CN111549000B

CN111549000B - 一种过表达Hpgds的重组脂肪干细胞、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN111549000B
Application number: CN202010557698.2A
Authority: CN
Inventors: 肖苒; 欧阳龙; 邱道静; 傅歆; 杨志岗
Original assignee: Plastic Surgery Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Plastic Surgery Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2020-06-18
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2040-06-18
Also published as: CN111549000A

Abstract

本发明提供了一种过表达Hpgds基因的重组脂肪干细胞、制备方法和及其应用，属于基因工程药物技术领域，所述重组脂肪干细胞通过将表达Hpgds基因的慢病毒载体感染脂肪干细胞获得。所述制备方法包括以下步骤：构建表达Hpgds基因的慢病毒载体；提取脂肪干细胞；将所述表达Hpgds基因的慢病毒载体感染脂肪干细胞获得重组脂肪干细胞；所述重组的脂肪干细胞在三维生物材料支架上进行增殖，能够安全、持久的表达免疫调节基因Hpgds，以加速糖尿病受损皮肤愈合，缩短愈合时间。

Description

一种过表达Hpgds的重组脂肪干细胞、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程药物技术领域，尤其是涉及一种表达Hpgds的重组脂肪干细胞、制备方法及其在糖尿病创面修复中的应用。

背景技术

在糖尿病患者的发病过程中，有30％的患者会发生皮肤感染，而且经常反复发作，持久不愈。患糖尿病的人，一旦发生皮肤感染后，皮肤溃烂的症状就会加重，而且不容易控制，如果治疗不及时就会向纵深发展，甚至最后会导致截肢，严重地影响患者的生活质量。据统计由于糖尿病溃疡所导致的截肢在非创伤性截肢患者中达到50％以上，因此糖尿病患者发生皮肤溃疡越来越引起医务工作者及研究人员的重视。

在糖尿病状态下，中性粒细胞数目和功能异常，巨噬细胞功能和表型转换紊乱，炎症复合体活化，形成持续扩大的炎症反应，从而造成创面愈合障碍。

发明内容

本发明的目的在于提供一种过表达Hpgds的重组脂肪干细胞、制备方法及其应用，所述过表达Hpgds基因的重组脂肪干细胞具有能够安全、持久的表达免疫调节基因Hpgds的优势，协同脂肪干细胞共同发挥作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种过表达Hpgds的重组脂肪干细胞，重组脂肪干细胞是通过将表达Hpgds的基因转染到脂肪干细胞中获得。

在一个优选的实施方案中，脂肪干细胞来源于人体脂肪组织。

在一个实施方案中，表达Hpgds基因的载体为腺病毒载体，优选的，腺病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP。

在一个实施方案中，提供了重组脂肪干细胞的制备方法，包括以下步骤：

构建表达Hpgds基因的慢病毒载体；

将所述表达Hpgds基因的慢病毒载体感染脂肪干细胞；

获得表达Hpgds基因的重组脂肪干细胞。

在一个实施方案中，所述方法还包括提取脂肪干细胞的步骤，提取脂肪干细胞采用胶原酶消化法；优选地，胶原酶消化的温度为36-33℃；消化时间为1-1.5小时。

在一个实施方案中，提取脂肪干细胞步骤之后还包括对提取获得的脂肪干细胞进行鉴定，优选的包括成骨和成脂的鉴定。

在一个实施方案中，所述表达Hpgds基因的慢病毒载体感染的感染复数值为300-400。

本发明还提供了重组脂肪干细胞在制备用于修复生物组织的药物中的应用。

在一个实施方案中，所述生物组织为糖尿病创面组织。

本发明还提供了一种修复糖尿病创面组织的药物的制备方法，包括以下步骤：

a.构建过表达Hpgds基因的重组脂肪干细胞；

b.将所述重组脂肪干细胞与水凝胶支架优选无动物源性RGD肽修饰多糖三维立体支架混合，得到修复糖尿病创面组织的药物。

本发明的有益效果：

本发明通过构建含Hpgds基因的重组慢病毒载体，转染人脂肪干细胞后高表达免疫调节蛋白Hpgds，与干细胞共同发挥作用，创造有利于皮肤再生的微环境。所述重组的脂肪干细胞能够安全、持久、有效的表达免疫调节基因Hpgds，对于促进糖尿病创面的愈合具有较好的应用前景。本发明通过表达Hpgds所构建的脂肪干细胞，对于小鼠背部创面损伤创具有良好的愈合效果，显著降低了新生组织中白细胞的数量和CD8T细胞的数量，显著提高了新生组织中M2修复型巨噬细胞，同时新生组织中的新生血管和胶原组织含量也提高，有助于促进创面由炎症期向增殖期转变。创面愈合的速度更快，愈合效果更好。本发明表达Hpgds的重组脂肪干细胞及制备方法为创伤修复的基础研究和临床应用提供参考。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为图1为倒置显微镜下ADSCs的形态，其中A：原代培养48h；B：3代ADSCs培养48h；

图2为倒置显微镜下ADSCs诱导鉴定，其中A：成骨诱导14d后茜素红染色；B：成脂诱导7d后油红O染色；

图3为流式检测第3代细胞表面标志结果；

图4为倒置荧光显微镜观察感染后ADSCs细胞形态，其中A：正常ADSCs 48h；B/C：pCDH-Hpgds-GFP感染48h；D：pCDH-Hpgds-GFP感染96h；

图5为实施例1中慢病毒感染后对ADSCs增值影响；

图6为实施例1中重组脂肪干细胞48小时后Hpgds基因表达水平以及培养上清中PGD2的含量；

图7为实施例1中动物模型；

图8为实施例1中小鼠糖尿病伤口愈合第7天创面中中性粒细胞和CD8T细胞免疫组化染色；

图9为实施例1中伤口愈合第7天创面中M2型巨噬细胞免疫荧光染色；

图10为实施例1中伤口愈合第10天创面中增殖细胞核抗原(Proliferating cellnuclear antigen,PCNA)免疫荧光染色；

图11为实施例1中伤口愈合第10天创面中I型胶原(Collagen I)和血管内皮细胞标志物(CD31)的免疫组化染色；

图12为实施例1中小鼠糖尿病创面的愈合过程；

图13为实施例1中小鼠糖尿病创面的愈合第17天创面的组织学观察及厚度统计。

具体实施方式

本发明提供了一种过表达Hpgds的重组脂肪干细胞，所述重组脂肪干细胞通过将表达Hpgds基因的慢病毒载体感染脂肪干细胞获得。

在本发明中，所述脂肪干细胞优选的来源于临床抽脂手术中的脂肪组织。在本发明中，所述基因载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-CoGFP，然后与psPAX2和pMD2G一起转入293T细胞包装慢病毒；所述pCDH载体优选的表达绿色荧光蛋白。本发明对所述慢病毒载体的来源没有特殊限定，采用本领域常规方法制备获得或者采用市售的常规慢病毒载体均可。

本发明提供了重组脂肪干细胞的制备方法，包括以下步骤：构建表达Hpgds基因的慢病毒载体；提取脂肪干细胞；将所述表达Hpgds基因的慢病毒载体感染脂肪干细胞获得重组脂肪干细胞。

在本发明中，所述构建表达Hpgds基因的慢病毒载体优选的用慢病毒载体将Hpgds基因包装获得表达Hpgds基因的慢病毒载体。在本发明中，所述表达Hpgds基因的慢病毒载体的构建方法参见法国Polyplus转染试剂盒。

在本发明中，所述提取脂肪干细胞优选的采用胶原酶消化法。在本发明具体实施过程中，包括以下步骤：S1)收集抽脂术中的脂肪组织；S2)将所述脂肪组织清洗、剪碎后，进行胶原酶消化得到消化后的细胞；S3)将所述消化后的细胞进行筛网过滤、离心后收集固相组分即为脂肪干细胞。

本发明在分离获得所述脂肪组织后，将所述脂肪组织清洗、剪碎后，进行胶原酶消化得到消化后的细胞。在本发明中，所述清洗的清洗液优选的为含体积分数1％双抗(双抗为青霉素、链霉素)的PBS溶液，所述清洗的次数优选为3～4次，所述清洗优选的在离心管中进行；在本发明具体实施过程中，所述清洗尽量将所述脂肪组织中的血管及残留物质洗净。本发明在所述清洗结束后，将清洗后的脂肪组织进行剪碎。在本发明中，将所述清洗后的脂肪组织转移至新的容器中，将所述脂肪组织剪碎；本发明对所述剪碎的方法没有特殊要求，采用本领域常规的组织剪碎方法即可；在本发明具体实施过程中的方法，所述剪碎的时间优选为10～20min；本发明优选的将所述脂肪组织剪碎至糊状为止。本发明在所述剪碎后进行胶原酶消化；将胶原酶溶液与剪碎后的脂肪组织混合进行胶原酶消化；所述胶原酶容液的体积与剪碎后的脂肪组织的体积比优选为(1.5～2):1，更优选为2:1；所述胶原酶溶液的浓度优选为0.5％～1.5％(v/v)，更优选为1％(v/v)。在本发明中，所述胶原酶优选为I型胶原酶。在本发明中，所述胶原酶消化的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述胶原酶消化的时间优选为1～1.5小时。本发明在所述消化的过程中，优选的在摇床中震荡，转速优选为80～100rpm。本发明在所述胶原酶消化结束后，优选的进行消化的终止并充分吹打。在本发明中，所述消化的终止优选的为将所述消化的组织中添加等体积的10％FBS的DMEM完全培养基。

本发明将所述消化后的细胞进行筛网过滤、离心后收集固相组分即为脂肪干细胞。在本发明中，所述筛网过滤的孔径优选为200目；所述离心的转速优选的为800～1200rpm，更优选为1000rpm；所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min。本发明在所述离心后，收集固相组分获得脂肪干细胞；所述获得的脂肪干细胞优选的用完全培养基重悬进行培养；所述培养优选为接种至培养瓶中，置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养。本发明在所述提取脂肪干细胞之后还包括对提取获得的脂肪肝干细胞进行鉴定。在本发明中所述鉴定的目的在于确定提取获得的脂肪干细胞是否具有干细胞的特性；所述鉴定优选的包括成骨和成脂的鉴定；本发明对所述鉴定的方法采用本领域常规的方法即可。

本发明在获得所述脂肪干细胞后，将所述表达Hpgds基因的慢病毒载体感染脂肪干细胞获得重组脂肪干细胞。在本发明中，所述脂肪干细胞优选为培养传代至第三代的脂肪干细胞；所述第三代的脂肪干细胞的浓度优选为(0.1～5)×10⁵个/ml，更优选为0.5～2×10⁵个/ml，最优选为1×10⁵个/ml。在本发明具体实施过程中，优选的将所述浓度的脂肪干细胞接种于细胞培养板上进行培养，待所述细胞长至70～80％时进行病毒感染。在本发明中，所述病毒感染的感染复数(MOI)值优选为300～400，更优选为350。本发明中，所述表达Hpgds基因的慢病毒载体的添加量优选为(1～5)×10¹⁰pfu/mL，更优选为1.26×10¹⁰pfu/mL；本发明加入病毒体积计算方式为：MOI＝病毒量(ml)×病毒滴度(pfu/mL)÷细胞数(个)。本发明在所述感染细胞后，优选的摇晃细胞培养板，使所述表达Hpgds基因的慢病毒载体与脂肪干细胞充分接触，在所述感染细胞4h更换完全培养基继续培养。本发明优选的在所述感染细胞24、48h、72h后在荧光显微镜下观察细胞的荧光表达，确定慢病毒携带的Hpgds可成功感染脂肪干细胞。

本发明在获得所述脂肪干细胞后，用无血清干细胞培养基重悬至密度为5×10⁵个/mL，与水凝胶支架按1:4(v/v)均匀混合。所述重组脂肪干细胞在RGD肽修饰的多糖三维生物材料支架上进行增殖，能够安全、持久的表达免疫调节基因Hpgds，协同脂肪干细胞共同发挥作用。

本发明还提供了重组脂肪干细胞在制备用于修复生物组织的药物中的应用，优选的，所述生物组织为糖尿病创面组织。本发明中，所述重组脂肪干细胞能够表达人Hpgds的基因。

a.构建过表达Hpgds基因的重组脂肪干细胞；

实施例

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.提取脂肪组织干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)

取抽脂术后的脂肪组织(男女不限)，放至含1％双抗的PBS的培养皿中清洗3-4遍，尽量将其中的血管及残留物质洗净，再将脂肪组织移入小烧杯中，充分剪碎(剪成糊状为止)，时间约15min。将剪碎的脂肪组织移入50ml离心管中，向其加入2倍体积的1％(v/v)Ⅰ型胶原酶，封口膜封管后放入37℃水浴箱中消化1小时，消化期间放在摇床中震荡，转速优选在80～100rpm范围内。待脂肪组织消化完全后(观察无块状组织即可)加入等量10％FBS的DMEM完全培养基终止消化。200目筛网过滤，1000rpm离心10min，加入5ml完全培养基重悬，接种于25cm²培养瓶内，在37℃5％CO₂培养箱中培养。图1为倒置显微镜下ADSCs的形态脂肪干细胞的诱导分化(成骨，成脂)。

将提取到的原代脂肪干细胞，经成脂、成骨诱导分化实验，免疫组化鉴定，流式细胞表型鉴定为脂肪干细胞。采用生长能力、分化潜能较强的第3代脂肪干细胞。图2为倒置显微镜下ADSCs诱导鉴定，其中A：成骨诱导14d后茜素红染色；B：成脂诱导7d后油红O染色；图3为流式检测第3代细胞表面标志结果。

2.重组慢病毒载体

Hpgds基因委托擎科生物科技(上海)有限公司构建，并***pCDH-CMV-MCS-EF1-CoGFP载体中，然后与psPAX2和pMD2G一起转入293T细胞包装慢病毒。

3.重组腺病毒载体感染脂肪组织干细胞

取脂肪组织干细胞的第三代细胞，制成单细胞悬液，调整密度为1×10⁵/ml接种于6孔板上。待细胞长至70～80％，取感染复数(MOI)值为350。向细胞中加入重组慢病毒载体(1.26×10¹⁰pfu/mL)。加入病毒体积计算方式为：MOI＝病毒量(ml)×病毒滴度(pfu/mL)÷细胞数(个)。轻轻摇晃6孔板使病毒液与细胞充分接触，24h更换完全培养基继续培养。病毒感染细胞24h、48h、72h后在荧光显微镜下观察细胞的荧光表达(能够表达荧光的ADSC即腺病毒成功转染的ADSC)。图4为倒置荧光显微镜观察感染后ADSCs细胞形态，其中A：正常ADSCs 48h；B/C：pCDH-Hpgds-GFP感染48h；D：pCDH-Hpgds-GFP感染96h。

4.采用CCK-8法检测转染后细胞增殖情况

对ADSC-Hpgds组(转染有Hpgds基因的重组慢病毒载体的ADSCs)、以及ADSC组(正常培养的ADSCs，不做任何处理)通过CCK-8法检测转染后细胞增殖情况，如图5所示，结果显示：

2组细胞均于培养3d时进入对数生长期，5d后细胞生长进入平台期，两组细胞均呈倒“S”型曲线生长；两组间在6d内的OD值比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

5.RT-PCR检测感染后ADSC-Hpgds组细胞内Hpgds基因的表达。

RT-PCR步骤

用TRIZOL法提取两组细胞总RNA

提取RNA过程具体操作如下

①用PBS溶液冲洗培养瓶2-3次，吸尽里面液体，向瓶内加入1mL TRIZOL，放置在冰上20min，同时摇动培养瓶使液体与细胞充分接触，吹打细胞，使细胞脱落下来与TRIZOL液体混合均匀，转入1.5ml无酶EP管中。

②向EP管中加入200μL氯仿，手动上下颠倒15s使其混匀，室温下静置15min。

③12000g 4℃离心15min。

④离心后，EP管中液体分为3层，最上层无色水样为RNA，取其中400-500μL移至一新的无酶EP管中(注意千万不要吸入中间一层，避免RNA降解或污染)。

⑤向其中加入等体积预冷的异丙醇(量要大于或等于吸入量)，上下颠倒混匀3次，室温下静置10min。

⑥12000g4℃离心15min，同时配制1mL 75％冰乙醇放置4℃冰箱预冷(无水乙醇750μl+DEPC250μl)。

⑦离心后室温下放置5min，使RNA完全沉淀，弃上清，加1mL 75％冰乙醇颠倒数次，洗涤RNA沉淀。

⑧弃掉上清液，室温下干燥约10min(保证管内无残余乙醇、避免不要使RNA过度干燥)，将RNA溶于10μL无酶的DEPC处理水中。

⑨所有RNA样本用微量移液枪吸取2μL，用NanoDrop微量紫外分光光度计测定RNA浓度及260/280nm的OD值，以A260/280在1.8-2.0之间视为达标，上机检测细胞总RNA浓度。测定RNA浓度后将RNA逆转录成cDNA。以GAPDH为内参，设计一对特异性引物(表1)，引物合成由上海擎科生物工程公司完成，再行PCR扩增特异序列具体操作如下。

表1引物序列

①引物稀释：将装有上游引物的EP管以4000rpm离心4-5min，缓慢打开管盖，加入DEPC水稀释至10μM，盖上盖后充分震荡混匀备用。

②以cDNA为模板作PCR，每组3个复孔，构建20μL总反应体系。

③20μL反应体系：

cDNA 1μg，

正向引物0.6μL，

反向引物0.6μL，

2×SYBER Green Master Mix 10μL，

ddH₂O补至20μL。

⑤反应条件：95℃5min；(94℃15s，60℃30s，72℃45s)(40个循环)。

RT-PCR结果见图6(左)。

6.ELISA法检测细胞上清中PGD2抗原表达水平

ELISA试剂盒购自南京建成生物科技有限公司，具体方法参见试剂盒说明书，检测结果如图7所示，ADSC组、ADSC-Hpgds组感染细胞上清中PGD2水平结果显示：两组感染ADSCs后72h内在细胞上清中均可检出Hpgds的催化产物PGD2表达，两组间PGD₂表达相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结果如图6(右)所示。

动物实验

1.所有的实验动物处理都遵循美国实验动物饲养管理和使用指南。所有努力都为尽量减轻痛苦和小鼠使用为目的。将10只小鼠正常饲养一段时间，麻醉后，对小鼠进行剃毛处理后，在其背部切开一个1cm*1cm全层皮肤创口(图7示出了小鼠动物模型)。随机将小鼠分为(1)对照组(PBS注射组，Control)；(2)未携带目的基因的空病毒转染的脂肪干细胞组；(3)感染有携带Hpgds基因的慢病毒载体的重组脂肪干细胞组，每组5只小鼠。

2.重组脂肪干细胞创面移植：将含有目的基因载体的靶细胞(即感染了携带Hpgds基因的慢病毒载体的重组脂肪干细胞，ADSC-Hpgds)、对照组(PBS注射组，Control)以及未携带目的基因的空病毒转染的脂肪干细胞组(ADSC-PCDH))(密度为5×10⁵个/ML)与水凝胶支架(按1:4(v/v))(购买至美国TheWell bioscience)复合后，移植覆盖于小鼠创面；

所有伤口均用透明材料覆盖，并用绷带加以固定。动物在相同条件下进行饲养，每天观察创面的愈合情况和动物状态，包括创面面积变化情况、局部炎症、肉芽组织增生及上皮愈合情况和愈合皮肤愈后状况等。在第0、3、7、10、14、17天，采用CO₂吸入法处死小鼠，取标本进行组织学、实时定量PCR分析。

3.HE染色

①烤片：将石蜡切片置于65度烤箱中烤180分钟；

②脱蜡：先后放入二甲苯、二甲苯、二甲苯：无水乙醇(1:1)中，每个步骤5-10分钟；

③浸水：按顺序先后放入100％酒精、95％酒精、85％酒精、70％酒精中，每个步骤2-5分钟；最后置于蒸馏水中转入染液染色；

④转入苏木精染液染色5～15分钟；

⑤水洗玻片上多余染液，用0.5～1％盐酸酒精分色片刻。镜检下观察，细胞核及核内染色质清晰时终止，约数10秒钟；

⑥流水冲洗15～30分钟，或者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色；

⑦蒸馏水清洗；

⑧0.1～0.5％伊红染液染色1～5分钟，若着色困难，可在每100毫升染液中加入1～2滴冰醋酸，使易着色且不易脱色；

⑨依次经70％酒精、85％酒精、95％酒精、100％酒精，每步2-3分钟；

⑩二甲苯透明2次，共约10分钟；

封片：擦去标本周围多余二甲苯，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固，避免产生气泡；

镜检：在显微镜下观察染色结果。

3.免疫荧光检测

组织标本使用4％多聚甲醛固定48h，用PBS溶液冲洗3遍。0.1％Triton-X100透化固定2min，1％BSA封闭30min，加一抗于4℃孵化培育过夜，用含1％血清蛋白血清的PBS冲洗3遍后，取标记的山羊抗小鼠IgG的二抗(1:10001％BSA：PBS)室温下孵化培育45min。PBS冲洗3遍后，加入DAPI(1:50001％BSA：PBS)，常温下染核10min，PBS清洗后，用荧光显微镜拍照。

4.免疫组织化学染色

留取背部切口处含两侧1cm范围全层皮肤组织，以4％多聚甲酸固定和石蜡嵌入，制成石蜡组织切片，进行免疫组织化学染色。具体步骤如下:

①脱蜡前，将石蜡切片放入烤箱中180分钟。

②常规脱离水化，用PBS漂洗5min。

③内源性酶阻断：加入3％过氧化氢乙醇溶液室温下放置10min，减少非特异性染色。

④PBS漂洗3min后抗原修复：将切片放入盛有抗原修复溶液容器中，在高压锅内加水并加热至沸腾。再将容器置于高压锅内，加热至产生喷气，持续2min后自然冷却。

⑤PBS漂洗3min后封闭：在组织片上滴加山羊血清，室温孵育30min。弃去血清，滴加稀释的一抗，在湿盒中孵育，4℃过夜。

⑥PBS漂洗15min，滴加HRP标记的山羊抗兔多克隆抗体，37℃孵育45min。

⑦PBS漂洗15min后显色：将新鲜配置DAB显色液滴加至组织片上，室温孵育1-2min。

⑧衬染：苏木素衬染1min，自来水冲洗1min。盐酸酒精分化2s后流水冲洗，返蓝液中返蓝1min。

⑨脱水：将玻璃片一次置于75％，85％，95％，100％酒精脱水，每次10s。

⑩二甲苯I 5min，二甲苯II 10min进行透明二甲苯透明。

最后采用中性树胶封片，光镜下进行观察中性粒细胞和CD8T、I型胶原、新生血管的染色结果。

5.糖尿病创面愈合过程中炎症细胞分析，移植治疗后第7天，过表达Hpgds脂肪干细胞组、空病毒转染的脂肪干细胞组以及对照组中的新生组织中白细胞和CD8T细胞的染色结果见图8。

由此可见，过表达Hpgds脂肪干细胞组的新生组织中白细胞和CD8T细胞的数量显著低于空病毒转染的脂肪干细胞组和对照组。

移植治疗后第7天，过表达Hpgds脂肪干细胞组、空病毒转染的脂肪干细胞组以及PBS组中的新生组织中M2修复型巨噬细胞的染色结果见图9。

由此可见，过表达Hpgds脂肪干细胞组的新生组织中M2修复型巨噬细胞显著多于对照组，有助于促进创面由炎症期向增殖期转变。

6.在第10天，通过对PCNA、collagen I和CD31的检测，伤口愈合第10天创面中增殖细胞核抗原免疫荧光染色情况见图10，伤口愈合第10天创面中I型胶原(Collagen I)和血管内皮细胞标志物(CD31)的免疫组化染色见图11。过表达Hpgds脂肪干细胞组增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)蛋白免疫组化切片进行图像分析测得平均灰度值高于空载组(ADSC-PCDH)和对照组(Control)。过表达Hpgds脂肪干细胞组增殖状态的细胞显著高于对照组。同时新生组织中的新生血管和胶原组织含量显著多于对照组。

7.愈后速度检测

在创伤后第3、5、8、10、14、17d使用己消毒的透明薄膜紧贴于创面，沿创缘描绘创面的范围，并使用扫描仪进行扫描，用ImageJ软件计算创面面积，测算创面愈合率。创面愈合率(％)＝(初始面积一现面积)/初始面积*100％。图12为小鼠糖尿病创面的愈合过程。

结果显示过表达Hpgds脂肪干细胞组创面愈合的速度显著快于对照组。

8.愈合皮肤厚度统计

在创伤后第17d，测量新生组织厚度(表皮+真皮)，每个视野随机选择5个测量点，每组随机挑选4张非连续切片，随机取5个非重叠视野/片，用ImageJ软件进行测量。图13为小鼠糖尿病创面的愈合第17天创面的组织学观察及厚度统计。

结果显示过表达Hpgds脂肪干细胞组创面新生组织的厚度显著优于对照组。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种过表达Hpgds基因的重组脂肪干细胞，其特征在于，所述重组脂肪干细胞是通过将Hpgds基因转染到脂肪干细胞中获得。

2.根据权利要求1所述的重组脂肪干细胞，其特征在于，所述脂肪干细胞来源于人体脂肪组织。

3.根据权利要求1所述的重组脂肪干细胞，其特征在于， Hpgds基因的载体为慢病毒载体。

4.根据权利要求3所述的重组脂肪干细胞，其特征在于，所述慢病毒载体包括pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP。

5.权利要求1-4任一项所述的重组脂肪干细胞的制备方法，其特征在于，

构建表达Hpgds基因的慢病毒载体；

将所述表达Hpgds基因的慢病毒载体感染脂肪干细胞；

获得表达Hpgds基因的重组脂肪干细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括提取脂肪干细胞的步骤，所述提取脂肪干细胞采用胶原酶消化法。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述胶原酶消化的温度为36-38℃；消化时间为1-1.5小时。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述提取脂肪干细胞步骤之后还包括对提取获得的脂肪干细胞进行鉴定，包括成骨和成脂的鉴定。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表达Hpgds基因的慢病毒载体感染的感染复数值为300-400。

10.一种修复糖尿病创面组织的药物，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的重组脂肪干细胞。

11.根据权利要求10所述的修复糖尿病创面组织的药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a. 构建过表达Hpgds基因的重组脂肪干细胞；

b. 将所述重组脂肪干细胞与水凝胶支架混合，得到修复糖尿病创面组织的药物。

12.根据权利要求11所述的修复糖尿病创面组织的药物的制备方法，其特征在于，所述水凝胶支架为无动物源性RGD肽修饰多糖三维立体支架。

13.根据权利要求1-4任一项所述的重组脂肪干细胞在制备用于修复生物组织的药物中的应用。

14.根据权利要求1-4任一项所述的重组脂肪干细胞在制备用于修复糖尿病创面组织的药物中的应用。