CN116083251B - 一种混合微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种混合微生物菌剂及其制备方法和应用，所述混合微生物菌剂包括哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌，所述混合微生物菌剂应用于菌核病的防治。本发明的混合微生物菌剂对引起辣椒菌核病核盘菌拮抗效果明显，能防止或减轻辣椒菌核病的发生，促进辣椒稳产，保障产品的产量和品质。

Description

一种混合微生物菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物菌剂技术领域，特别是涉及一种混合微生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

辣椒是一种茄科辣椒属植物，在全国普遍栽培，是一种大众化蔬菜，也可药用。辣椒菌核病是由核盘菌引起的、发生在辣椒的病害。主要危害茎基部，也能危害茎、叶和叶柄、花、果实和果柄。辣椒菌核病可发生在辣椒的整个生育期，但主要发生在辣椒开花期至挂果期，引起全株性枯萎死亡。

辣椒菌核病是对辣椒生产、制种的毁灭性病害，在中国各地均有发生，在温度湿度适合菌核病发生、蔓延的情况下，发病率25%-30%，严重地块病株率高达40%以上，辣椒种子减产20-30%，可给农户造成严重的经济损失。

辣椒菌核病病原菌核盘菌，属子囊菌亚门真菌。菌核初为白色，老熟后变黑色鼠粪状，由菌丝体扭集在一起形成。子囊盘浅褐色，盘状或扁平状。子囊盘柄的长度3～15mm，伸出土面为乳白色，渐展开呈杯状。子囊盘成熟后子囊孢子呈烟雾状弹射。子囊棍棒状，无色，内生子囊孢子8个。子囊孢子单胞，无色，椭圆形，大小(10～15)μm×(5～10)μm。菌丝生长及菌核形成最适温度20℃，最高35℃。这种病原菌可以侵染茄科、葫芦科等多种蔬菜。

核盘菌的防治方法包括化学、农业和生物防治。化学防治中常用的杀菌剂有多菌灵、菌核净、速克灵、戊唑醇等。在生产上，多菌灵的化学防治效果较好，但近几年研究发现其效果随寄主植物品种抗性的增强已呈现出不理想的状态，核盘菌在许多地区对多菌灵已产生抗药性。常用的农业防治有：釆用科学的栽培措施如种子处理、拉大行间距等避免或减少菌核病的发生，深翻土壤埋藏菌核以减少子囊盘萌发，歇田期灌水使菌核腐烂等。这些常规农业方法能控制部分菌核病的发生，但核盘菌寄主范围广泛，病菌可以菌核形式长期存活于土壤中，所以轮作、田园清洁等传统农业防治技术在规模化生产中很难取得较好的防治效果。生物防治高效且无毒、无害、无污染、不产生抗药性，不仅符合人们对绿色食品的需求，而且为农业的可持续发展提供了保障。因此，筛选一种核盘菌的拮抗混合微生物菌剂应用于实践生产中迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中缺乏对核盘菌具有高效防治效果的绿色制剂，而提供一种混合微生菌剂。

本发明的另一目的，提供一种所述混合微生物菌剂的制备方法。

本发明的另一目的，提供一种所述混合微生物菌剂的应用。

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

一种混合微生物菌剂，包括哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），所述混合微生物菌剂应用于菌核病的防治。

所述哈茨木霉保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微 生物研究所，邮政编码：100101)，保藏号为CGMCCNO.40350，保藏日期为2022年10月28日；

所述解淀粉芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微 生物研究所，邮政编码：100101)，保藏号为CGMCC NO.25986，保藏日期为2022年10月28日。

在上述技术方案中，所述哈茨木霉的有效活菌数≥2.0*10⁸个/g，所述解淀粉芽孢杆菌产品有效活菌数≥2.0*10¹⁰个/g。

在上述技术方案中，所述解淀粉芽孢杆菌和哈茨木霉的体积比为1:1~1:3，优选为1:2。

在上述技术方案中，所述混合微生物菌剂通过以下方法制备：制备哈茨木霉、制备解淀粉芽孢杆菌和混合制备所述混合微生物菌剂；

其中，哈茨木霉通过以下方法制备：

步骤1，一级种子培养：培养活化后的哈茨木霉菌株；

步骤2，发酵:发酵培养基灭菌后，刮取步骤1得到的一级种子菌苔后在无菌水中混匀，接种在哈茨木霉液体发酵培养基中，维持溶解氧浓度10%-20%，控制罐压在0.02 Mpa-0.07 Mpa，在28℃培养60h；

步骤3，待步骤2中的哈茨木霉的孢子比例≥90%时，结束发酵，放罐，得到哈茨木霉发酵液；

步骤4，将步骤3得到的所述发酵液与稳定剂复合制成哈茨木霉液体制剂；

步骤5，将所述哈茨木霉液体制剂进行浓缩喷干，得到粉末状哈茨木霉。

在上述技术方案中，所述解淀粉芽孢杆菌通过以下方法制备：

步骤S1，一级种子培养：培养活化的解淀粉芽孢杆菌；

步骤S2，发酵:发酵培养基灭菌后，刮取步骤S1得到的一级种子菌苔后在无菌水中混匀，接种在解淀粉芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02 Mpa-0.07 Mpa，在35℃培养26h；

步骤S3，待步骤S2中的解淀粉芽孢杆菌的孢子比例≥90%时，结束发酵，放罐，得到解淀粉芽孢杆菌发酵液；

步骤S4，将所述解淀粉芽孢杆菌发酵液与稳定剂复合制成解淀粉芽孢杆菌液体制剂；

步骤S5，将所述解淀粉芽孢杆菌液体发酵液进行浓缩喷干，得到粉末状解淀粉芽孢杆菌。

在上述技术方案中，所述混合制备混合微生物菌剂包括以下步骤：将所述粉末状解淀粉芽孢杆菌和粉末状哈茨木霉按体积比1:2混合，得到所述混合微生物菌剂。

在上述技术方案中，所述哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌均通过试管斜面活化。

本发明的另一方面，提供一种所述的混合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤A1，制备哈茨木霉；

步骤A1.1，一级种子培养：培养活化后的哈茨木霉菌株；

步骤A1.2，发酵:发酵培养基灭菌后，刮取步骤A1.1得到的一级种子菌苔后在无菌水中混匀，接种在哈茨木霉液体发酵培养基中，维持溶解氧浓度10%-20%，控制罐压在0.02Mpa-0.07 Mpa，在28℃培养60h，发酵所用培养基的原料及用量为: 糖蜜2%，酵母粉0.5%，氯化亚铁0.01%，硫酸镁0.125%，磷酸二氢钾0.4%，硝酸钠0.7% ，pH5.5～6.0，消泡剂3%；

步骤A1.3，待步骤A1.2中的哈茨木霉的孢子比例≥90%时，结束发酵，放罐，得到哈茨木霉发酵液；

步骤A1.4，将步骤A1.3得到的所述哈茨木霉发酵液与稳定剂复合制成哈茨木霉液体制剂；

步骤A1.5，将所述哈茨木霉液体制剂进行浓缩喷干，得到粉末状哈茨木霉，包装；

步骤A2，制备解淀粉芽孢杆菌；

步骤A2.1，一级种子培养：培养活化的解淀粉芽孢杆菌；

步骤A2.2，发酵:发酵培养基灭菌后，刮取步骤A2.1得到的一级种子菌苔后在无菌水中混匀，接种在解淀粉芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02 Mpa-0.07 Mpa，在35℃培养60h，发酵所用培养基的原料及用量为:葡萄糖1%，糖蜜2%，玉米浆1.5%，氯化钠0.1%，碳酸钙1%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.05%，氯化亚铁0.002%，pH7.0～7.5，消泡剂3%；

步骤A2.3，待步骤A2.2中的解淀粉芽孢杆菌的芽孢比例≥90%时，结束发酵，放罐，得到解淀粉芽孢杆菌发酵液；

步骤A2.4，将所述解淀粉芽孢杆菌发酵液与稳定剂复合制成解淀粉芽孢杆菌液体制剂；

步骤A2.5，将所述解淀粉芽孢杆菌液体发酵液进行浓缩喷干，得到粉末状解淀粉芽孢杆菌，包装；

步骤A3，将所述粉末状解淀粉芽孢杆菌和粉末状哈茨木霉按体积比1:2混合，得到所述混合微生物菌剂。

本发明的另一方面，提供一种所述的混合微生物菌剂在防治辣椒菌核病中的应用，防效不低于88%。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明的混合微生物菌剂对引起辣椒菌核病核盘菌拮抗效果明显，能防止或减轻辣椒菌核病的发生，促进辣椒稳产，保障产品的产量和品质。

2.本发明的混合微生物菌剂用在苗期盆栽防治辣椒菌核病，防治效果可以达到88%。绿色环保制剂、安全无残留、能大幅度降低农药使用量从而降低农业生产成本，其大面积推广使用的前景十分广阔。

本发明中：所述哈茨木霉保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，（CGMCC）(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏号为CGMCC NO.40350，保藏日期为2022年10月28日。

所述解淀粉芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏号为CGMCC NO.25986，保藏日期为2022年10月28日。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中哈茨木霉（MES71901）是2021年3月我公司研发人员从山东蓬莱北沟镇辣椒土壤中分离获得。土壤经稀释、划线培养、在28℃培养24小时后，经5次纯化后制成斜面菌种，挑取2支斜面送中国农业微生物保藏中心（ACCC）鉴定，确定为哈茨木霉（Trichoderma harzianum），在4℃和-80℃冰箱保藏。

本发明中解淀粉芽孢杆菌（MES81159）是2017年3月我公司研发人员从宁夏中宁市宁县枸杞地土壤中分离获得。土壤经稀释、划线培养、在28℃培养24小时后，经5次纯化后制成斜面菌种，挑取2支斜面送农业部微生物质检机构鉴定，确定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），在4℃和-80℃冰箱保藏。

所述哈茨木霉保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.40350，保藏日期为2022年10月28日；

所述解淀粉芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.25986，保藏日期为2022年10月28日。

实施例1

一种混合微生物菌剂，通过以下方法制备：

步骤A1，MES71901菌剂制备

步骤A1.1，一级种子培养：将经试管斜面活化的菌株MES71901进行安碚瓶培养，安碚瓶培养基为马铃薯葡萄糖培养基。培养条件为：温度 28℃，培养 72 h。

步骤A1.2，发酵:在30m³发酵罐中装有20L液体哈茨木霉发酵培养基，115℃-122℃湿热灭菌35-40min后冷却到35℃，刮取步骤A1.1得到的一级种子菌苔后用100mL室温无菌水中混匀，接种在哈茨木霉液体发酵培养基中，维持溶解氧浓度10%-20%，控制罐压在0.02Mpa-0.07 Mpa，在28℃培养60 h；发酵所用培养基的原料及用量为: 糖蜜2%，酵母粉0.5%，氯化亚铁0.01%，硫酸镁0.125%，磷酸二氢钾0.4%，硝酸钠0.7% ，pH5.5～6.0，消泡剂3%。

步骤A1.3，待步骤A1.2中的哈茨木霉的孢子比例大于等于90%时，结束发酵，放罐，得到哈茨木霉发酵液；

步骤A1.4，将步骤A1.3得到的所述哈茨木霉发酵液与稳定剂复合制成哈茨木霉液体制剂；

步骤1.5，将所述哈茨木霉液体制剂在喷干塔内进行浓缩喷干成粉末状，得到粉末状哈茨木霉，装入包装袋内。

对粉末状哈茨木霉检测计数，哈茨木霉产品有效活菌数（CFU）≥2.0*10⁸个/g。

步骤A2，MES81159菌剂制备

步骤A2.1，一级种子培养：将经试管斜面活化的菌株MES81159进行安碚瓶培养，安碚瓶培养基为固体营养琼脂培养基。培养基配方为：蛋白胨8-13g，牛肉膏2-5g，氯化钠3-5g，琼脂19.5 g，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5。培养条件为：温度 25℃-30℃，培养 24h。

步骤A2.2,发酵:在30m³发酵罐中装有20L液体解淀粉芽孢杆菌发酵培养基， 115℃-122℃湿热灭菌35-40min后冷却到35℃，刮取步骤2.1得到的一级种子菌苔后用100mL室温无菌水中混匀，接种在解淀粉芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02 Mpa-0.07Mpa，在35℃培养26 h；发酵所用培养基的原料及用量为:葡萄糖1%，糖蜜2%，玉米浆1.5%，氯化钠0.1%，碳酸钙1%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.05%，氯化亚铁0.002%，pH7.0～7.5，消泡剂3%。

步骤A2.3，待步骤2.2中的解淀粉芽孢杆菌的芽孢形成比例大于等于90%时，结束发酵，放罐，得到解淀粉芽孢杆菌发酵液；

步骤A2.4，将所述解淀粉芽孢杆菌发酵液与稳定剂复合制成解淀粉芽孢杆菌液体制剂；

步骤2.5，将所述解淀粉芽孢杆菌液体制剂在喷干塔内进行浓缩喷干成粉末状，得到粉末状解淀粉芽孢杆菌，装入包装袋内；

对所述粉末状解淀粉芽孢杆菌检测计数，解淀粉芽孢杆菌产品有效活菌数（CFU）≥2.0*10¹⁰个/g。

步骤A3，混合微生物菌剂制备

将粉末状解淀粉芽孢杆菌和粉末状哈茨木霉按重量比1:2混合，得到所述防治辣椒菌核病的微生物微生物混合菌剂。

实施例2

微生物混合菌剂对辣椒菌核病核盘菌的抑菌试验

（一）试验方法：

（1）供试菌种来源

辣椒菌核病原菌来自辣椒农田，经研发人员培养、分离、纯化，16S rDNA最终鉴定为核盘菌，经致病力测定鉴定为强致病力。

粉末状哈茨木霉、粉末状解淀粉芽孢杆菌和混合微生物菌剂均由实施例1制得。

（2）平板拮抗实验

制备PDA固体平板，用记号笔在PDA培养基平板背面分别标记对峙培养微生物菌剂和核盘菌具***置（微生物菌剂和核盘菌以培养皿中线相对称，间隔3cm）。按照不同实验分组接种进行对峙培养，置于28℃恒温培养箱中培养，培养5天，测量抑菌带宽度。

接种方式：核盘菌使用打孔器d=5mm在标示好的位置的培养基上接种；混合微生物菌剂使用无菌水稀释100倍，d=5mm的滤纸片加入标示好的位置，滴加稀释液10μL；解淀粉芽孢杆菌MES81159、哈茨木霉MES71901使用打孔器d=5mm在标示好的位置接种。

试验组别：1、解淀粉芽孢杆菌MES81159、核盘菌

2、哈茨木霉MES71901、核盘菌

3、微生物混合菌剂、核盘菌

（3）拮抗效果

通过本实验测定，解淀粉芽孢杆菌MES81159抑菌带宽度为18cm，哈茨木霉MES71901抑菌带宽度为20cm，混合微生物菌剂抑菌带宽度为25mm。说明哈茨木霉MES71901、解淀粉芽孢杆菌MES81159均对对引起辣椒菌核病的核盘菌具有明显的抑制作用，但两者混合的微生物混合菌剂抑菌效果更明显，具有更优秀的防治辣椒菌核病的生防潜力。

实施例3

微生物混合菌剂防治辣椒菌核病试验

（一）试验药剂

（1）微生物菌剂

实施例1制备的混合微生物菌剂，用水稀释500倍；

（2）化学药剂

43%戊唑醇悬浮剂，拜耳作物科学（中国）有限公司，用水稀释1000倍。

（3）空白对照

设置清水处理为空白对照。

（二）试验方法

1、采用穴盘法育苗，每盘20孔，每孔2粒种子，种子选育瑞特辣椒（安徽省砀山县同乐辣椒研究所）。

2、14天后，选生长健壮，高低粗细一致的幼苗移栽，移栽采用花盆，内径18.3cm，每盆装土1.2kg。实验共分微生物菌剂、化学药剂、空白对照三个处理，每个处理重复20次。

3、移栽后5天，回接核盘菌。核盘菌回接法：将核盘菌接种在PDA培养基上，28℃培养，待菌落长满平板，利用5mm打孔器在平板上打孔备用。在健康新鲜的辣椒茎上用接种针划开一道伤口，将核盘菌菌饼在伤口上涂抹几下再放置于叶片伤口上。回接后浇足水，用内部湿润的塑料袋套住辣椒苗，保持湿度在75%。

4、接核盘菌后5天，混合微生物菌剂组喷稀释后的菌液，每隔5天喷菌液50ml；化学试剂组，每隔5天喷化学试剂50ml；空白组每隔5天喷蒸馏水50ml。培养30天，观察发病情况。

试验结果评价方法以国家田间试验标准GB/T17980.31-2000为参考。每株植株上中下个取10片叶片调查。调查的分级标准是叶片上的病斑面积占叶面积的百分比。病害分级方法如下

病害分级标准：

0级 无病斑；

1级 病斑面积占整个植株叶片面积的5%以下；

3级 病斑面积占整个植株叶片面积的6%—10%以下；

5级 病斑面积占整个植株叶片面积的11%—20%以下；

7级 病斑面积占整个植株叶片面积的21%—50%以下；

9级 病斑面积占整个植株叶片面积的50%以上。

病情指数及防治效果计算公式如下：

；

；

式中：CK₀-空白对照组施药前病情指数

CK₁-空白对照组施药后病情指数

PT₀-处理区实施不同处理前病情指数

PT₁-处理区实施不同处理后病情指数

（三）试验结果

试验结果见表1，从结果可以看出，添加混合微生物菌剂的处理病情指数2.01显著低于空白对照处理后的病情指数（85.48），而与化学药剂处理后的病情指数（2.89）差异不显著，混合微生物菌剂对辣椒菌核病的防治效果达88.54%。说明混合微生物菌剂可作为防治辣椒菌核病的生防菌种，具有广阔的开发利用前景。

表1 不同处理对辣椒菌核病的防治效果

注：不同小写字母表示示处理间差异显著（P<0.05）（参见赵辉. 小麦根际解磷菌的筛选及其解磷效果的研究[D]. 山东农业大学.）

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种混合微生物菌剂，其特征在于，由哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）组成；

所述哈茨木霉保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.40350，保藏日期为2022年10月28日；

所述解淀粉芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.25986，保藏日期为2022年10月28日；

所述混合微生物菌剂应用于防治辣椒菌核病，防效不低于88%；

所述哈茨木霉的有效活菌数≥2.0*10⁸个/g，所述解淀粉芽孢杆菌产品有效活菌数≥2.0*10¹⁰个/g；

所述解淀粉芽孢杆菌和哈茨木霉的体积比为1:1~1:3。

2.如权利要求1所述的混合微生物菌剂，其特征在于，通过以下方法制备：制备哈茨木霉、制备解淀粉芽孢杆菌和混合制备所述混合微生物菌剂；

其中，哈茨木霉通过以下方法制备：

步骤1，一级种子培养：培养活化后的哈茨木霉菌株；

步骤2，发酵:发酵培养基灭菌后，刮取步骤1得到的一级种子菌苔后在无菌水中混匀，接种在哈茨木霉液体发酵培养基中，维持溶解氧浓度10%-20%，控制罐压在0.02 Mpa-0.07Mpa，在28℃培养60h；

步骤3，待步骤2中的哈茨木霉的孢子比例≥90%时，结束发酵，放罐，得到哈茨木霉发酵液；

步骤4，将步骤3得到的所述发酵液与稳定剂复合制成哈茨木霉液体制剂；

步骤5，将所述哈茨木霉液体制剂进行浓缩喷干，得到粉末状哈茨木霉。

3.如权利要求2所述的混合微生物菌剂，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌通过以下方法制备：

步骤S1，一级种子培养：培养活化的解淀粉芽孢杆菌；

步骤S2，发酵:发酵培养基灭菌后，刮取步骤S1得到的一级种子菌苔后在无菌水中混匀，接种在解淀粉芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02 Mpa-0.07 Mpa，在35℃培养26h；

步骤S3，待步骤S2中的解淀粉芽孢杆菌的孢子比例≥90%时，结束发酵，放罐，得到解淀粉芽孢杆菌发酵液；

步骤S4，将所述解淀粉芽孢杆菌发酵液与稳定剂复合制成解淀粉芽孢杆菌液体制剂；

步骤S5，将所述解淀粉芽孢杆菌液体发酵液进行浓缩喷干，得到粉末状解淀粉芽孢杆菌。

4.如权利要求3所述的混合微生物菌剂，其特征在于，所述混合制备混合微生物菌剂包括以下步骤：将所述粉末状解淀粉芽孢杆菌和粉末状哈茨木霉按体积比1:1~1:3混合，得到所述混合微生物菌剂。

5.如权利要求3所述的混合微生物菌剂，其特征在于，所述哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌均通过试管斜面活化。

6.一种如权利要求1-5任意一项所述的混合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A1，制备哈茨木霉；

步骤A1.1，一级种子培养：培养活化后的哈茨木霉菌株；

步骤A1.2，发酵:发酵培养基灭菌后，刮取步骤A1.1得到的一级种子菌苔后在无菌水中混匀，接种在哈茨木霉液体发酵培养基中，维持溶解氧浓度10%-20%，控制罐压在0.02 Mpa-0.07 Mpa，在28℃培养60h，发酵所用培养基的原料及用量为: 糖蜜2%，酵母粉0.5%，氯化亚铁0.01%，硫酸镁0.125%，磷酸二氢钾0.4%，硝酸钠0.7% ，pH5.5～6.0，消泡剂3%；

步骤A1.3，待步骤A1.2中的哈茨木霉的孢子比例≥90%时，结束发酵，放罐，得到哈茨木霉发酵液；

步骤A1.4，将步骤A1.3得到的所述哈茨木霉发酵液与稳定剂复合制成哈茨木霉液体制剂；

步骤A1.5，将所述哈茨木霉液体制剂进行浓缩喷干，得到粉末状哈茨木霉，包装；

步骤A2，制备解淀粉芽孢杆菌；

步骤A2.1，一级种子培养：培养活化的解淀粉芽孢杆菌；

步骤A2.2，发酵:发酵培养基灭菌后，刮取步骤A2.1得到的一级种子菌苔后在无菌水中混匀，接种在解淀粉芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02 Mpa-0.07 Mpa，在35℃培养60h，发酵所用培养基的原料及用量为:葡萄糖1%，糖蜜2%，玉米浆1.5%，氯化钠0.1%，碳酸钙1%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.05%，氯化亚铁0.002%，pH7.0～7.5，消泡剂3%；

步骤A2.3，待步骤A2.2中的解淀粉芽孢杆菌的芽孢比例≥90%时，结束发酵，放罐，得到解淀粉芽孢杆菌发酵液；

步骤A2.4，将所述解淀粉芽孢杆菌发酵液与稳定剂复合制成解淀粉芽孢杆菌液体制剂；

步骤A2.5，将所述解淀粉芽孢杆菌液体发酵液进行浓缩喷干，得到粉末状解淀粉芽孢杆菌，包装；

步骤A3，将所述粉末状解淀粉芽孢杆菌和粉末状哈茨木霉按体积比1:2混合，得到所述混合微生物菌剂。