CN109112069B - 一种生防内生真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株防治三七根腐病的三七内生真菌及其应用，属于农作物病害防治技术领域，所述的生防菌株为青霉菌(Penicillium sp.)。该菌株通过产生活性物质抑制三七病原菌的生长，对三七根腐病表现出较好的防治效果。应用时在三七苗期或者是成株期灌根使用。该菌剂也可与有机肥混合制成菌肥使用。本发明所述生防菌株青霉菌编号为Z1‑1031是从三七根部中获得，其保藏编号为CGMCC No.14134。此菌与土壤生态和三七植物和谐相融，无毒，无致病性，因此在三七根腐病生物防治中具有十分广阔的应用前景。

Description

一种生防内生真菌及其应用

技术领域：

本发明涉及一株生防内生真菌青霉(Penicillium sp.)及其应用，具体涉及一株对三七生长具有益生作用的内生真菌及其在防治三七根腐病中的应用，属于农作物病害防治技术领域。

背景技术：

三七属多年生阴生植物，生长过程中病害发生频繁，其中三七根腐病是影响三七产量的最主要因素。目前对根腐病的防治尚没有成熟有效的方法，前人对该病的发生与防治作过一些研究。土传病原菌导致三七根部发生腐烂的主要原因之一，真菌病原菌主要包括：柱孢菌、尖孢镰刀菌、茄腐镰孢菌、立枯丝核菌、轮枝孢霉菌、茎点霉菌，细菌病原菌以假单胞菌为主。七农为了保证三七的产量，施用大量化肥，导致土壤理化性质改变，土壤中菌群比例失衡，三七重金属严重超标等一系列不良问题。内生菌是一类具有重要经济价值的微生物资源，种类丰富，分布广泛，基本上每一种植物内都含有与之相适应的内生菌。内生菌中含有多种代谢途径，其对植物修复，元素循环，生物降解和生物转化起重要作用，同时在严重恶劣的环境条件,植物也可以为微生物提供庇护，协助微生物减少周围环境带来的压力。三七内生真菌在平衡生态环境促进三七生长过程中起重要作用。目前，我们已从三七的根、茎、叶和种子中分离出来89株内生真菌，它们分布在2个门(子囊菌门，接合菌门)，12个目，23个属，63.4％菌株具有拮抗至少一株三七致病菌的活性。本领域技术人员正在努力研究更多的内生真菌，以拮抗三七的根腐病害。

发明内容：

本发明的目的在于：针对目前三七根腐病严重发生，且面积逐年扩大，农药、轮作、土壤的化学处理等防治措施效果不理想，同时带来环境污染的问题，提供一种高效防治三七根腐病的生防菌及其应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

本发明提供了一种防治三七根腐病的生防内生真菌Z1-1031，经过形态学和分子生物学研究鉴定为青霉(Penicillium sp.)。

所述的生防内生真菌青霉菌的制备过程如下：将所述的菌株接种于PDA培养基平皿中，28℃倒置培养7-10天，活化菌株。使用蒸馏水将活化好的菌株制备成孢子悬浮液，显微镜下计数孢子浓度约为10⁸cfu/ml。取2ml孢子悬浮液接种于发酵培养基PDB中。26-28℃，120-150r/min，培养7-10天。

所述的生防内生真菌在防治三七根腐病中的应用方法如下：

可在三七成株期灌根使用，显微镜下计数，稀释孢子液到10⁶cfu/ml浓度，每株使用50ml。连续使用2-3次，每次间隔10-15天。该菌剂也可与有机肥混合配制成菌肥使用。

本发明有益效果：

本发明筛选出的生防内生真菌青霉菌发酵液能够明显抑制三七致病真菌腐皮镰孢、柱孢、链格孢等的生长，并且促进三七植株生长。由于是生物制剂，因此没有化学农药使用带来的一系列问题，对减少农业污染且有效防治三七根腐病大有益处。本发明生防内生真菌分离自健康三年生三七根部，同时也存在于三七的根际土壤中，其与三七土壤生态和谐相容，有利于充分发挥菌株的优势。

本发明生防内生真菌菌株培养条件简单，遗传稳定，易于工业化生产扩大，具有良好的开发应用前景。

本发明的青霉(Penicillium sp.)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年07月07日，保藏编号为：CGMCC No.14134。

附图说明：

图1为菌株Z1-1031菌落形态。

图2为菌株Z1-1031菌丝体和孢子形态。

图3为菌株Z1-1031拮抗三株三七致病菌活性。

图4为菌株Z1-1031发酵液及菌株田间回植结果。

具体实施方式：

为了更好的理解本发明，下面附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制，下面实施例中所述的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1三七内生真菌的分离

具体过程如下：

1样品的采集

从云南省文山县苗乡种植基地采集健康三年生三七植株，分装标记后装入保鲜袋中带回实验室备用。

2内生真菌的分离

植物清洗程序：在自来水下清洗植物表面的泥土，稍晾干，将植株切成小块，装入干净的三角瓶中超声，反复清洗，直至清洗后的水变得清澈，倒置，空水。

植物表面消毒程序：0.1％Tween 20，1min(浸泡，用烧杯处理，同一株植物用一个烧瓶，烧杯要求灭菌)→有效氯含量为5％的次氯酸钠溶液处理根样品6min→灭菌的2.5％硫代硫酸钠溶液处理10min→无菌水清洗至少3次→75％乙醇(用灭菌水配)处理根样品6min→无菌水清洗5次。经表面消毒后的样品置于无菌的培养皿中(培养皿内铺有无菌的滤纸)，放置在超净台上使其干燥(吹干，不能看到有水，可以在超净台中过夜)。

对表面消毒的效果进行检测：取0.2mL最后一遍清洗样品的水，涂布于待用的分离培养基上，将平板置于28℃培养2周以上，检测是否有菌落长出。

植物粉碎：将样品放入无菌搅拌器内(灭菌方法同生物鉴定盘，75％酒精泡5min，紫外照30min)充分打碎(打碎时打5s停5s，摇一下搅拌杯，使植物在刀片下，不贴壁)，放入无菌平皿中，50℃20min，然后用无菌竹签挑取样品并分撒在分离平板上。28℃培养观察，7天后挑取不同的单菌落划线纯化。将纯化的菌株转接到PDA培养基上培养，4℃保存备用，共分离得到21株内生真菌。

实施例2菌株Z1-1031的鉴定

1形态特征观察

将培养7-10天的菌株Z1-1031打开平皿盖，在黑色背景下拍照。菌落为灰绿色，边缘整齐偏灰白。表面呈天鹅绒状菌丝，培养基内产生黄色色素(图1)。取出少量菌丝体，制成片子，在光学显微镜下观察菌丝体和孢子形态特征。发现菌丝有横隔，其分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮不对称的小梗，形如扫帚，分生孢子球形光滑(图2)，根据以上形态特征分析，将菌株Z1-1031初步鉴定为青霉菌类群。

2 ITS序列分析

液氮研磨法提取菌株Z1-1031基因组DNA后，采用引物：ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，进行PCR扩增。凝胶电泳后送生物工程(上海)有限公司测序，序列全长为566bp(见SEQ)。将所得序列提交到GenBank数据库进行BLAST分析比对，发现与Z1-1031同源性较高的菌株属于青霉菌属，并且在NCBI上提交了菌株序列号为KU360251。

实施例3菌株Z1-1031发酵及发酵液处理工艺

将上述菌株孢子悬浮液10⁸cfu/ml接种于PDB液体培养基中，接种量为1-2ml,26-28℃，120-150r/min，培养7-10天后，发酵量为100mL/瓶。使用纱布将菌球与发酵液分离，发酵液使用等体积的乙酸乙酯萃取3次，收集萃取液减压抽干，最终得到发酵液干重为0.1-0.2g/瓶。使用少量甲醇溶解旋干物，并转移出来得到发酵液粗提物。

实施例4菌株Z1-1031代谢物抑菌测试

采用96孔板-比浊法，将Z1-1031代谢物对三七致病菌(Fusarium solani,Cylindrocarpon didynum,Alternaria panax)作拮抗测试。发酵液萃取物作用终浓度为0.1mg/ml。真菌将孢子从斜面洗下制成孢子悬浮液，血球计数板计数，稀释至孢子浓度10⁷cfu/ml。吸取上述稀释好的孢子悬浮液0.4ml加入40ml液体PDB培养基中，混匀成混悬液。空白对照组(CK)：198μl混悬液；DMSO对照组：198μl混悬液+2ul DMSO；阳性对照组：198μl混悬液+2μl G418；实验组：198μl混悬液+2μl发酵液萃取物(Extract)，每组三个平行。将96孔板置于28℃培养箱中培养，48h后600nm处测量OD值。结果如图3所示，发酵液萃取物对(Fusarium solani,Cylindrocarpon didynum,Alternaria panax)有杀灭作用，与空白对照组存在显著性差异。活性筛选实验结果表明，菌株Z1-1031的发酵液对三七根腐致病菌具有较好的拮抗作用。

实施例5菌株Z1-1031发酵液粗提物及菌株回植实验

将回植菌株Z1-1031接种于PDA培养基，28℃培养7d。用无菌水制备菌悬液，稀释至10⁶cfu/mL，每株三七苗灌根50mL。发酵液粗提物使用水溶解，配制成1mg/L的溶液，每株三七灌根50mL。每个处理分为三组，每组接种200株三七苗，均种植在新土(0年土)上。每隔1个月记录三七苗的存苗率，一共观察了4个月。由文山三七研究院、云南省农业科学研究院药用植物研究所协助完成。结果如图4所示。从第一个月至第四个月，对照组的存苗率由92％降到55％，而施用发酵液组和回植菌组分别由100％到90％、100％到88％。实验结果表明，菌株Z1-1031发酵液及菌体可以显著降低三七的死亡率，提高存苗率，表现出良好的应用潜力。

序列表

<110> 沈阳药科大学

<120> 一种生防内生真菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 566

<212> DNA

<213> 微紫青霉(Penicillium janthinellum)

<220>

<221> allele

<400> 1

tgcggaggac attaccgagt gagggccctc tgggtccaac ctcccacccg tgtttatcat 60

acctagttgc ttcggcgggc ccgccgtcat ggccgccggg gggcacccgc ccccgggccc 120

gcgcccgccg aagccccccc tgaacgctgt ctgaagattg ctgtctgagc gattagctaa 180

atcagttaaa actttcaaca acggatctct tggttccggc atcgatgaag aacgcagcga 240

aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgagtcttt gaacgcacat 300

tgcgccccct ggtattccgg ggggcatgcc tgtccgagcg tcattgctgc cctcaagcac 360

ggcttgtgtg ttgggccccc gccccccggc tcccgggggg cgggcccgaa aggcagcggc 420

ggcaccgcgt ccggtcctcg agcgtatggg gcttcgtcac ccgctctgta ggcccggccg 480

gcgcccgccg gcgacccccc tcaatctttc tcaggttgac ctcggatcag gtagggatac 540

ccgctgaact taagcatatc aataag 566

Claims (7)

1.生防内生真菌微紫青霉(Penicillium janthinellum)在制备防治三七或人参根腐病的农药中的应用，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.14134。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的根腐病的致病菌是腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、双孢柱孢(Cylindrocarpon didynum)或人参链格孢(Alternariapanax)。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的生防内生真菌通过如下方法制备：将所述的菌株接种于PDA培养基平皿中，28℃倒置培养7-10天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成孢子悬浮液，显微镜下计数孢子浓度，取孢子悬浮液接种于发酵培养基PDB中，26-28℃，120-150r/min，培养7-10天。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PDA培养基为：土豆200g,葡萄糖10g,琼脂20g,定容至1L蒸馏水中，PH自然，121℃灭菌30min，所述的PDB培养基为：土豆200g,葡萄糖10g,定容至1L蒸馏水中，pH自然，121℃灭菌30min。

5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，将生防内生真菌在三七苗期或者成株期灌根使用；连续使用2-3次，每次间隔15天。

6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的生防内生真菌单独作用或与有机肥混合使用。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，生防内生真菌的发酵方法为：使用新鲜孢子悬浮液接种于PDB培养基中摇瓶培养7-10天，使用等体积乙酸乙酯萃取发酵液3遍，收集浓缩萃取液，备用。

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