CN111172060A - 一种具有防治香蕉枯萎病功能的芽孢杆菌及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有防治香蕉枯萎病功能的芽孢杆菌及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有防治香蕉枯萎病功能的芽孢杆菌及其制备方法和应用，所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌YX‑11。所述的枯草芽孢杆菌是通过培养材料准备、分离培养、拮抗内生细菌筛选和拮抗内生细菌YX‑11的鉴定步骤得到的。所述的枯草芽孢杆菌YX‑11的菌剂，是以所述的枯草芽孢杆菌YX‑11经种子液一级制备、种子液二级制备和发酵得到的菌剂。所述的枯草芽孢杆菌YX‑11的菌剂的制备方法，包括一级种子液制备、二级种子液制备和发酵液制备步骤。所述枯草芽孢杆菌YX‑11为活性成分的制剂绿色环保无残留，不仅对香蕉枯萎病具有显著的防治作用，而且对植株生长具有促进作用。

Description

一种具有防治香蕉枯萎病功能的芽孢杆菌及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于芽孢杆菌微生物分离培养技术领域，具体涉及一种具有防治香蕉枯萎病功能的芽孢杆菌及其制备方法和应用。
背景技术
香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的一种维管束真菌性土传病害，会导致根和茎吸收传导养分受阻，生长不良、萎蔫、矮化，产量和品质受损，以致减产，严重的导致绝产，该病对世界香蕉产业造成严重危害和经济损失。目前香蕉枯萎病的发病面积正在逐步加大，由于常规药剂对香蕉枯萎病防治效果不理想，防治比较困难，目前尚无防治香蕉枯萎病的特效药剂，已成为香蕉产业发展的瓶颈，严重地制约了香蕉生产与发展。由于化学药剂和物理防控对于病害的防治效果较差，基于生物产业的快速发展，采用农用微生物菌剂进行枯萎病的防控，既能避免作物产生抗药性，又能实现绿色环保无残留，所以研制一株高效防香蕉枯萎病的功能菌株及其制成的防控产品对于香蕉产业的健康持续发展尤为重要。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种安全、环保、防治效果显著的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11；第二目的在于提供所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)YX-11的制备方法；第三目的在于提供所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)YX-11的菌剂；第四目的在于提供所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11菌剂的制备方法；第五目的在于提供枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11菌剂在防治香蕉枯萎病方面的应用。
本发明的第一目的是这样实现的：一种具有防治香蕉枯萎病功能的芽孢杆菌，所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)YX-11的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日为：2019年09月02日，保藏编号为：CGMCCNo.18456。
本发明的第二目的是这样实现的：一种具有防治香蕉枯萎病功能的芽孢杆菌YX-11的制备方法，包括以下步骤
1)培养材料准备：
选择采摘健康、无病害香蕉植株的香蕉叶片备用；
将LB固体培养基和PDA培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成LB培养基平板和PDA培养基平板；其中，LB培养基平板用于分离和保存内生细菌，PDA培养基平板用于培养香蕉枯萎病菌和对峙培养；
2)分离培养：
取香蕉叶片经酒精消毒后，用灭菌水冲洗3～5次，置于灭菌的研钵中研磨成汁，将研磨得到的汁液涂布于LB培养基平板上；随机挑取形态不同的菌落进行纯化培养并保存，将纯化培养所得的其中一株菌株命名为YX-11；
3)拮抗内生细菌筛选：
以香蕉枯萎病菌为指示菌，将挑选出的菌株YX-11采用PDA平板对峙培养法培养，在培养过程中观察菌株YX-11对香蕉枯萎病菌的抑菌作用，并测定其抑菌带宽度大小；
4)拮抗内生细菌YX-11的鉴定：
从16SrDNA序列相似性比对分析结果和***发育树可知，拮抗内生细菌YX-11与菌株Bacillus methylotrophicus(甲基营养型芽孢杆菌)、Bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)、Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)亲缘关系最近，同源性最高，相似度均达99％，根据***发育树相似性和同源性分析，菌株YX-11和Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)位于同一分支，两者进化关系和距离最近，相似度达100％，结合形态特征、培养特征和生理生化特征，鉴定此菌株为枯草芽孢杆菌。
本发明的第三目的是这样实现的：一种枯草芽孢杆菌YX-11的菌剂，该菌剂是以所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11经种子液一级制备、种子液二级制备和发酵得到。
本发明的第四目的是这样实现的：一种枯草芽孢杆菌YX-11菌剂的制备方法，具体步骤为
A一级种子液制备，选取经过活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11以5～10％的接种量接种到种子培养基上，培养10～15h得到菌种的得到一级种子液；
B二级种子液制备，按1～3％的接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基上，培养10～15h得到二级种子液；
C发酵液制备，按1～3％的接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基上，培养46～48h得到有效活菌数≧1×1010cfu/mL的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11的发酵液，即为具有防治香蕉枯萎病功能的枯草芽孢杆菌菌剂。
本发明的第五目的是这样实现的：所述的枯草芽孢杆菌YX-11菌剂在防治香蕉枯萎病方面的应用。
本发明的有益效果：本发明的枯草芽孢杆菌YX-11是一种有益微生物，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11为活性成分的制剂可应用于香蕉枯萎病防治，可作为微生物杀菌剂使用并具有以下优点：无毒、无污染、无残留、对人畜安全，具有很强的环境适应性和环境友好性；对真菌和细菌都具有强烈的抑制作用，不仅防香蕉枯萎病效果好，而且对植株生长具有促进作用；既能避免作物产生抗药性，又能实现绿色环保无残留；生产成本低，使用方法简单易行，有利于该制剂的工业化生产和应用普及。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的具有防治香蕉枯萎病功能的芽孢杆菌，所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日为：2019年09月02日，保藏编号为：CGMCC No.18456。
一种具有防治香蕉枯萎病功能的芽孢杆菌YX-11的制备方法，包括以下步骤
1)培养材料准备：
选择采摘健康、无病害香蕉植株的香蕉叶片备用；
将LB固体培养基和PDA培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成LB培养基平板和PDA培养基平板；其中，LB培养基平板用于分离和保存内生细菌，PDA培养基平板用于培养香蕉枯萎病菌和对峙培养；
2)分离培养：
取香蕉叶片经酒精消毒后，用灭菌水冲洗3～5次，置于灭菌的研钵中研磨成汁，将研磨得到的汁液涂布于LB培养基平板上；随机挑取形态不同的菌落进行纯化培养并保存，将纯化培养所得的其中一株菌株命名为YX-11；
3)拮抗内生细菌筛选：
以香蕉枯萎病菌为指示菌，将挑选出的菌株YX-11采用常规的PDA平板对峙培养法培养，在培养过程中观察菌株YX-11对香蕉枯萎病菌的抑菌作用，并测定其抑菌带宽度大小；
4)拮抗内生细菌YX-11的鉴定。
一种枯草芽孢杆菌YX-11的菌剂，该菌剂是以所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)YX-11经种子液一级制备、种子液二级制备和发酵得到。
一种枯草芽孢杆菌YX-11菌剂的制备方法，包括A一级种子液制备，B二级种子液制备，C发酵液制备，具体步骤为
A一级种子液制备，选取经过活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11以5～10％的接种量接种到种子培养基上，培养10～15h得到菌种的得到一级种子液；
B二级种子液制备，按1～3％的接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基上，培养10～15h得到二级种子液；
C发酵液制备，按1～3％的接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基上，培养46～48h得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11的发酵液，即为具有防治香蕉枯萎病功能的枯草芽孢杆菌菌剂。
所述的步骤A中，菌种在培养温度35～37℃、转速155～165rpm/min条件下，摇床培养10～15h，所述种子培养基为常规的液体LB培养基，pH值为7.0～8.0。
所述的步骤B中，一级种子液在35～38℃，转速100rpm/min，通气量为1.5×106mL/h，罐压保持在0.04～0.06MPa条件下培养10～15h。
所述的步骤C中，二级种子液在35～38℃，转速100rpm/min，通气量为1.5×106mL/h、罐压保持在0.04～0.06MPa条件下培养46～48h。
所述的步骤B中的二级种子培养基、步骤C的中发酵培养基均由以质量分数计的以下成分组成：黄豆粉1.4％，蔗糖3％，蛋白胨3％，玉米粉3％，鱼粉2％，氯化钠0.03％，硫酸镁0.05％，碳酸钙6％，磷酸二氢钾0.03％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸锰0.02％，余量为水，pH值为7.0～8.0。
所述的步骤C中制得的枯草芽孢杆菌菌剂的有效活菌数≧1×1010cfu/mL。
一种枯草芽孢杆菌YX-11菌剂在防治香蕉枯萎病方面的应用，将上述具有防治香蕉枯萎病功能的枯草芽孢杆菌菌剂稀释10倍、20倍或30倍液对大棚香蕉植株进行灌根(6000mL/株)+喷施处理，防治香蕉枯萎病病菌。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
本实施例提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11的制备方法。
1)培养材料准备：
选择采摘健康、无病害香蕉植株的香蕉叶片备用；
将常规的LB固体培养基和PDA培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成LB培养基平板和PDA培养基平板；其中，LB培养基平板用于分离和保存内生细菌，PDA培养基平板用于培养香蕉枯萎病菌和对峙培养；
2)分离培养：
取香蕉叶片经酒精消毒后，用灭菌水冲洗3～5次，置于灭菌的研钵中研磨成汁，将研磨得到的汁液涂布于LB培养基平板上；随机挑取形态不同的菌落进行常规的纯化培养并保存，将纯化培养所得的其中一株菌株命名为YX-11；
3)拮抗内生细菌筛选：
以香蕉枯萎病菌为指示菌，将挑选出的菌株YX-11采用常规的PDA平板对峙培养法培养，在培养过程中观察菌株YX-11对香蕉枯萎病菌的抑菌作用，并测定其抑菌带宽度大小；
4)拮抗内生细菌YX-11的鉴定：
经分子鉴定，拮抗内生细菌YX-11与菌株Bacillus methylotrophicus(甲基营养型芽孢杆菌)、Bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)、Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)亲缘关系最近，同源性最高，相似度均达99％，根据***发育树相似性和同源性分析，菌株YX-11和Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)位于同一分支，两者进化关系和距离最近，相似度达100％，结合形态特征、培养特征和生理生化特征，鉴定此菌株为枯草芽孢杆菌。
实施例2
本实施例提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11的菌剂的制备方法。
一种枯草芽孢杆菌YX-11菌剂的制备方法，具体步骤为：
A一级种子液制备，选取经过活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11以5％的接种量接种到pH值为7.0的种子培养基上，所述种子培养基为常规的液体LB培养基，并使菌种在培养温度35～37℃、转速155～165rpm/min条件下，摇床培养10～15h得到菌种的得到一级种子液；
B二级种子液制备，按1％的接种量，将一级种子液转接到种子罐内的pH值为7.0的二级种子培养基上，并使一级种子液在培养温度35～38℃、转速100rpm/min、通气量为1.5×106mL/h、罐压保持在0.04～0.06MPa条件下，培养10～15h得到二级种子液；
C发酵液制备，按1％的接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的pH值为7.0的发酵培养基上，并使二级种子液在培养温度35～38℃、转速100rpm/min、通气量为1.5×106mL/h、罐压保持在0.04～0.06MPa条件下，培养46～48h得到有效活菌数≧1×1010cfu/mL的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11的发酵液，即为具有防治香蕉枯萎病功能的枯草芽孢杆菌菌剂。
其中，步骤B中所述的二级种子培养基和步骤C所述的中发酵培养基均由以质量分数计的以下成分组成：黄豆粉1.4％，蔗糖3％，蛋白胨3％，玉米粉3％，鱼粉2％，氯化钠0.03％，硫酸镁0.05％，碳酸钙6％，磷酸二氢钾0.03％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸锰0.02％，余量为水，pH值为7.0。
实施例3
本实施例提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11的菌剂的制备方法。
一种枯草芽孢杆菌YX-11菌剂的制备方法，具体步骤为：
A一级种子液制备，选取经过活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11以7.5％的接种量接种到pH值为7.5的种子培养基上，所述种子培养基为常规的液体LB培养基，并使菌种在培养温度35～37℃、转速155～165rpm/min条件下，摇床培养10～15h得到菌种的得到一级种子液；
B二级种子液制备，按2％的接种量，将一级种子液转接到种子罐内的pH值为7.5的二级种子培养基上，并使一级种子液在培养温度35～38℃、转速100rpm/min、通气量为1.5×106mL/h、罐压保持在0.04～0.06MPa条件下，培养10～15h得到二级种子液；
C发酵液制备，按2％的接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的pH值为7.5的发酵培养基上，并使二级种子液在培养温度35～38℃、转速100rpm/min、通气量为1.5×106mL/h、罐压保持在0.04～0.06MPa条件下，培养46～48h得到有效活菌数≧1×1010cfu/mL的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11的发酵液，即为具有防治香蕉枯萎病功能的枯草芽孢杆菌菌剂。
其中，步骤B中所述的二级种子培养基和步骤C所述的中发酵培养基均由以质量分数计的以下成分组成：黄豆粉1.4％，蔗糖3％，蛋白胨3％，玉米粉3％，鱼粉2％，氯化钠0.03％，硫酸镁0.05％，碳酸钙6％，磷酸二氢钾0.03％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸锰0.02％，余量为水，pH值为7.5。
实施例4
本实施例提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11的菌剂的制备方法。
一种枯草芽孢杆菌YX-11菌剂的制备方法，具体步骤为：
A一级种子液制备，选取经过活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11以10％的接种量接种到pH值为8.0的种子培养基上，所述种子培养基为常规的液体LB培养基，并使菌种在培养温度35～37℃、转速155～165rpm/min条件下，摇床培养10～15h得到菌种的得到一级种子液；
B二级种子液制备，按3％的接种量，将一级种子液转接到种子罐内的pH值为8.0的二级种子培养基上，并使一级种子液在培养温度35～38℃、转速100rpm/min、通气量为1.5×106mL/h、罐压保持在0.04～0.06MPa条件下，培养10～15h得到二级种子液；
C发酵液制备，按3％的接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的pH值为8.0的发酵培养基上，并使二级种子液在培养温度35～38℃、转速100rpm/min、通气量为1.5×106mL/h、罐压保持在0.04～0.06MPa条件下，培养46～48h得到有效活菌数≧1×1010cfu/mL的枯草芽孢杆菌(Ba cillus subtilis)YX-11的发酵液，即为具有防治香蕉枯萎病功能的枯草芽孢杆菌菌剂。
其中，步骤B中所述的二级种子培养基和步骤C所述的中发酵培养基均由以质量分数计的以下成分组成：黄豆粉1.4％，蔗糖3％，蛋白胨3％，玉米粉3％，鱼粉2％，氯化钠0.03％，硫酸镁0.05％，碳酸钙6％，磷酸二氢钾0.03％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸锰0.02％，余量为水，pH值为8.0。
实施例5
本实施例提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11的菌剂在防治香蕉枯萎病方面的应用。
具体方式为：
田间试验在云南省昆明市安宁市微生物菌种与应用国家地方联合工程研究中心的试验大棚进行，采用伤根接种法接种香蕉枯萎病病原菌，接种浓度为107CFU/mL，接种量为50mL/株，以清水为对照。
试验分为处理组及对照组。将YX-11生物菌剂分别稀释10倍、20倍、30倍液对大棚香蕉植株进行灌根(6000mL/株)+喷施处理，以农药多菌灵(有效成分50％)1000倍液为阳性对照、清水为阴性对照，每隔7天喷施处理1次，连续喷施处理5次。每个处理3个重复小组，每个重复小组栽植12株香蕉植株(即每个处理下面分设3个同样种植条件的香蕉植株小组，每个小组栽植12株香蕉植株)。喷施各个处理6个月后调查发病率并计算防治效果，防治效果(％)＝[(对照发病率-处理发病率)对照发病率]×100，试验结果如表1所示。
叶部病害分级标准：
1级：没有出现条纹或者黄色叶片，植株表现健康；
2级：有轻微条纹或者底部叶片黄化；
3级：出现条纹或者底部叶片大部分黄化；
4级：出现大量条纹或者几乎全部叶片黄化；
5级：整株死亡。
Figure BDA0002328533020000101
从表1中的实验统计数据，我们可以看出用枯草芽孢杆菌YX-11发酵液原液及其10倍稀释发酵液处理的香蕉植株防效较好；枯草芽孢杆菌YX-11的40倍稀释发酵液与多菌灵处理的植株防效相似；而枯草芽孢杆菌YX-11的60倍稀释发酵液的防效只有16.17％，防效较差，故不建议施用。

Claims (10)

1.一种具有防治香蕉枯萎病功能的芽孢杆菌，其特征在于：所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日为：2019年09月02日，保藏编号为：CGMCC No.18456。
2.一种权利要求1所述的具有防治香蕉枯萎病功能的芽孢杆菌YX-11的制备方法，其特征在于：包括以下步骤
1)培养材料准备：
选择采摘健康、无病害香蕉植株的香蕉叶片备用；
将LB固体培养基和PDA培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成LB培养基平板和PDA培养基平板；其中，LB培养基平板用于分离和保存内生细菌，PDA培养基平板用于培养香蕉枯萎病菌和对峙培养；
2)分离培养：
取香蕉叶片经酒精消毒后，用灭菌水冲洗3～5次，置于灭菌的研钵中研磨成汁，将研磨得到的汁液涂布于LB培养基平板上；随机挑取形态不同的菌落进行纯化培养并保存，将纯化培养所得的其中一株菌株命名为YX-11；
3)拮抗内生细菌筛选：
以香蕉枯萎病菌为指示菌，将挑选出的菌株YX-11采用PDA平板对峙培养法培养，在培养过程中观察菌株YX-11对香蕉枯萎病菌的抑菌作用，并测定其抑菌带宽度大小；
4)拮抗内生细菌YX-11的鉴定。
3.一种权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YX-11的菌剂，其特征在于：是以所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11经种子液一级制备、种子液二级制备和发酵得到。
4.一种权利要求3所述的枯草芽孢杆菌YX-11菌剂的制备方法，包括A一级种子液制备，B二级种子液制备，C发酵液制备，其特征在于：具体步骤为
A一级种子液制备，选取经过活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11以5～10％的接种量接种到种子培养基上，培养10～15h得到菌种的得到一级种子液；
B二级种子液制备，按1～3％的接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基上，培养10～15h得到二级种子液；
C发酵液制备，按1～3％的接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基上，培养46～48h得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX-11的发酵液，即为具有防治香蕉枯萎病功能的枯草芽孢杆菌菌剂。
5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌YX-11菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤A中，菌种在培养温度35～37℃、转速155～165rpm/min条件下，摇床培养10～15h，所述种子培养基为常规的液体LB培养基，pH值为7.0～8.0。
6.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌YX-11菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤B中，一级种子液在35～38℃，转速100rpm/min，通气量为1.5×106mL/h，罐压保持在0.04～0.06MPa条件下培养10～15h。
7.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌YX-11菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤C中，二级种子液在35～38℃，转速100rpm/min，通气量为1.5×106mL/h、罐压保持在0.04～0.06MPa条件下培养46～48h。
8.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌YX-11菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤B中的二级种子培养基、步骤C的中发酵培养基均由以质量分数计的以下成分组成：黄豆粉1.4％，蔗糖3％，蛋白胨3％，玉米粉3％，鱼粉2％，氯化钠0.03％，硫酸镁0.05％，碳酸钙6％，磷酸二氢钾0.03％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸锰0.02％，余量为水，pH值为7.0～8.0。
9.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌YX-11菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤C中制得的枯草芽孢杆菌菌剂的有效活菌数≧1×1010cfu/mL。
10.一种权利要求4所述的枯草芽孢杆菌YX-11菌剂在防治香蕉枯萎病方面的应用。
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