CN109097342A

CN109097342A - 蓝色犁头霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN109097342A
Application number: CN201810902589.2A
Authority: CN
Inventors: 张学礼; 陈晶; 樊飞宇
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2018-08-09
Filing date: 2018-08-09
Publication date: 2018-12-28
Anticipated expiration: 2038-08-09
Also published as: CN109097342B

Abstract

本发明公开了一种蓝色犁头霉中甾类11β‑羟化酶及其编码基因与应用。本发明所提供的甾类11β‑羟化酶为至少含有SEQ ID No.1的第19‑527位，并且从SEQ ID No.1的第19位开始向SEQ ID No.1的N端延长，得到长度为509‑526位氨基酸的任意一个蛋白质(Ac‑CYP003蛋白)。另外本发明还提供了由甾类11β‑羟化酶和氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质(Ac‑CPR蛋白)组成的成套蛋白。本发明在异源微生物中表达Ac‑CYP003蛋白(或其与Ac‑CPR蛋白)，进行氢化可的松(HC)的催化合成，避免其他副产物的生成，提高了RSA到HC的转化率。

Description

蓝色犁头霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及蓝色犁头霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用。

背景技术

氢化可的松(Hydrocortisone，HC)化学名为11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮，是肾上腺糖皮质激素药物，在激素类药物中占与重要地位，其结构式如图1中所示。HC能够影响糖代谢，具有抗病毒、消炎、抗过敏及抗休克等作用[Dumas,B.,et al.,Hydrocortisone made in yeast:metabolic engineering turns a unicellularmicroorganism into a drug-synthesizing factory.Biotechnol J,2006.1(3):299-307.]。主要用于肾上腺皮质功能不全引起的疾病及先天性肾上腺皮质功能增生等症状的治疗，也可用于支气管哮喘、类风湿性关节炎、痛风、风湿性发热等炎症性及过敏性疾病的治疗，还可以用于严重性感染和抗休克治疗等。

HC的合成方法主要分为三类：全化学合成法、半合成法及全生物合成的方法[Colingsworth,D.R.,et al."A partial microbiological synthesis ofhydrocortisone."Journal of Biological Chemistry 203.2(1953):807.]。1950年，Wendler等用化学全合成的方法经30多步化学反应成功合成HC，但因其工艺复杂，总收率太低，而无工业生产价值。Dumas等[Szczebara,F.M.,et al.,Total biosynthesis ofhydrocortisone from a simple carbon source in yeast.Nat Biotechnol,2003.21(2):143-149.]在酿酒酵母中使用人来源的11位β羟基化P450(CYP11B1)实现以葡萄糖为唯一碳源生物法全合成氢化可的松，但由于合成途径复杂，产物得率较低也并没有实现工业化生产。目前国内外制备HC等甾体药物依然主要采用半合成的方法，即以薯蓣皂素或植物甾醇等前体通过化学合成获得药物中间体17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(Cortexolone-21-acetate,RSA)或11-脱氧皮质醇(11-deoxycortisol，RS)，然后通过犁头霉菌(Absidia orchidis)和新月弯孢霉(Curvularia lunata)等微生物的生物全细胞催化反应对其11位进行β羟基化反应获得HC[Kim,Y.H.,et al.,Synthesis of α-ketoglutarate using glutamate dehydrogenase combined with electrochemicalcofactor regeneration system.Journal of Bioscience and Bioengineering,2009.108:S45-S46.Manosroi,J.,Y.Chisti,and A.Manosroi,Biotransformation ofcortexolone to hydrocortisone by molds using a rapid color-developmentassay.Applied Biochemistry and Microbiology,2006.42(5):479-483.]。氢化可的松合成工艺见图2。

蓝色犁头霉(Absidia coerulea)属藻状菌纲毛霉目毛霉科。从上世纪60年代捷克首次使用蓝色犁头霉催化生产HC开始，我国近几十年在工业上普遍使用蓝色犁头霉作为工业化生产菌株进行HC的生产。而近几十年我国学者从菌种选育到发酵工艺上不断进行探索与研究，努力提高发酵生产HC的产率。2004年张宝全等[Zhang,B.,Effect ofSupercritical Fluids on C11-Hydroxylation Activity of Absidiacoerulea.Biotechnol Prog,2004.20:1885-1887.]使用超临界流体作为催化介质提高了底物RSA溶解度和11位β羟基化产物的得率。范志华等[范志华,孙爱友,郝建东,等.用海藻酸钙包埋法固定化蓝色梨头霉菌生产氢化可的松的初步研究[J].天津科技大学学报,2003,18(4):1-4.]以海藻酸钙固定化蓝色犁头霉细胞进行有机相催化RSA合成HC显著提高了产物中HC与表HC的比值以及HC的产率。

虽然蓝色犁头霉氢化可的松半合成工艺已经有了几十年的研究，但目前存在的一个重要问题是RSA到HC的转化率比较低，HC的得率只有50％左右。合成产物除了HC之外，还有大量的表氢化可的松，这主要有两个原因。一是蓝色犁头霉中存在多个P450蛋白，除了11-β羟基化P450蛋白催化合成HC外，其他P450蛋白会催化合成副产物。二是11-β羟基化P450蛋白催化的手性专一性不高，该蛋白除了在11位进行β羟基化反应合成HC之外，还能在11位进行α羟基化反应合成表氢化可的松。因此，从蓝色犁头霉中挖掘出11-β羟基化P450蛋白有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种蓝色犁头霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用。

第一方面，本发明要求保护如下蛋白质或成套蛋白质。

本发明所提供的蛋白质为如下(A1)-(A4)中任一所示的蛋白质：

(A1)至少含有SEQ ID No.1的第19-527位氨基酸序列，并且从SEQ ID No.1的第19位开始按照SEQ ID No.1的氨基酸序列向SEQ ID No.1的N端延长，得到长度为509-526位氨基酸的任意一个蛋白质；

(A2)将(A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

本发明所提供的成套蛋白质由蛋白质A和蛋白质B组成。

所述蛋白质A为如上(A1)-(A4)中任一所示的蛋白质或者氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示的蛋白质(其中，SEQ ID No.1所示的蛋白质为全长Ac-CYP003蛋白)。

所述蛋白质B为如下(B1)-(B4)中任一所示的蛋白质：

(B1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质(其中，SEQ ID No.2所示的蛋白质为全长Ac-CPR蛋白)；

(B2)将(B1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(B3)与(B1)或(B2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(B4)在(B1)-(B3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

进一步地，所述(A1)所示的蛋白质具体为氨基酸序列如SEQ ID No.1的第19-527位所示的蛋白质(即截短后的Ac-CYP003蛋白——Ac-CYP003-T1蛋白)。

第二方面，本发明要求保护核酸分子或成套核酸分子。

本发明所提供的核酸分子可为核酸分子1或核酸分子2。

所述核酸分子1为编码前文第一方面中所述蛋白质的核酸分子(包括优化和非优化的编码截短后的Ac-CYP003蛋白的核酸分子)。

所述核酸分子2为SEQ ID No.3所示的DNA分子(即优化后的编码Ac-CYP003全长蛋白的DNA分子)。

本发明所提供的成套核酸分子由核酸分子A和核酸分子B组成。

所述核酸分子A为编码前文第一方面中所述蛋白质A的核酸分子(包括优化和非优化的编码截短和非截短的Ac-CYP003蛋白的核酸分子)；

所述核酸分子B为编码前文第一方面中所述蛋白质B的核酸分子(包括优化和非优化的编码Ac-CPR蛋白的核酸分子)。

进一步地，所述核酸分子1具体可为如下(a1)-(a4)中任一所示的DNA分子：

(a1)至少含有SEQ ID No.3的第55-1584位核苷酸序列，并且从SEQ ID No.3的第55位开始按照SEQ ID No.3的核苷酸序列向SEQ ID No.3的5′端延长，得到长度为1530至1583bp的任意一个DNA分子；

(a2)至少含有SEQ ID No.5的第55-1584位核苷酸序列，并且从SEQ ID No.5的第55位开始按照SEQ ID No.5的核苷酸序列向SEQ ID No.5的5′端延长，得到长度为1530至1583bp的任意一个DNA分子；

(a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的DNA分子杂交且编码前文第一方面中所述(A1)-(A4)中任一所示的蛋白质的DNA分子；

(a4)与(a1)-(a3)中任一所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文第一方面中所述(A1)-(A4)中任一所示的蛋白质的DNA分子。

进一步地，所述核酸分子A具体可为如上(a1)-(a4)中任一所示的DNA分子或者核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示的DNA分子(其中，SEQ ID No.3为优化的全长Ac-CYP003蛋白的编码基因，SEQ ID No.5为非优化的全长Ac-CYP003蛋白的编码基因)。

进一步地，所述核酸分子B具体可为如下(b1)-(b3)中任一所示的DNA分子：

(b1)核苷酸序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示的DNA分子(其中，SEQ IDNo.4为优化的全长Ac-CPR蛋白的编码基因，SEQ ID No.6为非优化的全长Ac-CPR蛋白的编码基因)；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码前文第一方面中所述蛋白质B的DNA分子；

(b3)与(b1)或(b2)所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文第一方面中所述蛋白质B的DNA分子。

其中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

更进一步地，所述(a1)所示的DNA分子具体可为核苷酸序列如SEQ ID No.3的第55-1584位所示的DNA分子(即优化后的Ac-CYP003-T1蛋白的编码基因)。所述(a2)所示的DNA分子具体为核苷酸序列如SEQ ID No.5的第55-1584位所示的DNA分子(即未优化的Ac-CYP003-T1蛋白的编码基因)。

第三方面，本发明要求保护如下生物材料中的任一种：

(c1)重组载体，为含有前文第二方面中所述核酸分子的重组载体；

(c2)表达盒，为含有前文第二方面中所述核酸分子的表达盒；

(c3)转基因细胞系，为含有前文第二方面中所述核酸分子的转基因细胞系；

(c4)重组菌，为含有前文第二方面中所述核酸分子的重组菌；

(c5)成套重组载体，由重组载体A和重组载体B组成；所述重组载体A为含有前文第二方面中所述核酸分子A的重组载体；所述重组载体B为含有前文第二方面中所述核酸分子B的重组载体；

(c6)成套表达盒，由表达盒A和表达盒B组成；所述表达盒A为含有前文第二方面中所述核酸分子A的表达盒；所述表达盒B为含有前文第二方面中所述核酸分子B的表达盒；

(c7)成套转基因细胞系，由转基因细胞系A和转基因细胞系B组成；所述转基因细胞系A为含有前文第二方面中所述核酸分子A的转基因细胞系；所述转基因细胞系B为含有前文第二方面中所述核酸分子B的转基因细胞系；

(c8)成套重组菌，由重组菌A和重组菌B组成；所述重组菌A为含有前文第二方面中所述核酸分子A的重组菌；所述重组菌B为含有前文第二方面中所述核酸分子B的重组菌。

第四方面，本发明要求保护一种制备用于生产氢化可的松的工程菌的方法。

本发明所提供的制备用于生产氢化可的松的工程菌的方法，可包括如下步骤：对酵母菌进行改造，使其表达前文第一方面中所述的蛋白质或成套蛋白质，改造后的酵母菌即为用于生产氢化可的松的工程菌。

进一步地，所述方法可包括如下步骤：将前文第二方面中所述核酸分子或所述成套核酸分子导入所述酵母菌，得到表达前文第一方面中所述的蛋白质或所述成套蛋白质的重组酵母菌，即为所述工程菌。

更进一步地，所述核酸分子是通过前文第三方面中所述重组载体或所述重组表达盒的形式导入所述酵母菌中的；所述成套核酸分子是通过前文第三方面中所述成套重组载体或所述成套表达盒的形式导入所述酵母菌中的。

更进一步地，所述核酸分子或所述成套核酸分子被整合到所述酵母菌的基因组的常用位点，如Gal7位点或者rDNA位点处。

更进一步地，所述酵母菌可为酿酒酵母(如BY4742菌株)、解脂耶氏酵母(如PO1G菌株)，粟酒裂殖酵母(如CICC1762菌株)或毕赤酵母(如GS115菌株)等。

在本发明的一个具体实施方式中，所述核酸分子是通过重组载体的形式导入所述酵母菌中的；所述重组载体为将所述核酸分子***到pRS426质粒的酶切位点(如SexA1和Asc1)之间后得到的重组质粒。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述成套核酸分子是通过成套表达盒的形式导入所述酵母菌中的；所述成套表达盒由表达盒pPgk-CPR-ADHt和表达盒pTEF-CYP003-CYC1t组成；所述表达盒pPgk-CPR-ADHt的序列为SEQ ID No.7(或者为将SEQ ID No.7的第813-2864位所替换为SEQ ID No.4后所得的序列)；所述表达盒pTEF-CYP003-CYC1t的序列为SEQ ID No.8(或者为将SEQ ID No.8的第501-2084位替换为SEQ ID No.3或SEQ ID No.3的第55-1584位或SEQ ID No.5的第55-1584位后所得的序列)。当向所述酵母菌中导入所述表达盒pPgk-CPR-ADHt和表达盒pTEF-CYP003-CYC1t的同时，还导入了同源臂marker片段gal7-URA3-up和同源臂marker片段gal7-URA3-down(实现了整合于酿酒酵母BY4742的Gal7位点)；所述同源臂marker片段gal7-URA3-up的序列如SEQ ID No.9所示；所述同源臂marker片段gal7-URA3-down的序列如SEQ ID No.10所示。

在本发明的再一个具体实施方式中，所述成套核酸分子是通过成套表达盒的形式导入所述酵母菌中的；所述成套表达盒由所述表达盒pPgk-CPR-ADHt和所述表达盒pTEF-CYP003-CYC1t组成。当向所述酵母菌中导入所述表达盒pPgk-CPR-ADHt和表达盒pTEF-CYP003-CYC1t的同时，还导入了同源臂marker片段rDNA-Leu-up和同源臂marker片段rDNA-Leu-down(实现了整合于酿酒酵母BY4742的rDNA位点)；所述同源臂marker片段rDNA-Leu-up的序列如SEQ ID No.11所示；所述同源臂marker片段rDNA-Leu-down的序列如SEQ IDNo.12所示。

第五方面，本发明要求保护利用前文第四方面中所述方法制备得到的工程菌。

在本发明的具体实施方式中，所述工程菌具体为如下任一种：

(1)工程菌HC001：将重组载体pRS426-CYP003导入酿酒酵母BY4742菌株后得到的重组菌；所述重组载体pRS426-CYP003为将SEQ ID No.5所示的DNA片段(即未优化的全长Ac-CYP003基因)***到pRS426质粒的酶切位点SexA1和Asc1之间后得到的重组质粒。

(2)工程菌HC002：将所述表达盒pPgk-CPR-ADH1t(其中的Ac-CPR基因为非优化基因，如SEQ ID No.6所示)、所述表达盒pTEF-CYP003-CYC1t(其中的Ac-CYP003基因为非优化基因，如SEQ ID No.5所示)、所述同源臂marker片段gal7-URA3-up和所述同源臂marker片段gal7-URA3-down导入酿酒酵母BY4742菌株后得到的重组菌(实现了整合于酿酒酵母BY4742的Gal7位点)。

(3)工程菌HC023：将所述表达盒pPgk-CPR-ADH1t(其中的Ac-CPR基因为优化基因，如SEQ ID No.4所示)、所述表达盒pTEF-CYP003-CYC1t(其中的Ac-CYP003基因为优化基因，如SEQ ID No.3所示)、所述同源臂marker片段gal7-URA3-up和所述同源臂marker片段gal7-URA3-down导入酿酒酵母BY4742菌株后得到的重组菌(实现了整合于酿酒酵母BY4742的Gal7位点)。

(4)工程菌HC030：将所述表达盒pPgk-CPR-ADH1t(其中的Ac-CPR基因为优化基因，如SEQ ID No.4所示)、所述表达盒pTEF-CYP003-CYC1t(其中的Ac-CYP003基因为优化的Ac-CYP003-T1基因，如SEQ ID No.3的第55-1584位所示)、所述同源臂marker片段gal7-URA3-up和所述同源臂marker片段gal7-URA3-down导入酿酒酵母BY4742菌株后得到的重组菌(实现了整合于酿酒酵母BY4742的Gal7位点)。

第六方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的蛋白质或成套蛋白质或前文第二方面中所述的核酸分子或成套核酸分子或前文第三方面中所述的生物材料或前文第五方面中所述的工程菌在如下任一中的应用：

(A)制备氢化可的松；

(B)催化甾体激素类物质进行11位β羟基化。

另外，本发明还要求保护前文第一方面中所述的蛋白质在作为甾体激素类物质11位羟基化酶中的应用。

其中，所述甾体激素类物质可为能够被甾类11β-羟化酶催化生成氢化可的松的物质，具体如7α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(或称为去氧氢化可的松21-醋酸酯，Cortexolone-21-acetate,RSA)或11-脱氧皮质醇(11-deoxycortisol，RS)。

第七方面，本发明要求保护一种制备氢化可的松的方法。

本发明所提供的制备氢化可的松的方法，可为全细胞催化法或酶法。

其中，所述全细胞催化法可包括如下步骤：对前文第五方面中所述的工程菌进行发酵培养，收集菌体后加入底物，进行催化反应，反应产物中即含有氢化可的松；所述底物为能够被甾类11β-羟化酶催化生成氢化可的松的物质。

其中，所述酶法可包括如下步骤：从前文第五方面中所述的工程菌中提取具有甾类11β-羟化酶活性的物质，然后以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式催化底物生成氢化可的松；所述底物为能够被甾类11β-羟化酶催化生成氢化可的松的物质。

进一步地，所述底物具体可为17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(或称为去氧氢化可的松21-醋酸酯，Cortexolone-21-acetate,RSA)或11-脱氧皮质醇(11-deoxycortisol，RS)。

在本发明具体实施方式中，具体是采用的全细胞催化法。其中，所述催化反应的条件具体为30℃200-250rpm(如250rpm)振荡培养1-4天(如2天)；反应体系中的底物为RSA，其浓度为10mg-200mg(如170mg/L)。

实验证明，本发明在异源微生物中表达Ac-CYP003蛋白进行HC的催化合成，避免其他副产物的生成，提高了RSA到HC的转化率。本发明为应用更安全的酵母菌催化生产氢化可的松提供可能性，相比于传统的丝状真菌生产方式有效的缩短了生产周期，简化了发酵设备，并且能够进行单一蛋白的表达提高了产物转化率，有效的降低了生产和提取成本，对于氢化可的松生产技术革新具有重要意义。

附图说明

图1为氢化可的松的结构式。

图2为氢化可的松生产工艺。

图3为酿酒酵母工程菌HC001催化产物检测及鉴定。

图4为酿酒酵母工程菌HC002催化产物检测及鉴定。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

蓝色犁头霉：北纳生物产品。

pRS426质粒：上海北诺生物有限公司，货号为addgene 0499。

M2质粒：在peasy-Blunt-simple载体(全式金生物有限公司)的多克隆位点按顺序***了SexA1酶切位点，pPgk启动子，绿色荧光蛋白(GFP)基因，以及终止子ADH1t和Asc1酶切位点。

M3质粒：在peasy-Blunt-simple载体(全式金生物有限公司)的多克隆位点按顺序***了SexA1酶切位点，pTEF启动子，绿色荧光蛋白(GFP)基因，以及终止子CYC1t和Asc1酶切位点。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4742：Thermo Fisher公司产品。

解脂耶氏酵母(CICC32520)：中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)产品。

粟酒裂殖酵母(CICC1762)：中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)产品。

毕赤酵母(GS115)：优宝生物产品，产品编号：ST1030。

实施例1、蓝色犁头霉细胞色素还原酶和11位β-羟基化酶的克隆表达

基因的克隆表达分为以下3步：

1、蓝色犁头霉总RNA的提取

首先，将蓝色犁头霉在平板上培养数天，并收取一定数目的孢子接入到50mL马铃薯-葡萄糖(PDA)培养基中，过夜培养至合成大量菌体；随后，离心收集蓝色犁头霉菌丝体，使用磷酸钾盐缓冲液(PBS)进行洗涤，最后用50mL缓冲液重悬并加入终浓度为170mg/L的底物去氧氢化可的松21-醋酸酯(RSA)诱导1h，取样进行RNA提取。

RNA提取方法：

(1)2.0mL螺帽管(RNase free)中加入0.5mm的研磨珠(填满锥形管底)以及1mLTrizol，之后加入液氮速冻过的菌丝块(约100mg)。

(2)使用珠磨机(BeadBeater)最大转速30s，重复两次。

(3)室温温和的摇动5min，去除附着的核小体。

(4)加入0.2mL的氯仿，最大转速珠磨15s。

(5)室温温和的摇动2min。

(6)4℃下12000g离心15min，取上清液(约0.5mL)至新的EP管(RNase free)中。

(7)加入等体积(0.5mL)的异丙醇，充分混匀。

(8)室温温和的摇动10min，此时可见白色沉淀。

(9)4℃下12000g离心10min，去上清。

(10)1mL DEPC水配置的75％酒精洗涤沉淀，4℃下7500g离心5min，充分去除上清。

(11)室温放置约15-20min除去乙醇，晾置过久RNA会变得难溶。

(12)加入50μL DEPC水，60℃水浴10min助溶。

(13)NanoDrop测定RNA浓度和纯度。通常纯度较好的RNA样品A260/A280比值在1.9～2.0之间，A260/A230通常大于2。

2、反转录PCR与基因扩增

第一链反转录-PCR：取无RNA酶PCR管，按Thermo反转录试剂盒扩增得到cDNA。具体操作步骤如下：模板总RNA 3μL，Oligo(dT)₁₈引物1μL，10mM dNTP Mix 1μl，RNase-free水10μl。瞬间离心，PCR 65℃5min，冰上急冷；再加入以下体系中反应液：5×RT Buffer 4μL，Maxima H Minus Enzyme Mix 1μL，瞬间离心，PCR仪中进行反应50℃50min，85℃5min，4℃保温。

PCR扩增：反转录所得cDNA为模板，用下述引物扩增到目的基因，扩增体系为TAKARADNA聚合酶5×Buffer 10μl，Dntp mix 4μl，引物(见表1)各1μl，cDNA，模板0.5μl，PrimerSTAR HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μl，补加蒸馏水至总体积50μl。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火15秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。

所得扩增产物命名为Ac-CYP003，Ac-CPR。将得到的PCR扩增产物用上海生工生物工程有限公司的PCR产物纯化试剂盒纯化，纯化后用Thermo公司的SexA1与Asc1酶切DNA片段，胶回收产物备用。

表1 Ac-CYP003和Ac-CPR基因扩增引物

引物名称	序列(5’-3’)
		Ac-CYP003-SexA1-F	gcg<u>accaggt</u>ATGCTTACAGAGTACATTCAT
Ac-CYP003-Asc1-R	ggcgcgccTTACTTTCTTGGCACAATCTTGA
		Ac-CPR-SexA1-F	gcg<u>accaggt</u>ATGGATCTCCCTACAGCAACTGA
Ac-CPR-Asc1-R	<u>ggcgcgcc</u>CTATGCCCACACGTCTTCCACAT

Ac-CYP003基因(野生型)序列如SEQ ID No.5所示，编码SEQ ID No.1所示的蛋白质(命名为Ac-CYP003蛋白)；Ac-CPR基因(野生型)序列如SEQ ID No.6所示，编码SEQ IDNo.2所示的蛋白质(命名为Ac-CPR蛋白)。

3、构建基因表达质粒

用Thermo公司SexA1和Asc1酶切质粒pRS426，酶切产物胶回收备用。与上述所得Ac-CYP003基因片段各50ng加入连接体系：5μL 2×Quick ligation Buffer(NEB公司)、0.5μL Quick ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至10μL，室温反应10min得到连接产物，转入Trans1-T1感受态细胞中冰浴30分钟，42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入800μl LB培养基，250rpm，37℃孵育1小时，菌液涂在含有氨苄青霉素的LB平板上，过夜培养后，PCR筛选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pRS426上***目的片段，得到质粒pRS426-CYP003。

4、构建酵母多基因整合片段

用Thermo公司SexA1和Asc1酶切质粒M2，M3，酶切产物胶回收备用。与上述所得Ac-CPR，Ac-CYP003基因片段进行连接转化(方法同步骤3)，并挑选克隆测序验证，得到质粒M2-CPR，M3-CYP003。以构建好的质粒M2-CPR为模板使用引物1-M-pEASY-PGK1-F和1-M-ADHt-TEF1-R(见表2)进行PCR扩增(方法同步骤2)，获得pPgk-Ac-CPR-ADH1t片段(SEQ ID No.7)，该片段包含Pgk启动子(SEQ ID No.7的第63-812位)，蓝色犁头霉来源的Ac-CPR基因(SEQID No.7的第813-2864位)以及ADH1终止子(SEQ ID No.7的第2865-3022位)。以构建好的质粒M3-CYP003为模板使用引物2-M-ADHt-TEF1-F和M-CYC1t-pEASY-R(见表2)进行PCR扩增(方法同步骤2)，获得pTEF-Ac-CYP003-CYC1t片段(SEQ ID No.8)，该片段包含TEF启动子(SEQ ID No.8的第51-500位)，蓝色犁头霉来源的Ac-CYP003基因(SEQ ID No.8的第501-2084位)以及CYC1终止子(SEQ ID No.8的第2085-2391位)。对扩增获得的目的片段进行胶回收处理备用。

表2 Ac-CYP003和Ac-CPR基因整合片段扩增引物

实施例2、酿酒酵母工程菌HC001的构建

出发菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4742于筛选培养基中过夜培养。液体筛选培养基组成如下：SD-Trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％His.，0.01％Leu.，0.01％Ura.(各百分号均表示g/100mL)。取1ml(OD约0.6-1.0)分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mM LiAc；10mM DTT；0.6M山梨醇；10mM Tris-HCl(pH7.5)，处理液使用时才加DTT)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml 1M山梨醇(0.22μm水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1M山梨醇重悬二次)，到最终体积约为90μl。加入实施例1获得的表达质粒pRS426-CYP003 1.5μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml 1M山梨醇，30℃复苏1h，涂布于固体筛选培养基(配方：酵母选择培养基SD-Ura-Trp，2％葡萄糖，0.005％His.，0.01％Leu，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100mL)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。PCR鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株HC001。

实施例3、酿酒酵母工程菌HC001催化合成氢化可的松

摇瓶发酵催化：在固体选择培养基(配方：固体酵母筛选培养基SD-Ura-Trp，2％葡萄糖，0.005％His，0.01％Leu，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100mL)中活化HC101酵母菌株，于相应液体选择培养基(配方：液体酵母筛选培养基SD-Ura-Trp，2％葡萄糖，0.005％His，0.01％Leu；各百分号均表示g/100mL)中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1mL的接种量分别接种于3瓶含100ml YPD液体培养基的500ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养2天，5000rpm收集酵母细胞，并用PBS缓冲液洗涤最终重悬于含有30mL PBS的250mL三角瓶中，加入终浓度为170mg/L的底物RSA，进行催化反应，30℃，250rpm振荡培养2天。

取5mL的催化反应液于分液漏斗中，加入等体积的萃取剂(甲醇：氯仿＝1:9，体积比)，取下层有机相4mL，装入10mL离心管中干燥，用1mL甲醇溶液进行复溶，离心取上清过0.22μm有机滤膜至液相瓶中进行HPLC检测。通过安捷伦1260高效液相色谱仪(HPLC)分析产物，发现有两种新物质的生成(见图3)。通过与标准品的色谱图对比确认新获得的这两种新物质分别为表氢化可的松和氢化可的松(见图3)，因此得出结论，Ac-CYP003蛋白为甾体激素类物质11位羟基化酶，并且该基因可以同时进行11位α和β的羟基化。

实施例4、酿酒酵母工程菌HC002的构建

出发菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4742于筛选培养基中过夜培养。筛选培养基组成如下：SD-Trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％His.，0.01％Leu.，0.01％Ura.(各百分号均表示g/100mL)。取1ml(OD约0.6-1.0)分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mM LiAc；10mM DTT；0.6M山梨醇；10mM Tris-HCl(pH7.5)，处理液使用时才加DTT)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml 1M山梨醇(0.22μm水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1M山梨醇重悬二次)，到最终体积约为90μl。分别加入实施例1获得的片段pPgk-Ac-CPR-ADH1t，pTEF-Ac-CYP003-CYC1t以及同源臂marker片段gal7-URA3-up(SEQ ID No.9；该同源臂片段包含Gal7位点上游400bp同源区域，URA3 marker基因，以及Pgk启动子400bp同源区域)，gal7-URA3-down(SEQ ID No.10；该同源臂片段包含CYC1终止子200bp同源区域，以及Gal7位点下游300bp同源区域)(实现将Ac-CPR，Ac-CYP003基因片段整合于酿酒酵母BY4742的Gal7位点)各1μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1ml 1M山梨醇，30℃复苏1h，涂布于筛选培养基平板(配方：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp，2％葡萄糖，0.005％His.，0.01％Leu.，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100mL)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。PCR鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株HC002。

实施例5、酿酒酵母工程菌HC002催化合成氢化可的松(全细胞催化法)

摇瓶发酵催化：在固体选择培养基(同实施例3)中活化HC002酵母菌株，于相应液体选择培养基(同实施例3)中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1mL的接种量分别接种于3瓶含100ml YPD液体培养基的500ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养2天，5000rpm收集酵母细胞，并用PBS缓冲液洗涤最终重悬于含有30mL PBS的250mL三角瓶中，使菌体OD_600nm达到60，加入终浓度为170mg/L的底物RSA，进行催化反应，30℃，250rpm振荡培养2天，得催化反应液。

取5mL的催化反应液于分液漏斗中，加入等体积的萃取剂(甲醇：氯仿＝1:9，体积比)，取下层有机相4mL，装入10mL离心管中干燥，用1mL甲醇溶液进行复溶，离心取上清过0.22μm有机滤膜至液相瓶中进行HPLC检测。通过安捷伦1260高效液相色谱仪(HPLC)分析产物。

通过HPLC鉴定与标品对比，确认构建的酿酒酵母菌株HC002可以催化底物RSA合成两种物质，确认分别为氢化可的松和表氢化可的松，并且从峰面积推测其产量高于HC001菌株(图4)，所以推测从蓝色犁头霉中克隆的CPR基因对于酿酒酵母氢化可的松的生产有帮助。

随后，对HC002菌株的生产结果进行了定量分析，通过定量分析菌株HC002可以通过全细胞催化的方式获得目标产物氢化可的松3.15mg/L，表氢化可的松1.01mg/L相较于使用酿酒酵母HC001菌株产量提高了3倍(表3)，结果表明蓝色犁头霉中克隆的CPR基因对于酿酒酵母氢化可的松的生产有帮助。

表3菌株HC001与HC002催化产物定量分析

注：氢化可的松/表氢化可的松的单位mg/L的含义是每升催化反应液中氢化可的松/表氢化可的松的mg数。

实施例6、酿酒酵母工程菌HC023的构建与催化合成氢化可的松

1、酿酒酵母工程菌HC023的构建

对Ac-CYP003和Ac-CPR蛋白进行密码子优化，该优化与基因合成工作工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成，获得的优化后的基因命名为Ac-CYP003-sy-Sc，Ac-CPR-sy-Sc。Ac-CYP003-sy-Sc基因的序列如SEQ ID No.3所示，编码SEQ ID No.1所示的蛋白质；Ac-CPR-sy-Sc基因的序列如SEQ ID No.4所示，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质。

对获得的基因按照实施例1步骤4中的方法构建酿酒酵母多基因整合片段，随后按照实施例4中的方法将上述两个基因整合于酿酒酵母BY4742的Gal7位点，最终获得菌株HC023。

2、酿酒酵母工程菌HC023催化合成氢化可的松(全细胞催化法)

对构建的酿酒酵母菌株HC023进行催化合成氢化可的松，催化实验和样品检测方法同实施例5，通过催化发酵，HC023菌株可以合成18.4mg/L氢化可的松和5.6mg/L表氢化可的松，发酵结果见表4。

表4菌株HC023催化产物定量分析

实施例7、应用截短的CYP003蛋白的酿酒酵母工程菌株HC030的构建与催化合成氢化可的松

1、酿酒酵母工程菌株HC030的构建

根据本发明挖掘到的Ac-CYP003基因，由于该基因前部分存在有多于一个的起始密码子，所以尝试对该基因进行截短，获得的截短后的基因命名为Ac-CYP003-T1。Ac-CYP003-T1-sy-Sc基因(即优化后的Ac-CYP003基因截短体)的序列如SEQ ID No.3的第55-1584所示，编码SEQ ID No.1的第19-527位所示的蛋白质(命名为Ac-CYP003-T1蛋白)。

对获得的基因按照实施例1步骤4中的方法构建酿酒酵母多基因整合片段，随后按照实施例4中的方法将上述Ac-CYP003-T1-sy-Sc基因与原有的Ac-CPR-sy-Sc基因(SEQ IDNo.4)整合于酿酒酵母BY4742的Gal7位点，最终获得菌株HC030。

2、酿酒酵母工程菌HC030催化合成氢化可的松(全细胞催化法)

对构建的酿酒酵母菌株HC030进行催化合成氢化可的松，催化实验和样品检测方法同实施例5，通过催化发酵，HC030菌株可以合成氢化可的松和表氢化可的松，结果表明截短的Ac-CYP003蛋白，依然可以催化C11位β羟基化反应，催化底物RSA合成氢化可的松，并且产量略高于未截短的Ac-CYP003蛋白，发酵结果见表5。

表5菌株HC030催化产物定量分析

3、利用酿酒酵母工程菌HC030以粗酶液或纯酶法催化合成氢化可的松

第一步：蛋白的提取(下述反应都在4℃冰上进行)

(1)发酵培养，200ml对应的选择培养基，发酵48h后收集菌体，OD_600nm4.0左右；

(2)菌体收集(5000rpm离心5min，弃上清)，细胞破碎(应用液氮研磨菌体破碎细胞，磨三次，将研磨好的粗蛋白用1mL pH7.25的磷酸盐缓冲液重悬，并置于冰上)作为粗酶液备后续使用；

(3)如需纯化蛋白则要增加微粒体提取过程，过程如下：

A、将重悬好的酵母粗酶液以7000g离心10min，收集上清，然后沉淀用5ml TES-Bbuffer(表6)洗一次，重复上述步骤一次；

B、将收集的上清分装在超速离心管中，超速离心25000g/10min；

C、取离心后的上清，在分装在超速离心管中100000g离心1h；

D、吸净上清，获得的沉淀用TEG buffer(表6)1-2ml重悬，若重悬效果不好，可以去冰水浴中超声，作为纯酶液备后续使用。

表6 TES-B缓冲液和TEG缓冲液配方:

TES-B	终浓度	TEG	终浓度
				Tris-HCL pH 7.4	50mmol	Tris-HCL pH 7.4	50mmol
EDTA	1mmol	EDTA	1mmol
				Sorbitol	600mmol	Glycerol	20/30％
BSA	10g/l	水
				β-巯基乙醇	1.5mmol
水

第二步：催化反应合成HC

粗酶液或纯酶催化合成HC：催化体系总体积2mL(表7)；反应在30℃进行，摇床上70rpm缓慢摇，以NADPH的加入起始反应，相应萃取剂甲醇氯仿的加入终止反应，得到催化反应液。

表7粗酶液或纯酶催化合成HC的催化体系

催化体系	终浓度
		RSA	0.2μmol
磷酸盐缓冲液pH7.25	100mmol
		NADPH	1mmol
粗酶液或纯酶

第三步：催化产物萃取及检测

取2mL的催化反应液于分液漏斗中，加入等体积的萃取剂(甲醇：氯仿＝1:9，体积比)，取下层有机相2mL，装入5mL离心管中干燥，用1mL甲醇溶液进行复溶，离心取上清过0.22μm有机滤膜至液相瓶中进行HPLC检测。通过安捷伦1260高效液相色谱仪(HPLC)分析产物。

结果显示：通过上述在工程菌HC030中提取的蛋白粗酶液或纯酶并进行催化反应，同样在产物中成功检测到了氢化可的松和表氢化可的松两种产物，所以证明粗酶液或纯酶也可以进行催化生产HC。

实施例8、在酿酒酵母中进行人源CYP11B1蛋白的功能验证

1、应用人源CYP11B1以及ADX、ADR蛋白构建用于合成氢化可的松的酿酒酵母工程菌HC040

在之前的酿酒酵母合成氢化可的松研究中学者们普遍使用的是人来源的11位β羟基化P450，它具有产物专一性强的优点。所以，在本发明中同样对来自人的CYP11B1蛋白进行功能验证，分别通过密码子优化合成了牛来源的电子传递链蛋白ADX、ADR以及人源P450蛋白CYP11B1的编码基因(Hm-CYP11B1优化后基因序列如SEQ ID No.13所示；Bo-ADX优化后基因序列如SEQ ID No.14所示；Bo-ADR优化后基因序列如SEQ ID No.15所示)。并按照实施例1步骤4中的方法构建酿酒酵母多基因整合片段pPgk-Bo-ADX-ADH1t，pTDH3-Bo-ADR-TPI1t，pTEF-Hm-CYP11B1-CYC1t随后按照实施例4中的方法将上述基因进行酿酒酵母BY4742染色体整合，整合至Gal7位点，最终获得菌株HC040。

2、酿酒酵母菌株HC040催化合成氢化可的松

对构建的酿酒酵母菌株HC040进行催化合成氢化可的松，催化实验和样品检测方法同实施例5，通过催化发酵，HC040菌株可以合成氢化可的松这一唯一产物，但产量较低(见表8)。所以相比于目前已经鉴定出的人源CYP11B1蛋白催化底物合成氢化可的松，本发明鉴定出的蓝色犁头霉来源的Ac-CYP003蛋白具有更高的催化效率，但产物并不专一，说明蛋白立体选择性存在问题。

表8不同来源的P450蛋白催化合成氢化可的松产物分析

实施例9、酿酒酵母工程菌HC023催化合成氢化可的松的5L发酵罐发酵

本发明对构建的菌株HC023进行了5L发酵罐的发酵，通过高密度培养，进一步提升了菌株的催化能力，具体发酵流程如下：

(1)由-80℃冰箱取出保存菌株的冻存管约1.5ml，置于冰上融化，全部接到含有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，30℃，250rpm培养约20小时，至OD_600nm＝5～7，即为一级种子。

(2)将一级种子接到装有100ml种子培养基的1L三角瓶中，接种量3％，共接5瓶。30℃，250rpm培养约20小时，至OD_600nm＝5～7，即为二级种子。

(3)将二级种子通过火焰接种方式接到7L发酵罐中培养(接种量5％(v/v))。温度设定30℃，pH设定5.0，通过流加氨水(25wt.％)自动调节pH，溶氧设定30％，通过调节转速和通气量使溶氧维持在30％。

当底料中的葡萄糖耗尽时，溶氧迅速升高，此时开始流加补料培养基1，采用DO-Stat的补料方式。培养至59小时OD＝200左右改用补料培养基2继续培养(补料培养基2中含有4.5g/L RSA(RSA加入方式：将1g RSA加入30ml 80％乙醇，加热至完全溶解，然后迅速转入发酵罐中)。当培养至59、83、100小时加入1g RSA，培养至143小时发酵结束。

其中，高密度发酵中用到的培养基成分如表9所示(微量金属盐和维他命母液成分如表10所示)。

表9高密度发酵中用到的培养基成分

表10微量金属盐和维他命母液成分

发酵结束后氢化可的松产量为1.23mM(0.44g/L)，共消耗底物RSA约3.68mM，转化率约为33.4％。见表11。

表11高密度发酵氢化可的松产量

注：氢化可的松/表氢化可的松的单位mmol/L的含义是每升发酵液(143小时发酵结束时的发酵液)中氢化可的松/表氢化可的松的mmol数。

实施例10、应用蓝色犁头霉的11位β羟基化P450蛋白在其他酵母菌中合成氢化可的松

本发明成功在解脂耶氏酵母(CICC32520)，粟酒裂殖酵母(CICC1762)，以及毕赤酵母(GS115)中成功以质粒表达的形式表达了来自蓝色犁头霉的Ac-CPR和Ac-CYP003基因，对获得的菌株(见表12)以脱氧皮质醇(RS)为底物进行催化反应(同实施例5)，也成功合成出了氢化可的松及其副产物表氢化可的松。

表12其他酵母菌中发酵催化合成氢化可的松的产量

实施例11、酿酒酵母工程菌HC061-HC065的构建与催化合成氢化可的松

为了进一步提高氢化可的松的产量，本发明将蓝色犁头霉中挖掘到的Ac-CPR和Ac-CYP003整合于酿酒酵母BY4742的多拷贝位点rDNA位点。

出发菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4742于筛选培养基中过夜培养。筛选培养基组成如下：SD-Trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％His.，0.01％Leu.，0.01％Ura.(各百分号均表示g/100mL)。取1ml(OD约0.6-1.0)分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mM LiAc；10mM DTT；0.6M山梨醇；10mM Tris-HCl(pH7.5)，处理液使用时才加DTT)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml 1M山梨醇(0.22μm水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1M山梨醇重悬二次)，到最终体积约为90μl。分别加入实施例1获得的片段pPgk-CL3-CPR-ADHt，pTEF-CL3-CYP021-CYC1t以及同源臂marker片段rDNA-Leu-up(SEQ ID No.11；该同源臂片段包含rDNA位点上游约500bp同源区域，Leu marker基因，以及Pgk启动子400bp同源区域)，rDNA-Leu-down(SEQ ID No.12；该同源臂片段包含CYC1终止子200bp同源区域，以及rDNA位点下游约500bp同源区域)(实现将Ac-CPR，Ac-CYP003基因片段整合于酿酒酵母BY4742的rDNA位点)各1μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1ml 1M山梨醇，30℃复苏1h，涂布于固体选择培养基平板(配方：固体酵母筛选培养基SD-Leu-Trp，2％葡萄糖，0.005％His，0.01％Ura，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100mL)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。PCR鉴定出正确的阳性克隆，随机挑选五个克隆，分别命名为菌株HC061、HC062、HC063、HC064、HC065。其中产量最高的菌株HC064的氢化可的松产量可以达到25.7mg/L。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 蓝色犁头霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用

<130> GNCLN181612

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 527

<212> PRT

<213> Absidia coerulea

<400> 1

Met Leu Thr Glu Tyr Ile His His Phe Ile Asn Asn Phe Asp Gln Lys

1 5 10 15

Lys Thr Met Asp Gln Leu Gln Thr Met Val Ser Ser Lys Glu Gly Met

20 25 30

Ile Gly Leu Ala Thr Ala Ala Val Leu Met Ser Gly Ala Ala Val Tyr

35 40 45

Lys Ser Thr Arg Ile Glu Arg Gly Cys Pro Gln Val Pro Asn Gln Ser

50 55 60

Tyr Phe Met Gly Ser Thr Lys Glu Tyr Arg Asn Asn Pro Ala Ala Phe

65 70 75 80

Ile Glu Lys Trp Glu Lys Glu Leu Gly Pro Val Tyr Gly Ala Tyr Leu

85 90 95

Phe Gly Gln Tyr Thr Thr Val Val Ser Gly Pro Gln Val Arg Glu Val

100 105 110

Phe Leu Asn Asp Asp Phe Asp Phe Ile Ala Gly Ile Arg Arg Asp Phe

115 120 125

Asp Thr Asn Leu Leu Ser Asn Gly Gly Asp Leu Arg Asp Leu Pro Val

130 135 140

His Lys Phe Ala Gly Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ser Pro Lys Leu Pro

145 150 155 160

Phe Tyr Thr Ser Arg Val Ile Glu His Leu Lys Ile Gly Leu Lys Glu

165 170 175

Phe Cys Gly Val Val Pro Asp Glu Gly Lys Glu Phe Asp His Val Tyr

180 185 190

Pro Leu Val Gln His Met Val Ala Lys Ala Ser Ala Ser Val Phe Val

195 200 205

Gly Pro Glu Leu Ala Lys Asn Glu Gln Leu Ile Asp Ser Phe Lys Asn

210 215 220

Met Val Leu Glu Val Gly Ser Glu Leu Ala Pro Lys Pro Tyr Leu Glu

225 230 235 240

Phe Phe Pro Asn Leu Met Arg Leu Arg Met Trp Phe Ile Gly Lys Thr

245 250 255

Ser Gln Lys Val Lys Arg His Arg Asp Gln Leu Arg Ala Ala Leu Ala

260 265 270

Pro Gln Val Glu Tyr Arg Leu Lys Ala Met Lys Glu Asn Asp Ser Asn

275 280 285

Trp Asp Arg Pro Asn Asp Phe Leu Gln Asp Ile Leu Glu Ser Gly Asp

290 295 300

Ile Pro Ala His Val Asp Val Thr Asp His Cys Cys Asp Trp Met Thr

305 310 315 320

Gln Ile Ile Phe Ala Ala Leu His Thr Thr Ser Glu Asn Gly Thr Leu

325 330 335

Ser Phe Tyr Arg Leu Leu Asp Asn Pro Lys Val Leu Glu Asp Leu Leu

340 345 350

Glu Glu Gln Asn Gln Val Leu Glu Asp Ala Gly Tyr Asp Ser Ser Val

355 360 365

Gly Pro Glu Val Phe Thr Arg Glu Ile Leu Asn Lys Phe Val Lys Met

370 375 380

Asp Ser Val Ile Arg Glu Thr Ser Arg Leu Arg Asn Asp Tyr Ile Gly

385 390 395 400

Leu Pro His Lys Asn Ile Ser Ser Lys Thr Ile Thr Leu Ser Gly Gly

405 410 415

Ala Met Ile Arg Pro Gly Glu Arg Ala Tyr Val Asn Ala Tyr Ser Asn

420 425 430

His Arg Asp Gly Thr Ile Gln Lys Val Thr Asp Asn Leu Lys Ser Phe

435 440 445

Glu Pro Tyr Arg Phe Val Asn Gln Asp Arg Asn Ser Thr Lys Ile Gly

450 455 460

Glu Asp Phe Ile Phe Phe Gly Met Gly Lys His Ala Cys Pro Gly Arg

465 470 475 480

Trp Phe Ala Ile Gln Glu Ile Lys Thr Ile Ile Ala Met Met Ile Arg

485 490 495

Ser Tyr Gln Leu Ser Ala Leu Gly Pro Val Thr Phe Pro Thr Asp Asp

500 505 510

Tyr Ser Arg Ile Pro Met Gly Arg Phe Lys Ile Val Pro Arg Lys

515 520 525

<210> 2

<211> 683

<212> PRT

<213> Absidia coerulea

<400> 2

Met Asp Leu Pro Thr Ala Thr Asp Ile Asn Glu Lys Pro Lys Leu Ser

1 5 10 15

Lys Glu Glu Gln Asp Pro Arg Asn Phe Val Lys Leu Met Asn Asp Gln

20 25 30

Asn Arg Asn Glu Leu Ile Ile Phe Tyr Gly Ser Gln Thr Gly Thr Gly

35 40 45

Glu Asp Tyr Ala Gln Arg Leu Gly Lys Glu Cys Lys Lys Arg Phe Asn

50 55 60

Ile Gln Pro Met Val Ala Asp Leu Glu Asn Tyr Asp Leu Gly Tyr Leu

65 70 75 80

Asp Thr Leu Pro Lys Glu Thr Ile Ala Val Phe Val Ile Ser Thr Tyr

85 90 95

Gly Glu Gly Asp Pro Thr Asp Ser Ala Val Asn Phe Trp Glu Leu Leu

100 105 110

Asn Lys Asp Val Pro Thr Phe Ser Lys Gly Cys Ala Val Glu Arg Pro

115 120 125

Leu Lys Asp Leu Arg Tyr Phe Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Thr Tyr

130 135 140

Glu Tyr Phe Asn Gly Ala Ala Ile Gly Val Asp Lys Gln Leu Thr Gln

145 150 155 160

Leu Gly Ala Thr Arg Leu Gly Glu Val Gly Met Gly Asp Asp Asp Asn

165 170 175

Ser Leu Glu Asp Asp Phe Ile Gln Trp Gln Asp Gln Val Trp Pro Leu

180 185 190

Leu Ala Asp Ala Leu Ala Thr Ser Thr Asp Thr Val Asp Glu Gln Ala

195 200 205

Gln Ala Gln His Ala Tyr Lys Val Met Met Gly Gln Glu Lys Glu Asp

210 215 220

Glu Ser Phe Tyr Tyr Met Gly Glu Leu Gly Asp Thr Gln Leu Thr Thr

225 230 235 240

Trp Ser Ala Lys Arg Pro Tyr Pro Ala Pro Val Lys Ile His Asp Leu

245 250 255

Thr Pro Ala Ser Arg Asp Gln Arg His Cys Leu His Leu Asp Val Asp

260 265 270

Leu Ser Asn Ser Asn Ile Ser Tyr Thr Thr Gly Asp His Leu Gly Ile

275 280 285

Trp Pro Thr Asn Asn Glu Asp Glu Val Phe Leu Val Ser Ser Leu Phe

290 295 300

Gly Trp Asn Asp Ala Tyr Leu Asp Gln Val Ile Asn Val Val Pro Thr

305 310 315 320

Asp Ser Thr Asn Lys Pro Pro Phe Pro Gln Pro Thr Thr Leu Arg Ser

325 330 335

Ala Leu Arg His Tyr Leu Asp Ile Ala Gln Leu Pro Ser Arg Ser Thr

340 345 350

Leu Asp Leu Leu Leu Pro Ser Cys Ser Asn Asp Ser Leu Lys Ser Phe

355 360 365

Leu Gln Asn Leu Val Asn Asp Lys Asp Glu His Lys Arg Val Val Leu

370 375 380

Asp Gln Val Arg Asn Leu Gly Gln Leu Leu Ser Phe Ala Leu Glu Thr

385 390 395 400

Ile Gly Ser Thr Thr Thr Asp Gly Ala Leu Lys Asp Ile Pro Val Glu

405 410 415

Val Val Leu Glu Cys Tyr Ser Arg Leu Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile

420 425 430

Ser Ser Ser Ser Ser Glu Ser Ala Thr Thr Val Ser Ala Thr Ala Val

435 440 445

Thr Leu Lys Tyr Asn Pro Thr Pro Asp Arg Thr Val Tyr Gly Val Asn

450 455 460

Thr Asn Tyr Leu Trp Ala Ile His Gln Ser Met Ser Ser Thr Pro Ser

465 470 475 480

Ser Asp Val Pro Lys Tyr Val Val Asp Gly Pro Arg Gln Gln Tyr Leu

485 490 495

Ile Thr Lys Glu Ala Asn Ser Asp Ser Ile Lys Ile Lys Ile Pro Val

500 505 510

His Ile Arg Lys Ser Thr Phe Arg Leu Pro Pro Ser Ser Ser Thr Pro

515 520 525

Val Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly Phe

530 535 540

Val Arg Glu Arg Val Tyr Gln Lys Gln Val Leu Gly Glu Asp Val Gly

545 550 555 560

Ala Thr Val Leu Phe Phe Gly Cys Arg Arg Ser Thr Glu Asp Tyr Leu

565 570 575

Tyr Ala Asp Glu Trp Pro Arg Leu Phe Lys Ser Leu Gly Asn Gly Pro

580 585 590

Ser Arg Ile Ile Thr Ala Phe Ser Arg Glu Ser Glu Glu Lys Lys Val

595 600 605

Tyr Val Gln Gln Arg Leu Ala Glu His Gly Gln Glu Met Trp Asp Leu

610 615 620

Leu Ala Asn Gln Gly Ala Tyr Phe Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Tyr

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Met Ala Lys Asp Val Gln Gln Thr Val Ile Asp Met Ala Lys Ser Phe

645 650 655

Gly Gly Leu Gly Asp Asn Glu Ala Thr Thr Phe Ile Gln Glu Leu Arg

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<210> 3

<211> 1584

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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caattgcaaa ctatggtttc ttcaaaggag ggtatgattg gtttagctac agctgcagtt 120

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ttctacactt caagagttat tgaacatttg aagatcggtt tgaaggaatt ctgtggtgtt 540

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tcttttaaaa atatggtttt agaagttggt tctgaattgg ctccaaagcc atatttggaa 720

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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<210> 5

<211> 1584

<212> DNA

<213> Absidia coerulea

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<210> 6

<211> 2052

<212> DNA

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ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccttaatt 60

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tgggccagct tctctctttt gctttggaaa ctattggatc cacgactact gatggtgctt 2040

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tgtttctact cc 3072

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<211> 2445

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

ggtatagcat gaggtcgctc ttattgacca cacctctacc ggcatgccga ttaattaaag 60

tgatccccca agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac 120

tcttccagat tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag 180

catactaaat ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt 240

tggaaaagaa aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat 300

ttttatcacg tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga tttttttctc tttcgatgac 360

ctcccattga tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt 420

tcttgttcta ttacaacttt ttttacttct tgctcattag aaagaaagca tagcaatcta 480

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atcaaaagaa gactatggat caattacaaa ccatggtgtc atccaaagaa ggtatgatcg 600

gtttggccac agctgcagtc cttatgtctg gtgcagccgt ttacaaatca accaggatcg 660

aacggggatg ccctcaagta cctaaccagt cctactttat gggatctaca aaagaatatc 720

gcaacaaccc tgctgcattc atcgagaaat gggaaaagga actgggccct gtttatggtg 780

cttatttgtt tggtcagtat actactgttg tctctggtcc tcaagtgcgc gaagtattct 840

tgaacgatga ctttgacttt attgctggca tccgacgaga ctttgatacc aacttgttat 900

caaatggcgg cgatcttcga gacttgcctg tacacaagtt tgcgggtagt atcaagaaga 960

acctcagccc caaactccca ttctacacca gccgcgtgat tgaacatctc aagattggat 1020

taaaggaatt ctgtggagta gtgccagatg aaggaaagga attcgatcat gtgtatccct 1080

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cccccaagcc ttatttagaa ttcttcccta atctgatgcg tctacgaatg tggtttattg 1260

gcaaaacgtc acaaaaggtc aagagacatc gggatcagct tcgtgcggcc ttggcacctc 1320

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attgttgcga ttggatgaca caaattatct ttgcagctct acacacaacc agtgaaaacg 1500

gcacattatc cttctatcgc ttattggata acccaaaggt gttggaagat ttactggaag 1560

aacaaaatca agtgttggaa gatgcaggct atgatagctc cgttggccct gaagtcttta 1620

cccgggaaat cctcaacaaa ttcgtcaaga tggatagtgt gattcgtgaa acgagtcgac 1680

tacgaaacga ctatatcggt ctccctcaca agaatattag ctcaaagaca attacattat 1740

cagggggtgc tatgatccgt ccaggtgaac gtgcttatgt gaatgcttat tccaaccatc 1800

gtgatggaac tatccaaaaa gtgacggaca acttaaaatc atttgaaccc taccgatttg 1860

taaaccaaga caggaactct acaaagattg gtgaagactt tatattcttt ggaatgggta 1920

aacatgcctg tcctggtcga tggttcgcca ttcaagaaat taaaacgatt attgccatga 1980

tgatccgaag ctaccaatta tctgcccttg gtcctgttac cttccccacc gatgactatt 2040

ccagaatacc catgggtcga ttcaagattg tgccaagaaa gtaaccgctg atcctagagg 2100

gccgcatcat gtaattagtt atgtcacgct tacattcacg ccctcccccc acatccgctc 2160

taaccgaaaa ggaaggagtt agacaacctg aagtctaggt ccctatttat ttttttatag 2220

ttatgttagt attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacagac 2280

gcgtgtacgc atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga 2340

aggctttaat ttgcaagctg cggccctgca ttaatgaatc ggccaacgcg ccagggtttt 2400

cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattgta atacg 2445

<210> 9

<211> 1604

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

ggaaaagttg taaatattat tggtagtatt cgtttggtaa agtagagggg gtaatttttc 60

ccctttattt tgttcataca ttcttaaatt gctttgcctc tccttttgga aagctatact 120

tcggagcact gttgagcgaa ggctcattag atatattttc tgtcattttc cttaacccaa 180

aaataaggga aagggtccaa aaagcgctcg gacaactgtt gaccgtgatc cgaaggactg 240

gctatacagt gttcacaaaa tagccaagct gaaaataatg tgtagctatg ttcagttagt 300

ttggctagca aagatataaa agcaggtcgg aaatatttat gggcattatt atgcagagca 360

tcaacatgat aaaaaaaaac agttgaatat tccctcaaaa atgtcgaaag ctacatataa 420

ggaacgtgct gctactcatc ctagtcctgt tgctgccaag ctatttaata tcatgcacga 480

aaagcaaaca aacttgtgtg cttcattgga tgttcgtacc accaaggaat tactggagtt 540

agttgaagca ttaggtccca aaatttgttt actaaaaaca catgtggata tcttgactga 600

tttttccatg gagggcacag ttaagccgct aaaggcatta tccgccaagt acaatttttt 660

actcttcgaa gacagaaaat ttgctgacat tggtaataca gtcaaattgc agtactctgc 720

gggtgtatac agaatagcag aatgggcaga cattacgaat gcacacggtg tggtgggccc 780

aggtattgtt agcggtttga agcaggcggc agaagaagta acaaaggaac ctagaggcct 840

tttgatgtta gcagaattgt catgcaaggg ctccctatct actggagaat atactaaggg 900

tactgttgac attgcgaaga gcgacaaaga ttttgttatc ggctttattg ctcaaagaga 960

catgggtgga agagatgaag gttacgattg gttgattatg acacccggtg tgggtttaga 1020

tgacaaggga gacgcattgg gtcaacagta tagaaccgtg gatgatgtgg tctctacagg 1080

atctgacatt attattgttg gaagaggact atttgcaaag ggaagggatg ctaaggtaga 1140

gggtgaacgt tacagaaaag caggctggga agcatatttg agaagatgcg gccagcaaaa 1200

ctaaacgcac agatattata acatctgcac aataggcatt tgcaagaatt actcgtgagt 1260

aaggaaagag tgaggaacta tcgcatacct gcatttaaag atgccgattt gggcgcgaat 1320

cctttatttt ggcttcaccc tcatactatt atcagggcca gaaaaaggaa gtgtttccct 1380

ccttcttgaa ttgatgttac cctcataaag cacgtggcct cttatcgaga aagaaattac 1440

cgtcgctcgt gatttgtttg caaaaagaac aaaactgaaa aaacccagac acgctcgact 1500

tcctgtcttc ctattgattg cagcttccaa tttcgtcaca caacaaggtc ctagcgacgg 1560

ctcacaggtt ttgtaacaag caatcgaagg ttctggaatg gcgg 1604

<210> 10

<211> 499

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

agtctaggtc cctatttatt tttttatagt tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt 60

tcaaattttt cttttttttc tgtacagacg cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac 120

cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt tgcaagctgc ggccctgcat 180

taatgaatcg gccaacgcgc aaagaaagtg gaatattcat tcatatcata ttttttctat 240

taactgcctg gtttctttta aattttttat tggttgtcga cttgaacgga gtgacaatat 300

atatatatat atatttaata atgacatcat tatctgtaaa tctgattctt aatgctattc 360

tagttatgta agagtggtcc tttccataaa aaaaaaaaaa aagaaaaaag aattttagga 420

atacaatgca gcttgtaagt aaaatctgga atattcatat cgccacaact tcttatgctt 480

ataaaagcac taatgcctg 499

<210> 11

<211> 2181

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

tcctctaatc aggttccacc aaacagatac cccggtgttt cacggaatgg tacgtttgat 60

atcgctgatt tgagaggagg ttacacttga agaatcacag tcttgcgacc ggctattcaa 120

caaggcattc ccccaagttt gaattctttg aaatagattg ctattagcta gtaatccacc 180

aaatccttcg ctgctcacca atggaatcgc aagatgccca cgatgagact gttcaggtta 240

aacgcaaaag aaacacactc tgggaatttc ttcccaaatt gtatctctca atacgcatca 300

acccatgtca attaaacacg ctgtatagag actaggcaga tctgacgatc acctagcgac 360

tctctccacc gtttgacgag gccatttaca aaaacataac gaacgacaag cctactcgaa 420

ttcgtttcca aactcttttc gaacttgtct tcaactgctt tcgcatgaag tacctcccaa 480

ctacttttcc tcacacttgt actccatgac taaacccccc ctcccattac aaactaaaat 540

cttactttta ttttcttttg ccctctctgt cgctctgcct taactacgta tttctcgccg 600

agaaaaactt caatttaagc tattctccaa aaatcttagc gtatattttt tttccaaagt 660

gacaggtgcc ccgggtaacc cagttcatgt ctgcccctaa gaagatcgtc gttttgccag 720

gtgaccacgt tggtcaagaa atcacagccg aagccattaa ggttcttaaa gctatttctg 780

atgttcgttc caatgtcaag ttcgatttcg aaaatcattt aattggtggt gctgctatcg 840

atgctacagg tgttccactt ccagatgagg cgctggaagc ctccaagaag gctgatgccg 900

ttttgttagg tgctgtgggt ggtcctaaat ggggtaccgg tagtgttaga cctgaacaag 960

gtttactaaa aatccgtaaa gaacttcaat tgtacgccaa cttaagacca tgtaactttg 1020

catccgactc tcttttagac ttatctccaa tcaagccaca atttgctaaa ggtactgact 1080

tcgttgttgt cagagaatta gtgggaggta tttactttgg taagagaaag gaagacgatg 1140

gtgatggtgt cgcttgggat agtgaacaat acaccgttcc agaagtgcaa agaatcacaa 1200

gaatggccgc tttcatggcc ctacaacatg agccaccatt gcctatttgg tccttggata 1260

aagctaatgt tttggcctct tcaagattat ggagaaaaac tgtggaggaa accatcaaga 1320

acgaattccc tacattgaag gttcaacatc aattgattga ttctgccgcc atgatcctag 1380

ttaagaaccc aacccaccta aatggtatta taatcaccag caacatgttt ggtgatatca 1440

tctccgatga agcctccgtt atcccaggtt ccttgggttt gttgccatct gcgtccttgg 1500

cctctttgcc agacaagaac accgcatttg gtttgtacga accatgccac ggttctgctc 1560

cagatttgcc aaagaataag gtcaacccta tcgccactat cttgtctgct gcaatgatgt 1620

tgaaattgtc attgaacttg cctgaagaag gtaaggccat tgaagatgca gttaaaaagg 1680

ttttggatgc aggtatcaga actggtgatt taggtggttc caacagtacc accgaagtcg 1740

gtgatgctgt cgccgaagaa gttaagaaaa tccttgctta aacgcacaga tattataaca 1800

tctgcacaat aggcatttgc aagaattact cgtgagtaag gaaagagtga ggaactatcg 1860

catacctgca tttaaagatg ccgatttggg cgcgaatcct ttattttggc ttcaccctca 1920

tactattatc agggccagaa aaaggaagtg tttccctcct tcttgaattg atgttaccct 1980

cataaagcac gtggcctctt atcgagaaag aaattaccgt cgctcgtgat ttgtttgcaa 2040

aaagaacaaa actgaaaaaa cccagacacg ctcgacttcc tgtcttccta ttgattgcag 2100

cttccaattt cgtcacacaa caaggtccta gcgacggctc acaggttttg taacaagcaa 2160

tcgaaggttc tggaatggcg g 2181

<210> 12

<211> 705

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

agtctaggtc cctatttatt tttttatagt tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt 60

tcaaattttt cttttttttc tgtacagacg cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac 120

cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt tgcaagctgc ggccctgcat 180

taatgaatcg gccaacgcgc ctcactattt tttactgcgg aagcggaagc ggaaaatacg 240

gaaacgcgcg ggaacataca aaacatacaa aatatacctt tctcacacaa gaaatatatg 300

ctacttgcaa aatatcatac caaaaaactt ttcacaaccg aaaccaaaac caacggatat 360

catacattac actaccacca ttcaaacttt actactatcc tcccttcagt ttcccttttt 420

ctgccttttt cggtgacgga aatacgcttc agagacccta aagggaaatc catgccataa 480

caggaaagta acatcccaat gcggactata ccaccccacc acactcctac caataacggt 540

aactattcta tgttttctta ctcctatgtc tattcatctt tcatctgact acctaatact 600

atgcaaaaat gtaaaatcat cacacaaaac ataaacaatc aaaatcagcc atttccgcac 660

cttttcctct gtccactttc aaccgtccct ccaaatgtaa aatgg 705

<210> 13

<211> 1512

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

atggctttga gagctaaagc tgaagtttgt atggctgttc catggttatc tttgcaaaga 60

gctcaagctt tgggtactag agctgctaga gttccaagaa ctgttttgcc atttgaagct 120

atgccaagaa gaccaggaaa tagatggttg agattattac aaatctggag agaacaaggt 180

tatgaagatt tgcatttgga agttcatcaa acttttcaag aattgggtcc aatttttaga 240

tacgatttgg gtggtgctgg tatggtttgt gttatgttac cagaagatgt tgaaaaattg 300

caacaagttg attctttgca tccacataga atgtctttgg aaccatgggt tgcttataga 360

caacatagag gtcataaatg tggtgttttt ctattgaatg gtccagaatg gagattcaat 420

agattaagat tgaatccaga ggttttgtct ccaaatgctg ttcaaagatt tttaccaatg 480

gttgatgctg ttgctagaga tttttctcaa gctttaaaaa agaaggtctt gcaaaatgct 540

agaggttctt tgactttgga tgttcaacca tctatttttc attacactat cgaagcttct 600

aacttggctt tgtttggtga aagattaggt ttggttggtc attctccatc ttctgcttct 660

ttgaattttc tacatgcttt agaagtcatg ttcaaatcta ctgttcaatt gatgttcatg 720

ccaagatctt tgtctagatg gacatctcca aaagtttgga aagaacattt tgaagcttgg 780

gattgtattt ttcaatacgg tgacaattgt atccaaaaaa tatatcagga gctggctttt 840

tctagaccac aacaatatac atctatcgtt gctgaattgt tattgaatgc tgaattatct 900

ccagatgcta ttaaggctaa ttctatggaa ttaactgctg gttctgttga tactactgtt 960

tttccattgt tgatgacatt attcgaattg gctagaaatc caaatgttca acaagctttg 1020

agacaagaat ctttagctgc tgctgcttct atttctgaac atccacaaaa agctactact 1080

gaattaccat tgttaagagc tgctttgaaa gaaactttaa gattgtatcc agtcggtttg 1140

tttttggaaa gagttgcttc ttctgatttg gttttgcaaa attatcacat cccagctggt 1200

acattggtta gagtttttct atattctctg ggtagaaatc cagctttgtt tccaagacca 1260

gaaagatata atccacaaag atggttggat attagaggtt ctggtagaaa tttttaccat 1320

gttccatttg gtttcggtat gagacaatgt ttgggtagaa gattggctga agctgaaatg 1380

ttgttgttat tgcatcatgt tttgaagcat ttgcaagttg aaactttaac acaagaagat 1440

atcaagatgg tttactcttt tatcttgaga ccatctatgt ttccattatt aacattcaga 1500

gctatcaact aa 1512

<210> 14

<211> 561

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

atggctgcaa gattgttaag agtcgcttct gccgctttag gtgacactgc aggtagatgg 60

agattgttag ttagaccaag agcaggtgcc ggtggtttaa gaggttctag aggtcctggt 120

ttgggtggtg gtgctgtagc aaccagaact ttgtcagttt ccggtagagc tcaatcttca 180

tccgaagata agataaccgt tcatttcatc aacagagacg gtgaaacttt gactacaaag 240

ggtaaaattg gtgactcatt gttagacgtt gtcgtacaaa ataacttgga tatagacggt 300

ttcggtgcat gtgaaggtac attagcctgt tccacctgcc atttgatctt cgaacaacac 360

atcttcgaaa agttagaagc cattacagat gaagaaaacg atatgttgga cttagcatat 420

ggtttgaccg acagatcaag attaggttgt caaatatgct tgactaaggc tatggataac 480

atgacagtta gagtcccaga tgccgttagt gacgctagag aatctataga tatgggtatg 540

aacagttcta agatcgaata a 561

<210> 15

<211> 1479

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

atggctccta gatgttggag atggtggcca tggtcttcat ggaccagaac tagattacca 60

ccttctagat caatccaaaa cttcggtcaa catttctcca cccaagaaca aactcctcaa 120

atatgcgttg tcggtagtgg tccagcaggt ttctacactg cccaacattt gttgaagcat 180

cactctagag ctcacgtcga tatatacgaa aagcaattgg tacctttcag attggttaga 240

gtttggttag cattgactac accaagatct agaatgttgt tgaacacttt tactcaaact 300

gcaagatcag atagatgtgc cttctatggt aacgtcgaag taggtagaga cgttactgtc 360

caagaattga gagtttacag attgacagca gtagttttgt cttacggtgc tgaagatcat 420

caagcattgg acattcctgg tgaagaattg ccaggtgttt tctctgctag agcattcgtc 480

ggttggtaca atggtttacc tgaaaacaga gaattagctc cagatttgtc atgcgacact 540

gcagttatat tgggtcaggg taacgtcgca ttagatgtag ccagaatctt gttaacacca 600

cctgatcact tggaaaagac tgacattaca gaagctgcat taggtgcttt gagacaatct 660

agagtaaaga cagtttggat cgtcggtaga agaggtccat tgcaagttgc ttttactatt 720

aaagaattga gagaaatgat acaattgcca ggtacaagac ctatgttaga tccagctgac 780

ttcttaggtt tgcaagatag aattagagaa gccgctagac ctagaaagag attgatggaa 840

ttgttgttga gaacagcaac cgaaaagcca ggtgttgaag aagcagccag aagagcctcc 900

gctagtagag cctggggttt aagatttttc agatcccctc aacaagtttt aagattgcca 960

gatggtagag ctagaagatc cgcatggcaa agtcctgaat tggaaggtat tggtgaagcc 1020

catccaggtt ctgctcactg gggttgtggt ggtccacctt gcggtttagt tttgtccagt 1080

atcggttata aatccagacc aattgatcct agtgtcccat ttgaccctaa gttgggtgtc 1140

gtacctaata tggaaggtag agttgtcgat gttccaggtt tatactgttc cggttgggta 1200

aaaagaggtc caactggtgt tataaccact acaatgacag attcattttt gaccggtcaa 1260

atcttattgc aagacttgaa agctggtcat ttgccatctg gtccaagacc aggatctgcc 1320

tttattaagg ctttattgga ttcaagaggt gtatggccag tttctttctc agattgggaa 1380

aagttagacg ccgaagaagt ttctagaggt caagcatctg gtaaacctag agaaaagtta 1440

ttggacccac aagaaatgtt gagattattg ggtcactaa 1479

Claims

1.蛋白质或成套蛋白质，其特征在于：

所述蛋白质为如下(A1)-(A4)中任一所示的蛋白质：

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述成套蛋白质由蛋白质A和蛋白质B组成；

所述蛋白质A为如上(A1)-(A4)中任一所示的蛋白质或者氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；

所述蛋白质B为如下(B1)-(B4)中任一所示的蛋白质：

(B1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的蛋白质或成套蛋白质，其特征在于：所述(A1)所示的蛋白质为氨基酸序列如SEQ ID No.1的第19-527位所示的蛋白质。

3.核酸分子或成套核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为核酸分子1或核酸分子2；

所述核酸分子1为编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子；

所述核酸分子2为SEQ ID No.3所示的DNA分子；

所述成套核酸分子由核酸分子A和核酸分子B组成；

所述核酸分子A为编码权利要求1或2中所述蛋白质A的核酸分子；

所述核酸分子B为编码权利要求1或2中所述蛋白质B的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的核酸分子或成套核酸分子，其特征在于：

所述核酸分子1为如下(a1)-(a4)中任一所示的DNA分子：

(a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中所述(A1)-(A4)中任一所示的蛋白质的DNA分子；

(a4)与(a1)-(a3)中任一所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码权利要求1中所述(A1)-(A4)中任一所示的蛋白质的DNA分子；

所述核酸分子A为如上(a1)-(a4)中任一所示的DNA分子或者核苷酸序列如SEQ IDNo.3或SEQ ID No.5所示的DNA分子；

所述核酸分子B为如下(b1)-(b3)中任一所示的DNA分子：

(b1)核苷酸序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中所述蛋白质B的DNA分子；

(b3)与(b1)或(b2)所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码权利要求1中所述蛋白质B的DNA分子。

5.根据权利要求4所述的核酸分子或成套核酸分子，其特征在于：所述(a1)所示的DNA分子为核苷酸序列如SEQ ID No.3的第55-1584位所示的DNA分子；

所述(a2)所示的DNA分子为核苷酸序列如SEQ ID No.5的第55-1584位所示的DNA分子。

6.如下生物材料中的任一种：

(c1)重组载体，为含有权利要求3-5中任一所述核酸分子的重组载体；

(c2)表达盒，为含有权利要求3-5中任一所述核酸分子的表达盒；

(c3)转基因细胞系，为含有权利要求3-5中任一所述核酸分子的转基因细胞系；

(c4)重组菌，为含有权利要求3-5中任一所述核酸分子的重组菌；

(c5)成套重组载体，由重组载体A和重组载体B组成；所述重组载体A为含有权利要求3-5任一中所述核酸分子A的重组载体；所述重组载体B为含有权利要求3-5任一中所述核酸分子B的重组载体；

(c6)成套表达盒，由表达盒A和表达盒B组成；所述表达盒A为含有权利要求3-5任一中所述核酸分子A的表达盒；所述表达盒B为含有权利要求3-5任一中所述核酸分子B的表达盒；

(c7)成套转基因细胞系，由转基因细胞系A和转基因细胞系B组成；所述转基因细胞系A为含有权利要求3-5任一中所述核酸分子A的转基因细胞系；所述转基因细胞系B为含有权利要求3-5任一中所述核酸分子B的转基因细胞系；

(c8)成套重组菌，由重组菌A和重组菌B组成；所述重组菌A为含有权利要求3-5任一中所述核酸分子A的重组菌；所述重组菌B为含有权利要求3-5任一中所述核酸分子B的重组菌。

7.一种制备用于生产氢化可的松的工程菌的方法，包括如下步骤：对酵母菌进行改造，使其表达权利要求1或2所述的蛋白质或成套蛋白质，改造后的酵母菌即为用于生产氢化可的松的工程菌；

进一步地，所述方法包括如下步骤：将权利要求3-5中任一所述核酸分子或成套核酸分子导入所述酵母菌，得到表达权利要求1或2所述的蛋白质或成套蛋白质的重组酵母菌，即为所述工程菌；

更进一步地，所述核酸分子是通过权利要求6中所述重组载体或所述表达盒的形式导入所述酵母菌中的；所述成套核酸分子是通过权利要求6中所述成套重组载体或所述成套表达盒的形式导入所述酵母菌中的；

和/或

所述核酸分子或所述成套核酸分子被整合到所述酵母菌的基因组的Gal7位点或者rDNA位点处。

8.利用权利要求7所述方法制备得到的工程菌。

9.权利要求1或2所述的蛋白质或成套蛋白质或权利要求3-5中任一所述的核酸分子或成套核酸分子或权利要求6所述的生物材料或权利要求8所述的工程菌在如下任一中的应用：

(A)制备氢化可的松；

(B)催化甾体激素类物质进行11位β羟基化；

或

权利要求1或2所述的蛋白质在作为甾体激素类物质11位羟基化酶中的应用。

10.一种制备氢化可的松的方法，为全细胞催化法或酶法；

所述全细胞催化法包括如下步骤：对权利要求8所述的工程菌进行发酵培养，收集菌体后加入底物，进行催化反应，反应产物中即含有氢化可的松；所述底物为能够被甾类11β-羟化酶催化生成氢化可的松的物质；

所述酶法包括如下步骤：从权利要求8所述的工程菌中提取具有甾类11β-羟化酶活性的物质，然后以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式催化底物生成氢化可的松；所述底物为能够被甾类11β-羟化酶催化生成氢化可的松的物质。