Daniorerio)来源C7位还原酶(DHCR7)均具有最佳的效果，该结论同时也为其他种微生物高产菜油甾醇提供指导意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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Claims (3)

1.高产菜油甾醇的菌株，其特征在于，在底盘菌株中导入外源功能基因DHCR7；
所述外源功能基因包括斑马鱼（Danio rerio）来源的DHCR7基因或衣原体（Waddlia chondrophila WSU 86-1044）来源的DHCR7基因；
所述斑马鱼（Danio rerio）来源的DHCR7基因的序列如SEQ ID No.15所示；
所述衣原体（Waddlia chondrophila WSU 86-1044）来源的DHCR7基因的序列如SEQ IDNo.17所示；
所述底盘菌株为耶氏解脂酵母；
以耶氏解脂酵母ATCC 201249为底盘菌株，在不敲除ERG5的基础上，利用整合型质粒pYLEX1在底盘菌基因组上整合所述外源功能基因。
2.一种如权利要求1所述的菌株在发酵生产菜油甾醇中的应用。
3.发酵生产菜油甾醇的方法，其特征在于，以权利要求1所述的菌株接种、发酵，收集菌液，提取获得菜油甾醇。
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