CN109628344A - 一种防治猕猴桃疫霉病菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种防治猕猴桃疫霉病菌剂及其制备方法和应用，侧孢短芽孢杆菌（BreviBacillus laterosporus）MES818，保藏日期：2018年12月03日。防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂包括侧孢短芽孢杆菌的发酵液和分散剂。防治猕猴桃疫霉病菌剂的制备方法：①一级种子培养②发酵③至芽孢形成比例大于等于90%时，结束发酵，放罐；④将上述发酵液与分散剂复合制成液体制剂或继续将液体制剂干燥成菌粉。本发明的侧孢短芽孢杆菌对苹果疫霉、樟疫霉、侧生疫霉和大子疫霉菌属的致病菌有显著的抑菌效果，防止猕猴桃疫霉病的发生，促进猕猴桃稳产、增收，一般产量提高20‑30%，果实甜度提高2‑3个点。

Description

一种防治猕猴桃疫霉病菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物病害生物防治技术领域，涉及一种防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌及其菌剂的制备方法。
背景技术
猕猴桃种植过程中，埋土过深、土壤湿度大根系呼吸困难、营养不足、除草过深伤及根系易诱发猕猴桃疫霉病。猕猴桃疫霉病是一种毁灭性的土传真菌性病害，一旦发病很难根治，重病园发病率高达20％-30％，死亡率达10％-20％，有的果园出现果树成片死亡，严重影响了猕猴桃产业的发展。
引发猕猴桃疫霉病的病原菌有苹果疫霉(Phytophthora cacterum)、樟疫霉(P.cinnamomi)、侧生疫霉(P.lateralis)和大子疫霉(P.megasperma)等。病原菌寄主范围广、生长速度快、抗逆能力强，当灌溉或下雨时土壤中的病原菌孢子和菌丝体随发病作物残体传播迅速，很容易引起果树成片死亡，幼树受害更慎。常规防治方法采用加强果园栽培管理，避免漫灌，采用高垄栽培等传统方法来防治病害的措施很难实现完全控制病原菌的效果。采用化学农药防治病害需先刮除病斑后再施用福美双、乙膦铝、代森锰锌等，操作繁琐且化学农药会增加果实农药残留量，降低产品品质，导致环境污染问题，破坏生态平衡。
利用拮抗微生物防治植物病害符合有机生态农业的思路和环境可持续发展的方向，也是植物病害防治的有效途径之一。经检索，目前未见用侧孢短芽孢杆菌(BreviBacillus laterosporus)防治猕猴桃疫霉病的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌及其菌剂的制备方法。本发明的侧孢短芽孢杆菌对苹果疫霉(Phytophthora cacterum)、樟疫霉(P.cinnamomi)、侧生疫霉(P.lateralis)和大子疫霉(P.megasperma)菌属的致病菌有显著的抑菌效果，防止猕猴桃疫霉病的发生，促进猕猴桃稳产、增收，一般产量提高20-30％，果实比甜度提高2-3个点。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌，侧孢短芽孢杆菌(Bacilluslaterosporus) MES818，保藏日期：2018年12月03日，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC No.16859。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院。
本发明提供了防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂，包括侧孢短芽孢杆菌的发酵液和分散剂，两者的比例为1000：1制得含有防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的液态制剂。
作为上述实施例的进一步改进，将液体制剂再浓缩喷干，制得粉末状制剂。
作为上述实施例的进一步改进，所述分散剂为吐温80。
本发明还提供了防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂的制备方法，包括以下步骤：
①一级种子培养：将经试管斜面活化的菌株MES818进行种子瓶培养，种子瓶培养基为肉汤培养基，培养条件为：温度26-30℃，培养24-30h，制得一级种子液；
②发酵:将一级种子液，按6-10％接种量接种于侧孢短芽抱杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02MPa-0.07MPa，在32-38℃培养24-30h；
③至芽孢形成比例大于等于90％时，结束发酵，放罐；
④将上述发酵液与分散剂复合制成液体制剂。
作为上述实施例的进一步改进，所述种子培养基配方为：大豆蛋白胨8-10克，牛肉膏3-5 克，氯化钠4-6克，琼脂18克，超纯水1000毫升，pH值为7.3，121℃下灭菌30min。
11.作为上述实施例的进一步改进，所述发酵培养基为：按质量分数计，豆饼粉3-5％，玉米粉4-7％，蔗糖0.4-1.5％，葡萄糖0.5-1.5％，氯化钠0.1-0.3％，硫酸锰0.01-0.05％，磷酸氢二钠0.2-0.5％，碳酸钙0.3-0.8％，氢氧化钾0.02-0.06％，其余为水，培养基pH调为6.0-7.5；
作为上述实施例的进一步改进，所述发酵培养基的灭菌条件为：120-130℃湿热灭菌 30-50min后冷却到35℃后使用。
本发明还提供了防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂的应用，含有防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂在防治猕猴桃植株疫霉病中的应用。
作为上述实施例的进一步改进，将含有防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂稀释 100-300倍后沟施、穴施、灌根，每亩用量2-5kg。
原理：侧孢短芽孢杆菌生长过程中分泌激素类生长物质促进作物的生长，同时还分泌肽类抗生素等多种抑菌物质、几丁质酶、蛋白酶等物质分解抑制病原菌的生长。
本发明还提供了含有防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂的应用，其特征在于，含有防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂在防治猕猴桃植株疫霉病中的应用。菌株获得方式：
该株侧孢短芽孢杆菌MES818是2017年6月我公司研发人员从陕西周至猕猴桃根部土壤中分离获得。从猕猴桃根部土壤中分离经5次纯化后，经过平板划线，在28℃培养24小时后，制成斜面菌种，各挑取2支斜面送农村农业部微生物质检机构鉴定，确定为侧孢短芽孢杆菌，4℃和-80℃保藏。
经检测该侧孢短芽孢杆菌为芽孢杆菌属，革兰氏染色阳性细菌，杆状，单个细胞0.5-0.8 ×2-5微米，用甲苯胺蓝或着色均匀。芽孢为椭圆形，侧生、中生或近中生，孢囊膨大，游离芽孢一边比另一边厚(独木舟形)，兼性厌氧。麦芽糖、半乳糖、木糖、果糖产酸；葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、棉子糖不产酸。不分解淀粉，接触酶、氧化酶阳性。
有益效果
将本发明的菌剂用在果园防治猕猴桃疫霉病，防效明显，田间防治效果达70％以上，并且属于绿色无公害制剂、不污染环境、降低农药使用成本和人工管理成本、适宜大面积推广使用。
附图说明
图1为MES818侧孢芽孢杆菌的菌落和菌体照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌，侧孢短芽孢杆菌(BreviBacilluslaterosporus) MES818，保藏日期：2018年12月03日，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC No.16859。该菌体的菌落和菌体照片如图1所示。
本发明提供了防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂，包括侧孢短芽孢杆菌的发酵液和分散剂，两者的比例为1000：1制得含有防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的液态制剂，其中，分散剂为吐温80。
本发明还提供了防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂的制备方法，包括以下步骤：
①一级种子培养：将经试管斜面活化的菌株MES818进行种子瓶培养，种子瓶培养基为肉汤培养基，培养条件为：温度26℃，培养30h，制得一级种子液；种子培养基配方为：大豆蛋白胨10克，牛肉膏3克，氯化钠5克，琼脂18克，超纯水1000毫升，pH值为7.3，121℃下灭菌30min。
12.②发酵:将一级种子液，按6％接种量接种于侧孢短芽抱杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02MPa，在35℃培养26h；发酵培养基为：按质量分数计，豆饼粉4.2％，玉米粉5.6％，蔗糖0.5％，葡萄糖0.5％，氯化钠0.1％，硫酸锰0.01％，磷酸氢二钠0.3％，碳酸钙0.5％，氢氧化钾0.04％，其余为水，培养基pH调为6.0；灭菌条件为：122℃湿热灭菌40min后冷却到35℃后使用。
③至芽孢形成比例大于等于90％时，结束发酵，放罐；
④将上述发酵液与分散剂复合制成液体制剂。检测计数，侧孢短芽孢杆菌产品有效活菌数(CFU)≥1.0*1011个/g。
实施例2
一种防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌，侧孢短芽孢杆菌(BreviBacilluslaterosporus) MES818，保藏日期：2018年12月03日，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC No.16859。
本发明提供了防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂，包括侧孢短芽孢杆菌的发酵液和分散剂，两者的比例为1000：1制得含有防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的液态制剂，其中，分散剂为吐温80。将液体制剂再浓缩喷干，制得的粉末状制剂。
本发明还提供了防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂的制备方法，包括以下步骤：
①一级种子培养：将经试管斜面活化的菌株MES818进行种子瓶培养，种子瓶培养基为肉汤培养基，培养条件为：温度28℃，培养24h，制得一级种子液；种子培养基配方为：大豆蛋白胨8克，牛肉膏5克，氯化钠4克，琼脂18克，超纯水1000毫升，pH值为7.3，121℃下灭菌30min。
②发酵:将一级种子液，按10％接种量接种于侧孢短芽抱杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.07MPa，在32℃培养30h；发酵培养基为：按质量分数计，豆饼粉3％，玉米粉7％，蔗糖1.5％，葡萄糖0.5％，氯化钠0.2％，硫酸锰0.03％，磷酸氢二钠0.5％，碳酸钙0.3％，氢化钾0.06％，其余为水，培养基pH调为7.5；灭菌条件为：120℃湿热灭菌50min后冷却到 35℃后使用。
③至芽孢形成比例大于等于90％时，结束发酵，放罐；
④将上述发酵液与分散剂复合制成液体制剂，将液体制剂再浓缩喷干，制得的粉末状制剂用无菌水稀释后检测计数，侧孢短芽孢杆菌产品有效活菌数(CFU)≥1.0*1011个/g。
实施例3
一种防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌，侧孢短芽孢杆菌(BreviBacilluslaterosporus) MES818，保藏日期：2018年12月03日，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC No.16859。
本发明提供了防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂，包括侧孢短芽孢杆菌的发酵液和分散剂，两者的比例为1000：1制得含有防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的液态制剂，其中，分散剂为吐温80。
本发明还提供了防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂的制备方法，包括以下步骤：
①一级种子培养：将经试管斜面活化的菌株MES818进行种子瓶培养，种子瓶培养基为肉汤培养基，培养条件为：温度30℃，培养24h，制得一级种子液；种子培养基配方为：大豆蛋白胨9克，牛肉膏4克，氯化钠6克，琼脂18克，超纯水1000毫升，pH值为7.3，121℃下灭菌30min。
②发酵:将一级种子液，按8％接种量接种于侧孢短芽抱杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.05MPa，在38℃培养24h；发酵培养基为：按质量分数计，豆饼粉5％，玉米粉4％，蔗糖1..0％，葡萄糖1.5％，氯化钠0.3％，硫酸锰0.05％，磷酸氢二钠0.2％，碳酸钙0.3％，氢氧化钾0.02％，其余为水，培养基pH调为7.0；灭菌条件为：130℃湿热灭菌30min后冷却到35℃后使用。
③至芽孢形成比例大于等于90％时，结束发酵，放罐；
④将上述发酵液与分散剂复合制成液体制剂，将液体制剂再浓缩喷干，制得的粉末状制剂用无菌水稀释后检测计数，侧孢短芽孢杆菌产品有效活菌数(CFU)≥1.0*1011个/g。
本发明还提供了防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂的应用，含有防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂在防治猕猴桃植株疫霉病中的应用。
将含有防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的液态制剂稀释100-300倍后沟施、穴施、灌根，每亩用量2-5kg；将含有防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的粉末制剂稀释500倍后沟施、穴施、灌根，每亩用量1-3kg。
二、功能检测
侧孢短芽孢杆菌MES818对猕猴桃疫霉病的抑菌试验
试验方法：
(1)供试猕猴桃疫霉病病菌来源：猕猴桃疫霉病BYJ-02采自陕西省西安市周至县哑柏镇猕猴桃疫霉病病根组织，经公司研发人员分离纯化，最终鉴定为疫霉属的恶疫霉菌(Phytophthora cactorum(Leb.et Cohn)Schr.)，致病力测定表现为强致病力。
(2)平板拮抗实验：
制备PDA固体平板，在平板中间用无菌接种针挑取少量的猕猴桃疫霉病病原菌菌丝，烧红接种针，等接种针冷却后蘸取少量的侧孢短芽孢杆菌MES818接种在距接种病原菌菌斑2.0 厘米处，设置不接种侧孢短芽孢杆菌只接种猕猴桃疫霉病菌处理为空白对照，每个处理设置三次重复。28℃恒温培养，待空白对照菌丝长满整个培养皿时，测量仅接种猕猴桃疫霉病病菌的对照菌落面积(菌落半径)和接种MES818后病原菌的菌落面积(抑制菌落半径)，用拮抗效果表示(拮抗效果(％)＝(对照菌落面积-处理菌落面积)/对照菌落面积*100)。
(3)拮抗效果
通过本实验发现侧孢短芽孢杆菌MES818对猕猴桃疫霉病的拮抗效果达88.7％(表1)；对照平均菌落半径为4.49厘米，接种侧孢短芽孢杆菌的平均菌落半径为1.5cm。说明侧孢短芽孢杆菌MES818对猕猴桃疫霉病具有明显的抑制作用，具有巨大的防治猕猴桃疫霉病的生防潜力。
表1侧孢短芽孢杆菌MES818对猕猴桃疫霉病的拮抗结果
菌株名称 对照平均菌落面积(cm<sup>2</sup>) 处理平均菌落面积(cm<sup>2</sup>) 拮抗效果(％)
MES818 63.2 7.1 88.7
侧孢短芽孢杆菌MES818对猕猴桃疫霉病应用的田间防治效果
(一)试验药剂
(1)微生物菌剂：实施例2制备的MES818粉末制剂，用水稀释500倍；MES818粉末制剂的用量为1kg。
(2)化学药剂：80％代森锰锌可湿性粉剂(中国农科院植保所生产)，用水稀释600倍。
(3)空白对照：清水。
(二)试验时间和地点：2017年8月在陕西省周至县哑柏镇六屯村坤禾生物猕猴桃种植基地内进行。
(三)试验方法：随机选取15株猕猴桃病株，每个处理5株，每个处理重复三次，轻轻扒开根部土壤，使大约20cm的病根暴露在外。试验前调查每株的病情指数，做好记录。将实施例1制备的MES818制剂按用量均匀洒施在供试植株根部，再浇200mL水，覆土后分别在施菌7天，14天，30天，60天后调查病情指数，计算防治效果。化学药剂对照和空白清水对照处理同上。
(四)结果(见表2-5)侧孢短芽孢杆菌MES818菌粉处理后，病情指数(9.16)显著低于空白对照处理后的病情指数(78.29)，而与化学药剂处理后的病情指数(7.25)差异不显著， MES818对猕猴桃疫霉病的防治效果达85.28％，而在处理14天后使用MES818菌粉的处理病情指数开始上升，而化学防治效果开始下降，特别是30天和60天后使用微生物菌剂的效果好于化学药剂和空白对照。说明侧孢短芽孢杆菌MES818逐渐在猕猴桃根部定植繁殖，分泌的促生长及抑菌物质逐步积累，使用微生物菌剂对猕猴桃疫霉病防治效果开始表现明显效果。
表2处理7天后不同防治方法对猕猴桃疫霉病防治效果
处理 病情指数 防效(％)
施MES818菌粉 8.16c 83.43
使用代森锰锌 20.36b 30.46
空白对照 83.45a 0.00
表3处理14天后不同防治方法对猕猴桃疫霉病防治效果
处理 病情指数 防效(％)
施MES818菌粉 9.16bc 85.28
使用代森锰锌 7.25b 90.46
空白对照 78.29a 0.00
表4处理30天后不同防治方法对猕猴桃疫霉病防治效果
处理 病情指数 防效(％)
施MES818菌粉 8.96bc 90.21
使用代森锰锌 7.95b 89.46
空白对照 80.34a 0.00
表5处理60天后不同防治方法对猕猴桃疫霉病防治效果
处理 病情指数 防效(％)
施MES818菌粉 5.70c 92.43
使用代森锰锌 35.28b 26.12
空白对照 91.26a 0.00
SEQUENCE LISTING
<110> 天津开发区坤禾生物技术有限公司
<120> 一种防治猕猴桃疫霉病菌剂及其制备方法和应用
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<210> 1
<211> 1437
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<213> Brevibacillus laterosporu
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Claims (10)

1.一种防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌，其特征是：侧孢短芽孢杆菌（BreviBacillus laterosporus）MES818，保藏日期：2018年12月03日，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC No. 16859。
2.根据权利要求1所述的防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂，其特征在于，包括侧孢短芽孢杆菌的发酵液和分散剂，两者的比例为1000：1制得含有防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的液态制剂。
3.根据权利要求2所述的防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂，其特征在于，所述分散剂为吐温80。
4.根据权利要求2所述的防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂，其特征在于，将液体制剂再浓缩喷干，制得粉末状制剂。
5.根据权利要求1-4任一所述的防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①一级种子培养：将经试管斜面活化的菌株MES818进行种子瓶培养，种子瓶培养基为肉汤培养基，培养条件为：温度26-30℃，培养24-30h，制得一级种子液；
②发酵:将一级种子液，按6-10%接种量接种于侧孢短芽抱杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02MPa-0.07MPa，在32-38℃培养24-30h；
③至芽孢形成比例大于等于90%时，结束发酵，放罐；
④将上述发酵液与分散剂复合制成液体制剂。
6.根据权利要求5所述的防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂的制备方法，其特征在于，所述种子培养基配方为：大豆蛋白胨8-10克，牛肉膏3-5克，氯化钠4-6克，琼脂18克，超纯水1000毫升，pH值为7.3，121℃下灭菌30 min。
7.根据权利要求5所述的防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为：按质量分数计，豆饼粉3-5%，玉米粉4-7%，蔗糖0.4-1.5%，葡萄糖0.5-1.5%，氯化钠0.1-0.3%，硫酸锰0.01-0.05%，磷酸氢二钠0.2-0.5%，碳酸钙0.3-0.8%，氢氧化钾0.02-0.06%，其余为水，培养基pH调为6.0-7.5。
8.根据权利要求7所述的防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的灭菌条件为：120-130℃湿热灭菌30-50min后冷却到35℃后使用。
9.根据权利要求1-4任一所述的防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂的应用，其特征在于，含有防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂在防治猕猴桃植株疫霉病中的应用。
10.根据权利要求9所述的防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的制剂的应用，其特征在于，将含有防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的液态制剂稀释100-300倍后沟施、穴施、灌根，每亩用量2-5kg；将含有防治猕猴桃疫霉病的侧孢短芽孢杆菌的粉末制剂稀释500倍后沟施、穴施、灌根，每亩用量1-3kg。
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