CN111748496A - 侧孢短芽孢杆菌mes818在番茄培育方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于利用微生物培育植物的技术领域，尤其涉及一种侧孢短芽孢杆菌MES818在番茄培育方面的应用，该菌株为侧孢短芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)MES818，已于2018年12月17日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.16859。本发明的侧孢短芽孢杆菌MES818可应用在防治番茄立枯病方面和番茄增产方面。本发明的有益效果是：本发明的侧孢短芽孢杆菌MES818对番茄立枯病致病菌Rhizoctonia solani有明显的抑制效果，能够减轻番茄立枯病的发生及危害，促进番茄产量和品质的提高。

Description

侧孢短芽孢杆菌MES818在番茄培育方面的应用

技术领域

本发明属于利用微生物培育植物的技术领域，尤其涉及一种侧孢短芽孢杆菌MES818在番茄培育方面的应用。

背景技术

番茄因其营养丰富，口感好而深受人们喜爱，中国是全球最大的番茄制品出口国，番茄对人民生活及国民经济发展具有重要意义。然而，近年来番茄苗期立枯病的发生频繁，发病严重时常造成幼苗成片死亡，育苗期遇连续阴雨天气、光照少、温度高的年份发病重。幼苗刚出土幼苗及大苗均可发病。病苗茎基变褐，后病部缢缩变细，茎叶萎垂枯死；稍大幼苗白天萎蔫，夜间恢复，当病斑绕茎一周时，幼苗逐渐枯死，但不呈猝倒状；病部初生椭圆形暗褐色斑，具同心轮纹及淡褐色蛛丝状霉，有时并不明显，菌丝能结成大小不等的褐色菌核。一般引起10％-20％的减产，严重年份减产达40％-50％，极大地影响了番茄产业的发展。

番茄立枯病主要由真菌半知菌亚门立枯丝核菌Rhizoctonia solani侵染所致。该菌不产生孢子，主要以菌丝体传播繁殖。病菌以菌丝体或菌核在土壤中越冬。菌丝能直接侵入寄主，通过水流、农具、带菌堆肥等传播。病菌喜高温、高湿环境，发病最适宜的温度为20℃左右。

传统对番茄立枯病的防治大都采用化学防治。化学防治效果好，但化学农药的使用会造成环境的严重污染，破坏土壤生态环境，造成有毒物质的积累,最终造成人类生活质量的下降。因此,只有运用生物防治才能从根本上解决污染问题。

利用微生物防治植物病害的绿色防控方法具有安全、高效、环境友好的特点，符合未来农业的发展方向，是目前最为理想的防治措施之一。目前国内外对防治番茄立枯病的拮抗菌做了大量的研究，研究人员筛选发现一些微生物如枯草芽孢杆菌、木霉菌等具有抑制病原菌生长的作用。目前尚未发现用侧孢短芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)防治番茄立枯病的报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种侧孢短芽孢杆菌MES818在番茄培育方面的应用，侧孢短芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)MES818对番茄立枯病致病菌Rhizoctoniasolani有明显的抑制效果，能够减轻番茄立枯病的发生及危害，促进番茄产量和品质的提高。

本发明提供了一种侧孢短芽孢杆菌MES818在番茄培育方面的应用，所述侧孢短芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)MES818已于2018年12月17日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.16859。

作为本发明的优选，可将侧孢短芽孢杆菌MES818应用在防治番茄立枯病方面。

作为本发明的优选，可将侧孢短芽孢杆菌MES818应用在番茄增产方面。

作为本发明的优选，所述侧孢短芽孢杆菌MES818通过拮抗番茄立枯病致病菌防治番茄立枯病。

本发明还提供了一种上述侧孢短芽孢杆菌MES818在制备番茄培育菌剂的应用，所述菌剂包括侧孢短芽孢杆菌MES818。

作为本发明的优选，所述菌剂应用在防治番茄立枯病方面。

作为本发明的优选，所述菌剂应用在番茄增产方面。

作为本发明的优选，所述菌剂中有效活菌数CFU≥1.0×10¹⁰个/g。

作为本发明的优选，将所述菌剂用水稀释550-650倍，进行叶面喷施或穴施。

作为本发明的优选，所述的侧孢短芽孢杆菌MES818依次经摇瓶培养、一级种子培养、发酵、浓缩后得到所述菌剂。

优选地，当芽孢形成率大于90％时，结束发酵。

进一步优选地，所述菌剂的制备包括步骤：(1)摇瓶培养：将经斜面活化的侧孢短芽孢杆菌MES818菌株进行种子摇瓶培养，温度28℃-32℃，在180-220rpm转速条件下，震荡培养18-24h；

(2)一级种子培养：将经试管斜面活化的菌株MES818进行安碚瓶培养，培养条件为：温度28℃，培养24h；

(3)发酵：在50m³扩发酵罐中装有30L液体侧孢短芽孢杆菌发酵培养基，121℃湿热灭菌40min后冷却到32℃-35℃，将一级种子接种于侧孢短芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02MPa-0.07MPa，在35℃培养26h；

(4)至镜检芽孢形成率大于90％时，结束发酵；

(5)将上述发酵液与稳定剂复合制成液体制剂；

(6)喷干塔内进行浓缩喷干成粉末状，得到有效活菌数CFU≥1.0×10¹⁰个/g的侧孢短芽孢杆菌产品。

本发明制备所述菌剂使用的各培养基如下：

所述步骤(1)中摇瓶培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，各组分及用量为：大豆蛋白胨8-10克，牛肉膏2-4克，氯化钠4-5克，琼脂18-20克，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5；

所述步骤(2)中安碚瓶培养基为肉汤培养基，各组分及用量为：大豆蛋白胨8-10克，牛肉膏2-4克，氯化钠4-5克，琼脂18-20克，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5；

所述步骤(3)中发酵培养基的组分及用量为：豆饼粉3.5％-4.5％，玉米粉5％-6％，蔗糖0.3％-1％，葡萄糖0.3％-1％，氯化钠0.05％-0.2％，硫酸锰0.01％-0.03％，磷酸氢二钠0.2％-0.5％，碳酸钙0.3％-0.5％，氢氧化钾0.02％-0.05％，培养基pH调为6.0-7.5。

本发明的有益效果是：侧孢短芽孢杆菌对番茄立枯病致病菌Rhizoctonia solani有明显的抑制效果，能够减轻番茄立枯病的发生及危害，促进番茄产量和品质的提高。将本发明的菌剂用来防治番茄立枯病，防治效果达80％以上，并且绿色环保、成本低、便于大面积使用。另外，施用本发明的侧孢短芽孢杆菌菌肥后可使番茄增产幅度达15％，同时能改良番茄的果型，使主根粗壮，须根增多。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明侧孢短芽孢杆菌MES818对番茄立枯病抑制作用的结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合实施例对本发明作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

本发明提供的在番茄培育方面的应用菌株为侧孢短芽孢杆菌(Bacilluslaterosporus)MES818，该菌株的保藏日期为2018年12月17日，保藏单位名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.16859。

需要说明的是，本发明的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)菌株，本公司已经提出过专利申请，申请号为201911381797.3。

侧孢短芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，细胞呈杆状，有独舟状侧孢短，椭圆形，孢囊膨大，在营养琼脂培养基上，菌落为圆形，较小，灰白色，边缘整齐，表面湿润光滑，半透明。可在厌氧条件下生长，接触酶阳性，氧化酶阳性，能还原硝酸盐、分解酪素、明胶液化阳性、不能水解淀粉、D-甘露醇产酸、葡萄糖产酸不产气、蔗糖产酸、D-木糖不产酸、L-***糖不产酸、不能在含7％氯化钠的培养基上生长。

侧孢短芽孢杆菌MES818是2018年6月我公司研发人员从猕猴桃根部土壤里分离的。称取土壤样品10克，放入盛有100mL无菌水的三角瓶中震荡30分钟后，吸取1mL无菌水加入到9mL吸管做梯度稀释，平板划线于28℃培养24h，挑取单菌落制成斜面菌种，4℃冷藏。挑取单菌落镜检，后经农业部菌种检测机构鉴定为侧孢短芽孢杆菌，将其命名为MES818。以分离保藏的番茄立枯病菌立枯丝核菌Rhizoctonia solani为供试病原菌菌株，用侧孢短芽孢杆菌对其进行平板对峙实验，在28℃恒温培养箱培养5天，发现侧孢短芽孢杆菌能够显著抑制番茄立枯丝核菌菌丝的生长，出现较宽的抑菌条带。

本发明的侧孢短芽孢杆菌MES818可以应用在防治番茄立枯病方面。

本发明的侧孢短芽孢杆菌MES818对由于对立枯丝核菌Rhizoctonia solani具有拮抗作用，可以通过拮抗立枯丝核菌Rhizoctonia solani致病菌对防治番茄立枯病进行防治。

本发明的侧孢短芽孢杆菌MES818可以应用在番茄增产方面。

基于侧孢短芽孢杆菌MES818对立枯丝核菌Rhizoctonia solani的拮抗作用，还可以将本发明的侧孢短芽孢杆菌MES818制成防治番茄立枯病菌剂，以用于防治番茄立枯病。基于侧孢短芽孢杆菌MES818对番茄的增产作用，还可以将本发明的侧孢短芽孢杆菌MES818制成用于番茄增产的菌剂，以用于增加番茄产量。该菌剂可以将侧孢短芽孢杆菌MES818作为主要活性成分，也可将侧孢短芽孢杆菌MES818作为辅助的活性成分与其他微生物或者功效成分配合使用，均具有侧孢短芽孢杆菌MES818的有益效果。

将侧孢短芽孢杆菌MES818制成防治番茄立枯病菌剂或制成番茄增产菌剂时，该菌剂中有效活菌数CFU≥1.0×10¹⁰个/g。

使用时，将上述菌剂用水稀释550-650倍，进行叶面喷施或穴施。其中，稀释倍数例如可以为，但不限于550倍、560倍、570倍、580倍、590倍或600倍。

实施例1防治番茄立枯病的侧孢短芽孢杆菌MES818菌剂的制备

(1)摇瓶培养：将经斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养，摇瓶培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，各组分和含量为：大豆蛋白胨8-10克，牛肉膏2-4克，氯化钠4-5克，琼脂18-20克，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5。在温度28℃-32℃，180-220rpm转速条件下，震荡培养18-24h；

(2)一级种子培养：将经试管斜面活化的侧孢短芽孢杆菌MES818菌株进行安碚瓶培养，安碚瓶培养基为肉汤培养基，培养基配方为：大豆蛋白胨8-10克，牛肉膏2-4克，氯化钠4-5克，琼脂18-20克，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5。培养条件为：温度28℃，培养24h；

(3)发酵：在50m³扩发酵罐中装有30L液体侧孢短芽孢杆菌发酵培养基，121℃湿热灭菌40min后冷却到32℃-35℃，将一级种子接种于侧孢短芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02MPa-0.07MPa，在35℃培养26h；发酵所用培养基的原料及用量为：豆饼粉3.5％-4.5％，玉米粉5％-6％，蔗糖0.3％-1％，葡萄糖0.3％-1％，氯化钠0.05％-0.2％，硫酸锰0.01％-0.03％，磷酸氢二钠0.2％-0.5％，碳酸钙0.3％-0.5％，氢氧化钾0.02％-0.05％，培养基pH调为6.0-7.5；

(4)至镜检芽孢形成率大于90％时，结束发酵；

(5)将上述发酵液与稳定剂复合制成液体制剂；

(6)喷干塔内进行浓缩喷干成粉末状，检测计数，侧孢短芽孢杆菌产品有效活菌数(CFU)≥1.0×10¹⁰个/g。

在制备过程产生的尾气，采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。

实施例2侧孢短芽孢杆菌MES818对番茄立枯病的抑制作用

(一)试验时间和地点：2019年5月在公司研发实验室内进行。

(二)试验方法

(1)供试番茄立枯病病菌来源：番茄立枯病菌采自天津市武清区田间病株，经公司研究人员分离纯化，鉴定为立枯丝核菌Rhizoctonia solani，致病力测定表现为强致病力。

(2)平板对峙实验

先将番茄立枯病菌接种在马铃薯琼脂培养基平皿中央，再蘸取少量活化后的侧孢短芽孢杆菌MES818接种在病原菌的两侧约2cm处，同时设置只接种番茄立枯病菌的平板为空白对照。28℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量番茄立枯病菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种MES818后的抑菌生长半径)，拮抗效果用抑菌率表示：

(3)结果

侧孢短芽孢杆菌MES818对番茄立枯病的抑制作用参照图1，侧孢短芽孢杆菌MES818对番茄立枯病的抑菌带宽达7.9mm，抑菌率为89.38％。说明侧孢短芽孢杆菌MES818对番茄立枯病具有显著的抑制效果，具有防治番茄立枯病的生防潜力。

实施例3侧孢短芽孢杆菌MES818对番茄立枯病的防治试验

(一)试验药剂

(1)微生物菌剂

将实施例1制备的MES818液体制剂，用水稀释600倍。

(2)化学药剂

50％福美双可湿性粉剂(山东利邦农化有限公司)，用水稀释500倍。

(3)空白对照

设置只喷洒清水的处理为空白对照。

(二)试验时间和地点

2019年6月20日在天津坤禾生物科技集团股份有限公司育苗室内进行。

(三)试验方法

将番茄种子催芽后撒播在育苗盘里，待苗高至5厘米左右时选取长势均匀一致的幼苗移栽至口径为26厘米的塑料育苗盆里，每盆1株，每个处理5盆，每个处理设置3次重复。待幼苗约长出6-7片真叶时，将实施例1制备的MES818液体制剂，用水稀释600倍，均匀喷洒在植株的叶片及茎枝上，化学药剂处理及空白喷清水对照处理的喷施方法同MES818。3天后在每株番茄苗的同叶位上接种立枯丝核菌菌丝块，需在接种前将培养的新鲜病原菌菌丝块用直径为6mm的打孔器打成大小均匀的菌块，将长有菌丝的面朝下放在叶面上，接种部位罩上保鲜膜保湿。两周后待空白对照出现明显病斑时调查番茄立枯病的发生情况，记录发病级别及株数，计算病情指数和防治效果。其中：

番茄立枯病病害分级按下述标准：

0级：茎基部无病斑；

1级：茎基部病斑占整个茎围的1/3以下；

3级：茎基部病斑占整个茎围的1/3～1/2；

5级：茎基部病斑占整个茎围的1/2～3/4；

7级：茎基部病斑占整个茎围的3/4以上；

病情指数和防治效果的计算方法为：

式中，CK0、CK1分别为空白对照施药前、施药后的病情指数；PT0、PT1分别为药剂处理施药前、施药后的病情指数。

(四)结果

试验结果见表1，番茄植株经侧孢短芽孢杆菌MES818制剂处理后的病情指数(8.89)显著低于空白对照处理后的病情指数(89.64)，而与化学药剂处理后的病情指数(7.16)差异不显著，侧孢短芽孢杆菌MES818对番茄立枯病的防治效果达81.75％，说明侧孢短芽孢杆菌MES818及其微生物菌剂对番茄立枯病的防治效果较好，具有巨大的应用价值。

表1侧孢短芽孢杆菌MES818对番茄立枯病的防效

处理	病情指数	防效(％)
			MES818制剂	8.89b	81.75
福美双	7.16bc	90.60
			空白对照	89.64a	0.00

实施例4侧孢短芽孢杆菌MES818对番茄的增产作用

(一)试验材料

将实施例1制备的MES818液体制剂，用水稀释600倍。

(二)试验方法

试验共设3种处理方式，分别为处理方式1：将实施例1制备的MES818液体制剂，用水稀释600倍，叶面喷施；处理方式2：将实施例1制备的MES818液体制剂，用水稀释600倍，穴施；处理方式3：喷施清水对照。试验设置3次重复，随机区组排列，每处理小区面积为3×3m²。在番茄苗期挖穴浇施或喷施。

(三)统计方法

统计各个处理番茄的产量，计算增产率，番茄增产率计算公式如下：

(四)结果

侧孢短芽孢杆菌MES818对番茄立枯病的增产效果见表2。从表2的结果可以看出，使用侧孢芽孢杆菌菌剂的两种处理方式的番茄产量(处理方式1和处理方式2)均高于对照不施菌剂(处理方式3)的产量，而且穴施效果好于喷雾处理效果。

表2侧孢短芽孢杆菌MES818对番茄立枯病的增产效果

处理方式	产量(kg/667m<sup>2</sup>)	增产率(％)
			1	2164	10.4
2	2258	15.1
			3	1961	-

以上对本发明的实例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.侧孢短芽孢杆菌MES818在番茄培育方面的应用，其特征在于所述侧孢短芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)MES818已于2018年12月17日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.16859。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将侧孢短芽孢杆菌MES818应用在防治番茄立枯病方面。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将侧孢短芽孢杆菌MES818应用在番茄增产方面。

4.权利要求1所述的侧孢短芽孢杆菌MES818在制备番茄培育菌剂的应用，其特征在于所述菌剂包括侧孢短芽孢杆菌MES818。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述菌剂应用在防治番茄立枯病方面。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述菌剂应用在番茄增产方面。

7.根据权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于所述菌剂中有效活菌数CFU≥1.0×10¹⁰个/g。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于将所述菌剂用水稀释550-650倍，进行叶面喷施或穴施。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的侧孢短芽孢杆菌MES818依次经摇瓶培养、一级种子培养、发酵、浓缩后得到所述菌剂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于芽孢形成率大于90％时，结束发酵。

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