CN110964671A - 侧孢短芽孢杆菌mes818、菌剂、制备方法及应用 - Google Patents

侧孢短芽孢杆菌mes818、菌剂、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种侧孢短芽孢杆菌MES818、菌剂、制备方法及应用，涉及微生物技术领域，本发明提供了一种侧孢短芽孢杆菌MES818，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16859。该侧孢短芽孢杆菌MES818，对人参锈腐病致病菌有强烈的抑制作用，能够防止人参锈腐病的发生，将其用来防治人参锈腐病，能够促进人参产量和品质的提高。

Description

侧孢短芽孢杆菌MES818、菌剂、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种侧孢短芽孢杆菌MES818、菌剂、制备方法及应用。
背景技术
人参锈腐病属土传病害，是人参最为普遍、危害最大的病害之一，从早春到晚秋整个生育期均能浸染，对人参的产量和品质影响极大，常年发病率在20％～30％，严重地块发病率高达80％～100％。病轻时，表皮完好，仅侵染表皮下几层细胞，不侵染根内部组织；严重发病时，不仅破坏表皮，且深入根内组织，病斑处积聚大量锈粉状物，呈干腐状或主根横向烂掉。地上部表现植株矮小、叶片不展，呈红褐色，最终枯萎死亡。越冬芽胞出现黄褐色病斑，重病时在地下腐烂，不能出苗。
人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科人参属多年生草本药用植物,具有极高的药用和经济价值。在中国已经报道的人参锈腐病有3个种：(1)Cylindrocarponpanicicola(Zinss)et Zhu；(2)Cylindrocarpon destructans(Zinss)Scholten；(3)Cylindrocarpon sp。其中毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans(Zinss.)Scholtan)引起的人参锈腐病是人参种植期的一种主要病害。传统对锈腐病的防治大都采用化学防治，不但没有达到预期的效果，而且严重污染了环境，破坏了土壤的环境，造成有毒物质的积累，最终影响人参的产量和质量。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种侧孢短芽孢杆菌MES818，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明提供了一种侧孢短芽孢杆菌MES818，所述侧孢短芽孢杆菌MES818于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.16859。
本发明还提供了上述的侧孢短芽孢杆菌MES818在防治人参锈腐病中的应用。
进一步地，所述侧孢短芽孢杆菌MES818通过拮抗人参锈腐病致病菌防治人参锈腐病；
优选地，所述人参锈腐病致病菌包括Cylindrocarpon destructans(Zinss.)Scholtan。
本发明还提供了一种菌剂，包括上述的侧孢短芽孢杆菌MES818。
进一步地，所述菌剂中的有效活菌数≥2.0×1010个/g。
进一步地，将所述菌剂用水稀释550-650倍，得到所述菌剂的工作液。
本发明还提供了上述的菌剂在防治人参锈腐病中的应用。
进一步地，所述菌剂通过拮抗人参锈腐病致病菌防治人参锈腐病；
优选地，所述人参锈腐病致病菌包括Cylindrocarpon destructans(Zinss.)Scholtan。
另外，本发明还提供了上述的菌剂的制备方法，所述制备方法包括将侧孢短芽孢杆菌MES818依次经摇瓶培养、一级种子培养、发酵和浓缩，得到所述菌剂。
进一步地，芽孢形成率大于90％时，结束发酵。
本发明提供的侧孢短芽孢杆菌MES818，对人参锈腐病致病菌有强烈的抑制作用，能够防止人参锈腐病的发生，将其应用于防治人参锈腐病中，能够促进人参产量和品质的提高。
本发明提供的菌剂，包括本发明提供的侧孢短芽孢杆菌MES818，使用该菌剂用来防止人参锈腐病，防治效果达80％以上，并且绿色环保、成本低、便于大面积使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的侧孢短芽孢杆菌MES818对人参锈腐病的抑制作用的结果图；其中，A为侧孢短芽孢杆菌MES818对人参锈腐病的拮抗效果；B为未接种侧孢短芽孢杆菌的人参锈腐病对照。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
利用微生物防治作物土传病害的绿色防控方法具有安全高效、环境友好的特点，符合未来农业发展方向，是目前最为理想的防治措施之一，国内外对用拮抗菌防治锈腐病做了大量的研究，研究人员筛选发现一些微生物如放线菌、木霉菌等具有抑制病原菌生长的作用。目前尚未发现用侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)防治人参锈腐病的报道。
本发明的菌种保藏日期为2018年12月17日，保藏编号为：CGMCC No.16859。分类命名为：侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101。
侧孢芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，细胞呈杆状，有独舟状侧孢，椭圆形，孢囊膨大，在营养琼脂培养基上，菌落为圆形，较小，灰白色，边缘整齐，表面湿润光滑，半透明。可在厌氧条件下生长，接触酶阳性，氧化酶阳性，能还原硝酸盐、分解酪素、明胶液化阳性、不能水解淀粉、D-甘露醇产酸、葡萄糖产酸不产气、蔗糖产酸、D-木糖不产酸、L-***糖不产酸、不能在含7％氯化钠的培养基上生长。
本发明提供的侧孢短芽孢杆菌MES818是2018年6月从猕猴桃根部土壤里分离的。经过称取土壤样品，无菌水梯度稀释，平板划线于28℃培养24h，挑取单菌落制成斜面菌种，4℃冷藏。挑取单菌落镜检，后经农业部菌种检测机构鉴定为侧孢芽孢杆菌。以分离保藏的人参锈腐病菌毁灭柱孢菌Cylindrocarpon destructans(Zinss.)Scholtan菌为靶标，用侧孢芽孢杆菌对其进行平板对峙实验，28℃培养7天，结果发现侧孢芽孢杆菌能够显著抑制病原菌生长，出现较宽的抑菌带。
基于本发明提供的侧孢短芽孢杆菌MES818的特性，本发明还提供了上述的侧孢短芽孢杆菌MES818在防治人参锈腐病中的应用。
利用本发明提供的侧孢短芽孢杆菌MES818对人参锈腐病致病菌有强烈的抑制作用，能够防止人参锈腐病的发生，将其应用于防治人参锈腐病中，能够促进人参产量和品质的提高。
人参锈腐病的主要由人参锈腐病致病菌导致，本发明提供的侧孢短芽孢杆菌MES818通过实验发现对人参锈腐病致病菌具有拮抗作用，因此，在一些优选的实施方式中，所述侧孢短芽孢杆菌MES818通过拮抗人参锈腐病致病菌防治人参锈腐病。
人参锈腐病致病菌有多种，例如Cylindrocarpon panicicola(Zinss)et Zhu、Cylindrocarpon destructans(Zinss)Scholten和Cylindrocarpon sp等，优选地，所述人参锈腐病致病菌包括Cylindrocarpon destructans(Zinss.)Scholtan。
根据本发明的一方面，本发明还提供了一种菌剂，包括上述的侧孢短芽孢杆菌MES818。
该菌剂可以将侧孢短芽孢杆菌MES818作为主要活性成分；也可将侧孢短芽孢杆菌MES818作为辅助的活性成分与其他微生物或者功效成分配合使用。由于该菌剂包含上述侧孢短芽孢杆菌MES818，因此具有侧孢短芽孢杆菌MES818的所有有益效果。使用该菌剂用来防止人参锈腐病，防治效果达80％以上，并且绿色环保、成本低、便于大面积使用。
在一些优选的实施方式中，所述菌剂中的有效活菌数≥2.0×1010个/g。
在一些优选的实施方式中，将所述菌剂用水稀释550-650倍，得到所述菌剂的工作液。
将有效活菌数≥2.0×1010个/g的菌剂用水稀释550-650倍得到菌剂工作液，能够在有效抑制致病菌的基础上，避免菌剂的浪费。其中，稀释倍数例如可以为，但不限于550倍、560倍、570倍、580倍、590倍或600倍。
根据本发明的另一方面，还提供了上述的菌剂在防治人参锈腐病中的应用。
利用菌剂中的活性成分侧孢短芽孢杆菌MES818对人参锈腐病致病菌有强烈的抑制作用，能够防止人参锈腐病的发生，将包含其的菌剂应用于防治人参锈腐病中，能够促进人参产量和品质的提高。
在一些优选的实施方式中，所述菌剂通过拮抗人参锈腐病致病菌防治人参锈腐病；
优选地，所述人参锈腐病致病菌包括Cylindrocarpon destructans(Zinss.)Scholtan。
另外，本发明还提供了上述的菌剂的制备方法，所述制备方法包括将侧孢短芽孢杆菌MES818依次经摇瓶培养、一级种子培养、发酵和浓缩，得到所述菌剂。
本发明提供的上述菌剂的制备方法，工艺简单，操作方便，适合大规模扩增培养。
在一些优选的实施方式中，芽孢形成率大于90％时，结束发酵。
当芽孢形成率大于90％时，发酵效率最高，避免了资源浪费，同时也能够避免过度发酵造成的菌体衰亡。
具体地，上述菌剂的制备方法包括如下步骤：
①摇瓶培养：将经斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养。摇瓶培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基(大豆蛋白胨8-10克，牛肉膏2-4克，氯化钠4-5克，琼脂18-20克，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5)。温度28℃-32℃，在180-220rpm转速条件下，震荡培养18-24h。
②一级种子培养：将经试管斜面活化的菌株MES818进行安碚瓶培养，安碚瓶培养基为肉汤培养基。培养基配方为：大豆蛋白胨8-10克，牛肉膏2-4克，氯化钠4-5克，琼脂18-20克，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5。培养条件为：温度28℃，培养24h。
③发酵:在30m3扩发酵罐中装有20L液体侧孢短芽孢杆菌发酵培养基，121℃湿热灭菌40min后冷却到32℃-35℃，将一级种子接种于侧孢短芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02MPa-0.07MPa，在35℃培养26h；发酵所用培养基的原料及用量为:豆饼粉3.5％-4.5％，玉米粉5％-6％，蔗糖0.3％-1％，葡萄糖0.3％-1％，氯化钠0.05％-0.2％，硫酸锰0.01％-0.03％，磷酸氢二钠0.2％-0.5％，碳酸钙0.3％-0.5％，氢氧化钾0.02％-0.05％，培养基pH调为6.0-7.5；
④至镜检芽孢形成率大于90％时，结束发酵；
⑤将上述发酵液与稳定剂复合制成液体制剂：
⑥喷干塔内进行浓缩喷干成粉末状，装入包装袋内。
⑦检测计数，侧孢短芽孢杆菌产品有效活菌数(CFU)≥2.0×1010个/g。
⑧尾气处理:采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例1菌株的分离筛选
该株侧孢短芽孢杆菌MES818是2018年6月我公司研发人员从猕猴桃根部土壤里分离的。经过称取土壤样品，无菌水梯度稀释，平板划线于28℃培养24h，挑取单菌落制成斜面菌种，4℃冷藏。挑取单菌落镜检，后经农业部菌种检测机构鉴定为侧孢短芽孢杆菌。以分离保藏的人参锈腐病菌毁灭柱孢菌Cylindrocarpon destructans(Zinss.)Scholtan菌为靶标，用侧孢短芽孢杆菌对其进行平板对峙实验，28℃培养7天，结果发现侧孢短芽孢杆菌能够显著抑制病原菌生长，出现较宽的抑菌带，将其命名为MES818。
实施例2 MES818微生物菌剂的制备
按照以下步骤进行：
①摇瓶培养：将经斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养。摇瓶培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基(大豆蛋白胨8-10克，牛肉膏2-4克，氯化钠4-5克，琼脂18-20克，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5)。温度28℃-32℃，在180-220rpm转速条件下，震荡培养18-24h。
②一级种子培养：将经试管斜面活化的菌株MES818进行安碚瓶培养，安碚瓶培养基为肉汤培养基。培养基配方为：大豆蛋白胨8-10克，牛肉膏2-4克，氯化钠4-5克，琼脂18-20克，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5。培养条件为：温度28℃，培养24h。
③发酵:在30m3扩发酵罐中装有20L液体侧孢短芽孢杆菌发酵培养基，121℃湿热灭菌40min后冷却到32℃-35℃，将一级种子接种于侧孢短芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02MPa-0.07MPa，在35℃培养26h；发酵所用培养基的原料及用量为:豆饼粉3.5％-4.5％，玉米粉5％-6％，蔗糖0.3％-1％，葡萄糖0.3％-1％，氯化钠0.05％-0.2％，硫酸锰0.01％-0.03％，磷酸氢二钠0.2％-0.5％，碳酸钙0.3％-0.5％，氢氧化钾0.02％-0.05％，培养基pH调为6.0-7.5；
④至镜检芽孢形成率大于90％时，结束发酵；
⑤将上述发酵液与稳定剂复合制成液体制剂：
⑥喷干塔内进行浓缩喷干成粉末状，装入包装袋内。
⑦检测计数，侧孢短芽孢杆菌产品有效活菌数(CFU)≥2.0×1010个/g。
⑧尾气处理:采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。
实施例3侧孢短芽孢杆菌MES818对人参锈腐病的拮抗作用试验
(一)试验时间和地点：2018年8月在公司研发实验室内进行。
(二)试验方法：
(1)供试人参锈腐病病菌来源：人参锈腐病菌采自河北省邯郸市永年县人参种植田间病株，经公司研究人员分离纯化，鉴定为毁灭柱孢菌Cylindrocarpon destructans(Zinss.)Scholtan，致病力测定表现为强致病力。
(2)平板对峙实验：
先将人参锈腐病菌接种在营养琼脂培养基平皿中央，再蘸取少量活化后的侧孢短芽孢杆菌MES818接种在病原菌的两侧约2cm处，同时设置只接种人参锈腐病菌的平板为空白对照。28℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量人参锈腐病菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种MES818后的抑菌生长半径)，用拮抗作用抑菌率表示：
Figure BDA0002342451990000091
(3)结果(图1)侧孢短芽孢杆菌MES818对人参锈腐病的抑菌带宽达7.3mm，抑菌率为85.68％。说明侧孢短芽孢杆菌MES818对人参锈腐病具有显著的抑制效果，具有防治人参锈腐病的生防潜力。
实施例4侧孢短芽孢杆菌MES818对人参锈腐病的防治试验
(一)试验药剂
(1)微生物菌剂
实施例2制备的MES818液体制剂，用水稀释600倍。
(2)化学药剂
50％多菌灵可湿性粉剂(四川国光农化股份有限公司)，用水稀释800倍。
(3)空白对照
设置只喷洒清水处理为空白对照。
(二)试验时间和地点
2019年6月10日在河北省邯郸市永定县人参种植地块进行。
(三)试验方法
采用随机区组试验，小区面积6m2(3m×2m)，3次重复。在人参出土时进行用50％多菌灵可湿性粉剂8g/m2或稀释后的MES818液体制剂进行土壤浇灌，第一次施药后15天进行第2次施药。2019年8月空白对照充分发病时调查人参锈腐病的发生情况，记录发病级别及株数。调查时采用5点取样法，每点20株，记录各级病株数，计算病情指数和防治效果。分级方法：
0级：植株主根无病斑；
1级：主根上有少量病斑；
2级：主根上病斑较多，病斑面积占根总面积的1/4～1/2；
3级：主根上的病斑多且较大，病斑面积占根总面积的1/2～3/4；
4级：主根上病斑连片，但植株并未死亡；
5级：根腐烂坏死，植株地上部分萎蔫或死亡。
Figure BDA0002342451990000101
(四)结果
试验结果见表2，侧孢短芽孢杆菌MES818制剂处理后，病情指数(8.03)显著低于空白对照处理后的病情指数(85.89)，而与化学药剂处理后的病情指数(7.58)差异不显著，MES818对人参锈腐病的防治效果达88.45％，说明侧孢短芽孢杆菌MES818及其微生物菌剂对人参锈腐病的防治效果较好。
表2侧孢短芽孢杆菌MES818对人参锈腐病的防效
处理 病情指数 防效(％)
MES818制剂 8.03b 88.45
多菌灵 7.58bc 90.16
空白对照 85.89a 0.00
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种侧孢短芽孢杆菌MES818，其特征在于，所述侧孢短芽孢杆菌MES818于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.16859。
2.如权利要求1所述的侧孢短芽孢杆菌MES818在防治人参锈腐病中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述侧孢短芽孢杆菌MES818通过拮抗人参锈腐病致病菌防治人参锈腐病；
优选地，所述人参锈腐病致病菌包括Cylindrocarpon destructans(Zinss.)Scholtan。
4.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的侧孢短芽孢杆菌MES818。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中的有效活菌数≥2.0×1010个/g。
6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，将所述菌剂用水稀释550-650倍，得到所述菌剂的工作液。
7.如权利要求4-6任一项所述的菌剂在防治人参锈腐病中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述菌剂通过拮抗人参锈腐病致病菌防治人参锈腐病；
优选地，所述人参锈腐病致病菌包括Cylindrocarpon destructans(Zinss.)Scholtan。
9.权利要求4-6任一项所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将侧孢短芽孢杆菌MES818依次经摇瓶培养、一级种子培养、发酵和浓缩，得到所述菌剂。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，芽孢形成率大于90%时，结束发酵。
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