CN111602676B - 枯草芽孢杆菌mes810在防治葡萄白绢根腐病的应用 - Google Patents

枯草芽孢杆菌mes810在防治葡萄白绢根腐病的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于利用微生物防治土传植物病害的技术领域,尤其涉及一种枯草芽孢杆菌MES810在防治葡萄白绢根腐病的应用,该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MES810,已于2017年8月10日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC No.14514。本发明还提供了枯草芽孢杆菌MES810在葡萄白绢根腐病的应用。本发明的有益效果是:对葡萄白绢根腐病致病菌有明显的抑制作用,将本发明的菌剂用来防治葡萄白绢病,防治效果显著,并且绿色环保、低成本、便于大面积使用。

Description

枯草芽孢杆菌MES810在防治葡萄白绢根腐病的应用
技术领域
本发明属于利用微生物防治土传植物病害的技术领域,尤其涉及一种枯草芽孢杆菌MES810在防治葡萄白绢根腐病的应用。
背景技术
葡萄根腐病是属于严重的整株病害,会造成全株死亡,严重阻碍葡萄产业的发展。很多病害均能导致葡萄根部腐烂病,主要有白纹羽病、紫纹羽病、白绢病、根朽病及圆斑根腐病等。其中葡萄白绢病为半知菌亚门丝孢纲真菌齐整小核菌(Sclerotium rolfsiiSacc)引起的病害。病原菌多数为弱寄生菌,从少量根得病到主根腐烂,直到植株地上部表现症状,需经过一年到几年的时间。葡萄白绢病主要发生在苗木和幼树的根颈部,也可为害叶片和果实。地上部发病,叶小且黄,上有褐色病斑,枝梢节间缩短,果多且小。严重时枝叶枯萎,当病斑环蔓一周后枯死,长出小菌核。根颈部感病,皮层褐色坏死,严重的腐烂,并溢出褐色汁液。后期病部及周围土壤生出许多初为白色、渐变为褐色、后期为黑色的菜籽样小菌核。
葡萄白绢病的防治常通过传统方法如增施有机肥、调节土壤酸碱性、苗木消毒、加强栽培管理及代森铵、敌克松灌根等药剂防治的方法。传统方法操作繁琐,化学药剂见效快,但药效不持久,且会污染环境,不符合绿色防控及生态农业发展方向。
利用微生物防治植物土传病害是最有效的防治措施之一,微生物防治植物病害具有安全、有效、不污染环境的优点,符合未来农业绿色防控的发展方向,经检索,目前尚未发现用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)防治葡萄白绢病的报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足,本发明提供一种枯草芽孢杆菌MES810在防治葡萄白绢根腐病的应用,枯草芽孢杆菌MES810对葡萄白绢根腐病致病菌有明显的抑制作用,将本发明的菌剂用来防治葡萄白绢病,防治效果显著,并且绿色环保、低成本、便于大面积使用。
为了实现上述目的,本发明提供了一种枯草芽孢杆菌MES810在防治葡萄白绢根腐病的应用,所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MES810已于2017年8月10日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC No.14514。
作为本发明的优选,所述枯草芽孢杆菌MES810通过拮抗葡萄白绢根腐病致病菌防治葡萄白绢根腐病。
进一步优选地,所述枯草芽孢杆菌MES810通过拮抗齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii Sacc)防治葡萄白绢根腐病。
本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌MES810在制备防治葡萄白绢根腐病菌剂的应用,所述菌剂包括枯草芽孢杆菌MES810。
作为本发明的优选,所述菌剂中有效活菌数CFU≥2.0×1010个/g。
作为本发明的优选,所述菌剂的用量为2-5kg/亩。
进一步优选地,将所述菌剂直接以液体形式滴灌、微喷、冲施,或者将所述菌剂用水稀释100-800倍通过沟施、穴施、灌根的方式施用,或者将所述菌剂直接以固体形式通过沟施、穴施拌肥基施的方式施用。
作为本发明的优选,所述的枯草芽孢杆菌MES810依次经摇瓶培养、一级种子培养、发酵得到所述菌剂。
进一步优选地,芽孢形成率大于90%时,结束发酵。
进一步优选地,本发明的枯草芽孢杆菌菌剂制备方法如下:
(1)摇瓶培养:将经斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养,培养条件为:转速200-230r/min,温度32-37℃,培养10-12h;
(2)一级种子培养:在500mL茄子瓶中装有100mL一级种子培养基,116℃-121℃湿热灭菌20-35min,取10mL枯草芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中,在30℃-37℃培养10-12h;
(3)二级种子培养:在300L发酵罐中装有150L-200L二级种子培养基,115℃-122℃湿热灭菌20-40min,将100-300mL一级种子接种于二级种子培养基中;在30℃-38℃培养8-12h;
(4)发酵:在5m3或30m3扩发酵罐中装有或4000L或20m3枯草芽孢杆菌活菌发酵培养基,115℃-122℃湿热灭菌20-40min,将150L或200L二级种子接种于枯草芽孢杆菌活菌发酵培养基中,控制罐压0.02Mpa-0.07Mpa,在30℃-38℃培养24-36h;
(5)至芽孢形成率大于等于90%时,结束发酵;
(6)将上述发酵液与稳定剂复合制成液体制剂,得到的枯草芽孢杆菌产品cFu不少于2.0×1010个/g。
上述制备方法适用的培养基为:
所述步骤(1)中使用的摇瓶培养基为牛肉膏蛋白胨培养基,其原料及用量为:牛肉膏0.5%-3%,蛋白胨0.5%-3%,氯化钠0.2-1%,培养基pH为6.0-7.5;
所述步骤(2)中一级种子培养所用培养基的原料及用量为:牛肉膏0.5%-3%,蛋白胨0.5%-3%,氯化钠0.2-1%,营养琼脂1.5%-2.0%,培养基pH为6.0-7.5;
所述步骤(3)中二级种子培养所用培养基的原料及用量为:葡萄糖0.3%-2%,玉米粉1%-5%,豆粕粉1%-5%,磷酸氢二钠0.1‰-0.5‰,磷酸二氢钠0.5‰-5‰,消泡剂0.2‰-2‰,培养基pH调为6.0-7.5;
所述步骤(4)中发酵所用培养基的原料及用量为:葡萄糖0.3%-2%,玉米粉1%-5%,豆粕粉1%-5%,磷酸氢二钠0.1‰-0.5‰,磷酸二氢钠0.5‰-5‰,消泡剂0.2‰-2‰,培养基pH调为6.0-7.5。
本发明的有益效果:枯草芽孢杆菌对半知菌亚门真菌齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii Sacc)致病菌有强烈的抑制作用,能够防止葡萄白绢病的发生,促进葡萄增产、增收。
将本发明的枯草芽孢杆菌制成菌剂用来防治葡萄白绢病,防治效果显著,防效达60%以上,并且绿色环保、低成本、便于大面积使用。本发明液体菌剂满足水肥一体化需求,便于滴灌、微喷、冲施,也可以稀释100-800倍后沟施、穴施、灌根,每亩用量2-5kg。本发明的固体菌剂可沟施、穴施拌肥基施,每亩用量2-5kg。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明枯草芽孢杆菌MES810对葡萄白绢病的抑菌效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面结合实施例对本发明作进一步地详细描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
除非本文另有定义,连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰,然而,在任何潜在不明确性的情况下,本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中,除非另有说明,术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案:
本发明提供了枯草芽孢杆菌MES810在葡萄白绢根腐病的应用,该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MES810,该菌株的保藏日期为2017年8月10日,保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),保藏编号为:CGMCC No.14514。
需要说明的是,本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株,本公司已经提出过专利申请,申请号为201710862006.3。
枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧菌,单个细胞0.7-0.8×2-3μm,着色均匀。无荚膜,周生鞭毛,能运动。芽孢0.6-0.9×1.0-1.5μm,椭圆到柱状,位于菌体中央或稍偏,芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明,污白色或微黄色,在液体培养基中生长时,常形成皱醭。可利用蛋白质、多种糖及淀粉,分解色氨酸形成吲哚。
该株枯草芽孢杆菌MES810是2015年6月我公司研发人员从张家口葡萄田地里分离的。经过平板划线,在32℃培养24小时,挑取单菌落,制成斜面菌种,4℃冷藏。以分离的葡萄白绢病菌为靶标,用枯草芽孢杆菌对其进行平板对峙实验,30℃培养,4天后发现该株枯草芽孢杆菌能够显著抑制病原菌的生长,出现较宽的抑菌带,命名为MES810,后经农业部菌种检测机构鉴定,MES810为枯草芽孢杆菌。
本发明的枯草芽孢杆菌MES810通过拮抗葡萄白绢根腐病致病菌防治葡萄白绢根腐病。
其中,葡萄白绢根腐病致病菌包括齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc),本发明的枯草芽孢杆菌MES810通过拮抗齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc)防治葡萄白绢根腐病。
由于枯草芽孢杆菌MES810对齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc)具有拮抗作用,本发明的枯草芽孢杆菌MES810可以制成防治葡萄白绢根腐病的菌剂,该菌剂包括枯草芽孢杆菌MES810。可以将枯草芽孢杆菌MES810作为主要活性成分,也可将枯草芽孢杆菌MES810作为辅助的活性成分与其他微生物或者功效成分配合使用,均具有枯草芽孢杆菌MES810的功效。
在包含枯草芽孢杆菌MES810的防治葡萄白绢根腐病的菌剂中,要求菌剂中有效活菌数CFU≥2.0×1010个/g。
使用时,将所述菌剂以液体形式直接滴灌、微喷、冲施,或者将所述菌剂用水稀释100-800倍通过沟施、穴施、灌根的方式施用,或者将所述菌剂浓缩喷干直接以固体形式通过沟施、穴施拌肥基施的方式施用,其中菌剂的用量为2-5kg/亩。
发明的的枯草芽孢杆菌MES810依次经摇瓶培养、一级种子培养、发酵、浓缩后得到所述菌剂。优选地,芽孢形成率大于90%时,结束发酵。
实施例1枯草芽孢杆菌MES810微生物菌剂的制备
枯草芽孢杆菌MES810微生物菌剂的制备步骤如下:
(1)摇瓶培养:将经斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养,摇瓶培养基为牛肉膏蛋白胨培养基,牛肉膏蛋白胨培养基的配方为:牛肉膏0.5%-3%,蛋白胨0.5%-3%,氯化钠0.2-1%,培养基pH为6.0-7.5。培养条件为:转速200-230r/min,温度32-37℃,培养10-12h;
(2)一级种子培养:在500mL茄子瓶中装有100mL一级种子培养基,116℃-121℃湿热灭菌20-35min,取10mL枯草芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中,在30℃-37℃培养10-12h;一级种子培养所用培养基的原料及用量为:牛肉膏0.5%-3%,蛋白胨0.5%-3%,氯化钠0.2-1%,营养琼脂1.5%-2.0%,培养基pH为6.0-7.5;
(3)二级种子培养:在300L发酵罐中装有150L-200L二级种子培养基,115℃-122℃湿热灭菌20-40min,将100-300mL一级种子接种于二级种子培养基中;在30℃-38℃培养8-12h;二级种子培养所用培养基的原料及用量为:葡萄糖0.3%-2%,玉米粉1%-5%,豆粕粉1%-5%,磷酸氢二钠0.1‰-0.5‰,磷酸二氢钠0.5‰-5‰,消泡剂0.2‰-2‰,培养基pH调为6.0-7.5;
(4)发酵:在5m3或30m3扩发酵罐中装有或4000L或20m3枯草芽孢杆菌活菌发酵培养基,115℃-122℃湿热灭菌20-40min,将150L或200L二级种子接种于枯草芽孢杆菌活菌发酵培养基中,控制罐压0.02Mpa-0.07Mpa,在30℃-38℃培养24-36h;发酵所用培养基的原料及用量为:葡萄糖0.3%-2%,玉米粉1%-5%,豆粕粉1%-5%,磷酸氢二钠0.1‰-0.5‰,磷酸二氢钠0.5‰-5‰,消泡剂0.2‰-2‰,培养基pH调为6.0-7.5;
(5)至芽孢形成率大于等于90%时,结束发酵;
(6)将上述发酵液与稳定剂复合制成液体制剂;得到的枯草芽孢杆菌产品cfu不少于2.0×1010个。
如果需要,可以将得到的液体制剂经浓缩喷干,得到固体菌剂产品。
制备过程产生的尾气处理采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。
实施例2枯草芽孢杆菌MES810对葡萄白绢病的拮抗作用试验
(一)试验时间和地点:2019年2月在公司研发中心实验室内进行。
(二)试验方法:
(1)供试葡萄白绢病病菌来源:葡萄白绢病采自天津市武清区葡萄白绢病株,经公司研究人员分离纯化,菌种经16SrDNA鉴定为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc)。致病力测定表现为弱致病力。
(2)平板对峙实验:
首先对葡萄病菌在LB平板中央,再将活化后的枯草芽孢杆菌MES810点接在距指示菌菌片2.0厘米处,设空白对照。37℃恒温培养,待空白对照即将长满整个培养皿时,测量葡萄白绢病病菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种MES810后的抑制生长半径),用拮抗作用抑菌率表示,其中:抑菌率(%)=(对照生长量﹣处理生长量)/对照生长量×100。
(3)结果枯草芽孢杆菌MES810对葡萄白绢病的抑菌效果参照附图1,其拮抗结果参见表1。由图1和表1可知,枯草芽孢杆菌MES810对葡萄白绢病的抑制率达89.4%;透明的抑菌带宽8.0毫米。说明枯草芽孢杆菌MES810对葡萄白绢病具有明显的抑制作用,具有防治葡萄白绢病的生防潜力。
表1枯草芽孢杆菌MES810对葡萄白绢病的拮抗结果
菌株名称 对照生长量(mm) 处理生长量(mm) 抑菌率(%)
MES810 38.0 4.0 89.4
实施例3枯草芽孢杆菌MES810对葡萄白绢病的防治效果试验
(一)试验药剂
(1)微生物菌剂:将实施例1制备的MES810液体制剂,分别用水稀释300倍、500倍、800倍;
(2)化学药剂:50%代森铵(济南永泰化工),用水稀释500倍。
(3)空白对照:清水。
(二)试验时间和地点:2019年4月在武清葡萄种植基地内进行;
(三)试验方法:试验前调查统计发病葡萄白绢病的发病株数及每病株的病情指数,距离每株发病葡萄根部20厘米***挖一个15厘米宽20厘米深的环形沟,每个处理5株,重复三次。采用随机区组排列方法选株。将实施例1稀释300倍、500倍、800倍的MES810液体制剂分别取3L均匀灌入葡萄根部环形沟内,化学药剂对照和空白对照清水处理同上,处理完毕后把土壤封上。20天后观察葡萄植株的发病情况并计算病情指数和防治效果。
病情分级标准:
0级:未见枯黄病枝病叶;
1级:染病枯黄枝叶比例占25%;
3级:染病枯黄枝叶比例占25-50%;
5级:染病枯黄枝叶比例>50%,但植株未枯死;
7级:植株枯死。
Figure BDA0002567807330000071
Figure BDA0002567807330000072
(四)结果枯草芽孢杆菌MES810对葡萄白绢病防效对比试验结果见表2,由表2可知,葡萄植株经枯草芽孢杆菌MES810液体制剂处理后,病情指数(9.18-9.43)显著低于空白对照处理后的病情指数(89.82),而与化学药剂处理后的病情指数(7.46)差异不显著,MES810对葡萄白绢病的防治效果达89%以上,说明枯草芽孢杆菌MES810及其微生物菌剂对葡萄白绢病防治效果较好,具有大面积推广施用的潜力。
表2枯草芽孢杆菌MES810对葡萄白绢病防效对比试验
处理 病情指数 防效(%)
MES810液体制剂300倍 9.18b 89.78
MES810液体制剂500倍 9.25b 89.69
MES810液体制剂800倍 9.43b 89.50
化学药剂 7.46bc 91.69
空白对照 89.82a 0.00
以上对本发明的实例进行了详细说明,但所述内容仅为本发明的较佳实施例,不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等,均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (7)

1.枯草芽孢杆菌MES810在防治葡萄白绢根腐病的应用,其特征在于所述枯草芽孢杆菌MES810通过拮抗葡萄白绢根腐病致病菌防治葡萄白绢根腐病,所述葡萄白绢根腐病致病菌为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc);
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MES810已于 2017年8月10日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC No. 14514。
2.枯草芽孢杆菌MES810在制备防治葡萄白绢根腐病菌剂的应用,其特征在于所述菌剂包括枯草芽孢杆菌MES810;
所述枯草芽孢杆菌MES810通过拮抗葡萄白绢根腐病致病菌防治葡萄白绢根腐病,所述葡萄白绢根腐病致病菌为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc);
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MES810已于 2017年8月10日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC No. 14514。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于所述菌剂中有效活菌数CFU≥2.0×1010个/g。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于所述菌剂的用量为2-5 kg/亩。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于将所述菌剂以液体形式直接滴灌、微喷、冲施,或者将所述菌剂用水稀释100-800倍通过沟施、穴施、灌根的方式施用,或者将所述菌剂直接以固体形式通过沟施、穴施拌肥基施的方式施用。
6.根据权利要求2-5任一项所述的应用,其特征在于所述的枯草芽孢杆菌MES810依次经摇瓶培养、一级种子培养、发酵得到所述菌剂。
7.根据权利要求6的应用,其特征在于芽孢形成率大于90%时,结束发酵。
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