CN114686426B - 一种原代羊膜干细胞的培养方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种原代羊膜干细胞的培养方法及其应用。本发明提供的原代羊膜干细胞的培养方法，主要包括如下步骤：于无菌条件下将胎盘剥离，然后经生理盐水洗涤，含杀菌剂的混合液洗涤，消化酶处理，培养基培养等；所述含杀菌剂的混合液包括如下组分及其重量百分数：蒲公英提取物1~2%，迷迭香纯露0.5~0.8%，维生素C 0.3~0.8%，纯化水96.4~98.2%；所述培养基由LB液体培养基、吐温‑20、IV型胶原、BI重组玻璃粘连蛋白组成。采用本发明提供的培养方法，可以加速细胞贴壁，将细胞中的组织清除干净，在缩短羊膜干细胞培养时间的前提下，提高了细胞纯度。
Description
技术领域
本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种原代羊膜干细胞的培养方法及其应用。
背景技术
人羊膜来源干细胞包括人羊膜上皮细胞(humanamnioticepithelialcells，hAEC)、人羊膜间充质干细胞(humanamnioticmes-enchymalstromalcells，hAMSC)。其中人羊膜上皮细胞具有表达多种胚胎干细胞标记物的特点和较全面的多向分化潜能，hMSCs比骨髓间充质干细胞有更强的增殖能力及干细胞特性。因此，由于其全能性，羊膜干细胞常用于各种细胞学、分子生物学的研究过程。
然而，现有的羊膜干细胞培养方法由于羊膜组织较薄，导致细胞贴壁困难，而组织消化过程较慢导致去除起来比较复杂，最终使羊膜干细胞的培养时间在20天左右，且在细胞培养过程中，即使是无菌环境下培养，也无法避免少量细菌的污染，导致培养的细胞纯度较低。
发明内容
针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明提供了一种原代羊膜干细胞的培养方法及其应用。采用本发明提供的培养方法，可以加速细胞贴壁，将细胞中的组织清除干净，在缩短羊膜干细胞培养时间的前提下，提高了细胞纯度。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种原代羊膜干细胞的培养方法，包括如下过程：
S1、于无菌条件下，将羊膜从胎盘中剥离出来，用生理盐水洗涤，去除羊膜上的血丝及黏稠物，然后于培养皿中切成6cm×6cm的组织小块，将羊膜的光滑面朝下放置，获得初步处理的羊膜组织块；
S2、将步骤S1获得的初步处理的羊膜组织块置于培养皿中，每个培养皿中放一个组织小块，然后向各培养皿中按2.5g/L的量添加消化酶，于23-27℃下消化28-32min，然后用生理盐水洗涤，制得经消化后的羊膜组织；
S3、将步骤S2获得的经消化后的羊膜组织剪碎成1~2cm的碎块，用含杀菌剂的混合液浸泡10~20min，然后用生理盐水洗涤，每次洗涤后进行离心，最后收集沉淀，获得待培养的细胞；
S4、将步骤S3获得的待培养的细胞用1.5~2mL的培养基重悬接种于T25培养瓶中，将培养瓶倒转，干燥15~20min，然后置于37℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养24h，添加1.5~2mL培养基，之后每隔三天加一次培养基，5~7天后观察细胞生长情况并照相，待细胞达80%融合时记为P0，收获细胞，即得。
优选地，步骤S2中培养皿的规格为90mm；所述消化酶由胰蛋白酶、凝乳酶与木聚糖酶按重量比8~15：2~4：1~3组成。
优选地，步骤S3所述含杀菌剂的混合液包括如下组分及其重量百分数：蒲公英提取物1~2%，迷迭香纯露0.5~0.8%，维生素C 0.3~0.8%，纯化水96.4~98.2%。
优选地，步骤S3所述含杀菌剂的混合液包括如下组分及其重量百分数：蒲公英提取物1.5%，迷迭香纯露0.7%，维生素C 0.6%，纯化水97.2%。
优选地，步骤S3所述的离心条件为于1500~2000r/min离心5~10min。
优选地，步骤S4所述的培养基由LB液体培养基、吐温-20、IV型胶原、BI重组玻璃粘连蛋白组成，制备过程如下：分别将吐温-20、IV型胶原、BI重组玻璃粘连蛋白加入LB液体培养基中，培养基中IV型胶原的终浓度为2~5μg/mL，BI重组玻璃粘连蛋白的浓度为0.1~0.2mg/mL，吐温-20的加入量为8~15μL/mL。
优选地，步骤S4所述的培养基中IV型胶原的终浓度为4μg/mL，BI重组玻璃粘连蛋白的浓度为0.15mg/mL，吐温-20的加入量为12μL/mL。
优选地，步骤S4中观察细胞生长情况的具体操作为：于倒置显微镜下观察，若见组织块周围有细胞爬出，半量换液一次，即弃去原培养瓶中一半的培养液，再加入等量的新鲜培养液，待细胞爬出面积达到培养瓶面积的30%时吸出组织块，补充培养液，此后隔日换液一次，待细胞长至80%融合时进行传代。
本发明还提供了一种所述的培养方法在培养原代羊膜干细胞中的应用。
基于羊膜组织轻薄，不易于贴壁，主要原因可能是其贴壁培养时间过长，基于此，本发明主要优化贴壁法制备原代羊膜干细胞，在研究过程中，发明人发现将组织块置于由胰蛋白酶、凝乳酶与木聚糖酶按重量比8~15：2~4：1~3组成的消化酶中消化一段时间，其在促进细胞贴壁的基础上，还可以帮助去掉多余组织，其效果高于常用的胰蛋白酶消化的效果，而在消化过程中，为了提高消化效果及细胞纯度，添加一次消化酶仅消化一层羊膜（即上皮层，其余4层不消化）。而进一步在含杀菌剂的混合液中浸泡一段时间，可以进一步清除羊膜组织表面的污物，避免其他组织污染，而杀菌剂的加入，可以避免细胞在浸泡过程中被其他细菌污染，提高了培养细胞的纯度。
同时，在对促进细胞贴壁过程的研究中，将获得的待培养的细胞用培养基重悬接种于T25培养瓶中，将培养瓶倒转，干燥15~20min，即将培养瓶中的羊膜短暂干燥，这样可以使羊膜更易于贴壁，在进行细胞培养时，采用由LB液体培养基、IV型胶原、BI重组玻璃粘连蛋白组成的培养基，可以加快细胞贴壁，有利于缩短细胞培养时间。现有制备工艺中原代羊膜干细胞制备时间为20天以上，本发明优化后将制备时间缩短至12.5-14.5天，最低缩短至12.5天。
在对各物质的筛选过程中，IV型胶原主要用于神经元细胞、神经胶质细胞的贴壁培养，对内皮细胞、肝细胞及上皮细胞等的贴壁效果不佳，发明人在对羊膜干细胞贴壁培养的研究过程中发现，本发明采用的培养基中发现在加入少量IV型胶原的前提下，可以降低BI重组玻璃粘连蛋白的添加量，经进一步深入研究，IV型胶原终浓度为2~5μg/mL时，可以将BI重组玻璃粘连蛋白的使用浓度降低至0.1~0.2mg/mL，且在低浓度的BI重组玻璃粘连蛋白下，对羊膜干细胞的贴壁仍然具有良好的促进作用，有效降低了细胞的培养时间，最佳添加浓度比例为4μg/mL：0.15mg/mL。而且，整个培养过程均是无菌条件下进行的，加上含杀菌剂的混合液的浸泡过程，双重避免了细菌污染羊膜干细胞，提高了细胞纯度。
与现有技术相比，本发明提供的原代羊膜干细胞的培养方法具有如下优势：
本发明提供的培养方法，可以加速细胞贴壁，将细胞中的组织清除干净，在缩短羊膜干细胞培养时间的前提下，将细胞纯度提高至95%以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
所述蒲公英提取物提取自菊科植物蒲公英的全草可购自南京泽朗生物科技有限公司；所述迷迭香纯露可购自华茂生物科技有限责任公司，CAS号为084604-14-8；所述IV型胶原可购自上海恒远生物科技有限公司；所述BI重组玻璃粘连蛋白即BioLamina人类重组层粘连蛋白，可购自广州百旺生物技术有限公司，型号为LN111-LN521；所述LB液体培养基可购自北京百奥森泰生物技术有限公司。
实施例1 一种原代羊膜干细胞的培养方法
所述原代羊膜干细胞的培养方法，制备过程如下：
S1、于无菌条件下，将羊膜从胎盘中剥离出来，用生理盐水洗涤3次，去除羊膜上的血丝及黏稠物，然后于培养皿中切成6cm×6cm的组织小块，将羊膜的光滑面朝下放置，获得初步处理的羊膜组织块；
S2、将步骤S1获得的初步处理的羊膜组织块置于90mm的培养皿中，每个培养皿中放一个组织小块，然后将胰蛋白酶、凝乳酶与木聚糖酶按重量比8：2：1的比例混合均匀制成消化酶，将消化酶分别加入到各培养皿中，按2.5g/L的添加量置于23℃下消化28min，然后用生理盐水洗涤2次，制得经消化后的羊膜组织；
S3、按如下组分及其重量百分数配制含杀菌剂的混合液：蒲公英提取物1%，迷迭香纯露0.5%，维生素C 0.3%，纯化水98.2%，然后将步骤S2获得的经消化后的羊膜组织剪碎成1~2cm的碎块，用配制好的含杀菌剂的混合液浸泡10min，然后用生理盐水洗涤2次，每次洗涤后进行离心，离心条件为于1500r/min离心10min，最后收集沉淀，获得待培养的细胞；
S4、配制培养基：分别将吐温-20、IV型胶原、BI重组玻璃粘连蛋白加入LB液体培养基中，培养基中IV型胶原的终浓度为2μg/mL，BI重组玻璃粘连蛋白的终浓度为0.2mg/mL，吐温-20的加入量为8μL/mL将步骤S3获得的待培养的细胞用1.5mL配制好的培养基重悬接种于T25培养瓶中，将培养瓶倒转，干燥15min，然后置于37℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养24h，添加1.5mL培养基，之后每隔三天加一次培养基，5~7天后观察细胞生长情况并照相，待细胞达80%融合时记为P0，具体观察过程为：于倒置显微镜下观察，若见组织块周围有细胞爬出，半量换液一次，即弃去原培养瓶中一半的培养液，再加入等量的新鲜培养液，待细胞爬出面积达到培养瓶面积的30%时可吸出组织块，补充培养液，此后隔日换液一次，待细胞长至80%融合时记为P0，收获细胞，即得。
实施例2 一种原代羊膜干细胞的培养方法
所述原代羊膜干细胞的培养方法，制备过程如下：
S1、于无菌条件下，将羊膜从胎盘中剥离出来，用生理盐水洗涤5次，去除羊膜上的血丝及黏稠物，然后于培养皿中切成6cm×6cm的组织小块，将羊膜的光滑面朝下放置，获得初步处理的羊膜组织块；
S2、将步骤S1获得的初步处理的羊膜组织块置于90mm的培养皿中，每个培养皿中放一个组织小块，然后将胰蛋白酶、凝乳酶与木聚糖酶按重量比15：4：3的比例混合制成消化酶，将消化酶分别添加至各培养皿中，按2.5g/L的量置于27℃下消化32min，然后用生理盐水洗涤4次，制得经消化后的羊膜组织；
S3、按如下组分及其重量百分数配制含杀菌剂的混合液：蒲公英提取物2%，迷迭香纯露0.8%，维生素C 0.8%，纯化水96.4%，然后将步骤S2获得的经消化后的羊膜组织用眼科镜剪碎成1~2cm的碎块，用配制好的含杀菌剂的混合液浸泡20min，然后用生理盐水洗涤3次，每次洗涤后进行离心，离心条件为于2000r/min离心5min，最后收集沉淀，获得待培养的细胞；
S4、配制培养基：分别将吐温-20、IV型胶原、BI重组玻璃粘连蛋白加入LB液体培养基中，培养基中IV型胶原的终浓度为5μg/mL，BI重组玻璃粘连蛋白的终浓度为0.1mg/mL，吐温-20的加入量为15μL/mL；然后将步骤S3获得的待培养的细胞用1.8mL配制好的培养基重悬接种于T25培养瓶中，将培养瓶倒转，干燥20min，然后置于37℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养24h，添加1.8mL培养基，之后每隔三天加一次培养基，5~7天后观察细胞生长情况并照相，待细胞达80%融合时记为P0，然后收获细胞，即得。
实施例3 一种原代羊膜干细胞的培养方法
所述原代羊膜干细胞的培养方法，制备过程如下：
S1、于无菌条件下，将羊膜从胎盘中剥离出来，用生理盐水洗涤4次，去除羊膜上的血丝及黏稠物，然后于培养皿中切成6cm×6cm的组织小块，将羊膜的光滑面朝下放置，获得初步处理的羊膜组织块；
S2、将步骤S1获得的初步处理的羊膜组织块置于90mm的培养皿中，每个培养皿中放一个组织小块，然后将胰蛋白酶、凝乳酶与木聚糖酶按重量比12：3：2的比例混合制成消化酶，将消化酶分别添加至各培养皿中，按2.5g/L的量置于25℃下消化30min，然后用生理盐水洗涤3次，制得经消化后的羊膜组织；
S3、按如下组分及其重量百分数配制含杀菌剂的混合液：蒲公英提取物1.5%，迷迭香纯露0.7%，维生素C 0.6%，纯化水97.2%，然后将步骤S2获得的经消化后的羊膜组织用眼科镜剪碎成1~2cm的碎块，用含杀菌剂的混合液浸泡15min，用生理盐水洗涤3次，每次洗涤后进行离心，离心条件为于1800rpm转速下处理17min，最后收集沉淀，获得待培养的细胞；
S4、配制培养基：分别将吐温-20、IV型胶原、BI重组玻璃粘连蛋白加入LB液体培养基中，培养基中IV型胶原的终浓度为4μg/mL，BI重组玻璃粘连蛋白的终浓度为0.15mg/mL，吐温-20的加入量为12μL/mL，然后将步骤S3获得的待培养的细胞用2mL配制好的培养基重悬接种于T25培养瓶中，将培养瓶倒转，干燥20min，然后置于37℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养24h，添加2mL培养基，之后每隔三天加一次培养基，5~7天后观察细胞生长情况并照相，待细胞达80%融合时记为P0，然后收获细胞，即得。
对比例1 一种原代羊膜干细胞的培养方法
所述原代羊膜干细胞的培养方法与实施例3类似；
与实施例2的区别在于，对比例1中的消化酶为胰蛋白酶。
对比例2 一种原代羊膜干细胞的培养方法
所述原代羊膜干细胞的培养方法与实施例3类似；
与实施例2的区别在于，对比例2中将含杀菌剂的混合液中的蒲公英提取物替换为甘草提取物。
对比例3 一种原代羊膜干细胞的培养方法
所述原代羊膜干细胞的培养方法与实施例3类似；
与实施例2的区别在于，对比例3配制培养基时，将IV型胶原替换为I型胶原，用量不变。
对比例4 一种原代羊膜干细胞的培养方法
所述原代羊膜干细胞的培养方法与实施例3类似；
与实施例2的区别在于，对比例4配制培养基时，BI重组玻璃粘连蛋白的浓度为0.5mg/mL，不含IV型胶原。
对比例5 一种原代羊膜干细胞的培养方法
采用现有培养方法。
用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm培养皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块置于75cm2培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO2、37℃培养箱中培养；2d后补液10mL DMEM完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后除去组织，定期换液（每隔2天），待细胞达到80%融合时传代培养。
试验例1 培养时间对比
1.试验方法：实施例1-3及对比例1-5的培养方法；
2.试验结果：统计各培养方法培养至80%融合时所需要的时间；具体试验结果如表1所示。
表1 不同试验方法培养至80%融合时所需时间
试验例2 细胞纯度对比
1.试验样品：实施例1-3及对比例2培养方法获得的P0代细胞；
2.检测方法：利用流式细胞术检测P0代细胞表型及细胞纯度，包括CD73、CD90、CD44、CD105、CD166、CD11b、CD19、CD34、CD45、 HLA-DR等表面标志物。具体检测过程为：将细胞悬液收集后离心，1000rpm，10min，去上清，细胞沉淀用4℃预冷的0.01 mol/L PBS液洗涤2次，1000rpm，10min，用200μL PBS缓冲液重悬细胞沉淀，取1×106个细胞用0.1ml预冷的0.01 mol/L PBS重悬，避光加入2uL相应CD73、CD90、CD105、CD44、CD166、阴性标记物（CD34、CD45、CD19、CD11b、HLA-DR）荧光抗体，4℃避光孵育30min，加入2mL PBS，l000 rpm，l0min，洗涤细胞以除去未结合的抗体，去上清，细胞沉淀用PBS液重悬，4℃送检，上流式细胞仪检测。
3.试验结果：冻存细胞大于等于2×107（经细胞计数仪自动计数所得），P0表型检测合格，表面标志物表达结果分别如表2、表3所示。
表2 不同因子表达结果
表3 不同因子的表达结果对比
由上述表2及表3可知，实施例1-3，CD73、CD90、 CD44、CD105、CD166表达率为95%以上，CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR分子表达率均低于1%，其中实施例2细胞纯度最高。而对比例2，CD73、CD90、 CD44、CD105、CD166表达率未达到95%，CD11b、CD19、CD34、CD45、 HLA-DR表达率在1%-2%之间，相比实施例1-3而言，对比例2组纯度显著下降。
需要说明的是，尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (6)
1.一种原代羊膜干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下过程：
S1、于无菌条件下，将羊膜从胎盘中剥离出来，用生理盐水洗涤，去除羊膜上的血丝及黏稠物，然后于培养皿中切成6cm×6cm的组织小块，将羊膜的光滑面朝下放置，获得初步处理的羊膜组织块；
S2、将步骤S1获得的初步处理的羊膜组织块置于培养皿中，每个培养皿中放一个组织小块，然后向各培养皿中按2.5g/L的量添加消化酶，于23-27℃下消化28-32min，然后用生理盐水洗涤，制得经消化后的羊膜组织；
S3、将步骤S2获得的经消化后的羊膜组织剪碎成1～2cm的碎块，用含杀菌剂的混合液浸泡10～20min，然后用生理盐水洗涤，每次洗涤后进行离心，最后收集沉淀，获得待培养的细胞；
S4、将步骤S3获得的待培养的细胞用1.5～2mL的培养基重悬接种于T25培养瓶中，将培养瓶倒转，干燥15～20min，然后置于37℃，体积分数为5％的CO2培养箱中培养24h，添加1.5～2mL培养基，之后每隔三天加一次培养基，5～7天后观察细胞生长情况并照相，待细胞达80％融合时记为P0，收获细胞，即得；
步骤S2中培养皿的规格为90mm；所述消化酶由胰蛋白酶、凝乳酶与木聚糖酶按重量比8～15：2～4：1～3组成；
步骤S3所述含杀菌剂的混合液包括如下组分及其重量百分数：蒲公英提取物1～2％，迷迭香纯露0.5～0.8％，维生素C 0.3～0.8％，纯化水96.4～98.2％；
步骤S4所述的培养基由LB液体培养基、吐温-20、IV型胶原、BI重组玻璃粘连蛋白组成，制备过程如下：分别将吐温-20、IV型胶原、BI重组玻璃粘连蛋白加入LB液体培养基中，培养基中IV型胶原的终浓度为2～5μg/mL，BI重组玻璃粘连蛋白的终浓度为0.1～0.2mg/mL，吐温-20的加入量为8～15μL/mL。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤S3所述含杀菌剂的混合液包括如下组分及其重量百分数：蒲公英提取物1.5％，迷迭香纯露0.7％，维生素C 0.6％，纯化水97.2％。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤S3所述的离心条件为于1500～2000r/min离心5～10min。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤S4所述的培养基中IV型胶原的终浓度为4μg/mL，BI重组玻璃粘连蛋白的终浓度为0.15mg/mL，吐温-20的加入量为12μL/mL。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤S4中观察细胞生长情况的具体操作为：于倒置显微镜下观察，若见组织块周围有细胞爬出，半量换液一次，即弃去原培养瓶中一半的培养液，再加入等量的新鲜培养液，待细胞爬出面积达到培养瓶面积的30％时吸出组织块，补充培养液，此后隔日换液一次，待细胞长至80％融合时进行传代。
6.一种如权利要求1-5任一所述的培养方法在原代羊膜干细胞中的应用。
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