CN109628345A - 一种防治多肉植物褐腐病复合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种防治多肉植物褐腐病复合菌剂及其制备方法和应用，复合菌剂由短小芽孢杆菌（Bacillus Pumilus）MES828的发酵产物、侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）MES818的发酵产物按体积比1‑4:1‑4充分混合，然后5000rpm‑10000rpm离心15min‑30min获得菌体，用无菌水将菌体重悬打散配置成而成。本发明制得的防治景天科多肉植物褐腐病复合菌剂可有效防治景天科多肉植物褐腐病，能促进景天科多肉植物对养分的吸收和利用，改善景天科多肉植物的形态，对增强景天科多肉植物的观赏价值有着重要的积极意义。

Description

一种防治多肉植物褐腐病复合菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种防治多肉植物褐腐病复合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
多肉植物，又名肉质植物或多浆植物。因其色彩丰富，体态丰盈，纹理多样、适应性较强等特点，而深受大众消费者的喜爱。随着经济的发展和社会的进步，人们的消费观念发生较大的变化，越来越多的人们开始追求高品质的生活，促使景天科多肉植物的销量激增，随着景天科多肉植物面积不断扩大，景天科多肉植物褐腐病发病率连年上升，且日益突出，已经严重影响到种植户的收入，对整个产业造成严重的影响。因此控制景天科多肉植物危害已成为生产上亟待解决的问题。
褐腐病系真菌病害之一。褐腐病的适应能力和生存能力都非常的强，既可以从活体的植物组织中摄取营养，也可以在死亡的残体中生存。褐腐病的致病能力超强，一旦条件合适即可侵入景天科多景天科多肉植物器官就会迅速繁殖。叶片感病，初呈黄色或黄褐色小点，逐渐扩大为圆形或椭圆形病斑，红褐色；花瓣受害，初呈水渍状褐色斑点，逐渐扩展，整个花瓣变枯，枯萎下垂；球茎受害，外表产生不规则黑斑。潮湿条件下，感病茎叶上产生一层灰色霉层；在叶鞘内，球茎表面或土壤中产生黑色菌核。目前景天科多肉植物无抗褐腐病的品种，生产上控制褐腐病仍以化学防治为主。化学防治导致病原菌抗药性，很难从根源上有效防止病害的再次发生，且对环境污染较大，危害生态平衡，而采用微生物防治植物病害是最有效的生防手段之一，但关于生防菌剂对于景天科多肉植物褐腐病方面的研究尚无相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是防治多肉植物褐腐病复合菌剂及其制备方法和应用。本发明制得的防治多肉植物褐腐病复合菌剂可有效防治景天科多肉植物褐腐病，能促进景天科多肉植物对养分的吸收和利用，改善景天科多肉植物的形态，对增强景天科多肉植物的观赏价值有着重要的积极意义。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供的一种防治多肉植物褐腐病复合菌剂的制备方法，所述复合菌剂由短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)MES828的发酵产物、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus) MES818的发酵产物按体积比1-4:1-4充分混合，然后5000rpm-10000rpm离心15min-30min 获得菌体，用无菌水将菌体重悬打散配置成而成，使复合菌剂产品中活菌总数在2.5×109～ 2.0×1010范围内。
所述短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)MES828发酵产物和侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)MES818发酵产物均采用液体高密度发酵技术制备；其中短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)MES828发酵产物中的活菌数不少于2.5×109cFu/g，侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)MES818发酵产物中的活菌数不少于 2.5×109cFu/g。
一种防治景天科多肉植物褐腐的菌株，该菌株为短小芽孢杆菌(BacillusPumilus) MES828，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年12月03日，保藏编号为CGMCCNo.16858。
所述侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)MES818，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年12 月03日，保藏编号为CGMCCNo.16859。
所述的短小芽孢杆菌菌体呈现细杆状，革兰氏阳性，大小为0.6～0.7μm×2.0～3.0μm，芽孢椭圆形，中生或近中生，芽孢囊不明显膨大，在营养琼脂培养基上，菌落为圆形，淡黄色，不透明，扁平，表面湿润，边缘整齐。阳性反应：接触酶；氧化酶；V-P测定；明胶液化；柠檬酸盐利用。阴性反应：丙酸盐利用；淀粉水解；硝酸盐还原；明胶液化；厌氧生长。采用特异引物进行多重PCR扩增，该菌株产生唯一的扩增产物，条带大小与短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)相同。
所述的侧孢短芽孢杆菌菌体呈现细杆状，革兰氏阳性，大小为1.0～1.2μm×2.5～3.0μm，有独舟状侧孢，椭圆形，孢囊膨大，在营养琼脂培养基上，菌落为圆形，较小，灰白色，边缘整齐，表面湿润光滑，半透明。阳性反应：接触酶；氧化酶；明胶液化；硝酸盐还原；厌氧生长。阴性反应：V-P测定；柠檬酸盐利用；淀粉水解。采用特异引物进行多重 PCR扩增，该菌株产生唯一的扩增产物，条带大小与侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)相同。
优选的，所述短小芽孢杆菌的高密度发酵方法为，包括以下步骤：
(1)菌种的制备；将分离获得的短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)MES828转接至茄瓶培养基，于35℃～37℃，培养48h～72h，得到活化菌株，将30ml保护剂(2.0％葡萄糖溶液+3.5％脱脂奶粉溶液+20％甘油溶液)加到茄瓶中，用无菌刮铲刮下，经研磨器研磨均匀后，保存至-80℃冰箱，备用；
(2)种子液的制备：吸取-80℃保存的菌种，按照5％～15％接种量接入300mL液体培养基中，于35℃～37℃，220r/min培养72h，得到种子液；
(3)种子罐发酵：将上述制备的种子液以5％～15％的接种量接入50L种子罐进行发酵，种子罐装料系数45％～55％，发酵温度35℃～37℃，转速220rpm～250rpm，罐压保持在 0.05Mpa～0.08Mpa之间，通风比是1:0.5～1，种子培养基初始pH值6.5～7.0，发酵周期24h～ 36h，发酵过程中流加5M～10M NaOH，使发酵液pH值控制在6.5～7.0；
(4)发酵罐发酵：待种子罐发酵结束后，按照5％～15％的接种量移种至5000L发酵罐进行深层液体发酵，发酵罐装料系数45％～55％，发酵温度35℃～37℃，转速220rpm～250rpm，罐压保持在0.05Mpa～0.08Mpa之间，通风比是1:0.5～1，发酵培养基初始pH值6.5～7.0，待发酵24h～36h时，以补料方式流加外源营养物(0.5％～1％葡萄糖和1％～4％大豆多肽的混合液)，在继续发酵10h～12h，待发酵结束后即可获得短小芽孢杆菌MES828液体发酵产物。
优选的，所述侧孢短芽孢杆菌的高密度发酵方法为，包括以下步骤：
(1)菌种的制备；将分离获得的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)MES818 转接至茄瓶培养基，于35℃～37℃，培养48h～72h，得到活化菌株，将30ml保护剂(2.0％葡萄糖溶液+3.5％脱脂奶粉溶液+20％甘油溶液)加到茄瓶中，用无菌刮铲刮下，研磨器研磨均匀后，保存至-80℃冰箱，备用；
(2)种子液的制备：吸取-80℃保存的菌种，按照5％～15％接种量接入300mL液体培养基中，于35℃～37℃，220r/min培养72h，得到种子液；
(3)种子罐发酵：将上述制备的种子液以5％～15％的接种量接入50L种子罐进行发酵，种子罐装料系数45％～55％，发酵温度35℃～37℃，转速220rpm～250rpm，罐压保持在 0.05Mpa～0.08Mpa之间，通风比是1:0.5～1，种子培养基初始pH值6.5～7.0，发酵周期24h～ 36h，发酵过程中流加5M～10M NaOH，使发酵液pH值控制在6.5～7.0；
(4)发酵罐发酵：待种子罐发酵结束后，按照5％～15％的接种量移种至5000L发酵罐进行液体发酵，发酵罐装料系数45％～55％，发酵温度35℃～37℃，转速220rpm～250rpm，罐压保持在0.05Mpa～0.08Mpa之间，通风比是1:0.5～1，发酵培养基初始pH值6.5～7.0，待发酵24h～36h时，以补料方式流加外源营养物(0.5％～1％葡萄糖和1％～4％大豆多肽的混合液)，在继续发酵10h～12h，待发酵结束后即可获得侧孢短芽孢杆菌MES818液体发酵产物。
优选的，所述短小芽孢杆菌MES828培养时的茄瓶培养基，具体为，按质量分数计：胰蛋白胨0.5～2％，牛肉膏0.5％～2％，氯化钠0.2％～1％，琼脂1.5％～2％，余量为去离子水，pH 控制在7.0～7.3，121℃灭菌30min；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的种子液培养基，具体为，按质量分数计：鱼蛋白胨0.5％～2％，大豆蛋白胨0.5％～2％，酵母粉0.5％～2％，NaCl 0.2％～1％，自然pH值，121℃灭菌30min；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的种子罐培养基，具体为，按质量分数计：糖蜜2％～ 4％，黄豆粉0.5％～3％，酶解的花生粕粉0.5％～2％，酵母膏0.5％～1％，氯化钠0.2％～2％、硫酸镁0.5‰～2‰，柠檬酸0.2％～2％，KH2PO4 0.05％～0.10％，余量为去离子水，pH控制在7.0～ 7.3，121℃灭菌30min；
所述酶解的花生粕粉是采用风味蛋白酶与中性蛋白酶按照1:3～3:1复配，加酶量0.5％～ 1％(E/S，以底物质量计)，酶解温度40℃～55℃，酶解时间4h～6h，经真空抽滤，80℃烘干后获得；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的发酵罐液培养基，具体为，按质量分数计：白糖1％～ 3％，糖蜜1％～3％，花生饼粉0.5％～2％，酵母膏0.5％～1％，氯化钠0.2％～2％，硫酸镁0.5‰～ 2‰，柠檬酸0.2％～2％，KH2PO4 0.05～0.1％，中性蛋白酶0.5‰～2‰，风味蛋白酶0.5‰～2‰，泡敌0.2‰～1.5‰，余量为去离子水，培养基pH6.0～7.0，121℃灭菌30min。
优选的，所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的茄瓶培养基，具体为，按质量分数计：胰蛋白胨0.5％～2％，牛肉膏0.5％～2％，氯化钠0.2％～1％，琼脂1.5％～2％，余量为去离子水， pH控制在7.0～7.3，121℃灭菌30min；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的种子液培养基，具体为，按质量分数计：鱼蛋白胨 0.5％～2％，大豆蛋白胨0.5％～2％，酵母粉0.5％～2％，NaCl 0.2％～1％，自然pH值，121℃灭菌30min；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的种子罐培养基，具体为，按质量分数计：酵母浸粉 0.5％～2％，糖蜜1％～3％，酶解的花生粕粉1％～4％，磷酸二氢钾0.5％～1％，硫酸镁0.03％～0.05％，碳酸钙0.03％～0.05％，氯化钠0.5％～1％，余量为去离子水，pH自然，121℃灭菌30min；
所述酶解的花生粕粉是采用风味蛋白酶与中性蛋白酶按照1:3～3:1复配，加酶量0.5％～ 1％(E/S，以底物质量计)，酶解温度40℃～55℃，酶解时间4h～6h，经真空抽滤，80℃烘干后获得；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的发酵罐液培养基，具体为，按质量分数计：葡萄糖 2％～4％，糖蜜1％～3％，酵母浸粉1％～3％，花生粕2％～4％，氯化钠1％～3％，硫酸镁1％～2％，中性蛋白酶0.5‰～2‰，风味蛋白酶0.5‰～2‰，柠檬酸钠0.5％～3％，泡敌0.2‰～1.5‰，余量为去离子水，培养基pH6.0～7.0，121℃灭菌30min。
本发明还提供了一种防治多肉植物褐腐病复合菌剂的应用，特征在于，将复合菌剂按 1:1000～1:500水稀释，然后采用叶面喷施方式施用到多肉植物叶片或采用根灌方式施用到多肉植物根部。
有益效果
本发明的防治景天科多肉褐腐病的复合菌剂，效果试验表明，对景天科多肉植物褐腐病原菌防治效率达84％以上。
本发明的防治景天科多肉褐腐病的复合菌剂，能促进景天科多肉植物对养分的吸收和利用，改善景天科多肉植物的形态，对增强景天科多肉植物的观赏价值有着重要的积极意义。
本发明的防治景天科多肉褐腐病的复合菌剂，活菌数高达25亿/mL以上，微生物活力稳定，pH在4.0～7.5之间。
本发明的防治景天科多肉植物褐腐病的复合菌剂，采用多菌种复合而成，能维持景天科多肉植物根部微生物区系平衡，改善根际微生物菌群结构。
本发明的防治景天科多肉植物褐腐病的复合菌剂，在菌种发酵过程中，种子罐培养基采用酶解的花生粕粉作为原料之一，这是因为酶解的花生粕粉富含大量的可溶性蛋白和小分子多肽类等物质，有利于菌种的快速利用，从而缩短生长周期。
本发明的防治景天科多肉植物褐腐病的复合菌剂，与单一短小芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌菌种相比，复合菌剂的拮抗作用较强，复合的两株菌相互协同，能够在景天科多肉植物的根际、根表和体内定植、繁殖和转移，对景天科多肉植物褐腐病有较强的拮抗效果，该产品在褐腐病的防治上具有较大应用潜力。
附图说明
图1为MES828短小芽孢杆菌的菌落和菌体照片；
图2为MES818侧孢短芽孢杆菌的菌落和菌体照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种防治景天科多肉植物褐腐的菌株，包括短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)，该菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)MES828，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年12月03日，保藏编号为 CGMCCNo.16858。该菌体的菌落和菌体照片如图1所示。
还包括侧孢短芽孢杆菌，该菌株为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus) MES818，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年12月03日，保藏编号为CGMCCNo.16859。该菌体的菌落和菌体照片如图2所示。
本发明制得的短小芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌对景天科多肉植物褐腐病的拮抗效果试验：
供试景天科多肉植物褐腐病病原菌采自武清区陈咀镇梅石公路庞庄大棚基地伟益农庄。
景天科多肉植物褐腐病病原菌的制备：
用无菌的镊子夹取发病多肉叶片，将约5mm多肉叶片侵入75％酒精中处理2～3秒，转移到3％次氯酸钠溶液中处理3～5min，放入无菌水换洗3次，每次2～3min，然后用无菌滤纸吸干表面水分，最后将叶片组织放入PDA培养基平板上，28℃培养3～5天，待长出菌丝或孢子后，挑取少许菌苔划线，将其转移到PDA斜面培养基培养，28℃培养3～6天后，备用。
致病性考察：
将以长好的病原菌斜面试管，加入15ml无菌水，刮取菌苔制成菌悬液，取生长健康的景天科多肉植物，用接种针轻轻划开景天科多肉植物叶片，将病原菌接入，以接入无菌水为对照组。温室内常规管理，每个处理接种5株多肉植株，每个处理均重复5次，观察发病情况。结果表明，分离菌接入健康的景天科多肉植物叶片后引发的病害症状与病害景天科多肉植株症状相似，均出现褐色软腐，培养后期造成整片叶片腐烂，致病力测定表现为较强，经农业部菌种检测机构鉴定鉴定为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)，其编号为KHSWBYJ-012。
功能检测
短小芽孢杆菌MES828、侧孢短芽孢杆菌MES818的平板对峙试验：
用接种环挑取分离纯化的景天科多肉植物褐腐病菌苔，然后将景天科多肉植物褐腐病菌苔涂抹于无菌的营养琼脂平板中央，分别将培养至对数期的短小芽孢杆菌MES828、侧孢短芽孢杆菌MES818，点接在距指示菌菌片2.0cm处，设空白对照。30℃培养，4天后发现2种芽孢杆菌均能够显著抑制病原菌生长，出现较宽的抑菌带。30℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量景天科多肉植株褐腐病原菌的对照组生长量(菌落半径)和实验组生长量(接种MES828、MES818后的抑制生长半径)，以拮抗作用抑菌率(抑菌率＝(对照组生长量-实验组生长量)/对照组生长量×100％)表示抑制效果，具体如下表1所示。
表1短小芽孢杆菌MES828、侧孢短芽孢杆菌MES818对景天科多肉植物褐腐病的拮抗试验结果。
实验结果表明：表1的结果表明短小芽孢杆菌MES828对景天科多肉植物褐腐病的抑制率达85.7％，透明的抑菌带宽10.3mm；侧孢短芽孢杆菌MES818对景天科多肉植物褐腐病的抑制率达85.4％，透明的抑菌带宽10.0mm。说明短小芽孢杆菌MES828、侧孢短芽孢杆菌MES818 对景天科多肉植物褐腐病具有明显的抑制作用，具有防治景天科多肉植物褐腐病的生防潜力。
实施例2
本发明还提供了一种防治景天科多肉植物褐腐病复合菌剂，复合菌剂由短小芽孢杆菌 (Bacillus Pumilus)MES828的发酵产物、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus) MES818的发酵产物按体积比1:4充分混合，然后5000rpm离心30min获得菌体，用无菌水将菌体重悬打散配置成而成，使复合菌剂产品中活菌总数在2.5×109～1.0×1010范围内。
所述短小芽孢杆菌MES828发酵产物和侧孢短芽孢杆菌MES818发酵产物均采用液体高密度发酵技术制备，其中短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)MES828发酵产物中的活菌数不少于2.5×109cFu/g；所述侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)MES818发酵产物中的活菌数不少于2.5×109cFu/g。
优选的，所述短小芽孢杆菌的高密度发酵方法为，包括以下步骤：
(1)菌种的制备；将分离获得的短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)MES828转接至茄瓶培养，于37℃，培养72h，得到活化菌株，将30ml保护剂(2.0％葡萄糖溶液+3.5％脱脂奶粉溶液+20％甘油溶液)加到茄瓶中，用无菌刮铲刮下，经研磨器研磨均匀后，保存至-80℃冰箱，备用；
(2)种子液的制备：吸取-80℃保存的菌种，按5％的接种量接入300mL液体培养基中，于37℃，220r/min培养72h，得到种子液；
(3)种子罐发酵：将上述制备的种子液以10％接种量接入50L种子罐进行发酵，种子罐装料系数45％，发酵温度37℃，转速220rpm，罐压保持在0.05Mpa之间，通风比是1:1，种子培养基初始pH值7.0，发酵周期36h，发酵过程中流加5M NaOH，使发酵液pH值控制在6.8；
(4)发酵罐发酵：待种子罐发酵结束后，按照15％的接种量移种至5000L发酵罐进行深层液体发酵，发酵罐装料系数50％，发酵温度37℃，转速250rpm，罐压保持在0.05Mpa之间，通风比是1:0.5，发酵培养基初始pH值7.0，待发酵24h，以补料方式流加外源营养物(0.5％葡萄糖和1％大豆多肽混合液)，在继续发酵12h，待发酵结束后即可获得短小芽孢杆菌MES828 液体发酵产物。
优选的，所述侧孢短芽孢杆菌的高密度发酵方法为，包括以下步骤：
(1)菌种的制备；将分离获得的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)MES818 菌株转接至茄瓶培养基，于35℃，培养72h，得到活化菌株，将30ml保护剂(2.0％葡萄糖溶液+3.5％脱脂奶粉溶液+20％甘油溶液)加到茄瓶中，用无菌刮铲刮下，研磨器研磨均匀后，保存至-80℃冰箱，备用；
(2)种子液的制备：吸取-80℃保存的菌种，按10％的接种量接入300mL液体培养基中，于35℃，220r/min培养72h，得到种子液；
(3)种子罐发酵：将上述制备的种子液以15％的接种量接入50L种子罐进行发酵，种子罐装料系数50％，发酵温度35℃，转速220rpm，罐压保持在0.05Mpa之间，通风比是1:0.5～ 1，种子培养基初始pH值7.0，发酵周期36h，发酵过程中流加5M NaOH，使发酵液pH值控制在6.8；
(4)发酵罐发酵：待种子罐发酵结束后，按照15％的接种量移种至5000L发酵罐进行液体发酵，发酵罐装料系数55％，发酵温度35℃，转速250rpm，罐压保持在0.05Mpa之间，通风比是1:1，发酵培养基初始pH值7.0，待发酵36h，以补料方式流加外源营养物(1％葡萄糖溶液和1％大豆多肽混合液)，在继续发酵10h，待发酵结束后即可获得侧孢短芽孢杆菌MES818液体发酵产物。
优选的，所述短小芽孢杆菌MES828培养时的茄瓶培养基，具体为，按质量分数计：胰蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，琼脂2％，余量为去离子水，pH控制在7.0，121℃灭菌 30min；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的种子液培养基，具体为，按质量分数计：鱼蛋白胨2％，大豆蛋白胨0.5％，酵母粉1％，NaCl 0.5％，自然pH值，121℃灭菌30min；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的种子罐培养基，具体为，按质量分数计：糖蜜3％，黄豆粉0.5％，酶解的花生粕粉2％，酵母膏1％，氯化钠0.3％，硫酸镁2‰，柠檬酸0.5％，KH2PO4 0.10％，余量为去离子水，pH控制在7.0，121℃灭菌30min；
所述酶解的花生粕粉是采用风味蛋白酶与中性蛋白酶按照1:3复配，加酶量1％(E/S，以底物质量计)，酶解温度40℃，酶解时间6h，经真空抽滤，80℃烘干后获得；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的发酵罐液培养基，具体为，按质量分数计：白糖2％，糖蜜2％，花生饼粉2％，酵母膏0.5％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.5‰,，柠檬酸0.5％，KH2PO4 0.1％，中性蛋白酶2‰，风味蛋白酶2‰，泡敌0.5‰，余量为去离子水，培养基pH7.0，121℃灭菌 30min。
优选的，所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的茄瓶培养基，具体为，按质量分数计：胰蛋白胨1％，牛肉膏1％，氯化钠0.5％，琼脂2％，余量为去离子水，pH控制在7.0，121℃灭菌 30min；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的种子液培养基，具体为，按质量分数计：鱼蛋白胨 2％，大豆蛋白胨0.5％，酵母粉1％，NaCl 0.5％，自然pH值，121℃灭菌30min；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的种子罐培养基，具体为，按质量分数计：酵母浸粉 1％，糖蜜2％，酶解的花生粕粉4％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸镁0.05％，碳酸钙0.05％，氯化钠 0.5％，余量为去离子水，pH自然，121℃灭菌30min；
所述酶解的花生粕粉是采用风味蛋白酶与中性蛋白酶按照1:1复配，加酶量1％(E/S，以底物质量计)，酶解温度50℃，酶解时间4h，经真空抽滤，80℃烘干后获得；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的发酵罐液培养基，具体为，按质量分数计：葡萄糖 3％，糖蜜2％，酵母浸粉1％，花生粕4％，氯化钠1％，硫酸镁1％，中性蛋白酶2‰，风味蛋白酶2‰，柠檬酸钠1％，泡敌0.5‰，余量为去离子水，培养基pH7.0，121℃灭菌30min。
实施例3
本发明还提供了一种防治景天科多肉植物褐腐病复合菌剂，复合菌剂由短小芽孢杆菌 (Bacillus Pumilus)MES828的发酵产物、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus) MES818的发酵产物按体积比3:2充分混合，然后8000rpm离心20min获得菌体，用无菌水将菌体重悬打散配置成而成，使复合菌剂产品中活菌总数在2.5×109～2.0×1010范围内。
所述短小芽孢杆菌MES828液体发酵产物和侧孢短芽孢杆菌MES818发酵产物均采用液体高密度发酵技术制备，其中短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)MES828发酵产物中的活菌数不少于2.5×109cFu/g；所述侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)MES818发酵产物中的活菌数不少于2.5×109cFu/g。
优选的，所述短小芽孢杆菌的高密度发酵方法为，包括以下步骤：
(1)菌种的制备；将分离获得的短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)MES828转接至茄瓶培养基，于35℃，培养48h，得到活化菌株，将30ml保护剂(2.0％葡萄糖溶液+3.5％脱脂奶粉溶液+20％甘油溶液)加到茄瓶中，用无菌刮铲刮下，经研磨器研磨均匀后，保存至-80℃冰箱，备用；
(2)种子液的制备：吸取-80℃保存的菌种，按15％的接种量接入300mL液体培养基中，于35℃，220r/min培养72h，得到种子液；
(3)种子罐发酵：将上述制备的种子液以15％的接种量接入50L种子罐进行发酵，种子罐装料系数55％，发酵温度35℃，转速220rpm，罐压保持在0.08Mpa之间，通风比是1:0.5～1，种子培养基初始pH值6.8，发酵周期24h，发酵过程中流加5M NaOH，使发酵液pH值控制在7.0；
(4)发酵罐发酵：待种子罐发酵结束后，按照10％的接种量移种至5000L发酵罐进行深层液体发酵，发酵罐装料系数45％，发酵温度35℃，转速220rpm，罐压保持在0.08Mpa之间，通风比是1:0.5～1，种子培养基初始pH值6.8，待发酵36h，以补料方式流加培养基(1％葡萄糖和3％大豆多肽混合液)，在继续发酵10h，待发酵结束后即可获得短小芽孢杆菌MES828 液体发酵产物。
优选的，所述侧孢短芽孢杆菌的高密度发酵方法为，包括以下步骤：
(1)菌种的制备；将分离获得的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)MES818 菌株转接至茄瓶培养基，于37℃，培养48h，得到活化菌株，将30ml保护剂(2.0％葡萄糖溶液+3.5％脱脂奶粉溶液+20％甘油溶液)加到茄瓶中，用无菌刮铲刮下，研磨器研磨均匀后，保存至-80℃冰箱，备用；
(2)种子液的制备：吸取-80℃保存的菌种，按8％的接种量接入300mL液体培养基中，于36℃，220r/min培养72h，得到种子液；
(3)种子罐发酵：将上述制备的种子液以5％的接种量接入50L种子罐进行发酵，种子罐装料系数45％，发酵温度37℃，转速250rpm，罐压保持在0.08Mpa之间，通风比是1:0.5～ 1，种子培养基初始pH值6.5，发酵周期24h，发酵过程中流加10M NaOH，使发酵液pH值控制在7.0；
(4)发酵罐发酵：待种子罐发酵结束后，按照10％的接种量移种至5000L发酵罐进行液体发酵，发酵罐装料系数45％，发酵温度37℃，转速230rpm，罐压保持在0.05Mpa之间，通风比是1:0.5～1，发酵培养基初始pH值6.5，待发酵24h，以补料方式流加培养基(0.5％葡萄糖和1％大豆多肽混合液)，在继续发酵12h，待发酵结束后即可获得侧孢短芽孢杆菌MES818 液体发酵产物。
优选的，所述短小芽孢杆菌MES828培养时的茄瓶培养基，具体为，按质量分数计：胰蛋白胨2％，牛肉膏2％，氯化钠1％，琼脂1.5％，余量为去离子水，pH控制在7.3，121℃灭菌 30min；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的种子液培养基，具体为，按质量分数计：鱼蛋白胨 0.5％，大豆蛋白胨2％，酵母粉2％，NaCl 0.5％，自然pH值，121℃灭菌30min；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的种子罐培养基，具体为，按质量分数计：糖蜜2％，黄豆粉3％，酶解的花生粕粉1％，酵母膏0.5％，氯化钠0.2％，硫酸镁1‰，柠檬酸0.2％，KH2PO4 0.05％，余量为去离子水，pH控制在7.3，121℃灭菌30min；
所述酶解的花生粕粉是采用风味蛋白酶与中性蛋白酶按照1:1复配，加酶量0.5％(E/S，以底物质量计)，酶解温度50℃，酶解时间4h，经真空抽滤，80℃烘干后获得；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的发酵罐液培养基，具体为，按质量分数计：白糖1％，糖蜜3％，花生饼粉1％，酵母膏1％，氯化钠2％，硫酸镁1‰，柠檬酸0.2％，KH2PO40.05％，中性蛋白酶1‰，风味蛋白酶2‰，泡敌1.5‰，余量为去离子水，培养基pH6.5，121℃灭菌 30min。
优选的，所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的茄瓶培养基，具体为，按质量分数计：胰蛋白胨2％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.2％，琼脂1.5％，余量为去离子水，pH控制在7.3，121℃灭菌30min；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的种子液培养基，具体为，按质量分数计：鱼蛋白胨 0.5％，大豆蛋白胨2％，酵母粉0.5％，NaCl 1％，自然pH值，121℃灭菌30min；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的种子罐培养基，具体为，按质量分数计：酵母浸粉 2％，糖蜜3％，酶解的花生粕粉2％，磷酸二氢钾1％，硫酸镁0.03％，碳酸钙0.03％，氯化钠1％，余量为去离子水，pH自然，121℃灭菌30min；
所述酶解的花生粕粉是采用风味蛋白酶与中性蛋白酶按照1:3复配，加酶量0.5％(E/S，以底物质量计)，酶解温度55℃，酶解时间4h，经真空抽滤，80℃烘干后获得；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的发酵罐液培养基，具体为，按质量分数计：葡萄糖 2％，糖蜜1％，酵母浸粉3％，花生粕2％，氯化钠3％，硫酸镁2％，中性蛋白酶2‰，风味蛋白酶0.5‰，柠檬酸钠0.5％，泡敌1.5‰，余量为去离子水，培养基pH6.8，121℃灭菌30min。
实施例4
本发明还提供了一种防治景天科多肉植物褐腐病复合菌剂，复合菌剂由短小芽孢杆菌 (Bacillus Pumilus)MES828的发酵产物、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus) MES818的发酵产物按体积比4:1充分混合，然后10000rpm离心15min获得菌体，用无菌水重悬打散配置成而成，使复合菌剂产品中活菌总数在2.5×109～2.0×1010范围内。
所述短小芽孢杆菌MES828发酵产物和侧孢短芽孢杆菌MES818发酵产物均采用液体高密度发酵技术制备，其中短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)MES828发酵产物中的活菌数不少于2.5×109cFu/g；所述侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)MES818发酵产物中的活菌数不少于2.5×109cFu/g。
优选的，所述短小芽孢杆菌的高密度发酵方法为，包括以下步骤：
(1)菌种的制备；将分离获得的短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)MES828转接至茄瓶培养，于36℃，培养60h，得到活化菌株，将30ml保护剂(2.0％葡萄糖溶液+3.5％脱脂奶粉溶液+20％甘油溶液)加到茄瓶中，用无菌刮铲刮下，经研磨器研磨均匀后，保存至-80℃冰箱，备用；
(2)种子液的制备：吸取-80℃保存的菌种，按10％的接种量接入300mL液体培养基中，于36℃，220r/min培养72h，得到种子液；
(3)种子罐发酵：将上述制备的种子液以5％的接种量接入50L种子罐进行发酵，种子罐装料系数50％，发酵温度36℃，转速230rpm，罐压保持在0.07Mpa之间，通风比是1:0.5～ 1，种子培养基初始pH值6.5，发酵周期30h，发酵过程中流加5M NaOH，使发酵液pH值控制在6.5；
(4)发酵罐发酵：待种子罐发酵结束后，按照5％的接种量移种至5000L发酵罐进行深层液体发酵，发酵罐装料系数55％，发酵温度36℃，转速230rpm，罐压保持在0.07Mpa之间，通风比是1:0.5～1，发酵培养基初始pH值6.5，待发酵30h，以补料方式流加外源营养物(0.8％葡萄糖和2％大豆多肽混合液)，在继续发酵11h，待发酵结束后即可获得短小芽孢杆菌MES828 液体发酵产物。
优选的，所述侧孢短芽孢杆菌的高密度发酵方法为，包括以下步骤：
(1)菌种的制备；将分离获得的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)MES818 转接至茄瓶培养基，于36℃，培养63h，得到活化菌株，将30ml保护剂(2.0％葡萄糖溶液+3.5％脱脂奶粉溶液+20％甘油溶液)加到茄瓶中，用无菌刮铲刮下，研磨器研磨均匀后，保存至-80℃冰箱，备用；
(2)种子液的制备：吸取-80℃保存的菌种，按15％的接种量接入300mL液体培养基中，于36℃，220r/min培养72h，得到种子液；
(3)种子罐发酵：将上述制备的种子液以10％的接种量接入50L种子罐进行发酵，种子罐装料系数55％，发酵温度36℃，转速240rpm，罐压保持在0.07Mpa之间，通风比是1:0.5～1，种子培养基初始pH值6.8，发酵周期33h，发酵过程中流加5M NaOH，使发酵液pH值控制在6.5；
(4)发酵罐发酵：待种子罐发酵结束后，按照5％的接种量移种至5000L发酵罐进行液体发酵，发酵罐装料系数50％，发酵温度36℃，转速220rpm，罐压保持在0.08Mpa之间，通风比是1:0.5～1，发酵培养基初始pH值6.8，待发酵30h时，以补料方式流加外源营养物(0.8％葡萄糖和4％大豆多肽混合液)，在继续发酵11h，待发酵结束后即可获得侧孢短芽孢杆菌 MES818液体发酵产物。
优选的，所述短小芽孢杆菌MES828培养时的茄瓶培养基，具体为，按质量分数计：胰蛋白胨0.5％，牛肉膏1％，氯化钠0.2％，琼脂1.7％，余量为去离子水，pH控制在7.2，121℃灭菌30min；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的种子液培养基，具体为，按质量分数计：鱼蛋白胨 1％，大豆蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 2％，自然pH值，121℃灭菌30min；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的种子罐培养基，具体为，按质量分数计：糖蜜4％，黄豆粉2％，酶解的花生粕粉0.5％，酵母膏0.8％，氯化钠2％，硫酸镁0.5‰，柠檬酸2％，KH2PO4 0.08％，余量为去离子水，pH控制在7.2，121℃灭菌30min；
所述酶解的花生粕粉是采用风味蛋白酶与中性蛋白酶按照3:1复配，加酶量0.8％(E/S，以底物质量计)，酶解温度55℃，酶解时间6h，经真空抽滤，80℃烘干后获得；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的发酵罐液培养基，具体为，按质量分数计：白糖3％，糖蜜1％，花生饼粉0.5％，酵母膏0.8％，氯化钠0.2％，硫酸镁2‰，柠檬酸2％，KH2PO40.08％，中性蛋白酶0.5‰，风味蛋白酶0.5‰，泡敌0.2‰，余量为去离子水，培养基pH6.0，121℃灭菌30min。
优选的，所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的茄瓶培养基，具体为，按质量分数计：胰蛋白胨0.5％，牛肉膏2％，氯化钠1％，琼脂1.7％，余量为去离子水，pH控制在7.2，121℃灭菌30min；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的种子液培养基，具体为，按质量分数计：鱼蛋白胨 1％，大豆蛋白胨1％，酵母粉2％，NaCl 0.2％，自然pH值，121℃灭菌30min；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的种子罐培养基，具体为，按质量分数计：酵母浸粉 0.5％，糖蜜1％，酶解的花生粕粉1％，磷酸二氢钾0.7％，硫酸镁0.05％，碳酸钙0.05％，氯化钠1％，余量为去离子水，pH自然，121℃灭菌30min；
所述酶解的花生粕粉是采用风味蛋白酶与中性蛋白酶按照3:1复配，加酶量1％(E/S，以底物质量计)，酶解温度55℃，酶解时间4h，经真空抽滤，80℃烘干后获得；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818的发酵罐液培养基为：葡萄糖4％，糖蜜3％，酵母浸粉1％，花生粕4％，氯化钠2％，硫酸镁1％，中性蛋白酶0.5‰，风味蛋白酶2‰，柠檬酸钠3％，泡敌 0.2‰，余量为去离子水，培养基pH6.0，121℃灭菌30min。
实施例5
本发明还提供了一种防治景天科多肉植物褐腐病复合菌剂，复合菌剂由短小芽孢杆菌 (Bacillus Pumilus)MES828的发酵产物、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus) MES818的发酵产物按体积比3:2充分混合，然后10000rpm离心30min获得菌体，用无菌水重悬打散配置成而成，使复合菌剂产品中活菌总数在2.5×109～2.0×1010范围内。
所述短小芽孢杆菌MES828发酵产物和侧孢短芽孢杆菌MES818发酵产物均采用液体高密度发酵技术制备，其中短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)MES828发酵产物中的活菌数不少于2.5×109cFu/g；所述侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)MES818发酵产物中的活菌数不少于2.5×109cFu/g。
优选的，所述短小芽孢杆菌的高密度发酵方法为，包括以下步骤：
(1)菌种的制备；将分离获得的短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)MES828转接至茄瓶培养，于37℃，培养72h，得到活化菌株，将30ml保护剂(2.0％葡萄糖溶液+3.5％脱脂奶粉溶液+20％甘油溶液)加到茄瓶中，用无菌刮铲刮下，经研磨器研磨均匀后，保存至-80℃冰箱，备用；
(2)种子液的制备：吸取-80℃保存的菌种，按10％的接种量接入300mL液体培养基中，于37℃，220r/min培养72h，得到种子液；
(3)种子罐发酵：将上述制备的种子液以10％的接种量接入50L种子罐进行发酵，种子罐装料系数50％，发酵温度37℃，转速230rpm，罐压保持在0.05Mpa之间，通风比是1:0.5～ 1，种子培养基初始pH值6.8，发酵周期48h，发酵过程中流加5M NaOH，使发酵液pH值控制在6.8；
(4)发酵罐发酵：待种子罐发酵结束后，按照10％的接种量移种至5000L发酵罐进行深层液体发酵，发酵罐装料系数50％，发酵温度37℃，转速230rpm，罐压保持在0.05Mpa之间，通风比是1:0.5～1，发酵培养基初始pH值6.8，待发酵24h，以补料方式流加外源营养物(1％葡萄糖和1％大豆多肽混合液)，在继续发酵10h，待发酵结束后即可获得短小芽孢杆菌MES828 液体发酵产物。
优选的，所述侧孢短芽孢杆菌的高密度发酵方法为，包括以下步骤：
(1)菌种的制备；将分离获得的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)MES818 转接至茄瓶培养基，于37℃，培养72h得到活化菌株，将30ml保护剂(2.0％葡萄糖溶液+3.5％脱脂奶粉溶液+20％甘油溶液)加到茄瓶中，用无菌刮铲刮下，研磨器研磨均匀后，保存至-80℃冰箱，备用；
(2)种子液的制备：吸取-80℃保存的菌种，按10％的接种量接入300mL液体培养基中，于37℃，220r/min培养72h，得到种子液；
(3)种子罐发酵：将上述制备的种子液以10％的接种量接入50L种子罐进行发酵，种子罐装料系数45％，发酵温度37℃，转速220rpm，罐压保持在0.05Mpa之间，通风比是1:0.5～ 1，种子培养基初始pH值7.0，发酵周期33h，发酵过程中流加5M NaOH，使发酵液pH值控制在7.0；
(4)发酵罐发酵：待种子罐发酵结束后，按照15％的接种量移种至5000L发酵罐进行液体发酵，发酵罐装料系数50％，发酵温度37℃，转速230rpm，罐压保持在0.05Mpa之间，通风比是1:0.5～1，发酵培养基初始pH值6.8，待发酵30h时，以补料方式流加外源营养物(1％葡萄糖和3％大豆多肽混合液)，在继续发酵11h，待发酵结束后即可获得侧孢短芽孢杆菌 MES818液体发酵产物。
优选的，所述短小芽孢杆菌MES828培养时的茄瓶培养基，具体为，按质量分数计：胰蛋白胨1％，牛肉膏0.8％，氯化钠0.5％，琼脂2％，余量为去离子水，pH控制在7.0，121℃灭菌 30min；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的种子液培养基，具体为，按质量分数计：鱼蛋白胨 0.8％，大豆蛋白胨0.8％，酵母粉0.5％，NaCl 1％，自然pH值，121℃灭菌30min；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的种子罐培养基，具体为，按质量分数计：糖蜜2％，黄豆粉1％，酶解的花生粕粉1％，酵母膏0.8％，氯化钠1％，硫酸镁0.5‰，柠檬酸2％，KH2PO4 0.08％，余量为去离子水，pH控制在7.0，121℃灭菌30min；
所述酶解的花生粕粉是采用风味蛋白酶与中性蛋白酶按照3:1复配，加酶量1％(E/S，以底物质量计)，酶解温度55℃，酶解时间5h，经真空抽滤，80℃烘干后获得；
所述短小芽孢杆菌MES828的发酵罐液培养基为：白糖2％，糖蜜1％，花生饼粉1％，酵母膏0.8％，氯化钠0.5％，硫酸镁1‰，柠檬酸1％，KH2PO4 0.08％，中性蛋白酶0.5‰，风味蛋白酶0.5‰，泡敌0.5‰，余量为去离子水，培养基pH6.0，121℃灭菌30min。
优选的，所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的茄瓶培养基，具体为，按质量分数计：胰蛋白胨0.5％，牛肉膏1％，氯化钠0.5％，琼脂2％，余量为去离子水，pH控制在7.0，121℃灭菌30min；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的种子液培养基，具体为，按质量分数计：鱼蛋白胨 0.8％，大豆蛋白胨0.8％，酵母粉1％，NaCl 0.5％，自然pH值，121℃灭菌30min；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的种子罐培养基，具体为，按质量分数计：酵母浸粉 0.8％，糖蜜1％，酶解的花生粕粉2％，磷酸二氢钾0.7％，硫酸镁0.05％，碳酸钙0.05％，氯化钠0.5％，余量为去离子水，pH自然，121℃灭菌30min；
所述酶解的花生粕粉是采用风味蛋白酶与中性蛋白酶按照1:1复配，加酶量1％(E/S，以底物质量计)，酶解温度40℃，酶解时间6h，经真空抽滤，80℃烘干后获得；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818的发酵罐液培养基为：葡萄糖2％，糖蜜1％，酵母浸粉1％，花生粕2％，氯化钠1％，硫酸镁0.8％，中性蛋白酶1‰，风味蛋白酶2‰，柠檬酸钠1％，泡敌0.2‰，余量为去离子水，培养基pH 7.0，121℃灭菌30min。
实施例6
一种防治景天科多肉植物褐腐病复合菌剂的应用，将复合菌剂按1:1000～1:500水稀释，然后采用叶面喷洒的方式施用到多肉植物叶片或采用根灌的方式施用到多肉植物根部。
采用叶面喷施的方式施用复合菌剂(实施例2-5制备的复合菌剂)。
将短小芽孢杆菌MES828、侧孢短芽孢杆菌MES818按照上述方法分别进行活化培养至对数生长期，将活化的短小芽孢杆菌MES828的发酵产物、侧孢短芽孢杆菌MES818的发酵产物 5000rpm-10000rpm离心15min-30min获得菌体，用无菌水将菌体重悬打散配置成菌剂，使单一菌种有效活菌数在1.0×109～1.0×1010范围内；而后将活化的短小芽孢杆菌MES828的发酵产物、侧孢短芽孢杆菌MES818的发酵产物按照体积比1-4:1-4混合，然后5000rpm-10000rpm 离心15min-30min获得菌体，用无菌水将菌体重悬打散配置成菌剂，使复合菌剂产品中活菌总数在2.5×109～2×1010范围内。
使用方法：将短小芽孢杆菌剂、侧孢短芽孢杆菌菌剂、复合菌剂和70％甲基托布津可湿性粉剂按照1:500水稀释后，叶面喷施于景天科多肉植物叶片上。
实验地点选自武清区陈咀镇梅石公路庞庄大棚基地伟益农庄温室内进行。
试验设计：选取长势基本一致的褐腐病多肉植物雪莲种子苗进行应用效果研究。育苗基质选取草炭和蛭石，按照2:1比例混合而成，将种子苗移栽至多肉花盆(口径17cm，高度14) 中。试验设置如下表2所示。每个处理设置20盆，重复3次。每7天喷施一次处理液，喷施量以叶面完全沾处理液为宜，正常管理，并计算病情指数和防治效果，具体如下表2所示。
试验设计
表2不同叶面喷施处理方式对景天科多肉植物褐腐病的防效对比试验结果
组别 处理方式 病情指数 防效/％
试验1组 叶面喷施短小芽孢杆菌剂 16.14b 66.4
试验2组 叶面喷施侧孢短芽孢杆菌菌剂 15.31b 68.9
试验3组 叶面喷施复合菌剂 10.10bc 84.4
试验4组 叶面喷施70％甲基托布津可湿性粉剂 9.11c 92.6
对照组 叶面喷施无菌水 85.21a —
实验结果：表2试验结果表明试验1组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数16.14，防治效果为66.4％；试验2组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数15.31，防治效果为68.9％；试验3组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数10.10，防治效果为84.4％，试验4组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数9.11，防治效果为92.6％。
实施例7
采用叶面喷施的方式施用复合菌剂(实施例2-5制备的复合菌剂)。
将短小芽孢杆菌MES828、侧孢短芽孢杆菌MES818按照上述方法分别进行活化培养至对数生长期，将活化的短小芽孢杆菌MES828的发酵产物、侧孢短芽孢杆菌MES818的发酵产物 5000rpm-10000rpm离心15min-30min获得菌体，用无菌水将菌体重悬打散配置成菌剂，使单一菌种有效活菌数在1.0×109～1.0×1010范围内；而后将活化的短小芽孢杆菌MES828的发酵产物、侧孢短芽孢杆菌MES818的发酵产物按照体积比1-4:1-4混合，然后5000rpm-10000rpm 离心15min-30min获得菌体，用无菌水将菌体重悬打散配置成菌剂，使复合菌剂产品中活菌总数在2.5×109～2.0×1010范围内。
使用方法：将短小芽孢杆菌剂、侧孢短芽孢杆菌菌剂、复合菌剂和70％甲基托布津可湿性粉剂按照1:1000水稀释后，叶面喷施于景天科多肉植物叶片上。
实验地点选自武清区陈咀镇梅石公路庞庄大棚基地伟益农庄温室内进行。
试验设计：选取长势基本一致的褐腐病多肉植物雪莲种子苗进行应用效果研究。育苗基质选取草炭和蛭石，按照2:1比例混合而成，将种子苗移栽至多肉花盆(口径17cm，高度14) 中。试验设置如下表2所示。每个处理设置20盆，重复3次。每10天喷施一次处理液，喷施量以叶面完全沾处理液为宜，正常管理，并计算病情指数和防治效果，具体如下表3所示。
试验设计
表3不同叶面喷施处理方式对景天科多肉植物褐腐病的防效对比试验结果
组别 处理方式 病情指数 防效/％
试验1组 叶面喷施短小芽孢杆菌剂 15.33b 68.8
试验2组 叶面喷施侧孢短芽孢杆菌菌剂 14.97b 70.6
试验3组 叶面喷施复合菌剂 10.94bc 86.8
试验4组 叶面喷施70％甲基托布津可湿性粉剂 8.96c 95.6
对照组 叶面喷施无菌水 85.21a —
实验结果：表3试验结果表明试验1组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数15.33，防治效果为68.8％；试验2组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数14.97，防治效果为70.6％；试验3组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数10.94，防治效果为86.8％，试验4组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数8.96，防治效果为95.6％。
实施例8
采用罐根的方式施用复合菌剂(实施例2-5制备的复合菌剂)。
将短小芽孢杆菌MES828、侧孢短芽孢杆菌MES818按照上述方法分别进行活化培养至对数生长期，将活化的短小芽孢杆菌MES828的发酵产物、侧孢短芽孢杆菌MES818的发酵产物5000rpm-10000rpm离心15min-30min获得菌体，用无菌水将菌体重悬打散配置成菌剂，使单一菌种有效活菌数在1.0×109～1.0×1010范围内；而后将活化的短小芽孢杆菌MES828的发酵产物、侧孢短芽孢杆菌MES818的发酵产物按照体积比1-4:1-4混合，然后5000rpm-10000rpm 离心15min-30min获得菌体，用无菌水将菌体重悬打散配置成菌剂，使复合菌剂产品中活菌总数在2.5×109～2.0×1010范围内。
使用方法：将短小芽孢杆菌剂、侧孢短芽孢杆菌菌剂、复合菌剂和70％甲基托布津可湿性粉剂按照1:500水稀释后，根灌施于景天科多肉植物根部。
实验地点选自武清区陈咀镇梅石公路庞庄大棚基地伟益农庄温室内进行。
试验设计：选取长势基本一致的褐腐病多肉植物雪莲种子苗进行应用效果研究。育苗基质选取草炭和蛭石，按照2:1比例混合而成，将种子苗移栽至多肉花盆(口径17cm，高度14) 中。试验设置如下表2所示。每个处理设置20盆，重复3次。每盆灌根30ml处理液，每7天灌根一次，正常管理，并计算病情指数和防治效果，具体如下表4所示。
试验设计
表4不同根灌处理方式对景天科多肉植物褐腐病的防效对比试验结果
组别 处理方式 病情指数 防效/％
试验1组 灌根短小芽孢杆菌剂 15.71b 68.2
试验2组 灌根侧孢短芽孢杆菌剂 14.82b 70.1
试验3组 灌根复合菌剂 11.10bc 84.2
试验4组 灌根70％甲基托布津可湿性粉剂 8.82c 96.2
对照组 灌根无菌水 85.21a —
实验结果：表4试验结果表明试验1组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数15.71，防治效果为68.2％；试验2组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数14.82，防治效果为70.1％；试验3组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数11.10，防治效果为84.2％，试验4组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数8.82，防治效果为和96.2％。
实施例9
采用罐根的方式施用复合菌剂(实施例2-5制备的复合菌剂)。
将短小芽孢杆菌MES828、侧孢短芽孢杆菌MES818按照上述方法分别进行活化培养至对数生长期，将活化的短小芽孢杆菌MES828的发酵产物、侧孢短芽孢杆菌MES818的发酵产物 5000rpm-10000rpm离心15min-30min获得菌体，用无菌水将菌体重悬打散配置成菌剂，使单一菌种有效活菌数在1.0×109～1.0×1010范围内；而后将活化的短小芽孢杆菌MES828的发酵产物、侧孢短芽孢杆菌MES818的发酵产物按照体积比1-4:1-4混合，然后5000rpm-10000rpm 离心15min-30min获得，用无菌水将菌体重悬打散配置成菌剂，使复合菌剂产品中活菌总数在2.5×109～2.0×1010范围内。
使用方法：将短小芽孢杆菌剂、侧孢短芽孢杆菌菌剂、复合菌剂和70％甲基托布津可湿性粉剂按照1:1000水稀释后，根灌施于景天科多肉植物根部。
实验地点选自武清区陈咀镇梅石公路庞庄大棚基地伟益农庄温室内进行。
试验设计：选取长势基本一致的褐腐病多肉植物雪莲种子苗进行应用效果研究。育苗基质选取草炭和蛭石，按照2:1比例混合而成，将种子苗移栽至多肉花盆(口径17cm，高度14) 中。试验设置如下表2所示。每个处理设置20盆，重复3次。每盆灌根30ml处理液，每10天灌根一次，正常管理，并计算病情指数和防治效果，具体如下表5所示。
试验设计
表5不同根灌处理方式对景天科多肉植物褐腐病的防效对比试验结果
组别 处理方式 病情指数 防效/％
试验1组 灌根短小芽孢杆菌剂 15.21b 74.8
试验2组 灌根侧孢短芽孢杆菌剂 14.71b 75.2
试验3组 灌根复合菌剂 10.11bc 88.3
试验4组 灌根70％甲基托布津可湿性粉剂 8.71c 96.4
对照组 灌根无菌水 85.21a —
实验结果：表5试验结果表明试验1组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数15.21，防治效果为74.8％；试验2组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数14.71，防治效果为和75.2％；试验3组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数10.11，防治效果为88.3％，试验4组对景天科多肉植物褐腐病的病情指数8.71，防治效果为96.4％。
本发明的一种防治景天科多肉植物褐腐病的复合菌剂，从实施例6-9试验结果可知，复合菌剂防治效果略次于化学药剂。但从长远来看长期施用化学药剂对植物的生长不利，同时还会影响植物根际微生物菌群结构，而复合菌剂具有无毒无害、无残留、不抑制生长以及用量少的特点；本发明制得的防治景天科多肉植物褐腐病复合菌剂可有效防治景天科多肉植物褐腐病，能促进景天科多肉植物对养分的吸收和利用，改善景天科多肉植物的形态，对增强景天科多肉植物的观赏价值有着重要的积极意义。与单一施用短小芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌相比，复合菌剂的拮抗作用较强，复合的两株菌相互协同，能够在景天科多肉植物的根际、根表和体内定植、繁殖和转移，对景天科多肉植物褐腐病有较强的拮抗效果。因此，宜选取复合菌剂用于防治景天科多肉植物褐腐病。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津开发区坤禾生物技术有限公司
<120> 一种防治多肉植物褐腐病复合菌剂及其制备方法和应用
<140> 201811628263.1
<160> 2
<210> 1
<211> 1453
<212> DNA
<213> Bacillus Pumilus
<400> 1
gcgggggggg gctatactgc agtcgagcgg acagaaggga gcttgctccc ggatgttagc 60
ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa 120
ccggagctaa taccggatag ttccttgaac cgcatggttc aaggatgaaa gacggtttcg 180
gctgtcactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtggggtaa tggctcacca 240
aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc 300
ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga 360
gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac 420
aagtgcgaga gtaactgctc gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta 480
cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540
agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt 600
cattggaaac tgggaaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg 660
aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga 720
cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780
aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta 840
agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc 900
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt 960
gacatcctct gacaacccta gagatagggc tttcccttcg gggacagagt gacaggtggt 1020
gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080
ccttgatctt agttgccagc atttagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc 1140
ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200
ctacaatgga cagaacaaag ggctgcgaga ccgcaaggtt tagcgaatcc cataaatctg 1260
ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg 1320
cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacaa 1380
tacacgagag tttgcaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc tttatggagc cagccgccga 1440
agctgacaga gag 1453
<210> 2
<211> 1437
<212> DNA
<213> Brevibacillus laterosporu
<400> 1
gtaggggggg gtctataatg cagtcgagcg agggttttcg gaccctagcg gcggacgggt 60
gagtaacacg taggcaacct gcctgtaaga ctgggataac atagggaaac ttatgctaat 120
accggataga gttttgcttc gcatgaagcg aaacggaaag atggcgcaag ctatcacttg 180
cagatgggcc tgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaaa ggctcaccaa ggcgacgatg 240
cgtagccgac ctgagagggt gaccggccac actgggactg agacacggcc cagactccta 300
cgggaggcag cagtagggaa ttttccacaa tggacgaaag tctgatggag caacgccgcg 360
tgaacgatga aggctttcgg gtcgtaaagt tctgttgtta gggaagaaac agtgccattt 420
aaataaggtg gcaccttgac ggtacctaac gagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 480
gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca 540
ggtggctatg taagtctgat gttaaagccc ggggctcaac ctcggttcgc attggaaact 600
gcgtagcttg agtgcaggag aggaaagtgg tattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga 660
gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctttctggcc tgtaactgac actgaggcgc 720
gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt 780
gctaggtgtt aggggtttca atacccttag tgccgcagct aacgcaataa gcactccgcc 840
tggggagtac gctcgcaaga gtgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt 900
ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcccact 960
gaccgctcta gagatagagc ttcccttcgg ggcagtggtg acaggtggtg catggttgtc 1020
gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttatcttta 1080
gttgccagca ttcagttggg cactctagag agactgccgt cgacaagacg gaggaaggcg 1140
gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggtt 1200
ggtacaacgg gatgctactt cgcgagaaga tgctaatctc ttaaaaccaa tctcagttcg 1260
gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat 1320
gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gggagtttgc 1380
aacacccgaa gtcggtgagg taaccgcaag gagccagccg ccgaaggtgg agatccg 1437

Claims (8)

1.一种防治景天科多肉植物褐腐病复合菌剂，特征在于，所述复合菌剂包括短小芽孢杆菌（Bacillus Pumilus）MES828的发酵产物和侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）MES818的发酵产物，所述短小芽孢杆菌（Bacillus Pumilus）MES828和侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）MES818的发酵产物的体积比为1-4:1-4，所述复合菌剂产品中活菌总数在2.5×109～2.0×1010范围内。
2.根据权利要求1所述的防治景天科多肉植物褐腐病复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述短小芽孢杆菌（Bacillus Pumilus）MES828发酵产物和侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）MES818发酵产物均采用液体高密度发酵技术制备，其中短小芽孢杆菌（Bacillus Pumilus）MES828发酵产物中的活菌数不少于2.5×109cFu/g，侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）MES818发酵产物中的活菌数不少于2.5×109cFu/g；
所述短小芽孢杆菌（Bacillus Pumilus）MES828，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年12月03日，保藏编号为CGMCCNo.16858；
所述侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）MES818，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年12月03日，保藏编号为CGMCCNo.16859。
3.根据权利要求2所述的防治景天科多肉植物褐腐病复合菌剂的制备方法，其特征在于，将短小芽孢杆菌（Bacillus Pumilus）MES828的发酵产物、侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）MES818的发酵产物按体积比1-4:1-4充分混合，然后5000rpm-10000rpm离心15min-30min获得菌体，用无菌水将菌体重悬打散配置成而成，使复合菌剂产品中活菌总数在2.5×109～2.0×1010范围内。
4.根据权利要求2所述的防治景天科多肉植物褐腐病复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述短小芽孢杆菌的高密度发酵方法，包括以下步骤：
（1）菌种的制备；将分离获得的短小芽孢杆菌（Bacillus Pumilus）MES828转接至茄瓶培养基，于35℃～37℃，培养48h～72h，得到活化菌株，加入保护剂保存备用；
（2）种子液的制备：按照5%～15%接种量接入液体培养基中，于35℃～37℃，220r/min培养72h，得到种子液；
（3）种子罐发酵：将上述制备的种子液以5%～15%的接种量接入种子罐进行发酵，种子罐装料系数45%～55%，发酵温度35℃～37℃，转速220rpm～250rpm，罐压保持在0.05Mpa～0.08Mpa之间，通风比是1:0.5～1，种子培养基初始pH值6.5～7.0，发酵周期24h～36h，发酵过程中流加5M～10M NaOH，使发酵液pH值控制在6.5～7.0；
（4）发酵罐发酵：待种子罐发酵结束后，按照5%～15%的接种量移种至发酵罐进行深层液体发酵，发酵罐装料系数45%～55%，发酵温度35℃～37℃，转速220rpm～250rpm，罐压保持在0.05Mpa～0.08Mpa之间，通风比是1:0.5～1，发酵培养基初始pH值6.5～7.0，待发酵24h～36h时，以补料方式流加外源营养物，在继续发酵10h～12h，待发酵结束后即可获得短小芽孢杆菌MES828液体发酵产物。
5.根据权利要求2所述的防治多肉植物褐腐病复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述侧孢短芽孢杆菌的高密度发酵方法为，包括以下步骤：
（1）菌种的制备；将分离获得的侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）MES818转接至茄瓶培养基，于35℃～37℃，培养48h～72h，得到活化菌株，加入保护剂保存备用；
（2）种子液的制备：按照5%～15%接种量接入300mL液体培养基中，于35℃～37℃，220r/min培养72h，得到种子液；
（3）种子罐发酵：将上述制备的种子液以5%～15%的接种量接入种子罐进行发酵，种子罐装料系数45%～55%，发酵温度35℃～37℃，转速220rpm～250rpm，罐压保持在0.05Mpa～0.08Mpa之间，通风比是1:0.5～1，种子培养基初始pH值6.5～7.0，发酵周期24h～36h，发酵过程中流加5M～10M NaOH，使发酵液pH值控制在6.5～7.0；
（4）发酵罐发酵：待种子罐发酵结束后，按照5%～15%的接种量移种至发酵罐进行液体发酵，发酵罐装料系数45%～55%，发酵温度35℃～37℃，转速220rpm～250rpm，罐压保持在0.05Mpa～0.08Mpa之间，通风比是1:0.5～1，发酵培养基初始pH值6.5～7.0，待发酵24h～36h时，以补料方式流加外源营养物，在继续发酵10h～12h，待发酵结束后即可获得侧孢短芽孢杆菌MES818液体发酵产物。
6.根据权利要求3所述的防治多肉植物褐腐病复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述短小芽孢杆菌MES828培养时的茄瓶培养基成分，具体为，按质量分数计：胰蛋白胨0.5%～2%，牛肉膏0.5%～2%，氯化钠0.2%～1%，琼脂1.5%～2%，余量为去离子水，pH控制在7.0～7.3，121℃灭菌30min；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的种子液培养基成分，具体为，按质量分数计：鱼蛋白胨0.5%～2%，大豆蛋白胨0.5%～2%，酵母粉0.5%～2%，NaCl 0.2%～1%，自然pH值，121℃灭菌30min；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的种子罐培养基成分，具体为，按质量分数计：糖蜜2%～4%，黄豆粉0.5%～3%，酶解的花生粕粉0.5%～2%，酵母膏0.5%～1%，氯化钠0.2%～2%，硫酸镁0.5‰～2‰，柠檬酸0.2%～2%，KH2PO4 0.05%～0.10%，余量为去离子水，pH控制在7.0～7.3，121℃灭菌30min；
所述酶解的花生粕粉是采用风味蛋白酶与中性蛋白酶按照1:3～3:1复配，加酶量0.5%～1%（E/S，以底物质量计），酶解温度40℃～55℃，酶解时间4h～6h，经真空抽滤，80℃烘干后获得；
所述短小芽孢杆菌MES828培养时的发酵罐液培养基成分，具体为，按质量分数计：白糖1%～3%，糖蜜1%～3%，花生饼粉0.5%～2%，酵母膏0.5%～1%，氯化钠0.2%～2%，硫酸镁0.5‰～2‰，柠檬酸0.2%～2%，KH2PO4 0.05～0.1%，中性蛋白酶0.5‰～2‰，风味蛋白酶0.5‰～2‰，泡敌0.2‰～1.5‰，余量为去离子水，培养基pH6.0～7.0，121℃灭菌30min。
7.根据权利要求4所述的防治多肉植物褐腐病复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的茄瓶培养基成分，具体为，按质量分数计：胰蛋白胨0.5%～2%，牛肉膏0.5%～2%，氯化钠0.2%～1%，琼脂1.5%～2%，余量为去离子水，pH控制在7.0～7.3，121℃灭菌30min；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的种子液培养基成分，具体为，按质量分数计：鱼蛋白胨0.5%～2%，大豆蛋白胨0.5%～2%，酵母粉0.5%～2%，NaCl 0.2%～1%，自然pH值，121℃灭菌30min；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的种子罐培养基成分，具体为，按质量分数计：酵母浸粉0.5%～2%，糖蜜1%～3%，酶解的花生粕粉1%～4%，磷酸二氢钾0.5%～1%，硫酸镁0.03%～0.05%，碳酸钙0.03%～0.05%，氯化钠0.5%～1%，余量为去离子水，pH自然，121℃灭菌30min；
所述酶解的花生粕粉是采用风味蛋白酶与中性蛋白酶按照1:3～3:1复配，加酶量0.5%～1%（E/S，以底物质量计），酶解温度40℃～55℃，酶解时间4h～6h，经真空抽滤，80℃烘干后获得；
所述侧孢短芽孢杆菌MES818培养时的发酵罐液培养基成分，具体为，按质量分数计：葡萄糖2%～4%，糖蜜1%～3%，酵母浸粉1%～3%，花生粕2%～4%，氯化钠1%～3%，硫酸镁1%～2%，中性蛋白酶0.5‰～2‰，风味蛋白酶0.5‰～2‰，柠檬酸钠0.5%～3%，泡敌0.2‰～1.5‰，余量为去离子水，培养基pH6.0～7.0，121℃灭菌30min。
8.根据权利要求1所述的一种防治多肉植物褐腐病复合菌剂的应用，特征在于，将复合菌剂按1:1000～1:500水稀释，然后采用叶面喷施方式施用到多肉植物叶片或采用根灌方式施用到多肉植物根部。
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