CN112458011B - 一种解淀粉芽孢杆菌zjk1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌ZJK1及其应用，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZJK1，保藏日期为2020年6月8日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20036。本发明菌株及经过液体发酵制备得到的菌体、无芽孢发酵液，均可对草莓灰霉病病原灰葡萄孢菌产生较强的拮抗作用，生物制剂可对草莓灰霉病起到显著的防治效果，另外，对于鲜摘草莓起到保鲜效果。传统化学药剂相比，其具绿色安全，环境友好等优势，在灰霉病生物防治方面拥有广阔的应用前景。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌ZJK1及其应用

技术领域

本发明属于微生物学科领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌ZJK1及其应用。

背景技术

草莓是蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生常绿草本植物，是在世界范围内广泛栽培的重要经济作物。然而，在草莓生产过程中，极易遭受植物病原菌的侵染，其中由灰葡萄孢菌引起的草莓灰霉病严重危害草莓的产量和质量。

灰霉病是草莓生长和采摘后易于爆发的一种常见病害，且危害日益严重，草莓发病期较长，从开花坐果期至采收期，整个过程都有可能因受到灰葡萄孢菌的侵染而发病。不少农户会选择保护地种植草莓，可以不受季节限值而收获更多草莓以期望获取更多收益，但是保护地栽培的草莓与露地栽培的草莓相比，发病早且重。当遇到阴天或雾天的天气、灌水过多引起田间多水、地膜上积水、种植密度过大、氮肥使用量过多，生长过于繁茂这些情况时，更容易使草莓感染上灰霉病。采摘后的草莓果实一旦受到灰霉病的侵染也会发生大面积腐烂的现象，造成严重的经济损失。

灰霉病是由灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)引起的，该病原菌的寄主范围极广，不仅会危害草莓，还危害侵染番茄、葡萄、黄瓜等多种经济作物。目前，化学防治依然是控制草莓灰霉病的主要手段，农户常施用化学农药来对草莓灰霉病进行防治。但是在使用这些化学农药时，往往会造成环境污染和生态破坏。同时，这些化学农药都有一定毒性，人们若长期食用这些残留有化学农药的果蔬，可能会严重损害人体健康。此外，长期使用化学药剂易使灰霉病菌产生抗药性，甚至产生多重抗药性，影响化学农药的防治效果。

近年来，生物菌剂防治逐渐引起人们越来越多的关注和重视。它与化学杀菌剂明显不同，生物菌剂可以降低病原菌抗药性产生的机率，减少环境污染，且安全无毒不会对人体造成威胁，有利于生态平衡，生产工艺简单，此外有的微生物对植物生长有一定促生作用。生物菌剂防治是一种环境友好型防治保护地农业病害的途径，把生物菌剂防治与病害综合治理联系起来，对现代保护地农业的可持续发展有着重要的意义和深远的影响。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZJK1及其应用，所述应用包括在防治草莓灰霉病、草莓保鲜等技术领域。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案：

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZJK1，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZJK1，保藏日期为2020年6月8日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20036。

所述解淀粉芽孢杆菌ZJK1分离于自镇江句容市采集的草莓，菌落呈淡黄色，近似圆形，直径约2-6mm，表面粗糙、有凸起，较透明，边缘不规则，能够形成芽孢；生长环境为pH值为6.5～7.5，温度为28～37℃，革兰氏阳性杆菌。

所述的解淀粉芽孢杆菌ZJK1在防治草莓灰霉病中的应用。

所述的解淀粉芽孢杆菌ZJK1在草莓采摘后保鲜上的应用。

作为改进的是，步骤1，将解淀粉芽孢杆菌ZJK1接种于LB液体培养基，将培养液于28-37℃的摇床培养箱中培养24-48小时，至OD600达到0.6-0.8，得到种子培养液；步骤2，,将种子培养液以1-5％的接种量接种于发酵培养液中扩大培养，调节发酵培养液中解淀粉芽孢杆菌ZJK1的浓度，即得发酵菌剂；步骤3，将发酵菌剂喷施在生长期的草莓植株上或浸泡采摘后的草莓。

进一步改进的是，调节发酵液中解淀粉芽孢杆菌ZJK1的浓度为1×10⁸-1×10¹⁰CFU/mL。

进一步改进的是，发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH 6.5-7.5。

进一步改进的是，喷施生长期的草莓植株时，至植物表面水珠流动即可。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种解淀粉芽孢杆菌ZJK1及其应用，具有如下优势：

分离的解淀粉芽孢杆菌ZJK1对草莓生长过程及采后储存过程中灰霉病的产生均起到较好的防治作用；且该菌的繁殖速度快，抗逆能力强，安全无毒，不会对环境产生污染，是一种理想的生物杀菌剂；该解淀粉芽孢杆菌ZJK1的制备方法简单，能够人工大规模培养，易于实现工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZJK1拮抗草莓灰霉病菌的抗性平板图；

图2是基于16S rRNA基因序列的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZJK1***发育树；

图3是不同稀释倍数发酵液对草莓灰霉病防治效果；

图4是不同稀释倍数发酵液浸泡处理对果实上灰霉病的抑制图(间隔4d)，(a)为空白组，(b)为发酵液，(c)为稀释10倍的发酵液，(d)为稀释100倍的发酵液。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

实施例1

一株用于防治草莓灰霉病的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZJK1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.20036，保藏日期为2020年6月8日。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZJK1的采集、分离和鉴定，步骤如下：

1、从镇江句容白兔镇采集的草莓灰霉病果中，首先切取患有灰霉病的草莓果实的未患病部分，用0.1％氯化汞溶液对其表面进行消毒3min，然后在无菌的条件下进行研磨；用梯度稀释法在LB培养基中进行筛选；

2、平板上出现单一菌落后，根据菌落形态、颜色的差异区分不同菌落，用接种环分别挑取不同菌落在PDA固体培养基平板上划线培养；

3、进行拮抗菌初筛：取大小基本一致的灰霉菌块置于PDA平板中央，用接种环取划线培养的细菌在霉菌的菌块周围划一条较短的线，在该平板上共做四种细菌的划线，置于28℃恒温培养箱培养4天，选出对病原菌生长有抑制作用，且被抑制病原菌菌丝边缘平齐，拮抗作用持久的细菌；

4、进入拮抗菌复筛：采用对峙培养法，取大小一致的霉菌菌块置于PDA平板中央，用接种环挑取拮抗性好的细菌点接在距平板中央3cm处的4个角点上，置于28℃培养箱培养4天，观察抑菌圈大小(细菌菌落中心至病原菌菌丝边缘)；

5、对抑菌圈较大的拮抗菌用平板画线法进行纯化，先在平板上画一条线，然后将接种环上残菌烧掉，待接种环冷却后从上一条线的末端开始再画一条线，按此步骤连续画4-5条线，倒置于37℃恒温培养箱培养1-2天，长出单一菌落后按上述对峙培养法再做一次对峙实验；

6、重复上述步骤5，即可培养出下一代细菌，连续继代培养3-4代，得到拮抗性能好的菌株。

将分离得到的解淀粉芽孢杆菌ZJK1在LB培养基上进行恒温培养，菌落表面粗糙，干燥皱缩，半透明，淡黄色，能够形成芽孢。

解淀粉芽孢杆菌ZJK1可在pH值为6.5～7.5环境中生长；适宜生长温度为28℃～37℃。

提取解淀粉芽孢杆菌ZJK1的DNA，经PCR反应确定片段后进行16S rRNA基因测序，序列在NCBI网站Bl ast比对并以构建***发育树(图2)，从发育树结果结合形态观察和生理生化实验，确定拮抗菌ZJK1为解淀粉芽孢杆菌。

实施例2发酵菌剂对草莓叶片上灰霉病抑制试验

(1)灰葡萄孢子悬浊液的制备

将灰霉病菌(分离自草莓病果)接种于PDA平板上进行活化，随后用无菌去离子水冲刷平板，以将分生孢子洗脱至离心管中，用无菌纱布过滤后将所得到的孢子悬浊液浓度调至1×10⁶个/mL，用于后续实验使用。

(2)发酵菌液的制备

从保存的ZJK1菌株斜面上挑取一环，移至LB液体培养基中，在37℃、150r/min条件下培养24h进行活化，之后按照5％的接种量吸取菌液移入LB液体培养基中，按同样的温度和转速培养26h，此时ZJK1菌株处于对数生长期末期，细菌浓度为1×10⁸CFU/mL，细菌数量较多且代谢旺盛，因此要及时收集此时的菌液作为发酵原液，同时将发酵原液用无菌LB液体培养基分别稀释10倍、100倍、1000倍，作为抗霉菌的发酵菌液。

(3)灰霉病抑制实验

首先，对采集到的草莓植株上的叶子进行前处理，将叶子用水充分浸泡以去除叶片表面一些杂质，并用75％浓度酒精棉球轻轻擦拭叶片表面，对叶片表面进行消毒。随后给草莓叶片接种上灰葡萄孢菌，使其感染灰霉病，具体方法为用无菌针在叶片主脉两边各划5道1cm长的伤口，再将叶片浸泡在事先调配好的1×10⁶个/mL灰葡萄孢子悬浊液中5s后拿出，自然晾干2h。最后将晾干后的草莓叶片分别在稀释10倍的发酵液、稀释100倍的发酵液和稀释1000倍的发酵液中充分浸泡15s后拿出，作为三个试验组，三个试验组各重复三片叶子。用无菌水做与上述同样的处理，作为空白对照组，空白对照组也重复三片叶子。将所有处理过的草莓叶片***盛有水的小烧杯中，用保鲜膜封好杯口，在25℃、90％RH条件下培养13d。13d后观察叶片患病情况，统计叶片病斑面积比例并计算防治效果。防治效果计算公式如下：

结果见图3可知，10倍稀释菌液的防治效果最好，达到99％。

实施例3解淀粉芽孢杆菌ZJK1对草莓采后自然腐烂率的影响

将ZJK1菌株接种至LB液体培养基中，然后放置于37℃、130r/min的气浴摇床中振荡培养至对数期后取出。将发酵液的浓度作为最高浓度，依次稀释10倍、100倍，配制出低、中、高三种不同浓度的菌悬液，作为后续进行草莓果实保鲜实验的保鲜制品。

挑选完好、大小质量基本一致的草莓果实放入未稀释的菌悬液、稀释10倍的菌悬液、稀释100倍的菌悬液中浸泡1min左右，捞出后自然风干，放置在纸盒中，以生理盐水处理作为空白对照。不同浓度菌悬液浸泡处理以及生理盐水浸泡处理均做3盒草莓果实重复，5颗/盒。在30℃温度下储藏4天，定期记录草莓质量，同时观察并记录草莓感官品质如色泽、软硬程度等的变化。通过失重率反映不同菌悬液浸泡处理对储藏期草莓果实的保鲜效果，按照以下计算公式计算草莓失重率：

结果如图4所示，从图中可以看出不同浓度的菌液对草莓果实的腐烂均有一定的抑制作用，对草莓果实腐烂的抑制作用越为明显，说明该生防菌剂可用于草莓的采后保鲜中。

与CN201210192469相比，本发明菌株ZJK1菌株分离自草莓内部，属于草莓内生菌，专利CN201210192469的菌株来源并不清晰；另外，本发明菌株ZJK1菌落呈淡黄色，菌落较小，芽孢生一端，而专利CN201210192469的菌株为白色，菌落相对较大，芽孢生两端。

以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (8)

1.一种解淀粉芽孢杆菌ZJK1，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZJK1，保藏日期为2020年6月8日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20036。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌ZJK1，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌ZJK1分离于自镇江句容市采集的草莓，菌落呈淡黄色，近似圆形，直径2-5mm，表面粗糙、有凸起，半透明，边缘不规则，能够形成芽孢，芽孢在一端；生长环境为pH值为6.5-7.5，温度为28-37℃，革兰氏阳性杆菌。

3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌ZJK1在防治草莓灰霉病中的应用。

4.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌ZJK1在草莓采摘后保鲜上的应用。

5.根据权利要求3-4中任一项所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，将解淀粉芽孢杆菌ZJK1接种于LB液体培养基，将培养液于28-37℃的摇床培养箱中培养24-48小时，至OD600达到0.6-0.8，得到种子培养液；步骤2，将种子培养液以1-5％的接种量接种于发酵培养液中扩大培养，调节发酵培养液中解淀粉芽孢杆菌ZJK1的浓度，即得发酵菌剂；步骤3，将不同浓度的发酵菌剂喷施在生长期的草莓植株上，可以防治草莓灰霉病；或浸泡采摘后的草莓，可以取得不同程度的保鲜效果。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，调节发酵液中解淀粉芽孢杆菌ZJK1的浓度为1×10⁸-1×10¹⁰CFU/mL。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH 6.5-7.5。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，喷施生长期的草莓植株时，至植物表面水珠流动即可。

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