CN115044603B - 一种调控/降低乙酰辅酶a支路代谢高效合成7-脱氢胆固醇的方法 - Google Patents

一种调控/降低乙酰辅酶a支路代谢高效合成7-脱氢胆固醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种调控/降低乙酰辅酶A支路代谢高效合成7‑脱氢胆固醇的方法，其利用一类有关乙酰辅酶A分解代谢的关键基因降低乙酰辅酶A分解，同时平衡细胞内还原力，进而高效合成7‑脱氢胆固醇的方法。该方法克服了传统的只通过增强乙酰辅酶A用于提升7‑脱氢胆固醇的技术，而是提供有关7‑脱氢胆固醇合成相关的基因，并通过对这些基因的过表达和敲除，进而增强乙酰辅酶A的合成，同时降低乙酰辅酶A消耗，实施例证明其最终7‑DHC的产量达到269mg/L；比SC001的7‑DHC产量提高了25倍；达到增强7‑脱氢胆固醇在微生物中合成的目的。

Description

一种调控/降低乙酰辅酶A支路代谢高效合成7-脱氢胆固醇的 方法
技术领域
本发明涉及一种，特别涉及一种调控/降低乙酰辅酶A支路代谢高效合成7-脱氢胆固醇的方法。
背景技术
维生素D3(Cholecalciferol,VD3)是一种人体必需的脂溶性维生素，调节人体中的钙、磷代谢，因此，常作为于治疗佝偻病、软骨病和维持钙稳态等方面的药物。一般成年健康的人类可以通过将体内摄入的胆固醇转化为VD3，而不需要额外补充VD3。但是随着全球老龄化人口的增加，老年人户外活动减少，并且随着年纪的增长，人体吸收能力的降低和内脏功能的退化，便会出现因VD3缺乏而导致的骨质疏松等疾病。不光是老年人需要补充VD3，婴幼儿由于刚出生吸收能力还未完全成熟，并急需供应身体快速生长所需要的营养物质，因此，同样需要额外补充VD3。7-脱氢胆固醇(7-dehydrocholestero，7-DHC)是合成VD3的重要前体物质，它经过紫外照射转化为VD3。7-DHC是一种重要的甾体激素类药物中间体，不光能合成VD3，同时也是合成雄甾烯二酮(4AD)等甾体药物的中间体。为了满足全球VD3的巨大市场，工业上将获得的7-DHC，在230-300nm的高压汞灯照射下转化为VD3，因此，生产VD3的核心问题在于7-DHC的合成。
传统的工业化7-DHC的制备方法主要有提取法(鱼肝油为原料)和化学合成法，因容易受到过敏反应的影响，提取法目前已逐步被化学合成法所替代。化学合成法是以羊毛脂胆固醇为原料，经过氧化、溴化、消除和水解反应合成7-DHC。化学合成法中底物羊毛脂胆固醇的质量直接决定了最终产物7-DHC的质量，因此，为了获得高品质的羊毛脂胆固醇，通常也需要进行酸化等处理。化学合成的方法虽然是目前工业化生产中常用的方法，但是其能耗高，反应条件苛刻且后处理繁琐，并对环境污染严重。利用微生物发酵法生产7-DHC具有绿色可持续的优势，并且微生物(如酿酒酵母)是一种安全可靠，具有巨大工业化应用潜力的微生物，是生产7-DHC和VD3优秀的底盘细胞。
7-DHC的微生物合成主要集中在已知合成路径中基因的增强和分支路径的阻断，但所需强化的基因同样也适合生产其他产物。利用微生物进行7-DHC的生产时，强化和阻断的基因虽然对合成目标产物具有一定的效果，但是由于7-DHC的合成涉及多个合成路径，往往会造成代谢通量失衡，给生产菌株带来负面影响。VD3的微生物合成主要集中于菌株的筛选方面，但是菌株的筛选费时费力，不仅要确定高效的筛选方法，还需要花费大量金钱进行大规模后期筛选与发酵检测，才能获得VD3产量极低的菌株。如中国专利CN103275997A、美国专利US2007/0204059A1、中国专利CN107075551B、中国专利CN104988168A。
中国专利CN104988168A是通过增强乙酰辅酶A的合成通量，进而提升7-DHC的合成，强化的基因有：acs、adh2、acl和ald6。但是使用组成型启动子对乙酰辅酶A的合成进行强化，会造成菌体代谢压力过高。中国专利CN104988168A和中国专利CN103275997A通过敲除ERG5和ERG6基因，进一步增强7-DHC的合成，但是敲除ERG5和ERG6会造成酿酒酵母合成麦角甾醇受阻。麦角甾醇是一种决定膜的流动性和渗透性的重要物质，直接阻断其合成，会导致细胞生长缓慢，不利于目标产物7-DHC的合成。专利CN202110160871将7-DHC合成路径中的部分酶使用氧化酶体和线粒体定位标签定位在酿酒酵母中各区室化中，形成相对独立的7-DHC合成途径，同时也增加了7-DHC合成所需前体物质的储存空间，也减少了反馈作用，在同一区室中，酶与酶之间的转化效率提高，减少作用底物的损失，最终实现7-DHC产量提升4倍，达到53.31mg/L，但是同一区室中产物的传质传递效率降低，阻止了生产效率的提高。中国专利CN202110562366设计了动态调控***，实现代谢通量更大限度的流向目标产物，同时也不会影响菌体的生长繁殖，最终使7-DHC的产量达到156mg/L，但是其副产物的生成并没有得到有效的弱化，7-DHC的产量无法进一步提升，且产物组分不利于分离过程。
通过上文分析可知，传统技术通过增强乙酰辅酶A的方式，对于提升7-脱氢胆固醇的合成具有一定助益，但实际上仍不能达到理想效果，因为前体物质的强化对于其下游路径上的供应都会提升，而并不能因此提高7-DHC的合成竞争力。该问题亟待本领域技术人员解决。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明利用一类有关乙酰辅酶A分解代谢的关键基因降低乙酰辅酶A分解，同时平衡细胞内氧化还原力，进而高效合成7-脱氢胆固醇的方法。该方法克服了传统的只通过增强乙酰辅酶A用于提升7-脱氢胆固醇的技术，而是提供有关7-脱氢胆固醇合成相关的基因，并通过对这些基因的过表达和敲除，进而增强乙酰辅酶A的合成，同时降低乙酰辅酶A消耗，达到增强7-脱氢胆固醇在微生物中合成的目的。
本发明第一方面提供了一种调控/降低乙酰辅酶A支路代谢高效合成7-脱氢胆固醇的方法，包括利用一类有关乙酰辅酶A分解代谢的关键基因，在工程菌内进行基因重组，以降低乙酰辅酶A分解；从而增强7-脱氢胆固醇合成。
进一步地，所述的在7-DHC合成中有重要的作用的一类有关乙酰辅酶A分解代谢的关键基因包括：
进一步地，编码天冬氨酸转氨酶的基因aat1(SEQ ID No.41)、磷酸甘油酸途径的磷酸丝氨酸磷酸酶基因ser2(SEQ ID No.42)、NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶基因gdh1(SEQID No.44)、NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶基因gdh3(SEQ ID No.43)、CDP-二酰基甘油-丝氨酸O-磷脂酰转移酶基因cho1(SEQ ID No.45)。
进一步地，所述天冬氨酸转氨酶(酶的EC编号——EC：2.6.1.1)用于催化草酰乙酸转化为天冬氨酸；所述磷酸丝氨酸磷酸酶(EC:3.1.3.3)参与丝氨酸和甘氨酸的生物合成；所述谷氨酸脱氢酶(EC:1.4.1.4)是催化氨和α-酮戊二酸合成谷氨酸；所述CDP-二酰基甘油-丝氨酸O-磷脂酰转移酶(EC：2.7.8.8)是在磷脂的生物合成中起作用。
进一步地，所述利用有关乙酰辅酶A分解代谢的关键基因的方法是敲除这些基因。
进一步地，所述高效合成7-脱氢胆固醇的方法，不仅包括利用上文所述的一类有关乙酰辅酶A分解代谢的关键基因，还包括利用增加乙酰辅酶A合成的基因，在工程菌内进行基因重组，从而增强7-脱氢胆固醇合成的方法。
进一步地，所述的增加乙酰辅酶A合成的基因包括：线粒体苹果酸脱氢酶mae1(SEQID No.40)、乙醇脱氢酶II adh2或D-乳酸脱氢酶dld1。
进一步地，所述线粒体苹果酸脱氢酶mae1(EC：1.1.1.38)用于催化苹果酸氧化脱羧为丙酮酸；所述D-乳酸脱氢酶dld1(EC：1.1.2.4)用于催化D-乳酸氧化为丙酮酸；乙醇脱氢酶II adh2(EC：1.1.1.1)用于催化乙醇转化为乙醛。
进一步地，所述利用有关乙酰辅酶A合成的关键基因的方法是对增加乙酰辅酶A合成的基因进行增强表达。
进一步地，所述的增强表达的途径包括使用下述组成型启动子：PTDH3、PTEF1、PPGK1、PENO2、PTPL1或者使用下述诱导型启动子PGAL1、PGAL10、PGAL7。通常情况下，是指在菌株内进行同源重组时，使用组成型启动子PTDH3、PTEF1、PPGK1、PENO2、PTPL1和诱导型启动子PGAL1、PGAL10、PGAL7表达上述需增强的乙酰辅酶A合成的基因(线粒体苹果酸脱氢酶mae1，乙醇脱氢酶II adh2或D-乳酸脱氢酶dld1)。
进一步地，上文所述的工程菌选自酿酒酵母S288C、酿酒酵母BY4742、酿酒酵母Y187、毕赤酵母x-33或热带假丝酵母1798。
进一步地，本发明通过过表达和敲除相关基因，即：过表达增加乙酰辅酶A合成的基因，且敲除有关乙酰辅酶A分解代谢的关键基因，不仅增加了7-DHC合成前体物质乙酰辅酶A的含量，还对酵母中整体的辅因子NADH/NAD+的比例产生影响，更有利于菌体生长和7-脱氢胆固醇的合成；
进一步地，通过过表达和敲除相关基因，控制酵母中整体的辅因子NADH/NAD+的比例范围一般以微摩尔计，控制NADH/NAD+的比例范围是0.3-0.8。
以原始的酿酒酵母S288C为出发菌株，导入7-DHC合成模块，同时使用启动子PTDH3控制线粒体苹果酸脱氢酶mae1(SEQ ID No.40)的表达，接下来使用Cas9分别对编码天冬氨酸转氨酶的aat1(SEQ ID No.41)、NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶gdh1(SEQ ID No.44)、NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶gdh3(SEQ ID No.43)和CDP-二酰基甘油-丝氨酸O-磷脂酰转移酶cho1(SEQ ID No.45)基因进行敲除。
进一步地，所述的7-DHC合成模块是包括经密码子优化的来源于鸡的DHCR24还原酶基因人工合成基因片段(SEQ ID No.46)，内源C-8甾醇异构酶(ERG2)，内源C-5甾醇去饱和酶(ERG3)。
进一步地，所述C-8甾醇异构酶ERG2(EC:5.3.3.5)用于在甾醇合成过程中，催化delta-8双键异构化到delta-7位置。C-5甾醇去饱和酶ERG3(EC:1.14.19.20)用于催化将C-5双键引入表甾醇。
进一步地，本发明以原始的酿酒酵母S288C为出发菌株，使用启动子PTDH3控制线粒体苹果酸脱氢酶mae1(SEQ ID No.40)的表达，接下来使用Cas9分别对编码天冬氨酸转氨酶的aat1、NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶gdh1(SEQ ID No.44)/gdh3(SEQ ID No.43)和CDP-二酰基甘油-丝氨酸O-磷脂酰转移酶cho1(SEQ ID No.45)基因进行敲除，检测菌株生长状态和7-DHC的产量，最终7-DHC的产量达到269mg/L。
具体而言，本发明所述的使用Cas9分别对不同的基因进行敲除的方法是本领域的常规技术，通常指按照Cas9基因敲除试剂盒的操作进行实验的过程。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明确定有助于7-脱氢胆固醇合成的有关乙酰辅酶A分解代谢的关键基因；
2.优化了菌株生长状态，降低冗余基因负担，在菌株生物量不降低的条件下提高7-DHC的产量；
通过抑制乙酰辅酶A的分解后，代谢通量大量流入目标代谢产物，目标代谢产物7-脱氢胆固醇的产量得到显著提升，达到269mg/L，并且生物量增多，更有利于后续的基因改造。
3.7-DHC的产量，最终7-DHC的产量达到269mg/L；比SC001的7-DHC产量提高了25倍；
4.增加7-DHC合成前体物质乙酰辅酶A的同时，优化了路径中整体的辅因子比例，有利于菌体的生长和7-DHC产量的提升。
附图说明
图1是整体代谢路径；
图2是各个菌株的7-DHC产量；
图3A、B、C是各个菌株中总NADH/NAD+的值以及标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明中，除非另有其他明确说明，否则百分比、百分含量均以质量计。如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
实施例1
生产7-DHC的重组酿酒酵母菌株的构建
如图1所示，图中展示了7-DHC合成的整体代谢路径。(a)以酿酒酵母工程菌S228C基因组为模板，采用引物HO-UP-F，HO-UP-R扩增得到基因片段HO-UP，采用引物HO-Down-F，HO-Down-R扩增得到基因片段HO-Down，片段HO-UP和HO-Down分别作为整合片段的上、下游同源臂。采用引物TDH3p-F，TDH3p-R扩增得到启动子片段TDH3p。人工合成基因片段鸡来源的C-24还原酶(DHCR24:SEQ ID No.46)，使用引物DH24-F、DH24-R扩增得到基因片段dhcr24。
(b)使用http://wyrickbioinfo2.smb.wsu.edu/crispr.html.网站进行sgRNA的设计，以质粒pML-104为模板，采用引物Cas9-HO-F和Cas9-HO-R进行质粒环P，得到替换了20bp sgRNA的pML-104-HO质粒。
(c)将原始酵母菌制成感受态，把步骤(a)和(b)中质粒和片段导入酿酒酵母中，在URA-SD的平板上进行筛选，30℃培养2-3天，使用YZ-HO-F和YZ-HO-R进行菌落PCR验证，将验证正确的单菌落，在含有5-FAO的YPD固体平板上划线培养，消除掉菌体中含有的pML-104质粒，得到的基因工程菌，命名为SC001。
引物序列：
SEQ ID No.1：HO-UP-F：aatgatttcctccctagctgacct
SEQ ID No.2：HO-UP-R：ggcgagtattgataatgataggttagatcccaggcgtagaac
SEQ ID No.3：HO-Down-F：taatttgcggccatagtgcgtttagaacgcttcatca
SEQ ID No.4：HO-Down-R：acgtaggttttgtctcgctaattgc
SEQ ID No.5：TDH3p-F：ttaacctatcattatcaatactcgccatttcaaaga
SEQ ID No.6：TDH3p-R：agaccaaacggcagacattcgaaactaagttctggtgttttaaaact
SEQ ID No.7：DH24-F：agaacttagtttcgaatgtctgccgtttggtct
SEQ ID No.8：DH24-R：agcgttctaaacgcactatggccgcaaattaaagccttcgag
SEQ ID No.9：Cas9-HO-F：tttctagctctaaaactagcatctagcacatactcggatcatttatctttcactgcggag
SEQ ID No.10：Cas9-HO-R：cgagtatgtgctagatgctagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagt
SEQ ID No.11：YZ-HO-F：tgacaatttatgacctgcagtaca
SEQ ID No.12：YZ-HO-R：tcctcggtgaatttctcgcagatagac
实施例2
增强乙酰辅酶A的合成
(a)以酿酒酵母工程菌S228C基因组为模板，采用引物mae1-F，mae1-R扩增得到基因片段mae1(SEQ ID No.40)，采用引物UPERG6-F，UPERG6-R扩增得到基因片段UPERG6，采用引物DOWNERG6-F，DOWNERG6-R扩增得到基因片段DOWNERG6，采用引物Mae1-TDH3p-F，Mae1-TDH3p-R扩增得到含有mae1片段重叠区域的启动子片段TDH3p。
(b)使用http://wyrickbioinfo2.smb.wsu.edu/crispr.html.网站进行sgRNA的设计，以质粒pML-104为模板，采用引物Cas9-ERG6-F和Cas9-ERG6-R进行质粒环P，得到替换了20bp sgRNA的pML-104-ERG6质粒。
(c)将SC001酵母菌制成感受态，把步骤(a)和(b)中质粒和片段导入感受态中，在URA-SD的平板上进行筛选，30℃培养2-3天，使用YZ-ERG6-F和YZ-ERG6-R进行菌落PCR验证，将验证正确的单菌落，在含有5-FAO的YPD固体平板上划线培养，消除掉菌体中含有的pML-104-ERG6质粒，得到的基因工程菌，命名为SC002。
引物序列：
SEQ ID No.13：mae1-F:aacttagtttcgaatgcttagaaccagactatccgtttccgtt
SEQ ID No.14：mae1-R:gtgcattgatgtcgaagaacactacaattggttggtgtgcacc
SEQ ID No.15：UPERG6-F:cttaccaccggcaactaaaccaac
SEQ ID No.16：UPERG6-R:atggcgagtattgataatgaaagccacacattcctactataacgtc
SEQ ID No.17：DOWNERG6-F:accaaccaattgtagtgttcttcgacatcaatgcactcaaacctg
SEQ ID No.18：DOWNERG6-R:aaactaaaaatggctcgtgttcatgc
SEQ ID No.19：Mae1-TDH3p-F:gtaggaatgtgtggctttcattatcaatactcgccatttcaaaga
SEQ ID No.20：Mae1-TDH3p-R:atagtctggttctaagcattcgaaactaagttctggtgttttaaaact
SEQ ID No.21：Cas9-ERG6-F:ctagctctaaaacaatttctcaagtacttctgagatcatttatctttcactgcggagaa
SEQ ID No.22：Cas9-ERG6-R:cagaagtacttgagaaattgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcc
SEQ ID No.23：YZ-ERG6-F:tctctcttgctgggcccccaacac
SEQ ID No.24：YZ-ERG6-R:gtcacgggctagtttcttgttgttagt
实施例3
抑制乙酰辅酶A的分解代谢和调控整体路径中氧化还原水平
(a)使用http://wyrickbioinfo2.smb.wsu.edu/crispr.html.网站进行sgRNA的设计，以质粒pML-104为模板，采用引物Cas9-AAT1-F和Cas9-AAT1-R进行质粒环P，得到替换了20bp sgRNA的pML-104-AAT1质粒。采用引物Cas9-GDH1-F和Cas9-GDH1-R进行质粒环P，得到替换了20bp sgRNA的pML-104-GDH1质粒。采用引物Cas9-GDH3-F和Cas9-GDH3-R进行质粒环P，得到替换了20bp sgRNA的pML-104-GDH3质粒。采用引物Cas9-CHO1-F和Cas9-CHO1-R进行质粒环P，得到替换了20bp sgRNA的pML-104-CHO1质粒。
(b)将SC002酵母菌制成感受态，把步骤(a)中获得的质粒分别导入感受态中，分别获得菌株SC003、SC004、SC005、SC006，接下来，将上述获得的全部质粒依次导入SC002中，最终获得工程菌SC007,将上述得到的菌株在URA-SD的平板上进行筛选，30℃培养2-3d，SC003菌株使用YZ-AAT1-F测序验证，SC004菌株使用YZ-GDH1-F进行测序验证，SC005菌株使用YZ-GDH3-F进行测序验证，SC006菌株使用YZ-CHO1-F进行测序验证，在含有5-FAO的YPD固体平板上划线培养，消除掉菌体中含有的pML-104质粒，得到的基因工程菌，分别命名为SC003X、SC004X、SC005X、SC006X、SC007X，其中SC003X、SC004X、SC005X、SC006X、SC007X分别为在S228C酵母中构建了7-DHC合成模块并增强乙酰辅酶A合成后敲除了天冬氨酸转氨酶的aat1基因、NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶gdh1基因、NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶gdh3基因、CDP-二酰基甘油-丝氨酸O-磷脂酰转移酶cho1基因以及同时敲除上述基因的菌株。
引物序列：
SEQ ID No.25：Cas9-AAT1-F:ctagctctaaaacgtagggttgtgacaacacgcgatcatttatctttcactgcggagaa
SEQ ID No.26：Cas9-AAT1-R:gcgtgttgtcacaaccctacgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcc
SEQ ID No.27：Cas9-GDH1-F:ctagctctaaaacaagaatttcaagatagacaagatcatttatctttcactgcggagaa
SEQ ID No.28：Cas9-GDH1-R:ttgtctatcttgaaattcttgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcc
SEQ ID No.29：Cas9-GDH3-F:ctagctctaaaacagtgagcgcattcttgaagagatcatttatctttcactgcggagaa
SEQ ID No.30：Cas9-GDH3-R:tcttcaagaatgcgctcactgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcc
SEQ ID No.31：Cas9-CHO1-F:ctagctctaaaacgtaagcgtaaatctcagacagatcatttatctttcactgcggagaa
SEQ ID No.32：Cas9-CHO1-R:tgtctgagatttacgcttacgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcc
SEQ ID No.33：YZ-AAT1-F:tggattgagcaattgaaaacctttgc
SEQ ID No.34：YZ-GDH1-F:aagttgctcaaggttacagagtgc
SEQ ID No.35：YZ-GDH3-F:ttcaattcagggtcacgtgggaa
SEQ ID No.36：YZ-CHO1-F:catttcagcatgatgaggaatttg
实施例4
构建成功的重组酿酒酵母菌发酵水平验证
在2mL YPD培养基中接种固体YPD平板上的酿酒酵母菌SC007X单菌落，30℃，220rpm培养16-20h后，按接种量2％接入含有25mLYPD液体培养基的250mL圆底摇瓶内，30℃，220rpm培养96h。发酵至26h时，加入葡萄糖进行碳源的补充。
发酵90-120h后，5000rpm离心，使用10mL无菌水重悬，加入0.5mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪进行破碎10min，取出破碎后的混合液，加入1g抗坏血酸和0.5g HBT，混匀，依次加入20mL的无水乙醇，10mL的1.5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，在80℃的水域中皂化2h，皂化结束后使用萃取液(异丙醇：正己烷＝1:3/石油醚)进行超声30min，使用分液漏斗除去下层杂质后，将萃取混合液进行冷冻干燥处理，处理结束后使用甲醇或乙腈或甲醇和乙腈的混合物复溶，0.55μm过滤后进行高效液相色谱分析。流动相使用甲醇和水，比例为90:10或者95:5或者98:2。检测器使用紫外检测器，检测波长为265nm。
计算得最终SC007X的7-DHC的产量达到269mg/L(如图2)。
实施例5
构建成功的重组酿酒酵母菌细胞内总NADH/NAD+
利用ATT Biorequest公司的NADH/NAD+试剂盒进行检测，首先离心取菌体，使用NAD+/NADH提取液进行细胞裂解，接下来，进行NADH和NAD+标准品曲线的测定，将上述裂解的细胞，分别加入96孔板中，分别对NADH和NAD+进行测量，最终与绘制的标准进行比对，计算细胞内总NADH/NAD+的值。NADH/NAD+的标准曲线和检测结果如图3所示，数据显示所构建的不同菌株胞内NADH/NAD+的含量，证明了胞内NADH/NAD+的含量在0.3-0.8范围内，可得到较高的7-DHC产量。
对比例1
出发菌株酿酒酵母S288C的发酵
在2mLYPD培养基中接种固体YPD平板上的酿酒酵母菌S288C单菌落，30℃，220rpm培养16-20h后，按接种量2％接入含有25mLYPD液体培养基的250mL圆底摇瓶内，30℃，220rpm培养96h。发酵至26h时，加入葡萄糖进行碳源的补充。
发酵90-120h后，5000rpm离心，使用10mL无菌水重悬，加入0.5mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪进行破碎10min，取出破碎后的混合液，加入1g抗坏血酸和0.5g HBT，混匀，依次加入20mL的无水乙醇，10mL的1.5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，在80℃的水域中皂化2h，皂化结束后使用萃取液(异丙醇：正己烷＝1:3/石油醚)进行超声30min，使用分液漏斗除去下层杂质后，将萃取混合液进行冷冻干燥处理，处理结束后使用甲醇或乙腈或甲醇和乙腈的混合物复溶，0.55μm过滤后进行高效液相色谱分析。流动相使用甲醇和水，比例为90:10或者95:5或者98:2。检测器使用紫外检测器，检测波长为265nm。
没有检测到7-DHC的产量。
对比例2
生产7-DHC的重组酿酒酵母SC001的发酵
在2mLYPD培养基中接种固体YPD平板上的酿酒酵母菌SC001单菌落，30℃，220rpm培养16-20h后，按接种量2％接入含有25mLYPD液体培养基的250mL圆底摇瓶内，30℃，220rpm培养96h。发酵至26h时，加入葡萄糖进行碳源的补充。
发酵90-120h后，5000rpm离心，使用10mL无菌水重悬，加入0.5mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪进行破碎10min，取出破碎后的混合液，加入1g抗坏血酸和0.5g HBT，混匀，依次加入20mL的无水乙醇，10mL的1.5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，在80℃的水域中皂化2h，皂化结束后使用萃取液(异丙醇：正己烷＝1:3/石油醚)进行超声30min，使用分液漏斗除去下层杂质后，将萃取混合液进行冷冻干燥处理，处理结束后使用甲醇或乙腈或甲醇和乙腈的混合物复溶，0.55μm过滤后进行高效液相色谱分析。流动相使用甲醇和水，比例为90:10或者95:5或者98:2。检测器使用紫外检测器，检测波长为265nm。
计算得最终7-DHC的产量仅有10.7mg/L。
对比例3
增强乙酰辅酶A的合成重组酿酒酵母SC002的发酵
在2mLYPD培养基中接种固体YPD平板上的酿酒酵母菌SC002单菌落，30℃，220rpm培养16-20h后，按接种量2％接入含有25mLYPD液体培养基的250mL圆底摇瓶内，30℃，220rpm培养96h。发酵至26h时，加入葡萄糖进行碳源的补充。
发酵90-120h后，5000rpm离心，使用10mL无菌水重悬，加入0.5mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪进行破碎10min，取出破碎后的混合液，加入1g抗坏血酸和0.5g HBT，混匀，依次加入20mL的无水乙醇，10mL的1.5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，在80℃的水域中皂化2h，皂化结束后使用萃取液(异丙醇：正己烷＝1:3/石油醚)进行超声30min，使用分液漏斗除去下层杂质后，将萃取混合液进行冷冻干燥处理，处理结束后使用甲醇或乙腈或甲醇和乙腈的混合物复溶，0.55μm过滤后进行高效液相色谱分析。流动相使用甲醇和水，比例为90:10或者95:5或者98:2。检测器使用紫外检测器，检测波长为265nm。
计算知最终7-DHC的产量仅有51.6mg/L。
对比例4
敲除乙酰辅酶A的分解代谢基因重组酵母的发酵
在2mLYPD培养基中接种固体YPD平板上的酿酒酵母菌SC003X、SC004X、SC005X、SC006X单菌落，30℃，220rpm培养16-20h后，按接种量2％接入含有25mLYPD液体培养基的250mL圆底摇瓶内，30℃，220rpm培养96h。发酵至26h时，加入葡萄糖进行碳源的补充。
发酵90-120h后，5000rpm离心，使用10mL无菌水重悬，加入0.5mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪进行破碎10min，取出破碎后的混合液，加入1g抗坏血酸和0.5g HBT，混匀，依次加入20mL的无水乙醇，10mL的1.5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，在80℃的水域中皂化2h，皂化结束后使用萃取液(异丙醇：正己烷＝1:3/石油醚)进行超声30min，使用分液漏斗除去下层杂质后，将萃取混合液进行冷冻干燥处理，处理结束后使用甲醇或乙腈或甲醇和乙腈的混合物复溶，0.55μm过滤后进行高效液相色谱分析。流动相使用甲醇和水，比例为90:10或者95:5或者98:2。检测器使用紫外检测器，检测波长为265nm。
计算得最终SC003X、SC004X、SC005X、SC006X的7-DHC的产量分别达到80mg/L、110mg/L、90mg/L和76mg/L。
对比例5
敲除其他乙酰辅酶A的分解代谢基因重组酵母的构建及发酵
使用http://wyrickbioinfo2.smb.wsu.edu/crispr.html.网站进行sgRNA的设计，以质粒pML-104为模板，采用引物Cas9-ACH1-F和Cas9-ACH1-R进行质粒环P，得到替换了20bp sgRNA的pML-104-ACH1质粒。
将SC001酵母菌制成感受态，把步骤(a)中获得的质粒分别导入感受态中，将获得的菌株在URA-SD的平板上进行筛选，30℃培养2-3d，SC001X菌株使用YZ-ACH1-F测序验证，得到的基因工程菌，分别命名为SC001X。
在2mLYPD培养基中接种固体YPD平板上的酿酒酵母菌SC002X单菌落，30℃，220rpm培养16-20h后，按接种量2％接入含有25mLYPD液体培养基的250mL圆底摇瓶内，30℃，220rpm培养96h。发酵至26h时，加入葡萄糖进行碳源的补充。
发酵90-120h后，5000rpm离心，使用10mL无菌水重悬，加入0.5mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪进行破碎10min，取出破碎后的混合液，加入1g抗坏血酸和0.5g HBT，混匀，依次加入20mL的无水乙醇，10mL的1.5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，在80℃的水域中皂化2h，皂化结束后使用萃取液(异丙醇：正己烷＝1:3/石油醚)进行超声30min，使用分液漏斗除去下层杂质后，将萃取混合液进行冷冻干燥处理，处理结束后使用甲醇或乙腈或甲醇和乙腈的混合物复溶，0.55μm过滤后进行高效液相色谱分析。流动相使用甲醇和水，比例为90:10或者95:5或者98:2。检测器使用紫外检测器，检测波长为265nm。
计算得最终7-DHC的产量仅有23mg/L。
引物序列：
SEQ ID No.37：Cas9-ACH1-F：tttctagctctaaaacctattgtctagtaagacggtgatcatttatctttcactgcggagSEQ ID No.38：Cas9-ACH1-R：accgtcttactagacaataggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtSEQ ID No.39：YZ-ACH1-F：gagctaaggggagcagttacgcaa
对比例6
将实施例3(a)得到的质粒pML-104-AAT1、pML-104-GDH1和pML-104-GDH3依次导入SC002酵母菌中，得到菌株SC005C，其与SC007X菌株相比，没有敲除cho1基因。将得到的SC005X与SC007X分别按照接种量2％接入含有25mLYPD液体培养基的250mL圆底摇瓶内，30℃，220rpm培养96h。发酵至26h时，加入葡萄糖进行碳源的补充。
发酵90-120h后，5000rpm离心，使用10mL无菌水重悬，加入0.5mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪进行破碎10min，取出破碎后的混合液，加入1g抗坏血酸和0.5g HBT，混匀，依次加入20mL的无水乙醇，10mL的1.5mol/L的氢氧化钾甲醇溶液，在80℃的水域中皂化2h，皂化结束后使用萃取液(异丙醇：正己烷＝1:3/石油醚)进行超声30min，使用分液漏斗除去下层杂质后，将萃取混合液进行冷冻干燥处理，处理结束后使用甲醇或乙腈或甲醇和乙腈的混合物复溶，0.55μm过滤后进行高效液相色谱分析。流动相使用甲醇和水，比例为90:10或者95:5或者98:2。检测器使用紫外检测器，检测波长为265nm。
计算知SC007X的7-DHC的产量达到269mg/L，SC005C的7-DHC产量仅为115mg/L，7-DHC的产量降低了57％。
对比例7
使用启动子gal1p对mae1基因进行增强，使用弱启动子FRS1p依次对天冬氨酸转氨酶的aat1基因、NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶gdh1基因、NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶gdh3基因、CDP-二酰基甘油-丝氨酸O-磷脂酰转移酶cho1基因的表达进行下调，得到菌株SC007C。将SC007C与SC007X菌株按照接种量2％接入含有25mLYPD液体培养基的250mL圆底摇瓶内，30℃，220rpm培养96h。发酵至26h时，加入葡萄糖进行碳源的补充。
发酵90-120h后，5000rpm离心，使用10mL无菌水重悬，加入0.5mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪进行破碎10min，取出破碎后的混合液，加入1g抗坏血酸和0.5g HBT，混匀，依次加入20mL的无水乙醇，10mL的1.5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，在80℃的水域中皂化2h，皂化结束后使用萃取液(异丙醇：正己烷＝1:3/石油醚)进行超声30min，使用分液漏斗除去下层杂质后，将萃取混合液进行冷冻干燥处理，处理结束后使用甲醇或乙腈或甲醇和乙腈的混合物复溶，0.55μm过滤后进行高效液相色谱分析。流动相使用甲醇和水，比例为90:10或者95:5或者98:2。检测器使用紫外检测器，检测波长为265nm。
计算知SC007X的7-DHC的产量达到269mg/L，SC007C的7-DHC产量仅为135mg/L，7-DHC的产量降低了50％。
总之，在此本发明通过构建7-DHC合成模块使菌株能够生成7-DHC，增加乙酰辅酶A的合成能够将产量提升约5倍，降低乙酰辅酶A的分解可增强7-脱氢胆固醇合成，大幅提高7-DHC的产量(26倍)。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
序列表
<110> 大连医诺生物股份有限公司
<120> 一种调控/降低乙酰辅酶A支路代谢高效合成7-脱氢胆固醇的方法
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物HO-UP-F(无)
<400> 1
aatgatttcc tccctagctg acct 24
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 引物HO-UP-R(无)
<400> 2
ggcgagtatt gataatgata ggttagatcc caggcgtaga ac 42
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物HO-Down-F(无)
<400> 3
taatttgcgg ccatagtgcg tttagaacgc ttcatca 37
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物HO-Down-R(无)
<400> 4
acgtaggttt tgtctcgcta attgc 25
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> TDH3p-F(无)
<400> 5
ttaacctatc attatcaata ctcgccattt caaaga 36
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> TDH3p-R(无)
<400> 6
agaccaaacg gcagacattc gaaactaagt tctggtgttt taaaact 47
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> DH24-F(无)
<400> 7
agaacttagt ttcgaatgtc tgccgtttgg tct 33
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> DH24-R(无)
<400> 8
agcgttctaa acgcactatg gccgcaaatt aaagccttcg ag 42
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> Cas9-HO-F(无)
<400> 9
tttctagctc taaaactagc atctagcaca tactcggatc atttatcttt cactgcggag 60
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> Cas9-HO-R(无)
<400> 10
cgagtatgtg ctagatgcta gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagt 59
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> YZ-HO-F(无)
<400> 11
tgacaattta tgacctgcag taca 24
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> YZ-HO-R(无)
<400> 12
tcctcggtga atttctcgca gatagac 27
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> mae1-F(无)
<400> 13
aacttagttt cgaatgctta gaaccagact atccgtttcc gtt 43
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> mae1-R(无)
<400> 14
gtgcattgat gtcgaagaac actacaattg gttggtgtgc acc 43
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> UPERG6-F(无)
<400> 15
cttaccaccg gcaactaaac caac 24
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> UPERG6-R(无)
<400> 16
atggcgagta ttgataatga aagccacaca ttcctactat aacgtc 46
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> DOWNERG6-F(无)
<400> 17
accaaccaat tgtagtgttc ttcgacatca atgcactcaa acctg 45
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> DOWNERG6-R(无)
<400> 18
aaactaaaaa tggctcgtgt tcatgc 26
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> Mae1-TDH3p-F(无)
<400> 19
gtaggaatgt gtggctttca ttatcaatac tcgccatttc aaaga 45
<210> 20
<211> 48
<212> DNA
<213> Mae1-TDH3p-R(无)
<400> 20
atagtctggt tctaagcatt cgaaactaag ttctggtgtt ttaaaact 48
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> Cas9-ERG6-F(无)
<400> 21
ctagctctaa aacaatttct caagtacttc tgagatcatt tatctttcac tgcggagaa 59
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> Cas9-ERG6-R(无)
<400> 22
cagaagtact tgagaaattg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 60
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> YZ-ERG6-F(无)
<400> 23
tctctcttgc tgggccccca acac 24
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> YZ-ERG6-R(无)
<400> 24
gtcacgggct agtttcttgt tgttagt 27
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> Cas9-AAT1-F(无)
<400> 25
ctagctctaa aacgtagggt tgtgacaaca cgcgatcatt tatctttcac tgcggagaa 59
<210> 26
<211> 61
<212> DNA
<213> Cas9-AAT1-R(无)
<400> 26
gcgtgttgtc acaaccctac gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
c 61
<210> 27
<211> 59
<212> DNA
<213> Cas9-GDH1-F(无)
<400> 27
ctagctctaa aacaagaatt tcaagataga caagatcatt tatctttcac tgcggagaa 59
<210> 28
<211> 61
<212> DNA
<213> Cas9-GDH1-R(无)
<400> 28
ttgtctatct tgaaattctt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
c 61
<210> 29
<211> 59
<212> DNA
<213> Cas9-GDH3-F(无)
<400> 29
ctagctctaa aacagtgagc gcattcttga agagatcatt tatctttcac tgcggagaa 59
<210> 30
<211> 61
<212> DNA
<213> Cas9-GDH3-R(无)
<400> 30
tcttcaagaa tgcgctcact gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
c 61
<210> 31
<211> 59
<212> DNA
<213> Cas9-CHO1-F(无)
<400> 31
ctagctctaa aacgtaagcg taaatctcag acagatcatt tatctttcac tgcggagaa 59
<210> 32
<211> 61
<212> DNA
<213> Cas9-CHO1-R(无)
<400> 32
tgtctgagat ttacgcttac gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
c 61
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> YZ-AAT1-F(无)
<400> 33
tggattgagc aattgaaaac ctttgc 26
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> YZ-GDH1-F(无)
<400> 34
aagttgctca aggttacaga gtgc 24
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> YZ-GDH3-F(无)
<400> 35
ttcaattcag ggtcacgtgg gaa 23
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> YZ-CHO1-F(无)
<400> 36
catttcagca tgatgaggaa tttg 24
<210> 37
<211> 60
<212> DNA
<213> Cas9-ACH1-F(无)
<400> 37
tttctagctc taaaacctat tgtctagtaa gacggtgatc atttatcttt cactgcggag 60
<210> 38
<211> 59
<212> DNA
<213> Cas9-ACH1-R(无)
<400> 38
accgtcttac tagacaatag gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagt 59
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> YZ-ACH1-F(无)
<400> 39
gagctaaggg gagcagttac gcaa 24
<210> 40
<211> 2010
<212> DNA
<213> mae1序列(无)
<400> 40
atgcttagaa ccagactatc cgtttccgtt gctgctagat cgcaactaac cagatccttg 60
acagcatcaa ggacagcacc attaagaaga tggcctattc agcaatcgcg tttatattct 120
tctaacacta gatcgcataa agctaccaca acaagagaaa atactttcca aaagccatac 180
agcgacgagg aggtcactaa aacacccgtc ggttctcgcg ccagaaagat cttcgaagct 240
cctcacccac atgccactcg tttgactgta gaaggtgcca tagaatgtcc cttggagagc 300
tttcaacttt taaactctcc tttatttaac aagggttctg catttacaca agaagaaagg 360
gaagcgttta atttagaagc attgctacca ccacaagtga acactttgga cgaacaactg 420
gaaagaagct acaagcagtt atgctatttg aagacgccct tggccaaaaa cgacttcatg 480
acgtctttga gagtacagaa caaagtccta tattttgcat taataaggag acatatcaag 540
gaattagttc ctatcattta caccccaacc gaaggtgatg ctattgctgc ctattcccac 600
aggttcagaa agccagaagg tgtgttttta gacattaccg aacctgattc catcgaatgt 660
agattggcta catacggtgg agacaaagat gtagactaca tcgttgtgtc ggattcggaa 720
ggtattctgg gaattggtga ccaaggtatc ggtggtgtac gtattgctat ctccaaattg 780
gcattgatga cgctgtgcgg tggtattcat cccggccgtg tgctacctgt gtgtttggac 840
gtcggtacta acaacaagaa actagcccgt gacgaattgt acatgggtaa caagttctcc 900
agaatcaggg gtaagcaata tgacgacttc ttggaaaaat tcatcaaggc cgttaagaaa 960
gtgtatccaa gcgccgttct gcatttcgaa gatttcggtg ttaagaacgc tagaagatta 1020
ctagaaaagt acaggtacga attgccatca ttcaacgatg acattcaggg caccggtgcc 1080
gtcgtgatgg cctcgttgat tgctgctttg aaacatacca acagagactt gaaagacacc 1140
agagtgctta tttacggtgc cgggtctgcg ggcctcggta tcgcagatca aattgtgaat 1200
catatggtca cgcacggcgt tgacaaggaa gaagcgcgca agaaaatctt cttgatggac 1260
agacgtgggt taattctaca atcttacgag gctaactcca ctcccgccca acacgtatac 1320
gctaagagtg atgcggaatg ggctggtatc aacacccgct ctttacatga tgtggtggag 1380
aacgtcaaac caacgtgttt ggttggctgc tccacacaag caggcgcatt cactcaagat 1440
gtcgtagaag aaatgcacaa gcacaatcct agaccgatca ttttcccatt atccaaccct 1500
actagactac acgaagccgt tcctgccgat ttaatgaagt ggaccaacaa caacgctctt 1560
gtagctaccg gatctccttt cccacctgtt gatggttacc gtatctcgga gaacaacaat 1620
tgttactctt tcccaggtat cggtttaggt gccgtactat cgcgtgccac caccatcaca 1680
gacaagatga tctccgctgc agtggaccaa ctagccgaat tgtcgccact aagagagggc 1740
gactcgagac ctgggttgct acccggcctg gacaccatca ccaacacttc tgcgcgtcta 1800
gctaccgctg tgatcttgca agcactcgag gagggaaccg cccgtatcga gcaagaacaa 1860
gtaccgggag gagctcccgg cgaaactgtc aaggttcctc gtgactttga cgaatgttta 1920
cagtgggtca aagcccaaat gtgggagcct gtgtacagac ctatgatcaa ggtccaacat 1980
gacccatcgg tgcacaccaa ccaattgtag 2010
<210> 41
<211> 1356
<212> DNA
<213> aat1序列(无)
<400> 41
atgttgagga cgaggcttac taattgcagt ctatggaggc cctactacac gtcatcgctt 60
agtagagtac caagagcacc tccagataaa gtcttggggt tatctgaaca cttcaaaaag 120
gtaaaaaatg ttaacaaaat tgacctgacc gtaggaatat ataaagatgg ttggggcaaa 180
gtgacgacgt ttccctccgt tgcaaaagct caaaaattga ttgaatctca tttagagttg 240
aataagaatc tttcatattt accaataaca ggttccaaag aatttcagga aaacgttatg 300
aaatttttgt tcaaggaatc atgtccgcag tttgggccat tttatttagc ccatgataga 360
atcagctttg ttcagacttt gagtggtaca ggcgccctag ctgtagcagc taaattcttg 420
gcattattta tttcaagaga tatttggata cctgacccat catgggcaaa tcataagaac 480
atttttcaga acaatggttt tgaaaatatt taccggtatt cctattataa ggacggtcag 540
atagacatcg acggatggat tgagcaattg aaaacctttg catataacaa ccagcaagaa 600
aacaataaga acccaccttg cataatcttg catgcgtgtt gtcacaaccc tacaggtctc 660
gacccaacta aagagcaatg ggaaaagatt atagatacta tatatgagct aaaaatggta 720
cccattgttg atatggctta tcagggttta gagtctggta acttactaaa ggacgcatat 780
ttattgaggc tatgtctcaa tgtaaataaa tatccaaatt ggagtaacgg tatctttctt 840
tgtcaatctt ttgccaagaa catgggcctt tatggtgaac gagttggttc cttaagcgtt 900
atcacgccgg caactgcgaa caatggaaag ttcaaccctc tacaacagaa aaactcattg 960
cagcaaaata ttgactccca attaaaaaag attgtcagag gtatgtattc ttctccacca 1020
ggatacggtt ctcgtgtggt aaatgtagta ttatcagatt tcaaattgaa acagcaatgg 1080
ttcaaggatg ttgatttcat ggttcagaga ttgcatcacg tcagacagga gatgtttgac 1140
cgtctagggt ggccggatct tgtaaatttc gcacaacagc acggtatgtt ttactataca 1200
aggtttagtc caaagcaagt cgaaatattg agaaacaatt acttcgtcta tttaacaggt 1260
gatggtagat tgtcgcttag cggagtcaat gattcgaacg ttgattactt atgtgaatct 1320
cttgaagcag tctcgaaaat ggacaaactc gcataa 1356
<210> 42
<211> 930
<212> DNA
<213> ser2序列(无)
<400> 42
atgtcaaagt ttgttatcac ctgcatagct catggagaaa atctcccaaa agaaaccatc 60
gaccagattg cgaaagaaat tactgaaagc tcggcgaaag atgtatcaat caatggtacc 120
aagaaactat cggccagagc taccgatata ttcattgaag tcgcaggatc gattgttcaa 180
aaagacctca agaataagct gacgaacgtc attgacagtc ataatgatgt tgatgttatt 240
gtttctgtcg acaatgaata tcgtcaagcc aaaaagctct ttgtctttga catggattca 300
acattaatct accaagaggt catcgaattg attgccgctt atgctggtgt tgaagaacaa 360
gtgcacgaga tcacagaaag agccatgaac aatgaacttg atttcaaaga gtctttaaga 420
gaacgcgtta aattattgca aggcctccaa gtcgatacac tatatgatga aataaaacaa 480
aagctagagg tcaccaaggg tgtgccagaa ctatgcaagt tccttcacaa aaaaaattgc 540
aagctcgctg ttttaagcgg tggttttatt cagtttgccg gttttatcaa ggatcagtta 600
ggtttagatt tttgtaaggc aaacttgttg gaagttgaca ctgatggaaa attaaccggt 660
aaaacactgg gtcctatcgt agacggacag tgcaagagtg aaacccttct gcaactatgt 720
aatgactaca atgttccagt tgaagcaagt tgtatggtgg gtgacggtgg taacgacctg 780
ccagccatgg ctaccgccgg gtttgggatc gcatggaacg ccaagccaaa ggtgcagaaa 840
gctgcacctt gtaagttgaa taccaagagc atgactgaca ttttatacat tcttggttac 900
accgatgatg aaatatacaa tagacaatga 930
<210> 43
<211> 1374
<212> DNA
<213> gdh3序列(无)
<400> 43
atgacaagcg aaccagagtt tcagcaggct tacgatgaga tcgtttcttc tgtggaggat 60
tccaaaattt ttgaaaaatt cccacagtat aaaaaagtgt tacctattgt ttctgtcccg 120
gagaggatca ttcaattcag ggtcacgtgg gaaaatgata atggcgagca agaagtggct 180
caaggataca gggtgcagtt caattcagcc aagggccctt acaagggtgg cctacgcttc 240
cacccatcag tgaacctgtc tatcctaaaa tttttgggtt ttgaacagat cttcaagaat 300
gcgctcactg ggctagatat gggcggtggt aagggtggcc tgtgtgtgga cttgaaaggc 360
aagtctgaca acgagatcag aaggatttgt tatgcgttca tgagagaact gagcaggcat 420
attggtaagg acacagacgt gcccgcagga gatattggtg tcggtggccg tgaaattggc 480
tacctattcg gcgcttacag atcatacaag aactcctggg aaggtgtgtt gactggtaag 540
ggtttaaact ggggtggctc acttatcagg ccggaggcca ccgggttcgg cttagtttac 600
tatacgcaag caatgatcga ttatgcaaca aacggcaagg agtcgtttga gggcaaacgt 660
gtgacaatct ccggaagtgg caatgttgcg caatatgcag ctttgaaagt gatcgagctg 720
ggtggtattg tggtgtcttt atccgattcg aaggggtgca tcatctctga gacgggcatt 780
acttctgagc aaattcacga tatcgcttcc gccaagatcc gtttcaagtc gttagaggaa 840
atcgttgatg aatactctac tttcagcgaa agtaagatga agtacgttgc aggagcacgc 900
ccatggacgc atgtgagcaa cgtcgacatt gccttgccct gtgccaccca aaacgaggtc 960
agtggtgacg aagccaaggc cctagtggca tctggcgtta agttcgttgc cgaaggtgct 1020
aacatgggtt ctacacccga ggctatttct gttttcgaaa cagcgcgtag cactgcaacc 1080
aatgcaaagg atgcagtttg gtttgggcca ccaaaggcag ctaacctggg cggcgtggca 1140
gtatccggtc tggaaatggc tcagaattct caaaaagtaa cttggactgc cgagcgggtc 1200
gatcaagaac taaagaagat aatgatcaac tgcttcaacg actgcataca ggccgcacaa 1260
gagtactcta cggaaaaaaa tacaaacacc ttgccatcat tggtcaaggg ggccaacatt 1320
gccagcttcg tcatggtggc tgacgcaatg cttgaccagg gagacgtttt ttag 1374
<210> 44
<211> 1365
<212> DNA
<213> gdh1序列(无)
<400> 44
atgtcagagc cagaatttca acaagcttac gaagaagttg tctcctcttt ggaagactct 60
actcttttcg aacaacaccc agaatacaga aaggttttgc caattgtttc tgttccagaa 120
agaatcatac aattcagagt cacctgggaa aatgacaagg gtgaacaaga agttgctcaa 180
ggttacagag tgcaatataa ctccgccaag ggtccataca agggtggtct acgtttccat 240
ccttccgtga acttgtctat cttgaaattc ttgggtttcg aacaaatctt caagaactcc 300
ttgaccggcc tagacatggg tggtggtaaa ggtggtctat gtgtggactt gaagggaaga 360
tctaataacg aaatcagaag aatctgttat gctttcatga gagaattgag cagacacatt 420
ggtcaagaca ctgacgtgcc agctggtgat atcggtgttg gtggtcgtga aattggttac 480
ctgttcggtg cttacagatc atacaagaac tcctgggaag gtgtcttaac cggtaagggt 540
ttgaactggg gtggttcttt gatcagacca gaagccactg gttacggttt agtttactat 600
actcaagcta tgatcgacta tgccacaaac ggtaaggaat ctttcgaagg taagcgcgtc 660
accatctctg gtagtggtaa cgttgctcaa tacgctgcct tgaaggttat tgagctaggt 720
ggtactgtcg tttccctatc tgactccaag ggttgtatca tctctgaaac tggtatcacc 780
tccgaacaag tcgctgatat ttccagtgct aaggtcaact tcaagtcctt ggaacaaatc 840
gtcaacgaat actctacttt ctccgaaaac aaagtgcaat acattgctgg tgctcgtcca 900
tggacccacg tccaaaaggt cgacattgct ttgccatgtg ccacccaaaa tgaagtcagc 960
ggtgaagaag ccaaggcctt ggttgctcaa ggtgtcaagt ttattgccga aggttccaac 1020
atgggttcca ctccagaagc tattgccgtc tttgaaactg ctcgttccac cgccactgga 1080
ccaagcgaag ctgtttggta cggtccacca aaggctgcta acttgggtgg tgttgctgtt 1140
tctggtttag aaatggcaca aaactctcaa agaatcacat ggactagcga aagagttgac 1200
caagagttga agagaattat gatcaactgt ttcaatgaat gtatcgacta tgccaagaag 1260
tacactaagg acggtaaggt cttgccatct ttggtcaaag gtgctaatat cgcaagtttc 1320
atcaaggtct ctgatgctat gtttgaccaa ggtgatgtat tttaa 1365
<210> 45
<211> 831
<212> DNA
<213> cho1序列(无)
<400> 45
atggttgaat cagatgaaga tttcgcacct caagaattcc cacacacgga cacagacgtt 60
atcgtaaatg aacacagaga cgaaaatgac gggtatgcct cagatgaagt tggtggcaca 120
ttaagcagaa gggcctcaag tatattttct ataaatacaa ctccattggc cccccctaat 180
gctactgata tccaaaaatt tacaagtgac gaacatcatt tcagcatgat gaggaatttg 240
catatggcag attacattac tatgctgaat ggattttctg ggttttactc tattgtaagt 300
tgtctgagat ttacgcttac aggtaaacct cattacgtcc agcgtgccca tttctttatt 360
ttattgggta tgtgtttcga tttccttgac gggagagtag cacgtctgag aaataggtct 420
tccttaatgg gtcaagaact ggactctttg gccgacttgg tttcctttgg tgtggctccg 480
gctgcaattg cttttgccat tggatttcaa actacattcg atgtcatgat tttatctttc 540
tttgtccttt gcggcttagc gagattagca aggtttaatg tcaccgttgc tcaattaccc 600
aaagattcta gcacaggtaa atctaaatat tttgagggat tgcctatgcc aaccactcta 660
gctttggtgt tgggtatggc atattgtgtc agaaagggtt taatttttga taacatccca 720
ttcggcattt ttagagaaga ccaaatattg gaatttcatc caattattct agtatttttt 780
atccatgggt gtggaatgat ttcgaagagc ttgaaaattc caaagccata g 831
<210> 46
<211> 1800
<212> DNA
<213> 合成DHCR24序列(无)
<400> 46
atgtctgccg tttggtcttt gggtgccggt ttgttgttgc ttttgctttg ggttaggcac 60
agaggtttgg aggctgtctt ggttcaccat agatggatct tcgtctgctt cttccttatg 120
ccactttcta ttctttttga cgtctactac cagttgaggg cttgggccgt tagaaggatg 180
cacagtgctc caaggttgca tggtcaaagg gtcagacaca tccaagaaca agtcagagaa 240
tggaaggagg agggaggaag aaggtatatg tgcaccggaa ggcccggttg gcttaccgtc 300
tctcttaggg ttggtaagta taaaaagact cataaaaata ttatgattaa ccttatggac 360
gtccttgagg tcgacagtga gagacaagtt gttagggtcg agcctcttgt taccatgggt 420
cagttgaccg cctacttgaa tcctatgggt tggaccatcc cagtcgtccc agaattggac 480
gatcttaccg tcggtggatt gatcatggga accggaatcg agagttcttc tcacatctac 540
ggtcttttcc aacacacttg tatggcctac gagttggtct tggccgacgg atctcttgtt 600
aggtgcagtc ctaccgagaa ctctgacttg ttctacgccg tcccatggtc ttgcggtacc 660
cttggattct tggttgccgc cgagatcaag atgattccag ccaagaagta cattagattg 720
cactacgagc cagttagagg attgaggtct atctgcgaga aattcaccga ggagtctaaa 780
aataaagaga acagtttcgt cgagggtctt gtctacagtc ttgaggaggc cgtcattatg 840
actggagtct tgaccgacga ggctgagcca tctaagatta acagaattgg taattattat 900
aaaccatggt tttttaagca cgttgagaaa tacttgaagg ccaataaaac cggtattgaa 960
tatatccctt ctaggcacta ctaccataga cacactagga gtatcttctg ggagcttcaa 1020
gatatcatcc ctttcggaaa caatccagtc tttagatatc ttttcggatg gatggttcca 1080
ccaaagatct ctttgcttaa gttgacccaa ggtgaagcca ttagaaaatt gtacgagcag 1140
caccacgtcg tccaagacat gcttgtccct atgaaatctc ttgagaagag tatccagacc 1200
ttccacgtcg acttgaacgt ctacccattg tggctttgcc ctttccttct tcctaacaac 1260
cccggtatgg tccaccctaa gggagacgaa accgaacttt acgtcgacat cggagcctac 1320
ggagagccaa aaaccaagca gttcgaggct agagccagta tgaggcagat ggagaagttc 1380
gttagaagtg tccatggttt ccagatgctt tacgccgact gctacatgac tagagaggaa 1440
ttctgggaca tgttcgacgg ttctctttat cattctttga gggagcaaat gaactgtaag 1500
gacgccttcc cagaggtcta tgacaagatc tgcaaggctg ctaggcattc atgtaattag 1560
ttatgtcacg cttacattca cgccctcccc ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag 1620
ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt atttttttat agttatgtta gtattaagaa 1680
cgttatttat atttcaaatt tttctttttt ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca 1740
ttatactgaa aaccttgctt gagaaggttt tgggacgctc gaaggcttta atttgcggcc 1800

Claims (2)

1.一种调控/降低乙酰辅酶A支路代谢高效合成7-脱氢胆固醇的方法，其特征在于，
以原始酿酒酵母S288C为出发菌株，导入核苷酸序列如SEQ ID No.46所述的经密码子优化的来源于鸡的DHCR24还原酶基因，同时使用启动子PTDH3控制核苷酸序列如SEQ IDNo.40所述的线粒体苹果酸脱氢酶mae1的表达，接下来使用Cas9对核苷酸序列如SEQ IDNo.41所述的编码天冬氨酸转氨酶的aat1、核苷酸序列如SEQ ID No.44所述的NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶gdh1、核苷酸序列如SEQ ID No.43所述的NADP(+)依赖性谷氨酸脱氢酶gdh3和核苷酸序列如SEQ ID No.45所述的CDP-二酰基甘油-丝氨酸 O-磷脂酰转移酶cho1基因进行敲除，得到高效合成7-脱氢胆固醇的工程菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述工程菌胞内NADH/NAD+的比例范围是0.3-0.8。
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Oleaginicity of the yeast strain Saccharomyces cerevisiae D5A;Qiaoning He等;Biotechnology for Biofuels;第11卷;https://doi.org/10.1186/s13068-018-1256-z，第1-20页 *
Saccharomyces cerevisiae Forms D-2-Hydroxyglutarate and Couples Its Degradation to D-Lactate Formation via a Cytosolic Transhydrogenase;Julia Becker-Kettern等;THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY;第291卷(第12期);6036–6058 *
王金亭主编.生物化学.北京理工大学出版社,2017,278. *
辅因子对工程酿酒酵母中7-脱氢胆甾醇合成的影响;苏皖;中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑(第3期);B024-612，论文摘要，论文第5页 *

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