CN109971817B - 简单节杆菌与基因工程酵母菌株顺序转化制备宝丹酮 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种甾体类药物的生产方法,具体涉及利用简单节杆菌与基因工程酵母菌株顺序发酵制备宝丹酮甾体化合物的方法。本发明首先提供一株能高效表达17β羰基还原酶的毕赤酵母基因工程菌株,其次利用上述毕赤酵母基因工程菌,提供一种微生物顺序转化发酵化合物AD制备化合物BD的方法,该方法是将AD先经简单节杆菌发酵后,将反应体系灭活,再经毕赤酵母基因工程菌株顺序发酵制备化合物宝丹酮。
Description
技术领域:
本发明涉及一种甾体类药物的生产方法,具体涉及利用简单节杆菌与基因工程酵母菌株顺序发酵制备宝丹酮甾体化合物的方法。
背景技术:
宝丹酮(BD)又名勃地酮,是一种白色或类白色结晶性粉末,其分子式为C19H26O2。宝丹酮是睾酮的衍生物,因此继承了睾酮的大部分性质,具有雄性激素能力和蛋白质合成能力。宝丹酮能使肌纤维细胞的氮平衡状态随时保持趋于正向,使肌纤维细胞加速合成蛋白质,肌纤维细胞因此而扩张膨胀,对体能锻炼者增强肌肉和耐力有很大功效。长期以来,宝丹酮的原料生产企业在国内并不多,且多为化学法合成。化学法因其生产步骤繁琐、涉及有毒有害试剂的使用、高污染等问题,不利于工业大规模生产。因此,如何通过生物合成途径来替代化学合成方法,并建立高效的生物合成策略,是目前亟待解决的关键性问题。
近年来,研究者在通过微生物转化法合成宝丹酮的相关研究多集中于利用单一菌株进行催化,且其催化过程依然存在底物投料浓度低、转化效率不足等问题。虽然Mucorracemosus,Nostocmuscorum,Arihrobacteroxydans等微生物,都能够以雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)为底物,通过17β羰基还原作用生产BD,但是它们中很少有微生物能够直接以价格相对低廉的雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)为底物合成BD。AD是合成ADD的前体物质,AD经3-甾酮-△1-脱氢酶(KsdD)的C1,2位脱氢作用可以合成ADD,ADD再经17β羰基还原作用生成目的产物BD。虽然已有研究将真菌来源的KsdD蛋白于毕赤酵母中外源表达可以获得产物BD,但由于毕赤酵母自身的17β羰基还原作用不够强,因此其底物投料量及BD产量并不高。
目前为止,还未发现有微生物同时具有较强的C1,2位脱氢作用及较强的17β羰基还原作用。简单节杆菌(Arthrobacter simplex)因为转化效率高、反应速率快等优点,已成为工业生产中广泛使用的甾体C1,2脱氢反应菌株;而酵母来源的17β羰基还原酶具有较强的17β羰基还原作用。目前,尚未有利用简单节杆菌和酵母菌株进行联合发酵生产BD的相关研究。
发明内容:
为解决上述问题,节约成本并提高产品收率,本发明首先提供一株能高效表达17β羰基还原酶的毕赤酵母基因工程菌株,其次利用上述毕赤酵母基因工程菌,提供一种微生物顺序转化化合物AD制备化合物BD的方法,该方法是将AD先经简单节杆菌发酵后,将反应体系灭活,再经毕赤酵母基因工程菌株顺序发酵制备化合物宝丹酮。
所述毕赤酵母基因工程菌株,是在毕赤酵母宿主细胞中过表达17β羰基还原酶编码基因所述的;
优选地,所述毕赤酵母宿主细胞为毕赤酵母GS115;
优选地,所述17β羰基还原酶(GenBank编号为:KZV10489.1)编码基因为ayr1基因,Gene ID:854682;
优选地,所述毕赤酵母基因工程菌株为毕赤酵母(P.pastoris)GS115AYR1S.c,是通过在毕赤酵母GS115中通过质粒pPIC3.5K表达Gene ID:854682所示的ayr1基因所得;
所述微生物顺序转化发酵化合物AD制备化合物BD的方法具体如下:
在含有底物AD浓度为3g/L-10g/L的生物转化体系中,投加生物量为4-6g/L(湿重)的具有C1,2脱氢能力的简单节杆菌,待中间产物ADD的量达到最高后,将反应体系灭活,再经25-200g/L(湿重)的毕赤酵母基因工程菌株(Pichia pastoris)GS115AYR1S.c顺序发酵制备化合物宝丹酮;
进一步地,所述生物转化体系为50mM PBS缓冲溶液(pH 7.2);
进一步地,简单节杆菌的发酵时间为25-50h,发酵条件为:20-40℃,150-250r/min;
进一步地,反应体系灭活条件为:121℃,20min;
进一步地,添加毕赤酵母同时,在体系中加入终浓度0-100g/L的葡萄糖;
优选地,葡萄糖浓度为75g/L;
进一步地,毕赤酵母基因工程菌株的发酵时间为2-4h,发酵条件为:20-40℃,150-250r/min;
优选地,所述简单节杆菌为简单节杆菌(Arthrobacter simplex)TCCC 11037;
优选地,生物转化体系中采用羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)作为底物助溶剂,其与底物AD的摩尔比为0-2:1;
优选地,HP-β-CD作为底物助溶剂,其与底物AD的摩尔比为1:1;
上述反应结束后,发酵体系中的BD的产量可以达到1.68-7.7g/L,产率达到56%-83%。
有益效果:
(1)本发明首次实现了利用微生物联合发酵转化AD制备化合物BD的方法,并且使BD的最终产率达到83%,达到了提高化合物BD产率的目的,具有良好的应用价值和推广前景。
(2)本发明可以提高反应体系中的辅酶利用率,降低体系中的氧化作用,提高BD最终转化率。
(3)本发明所述的微生物联合发酵简单便捷,便于实现,效果显著。
附图说明:
图1重组质粒pPIC3.5K-ayr1的PCR分析
其中,M:DL5000DNA Marker;1,2:pPIC3.5K-ayr1S.cPCR产物;
图2重组质粒pPIC3.5K-ayr1经BamHⅠ和EcoRⅠ的双酶切分析
其中M:1kbDNA Marker;1,2:pPIC3.5K-ayr1S.c双酶切产物;
图3含有重组表达载体pPIC3.5K-ayr1的P.pastoris GS115基因工程菌株的PCR验证
其中,M:DL5000DNA Marker;1,2:pPIC3.5K-ayr1S.c重组P.pastoris GS115基因组PCR产物;
图4简单节杆菌和重组毕赤酵母双菌同时转化AD;
图5重组毕赤酵母对AD及ADD的转化;
图6失活简单节杆菌对BD生产的影响。
具体实施方式:
下面将通过实施例对本发明做进一步描述,以下实施例只是描述性的,不是限定性的,不能以此限定本发明的保护范围。
本发明的简单节杆菌(Arthrobacter simplex)TCCC 11037和毕赤酵母基因工程菌株(P.pastoris)GS115AYR1S.c通过常规的斜面培养、种子培养以发酵培养,得到生物转化用湿菌体,本发明以下实施例如未特别说明则所用湿菌体获得方法如下:
简单节杆菌(Arthrobacter simplex)TCCC 11037:
(1)斜面培养:
斜面培养基:1%葡萄糖,1%酵母膏,2%琼脂,调pH至7.2;
培养条件:32℃,3-5天;
(2)种子培养:
种子培养基:1%葡萄糖,1%玉米浆(上清),0.5%蛋白胨,0.25%磷酸二氢钾,调pH至7.2;
培养条件:32℃,160r/min,18小时;
(3)发酵培养:
发酵培养基:1%葡萄糖,1%玉米浆(上清),0.5%蛋白胨,0.25%磷酸二氢钾,调pH至7.2的接种量将种子液接入发酵培养基中,32℃,200r/min,16小时时加入乙醇溶解的底物AD,使发酵液的底物终浓度为0.1%,诱导简单节杆菌细胞产生脱氢酶,继续培养8h后,发酵结束。
发酵培养结束后,将发酵培养液于4℃,5000×g下离心10min,弃去上清液,用0.05mol/L的PBS缓冲液(pH 7.2)将离心得到的菌体洗涤2次,5000×g离心10min,收集细胞得湿菌体。
毕赤酵母基因工程菌株(P.pastoris)GS115AYR1S.c:
(1)斜面培养:
斜面培养基:1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,2%葡萄糖,2%琼脂粉;
培养条件:30℃,3-5天;
(2)种子培养:
种子培养基:1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,2%葡萄糖;
培养条件:30℃,200r/min,20小时;
(3)发酵培养
发酵培养基:1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,100mmol/L磷酸钾(pH 6.0),1.34%YNB(过滤除菌),4×10-5生物素(过滤除菌),0.5%甲醇(过滤除菌);
培养条件:30℃,200r/min,培养4天,每24h补加0.5%甲醇,诱导毕赤酵母产生羰基还原酶。发酵培养完成后,将发酵培养液于4℃,6000r/min下离心10min,弃去上清液,用0.05mol/L的PBS缓冲液(pH 7.2)将离心得到的菌体洗涤2次,离心10min,收集细胞得湿菌体。
实验室前期研究表明,简单节杆菌中含有作用较强的17位羟基脱氢酶,会严重影响终产物BD的生成。因此,联合转化的技术难点和关键点就在于如何确定合适的催化顺序和催化方式,以获得产物BD的最大产率。相对于单独或同时使用上述两种菌株进行脱氢和羟化反应,本发明通过两菌株的顺序发酵制备甾体化合物BD,使产物的总收率大幅度提高,减少了能耗和生产周期,降低了生产成本和劳动力,符合科学生产的要求。
以下将通过具体实施方式对本发明做进一步的解释说明。
实施例1 17β羰基还原酶基因的获取以及毕赤酵母基因工程菌株的构建
(1)17β羰基还原酶基因ayr1的获取
以酿酒酵母W303基因组为模板,扩增17β羰基还原酶(GenBank编号为:KZV10489.1)编码基因ayr1(GeneID:854682),设计引物对如下所示,PCR产物用GelExtraction Kit(Omega,USA)回收,回收片段连接于载体pPIC3.5K上,构建重组质粒pPIC3.5K-ayr1,并转化E.coli JM109,获得含有目标基因的基因工程菌株。经菌液PCR验证及双酶切验证,表明重组质粒pPIC3.5K-ayr1构建成功(如图1及图2所示)。通过对上述克隆子进行测序,并与已获得的ayr1序列进行比对,测序结果与目标基因序列完全符合。
上游引物:CGCGGATCCATGTCGGAGTTACAGTCACAACCTAA;
下游引物:CCGGAATTCCTAATCGTCCTTATTCTTCTGTTTCG。
(2)17β羰基还原酶毕赤酵母基因工程菌株的构建和筛选
(1)毕赤酵母感受态细胞的制备:
①在含5mL YPD的50mL离心管中,培养毕赤酵母GS115,30℃过夜;
②取0.1-0.5mL过夜培养物,接种含500mL新鲜培养基的2L摇瓶,过夜生长至OD600=1.3-1.5;
③在4℃,1500g离心5min收集细胞,用500mL预冷的灭菌水悬浮细胞;
④如上离心,用250mL预冷的灭菌水悬浮细胞;
⑤如上离心,用20mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮细胞;
⑥如上离心,用1mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮细胞,至终体积约1.5mL。
(2)电转化毕赤酵母感受态细胞:
将提取的重组表达质粒pPIC3.5K-ayr1经SacⅠ进行线性化后,通过酚:氯仿抽提及乙醇沉淀,提纯线性化产物。
①取80μL上述细胞与5-20μg线性化DNA混合,转入预冷的0.2cm电转杯中;
②在冰上放置5min;
③根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击;
④立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇至杯中,将内容物转移至灭菌离心管中;
⑤分成200-600μL等份,涂于MD平板上;
⑥在30℃孵育平板至克隆产生。
通过对含有重组表达载体pPIC3.5K-ayr1的毕赤酵母进行基因组PCR鉴定,确定构建了表达ayr1基因的毕赤酵母基因工程菌株(P.pastoris)GS115AYR1S.c。(如图3所示)
实施例2双菌顺序催化体系的建立
在下面的实施例中分别考察了毕赤酵母基因工程菌株对AD或ADD的作用,简单节杆菌和毕赤酵母基因工程菌株同时转化和顺序转化对BD合成的影响,及简单节杆菌反应体系的失活对BD合成的影响。
实施例2-1
挑取毕赤酵母基因工程菌株P.pastoris GS115AYR1S.c单克隆,接种至30mL BMGY中,30℃,200r/min,摇至OD600=5-6;室温1500g-3000g离心5min,收集细胞,去除上清,用30mL BMMY重悬细胞,进行诱导表达;每24h,加甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导4d;于诱导4d后的发酵液中分别投加5g/L的底物AD(或ADD)及与底物摩尔比1:1的HP-β-CD,30℃,200r/min继续转化4d,取样1mL,等体积乙酸乙酯超声萃取,HPLC分析。如图5所示,毕赤酵母基因工程菌株P.pastoris GS115AYR1S.c生长细胞对底物AD及ADD进行转化后,其对应产物TS(睾酮)和BD的产率分别为59%和69%。这表明,ADD更适合于用作重组毕赤酵母17β羰基还原作用的底物。
实施例2-2
将简单节杆菌和毕赤酵母基因工程菌株P.pastoris GS115AYR1S.c的湿菌体同时加入50mM PBS缓冲溶液(pH 7.2)反应体系中,使得简单节杆菌的终浓度为5g/L(湿重)、毕赤酵母基因工程菌株终浓度为175g/L(湿重),并向反应体系中投加终浓度5g/L的底物AD及与底物摩尔比1:1的HP-β-CD,30℃,200r/min连续转化30h。转化过程中每6h取样,等体积乙酸乙酯超声萃取,HPLC分析,如图4所示,BD产率可达36%。但生成的BD并不能稳定地存在于体系中,随后BD的生成率又明显下降;而相反,ADD的积累量却持续上升至约占总体系的80%以上。分析原因,这可能是由该双菌催化体系的简单节杆菌内存在的内源的17β羟基氧化酶的作用,于是新生成的BD又继续被氧化成了ADD。
实施例2-3
以30mL 50mM PBS(pH7.2)缓冲液将制得的简单节杆菌湿菌体重悬至浓度5g/L,同时投加5g/L的底物AD及摩尔比1:1的HP-β-CD,于34℃,200r/min转化30h后,直接向该反应体系中加入终浓度175g/L的毕赤酵母基因工程菌株GS115AYR1S.c湿菌体,于30℃,200r/min继续转化12h。转化过程中定时取样,等体积乙酸乙酯超声萃取,HPLC分析,BD产率可达62.4%。
实施例2-4
以30mL PBS(pH7.2)缓冲液将制得的简单节杆菌湿菌体重悬至浓度5g/L,同时投加5g/L的底物AD及摩尔比1:1的HP-β-CD,于34℃,200r/min转化30h后,将该转化体系通过121℃,20min进行失活处理。然后向该失活后的反应体系中加入终浓度175g/L的毕赤酵母基因工程菌株GS115AYR1S.c湿菌体,于30℃,200r/min继续转化12h。转化过程中定时取样,等体积乙酸乙酯超声萃取,HPLC分析,BD产率可达73%。
图6中“对照”为实施例2-3的转化过程,“失活”为实施例2-4的转化过程。对比可见,失活简单节杆菌有助于提高BD产率。
实施例2-5
以30mL PBS(pH7.2)缓冲液将制得的简单节杆菌湿菌体重悬至浓度5g/L,同时投加5g/L的底物AD及与底物摩尔比1:1的HP-β-CD,于34℃,200r/min转化30h后,将该转化体系通过121℃,20min进行失活处理。然后向该失活后的反应体系中加入终浓度175g/L(湿重)的毕赤酵母基因工程菌株GS115AYR1S.c湿菌体及75g/L葡萄糖,于30℃,200r/min继续转化12h。转化过程中定时取样,等体积乙酸乙酯超声萃取,HPLC分析,BD产率可达83%。
实施例2说明简单节杆菌和毕赤酵母基因工程菌株顺序转化合成BD的效果优于双菌同时转化及单菌转化;顺序转化时,简单节杆菌完成转化后增加灭菌程序效果优于不灭菌直接进行毕赤酵母转化;反应体系中添加葡萄糖效果优于不添加。
实施例3微生物顺序转化发酵化合物AD制备化合物BD的方法
在含有底物AD浓度为3g/L的50mM PBS缓冲溶液(pH 7.2)生物转化体系中,添加与底物摩尔比1:1的HP-β-CD,投加生物量为5g/L的简单节杆菌TCCC 11037湿菌体,20℃,150r/min反应30h中间产物ADD的量达到最高后,将反应体系121℃,20min灭活,再经湿重为25g/L的毕赤酵母基因工程菌株(Pichia pastoris)GS115AYR1S.c在25℃,150r/min条件下,顺序发酵2h制备化合物宝丹酮;
上述反应结束后,发酵体系中的BD的产量可以达到1.68g/L,产率达到56%。
实施例4微生物顺序转化发酵化合物AD制备化合物BD的方法
在含有底物AD浓度为10g/L的50mM PBS缓冲溶液(pH 7.2)生物转化体系中,添加与底物摩尔比1:1的HP-β-CD,投加生物量为5g/L的简单节杆菌TCCC 11037湿菌体,35℃,250r/min反应50h中间产物ADD的量达到最高后,将反应体系121℃,20min灭活,再添加终浓度200g/L的毕赤酵母基因工程菌株(Pichia pastoris)GS115AYR1S.c湿菌体在37℃,250r/min条件下,顺序发酵4h制备化合物宝丹酮,添加酵母的同时,加入体系终浓度100g/L的葡萄糖;
上述反应结束后,发酵体系中的BD的产量可以达到7.7g/L,产率达到77%。
Claims (1)
1.一种微生物顺序转化发酵化合物雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)制备化合物宝丹酮(BD)的方法,其特征在于,该方法是将AD先经简单节杆菌发酵后,将反应体系灭活,再经毕赤酵母基因工程菌株顺序发酵制备化合物宝丹酮;
所述毕赤酵母基因工程菌株是在毕赤酵母宿主细胞中过表达17β羰基还原酶编码基因所得;
方法具体如下:在含有底物AD浓度为3g/L-10g/L的生物转化体系中,投加生物量为5g/L的具有C1,2脱氢能力的简单节杆菌,待中间产物雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)的量达到最高后,将反应体系灭活,再加入175-200 g/L的毕赤酵母基因工程菌株(Pichia pastoris)GS115 AYR1S.c顺序发酵制备化合物宝丹酮;
所述17β羰基还原酶 GenBank编号为:KZV10489.1;所述宿主细胞为毕赤酵母GS115,所述毕赤酵母基因工程菌株(Pichia pastoris)为GS115 AYR1S.c;
所述简单节杆菌为简单节杆菌(Arthrobacter simplex)TCCC 11037;
转化体系中添加毕赤酵母的同时还添加葡萄糖75 g/L;
生物转化体系中采用羟丙基-β-环糊精作为底物助溶剂,其与底物AD的摩尔比为1:1-2:1。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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