CN113648417A

CN113648417A - Postn作为调控间充质干细胞分化能力的标志物及其应用

Info

Publication number: CN113648417A
Application number: CN202110276919.3A
Authority: CN
Inventors: 张毅; 于丰实; 刘伟江; 白海涛; 袁福临; 刘元林; 李雪; 王洋
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-03-15
Filing date: 2021-03-15
Publication date: 2021-11-16

Abstract

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种POSTN作为调控间充质干细胞分化能力的标志物及其应用。本发明公开了一种POSTN基因或蛋白作为调控脐带间充质干细胞分化能力的标志物中的应用。进一步，本发明还公开了一种调控间充质干细胞分化能力的制剂。本研究首次发现POSTN基因可以调控人脐带来源间充质干细胞的成脂肪细胞和成骨细胞分化功能，发现POSTN是脐带间充质干细胞成骨分化的重要调控基因，为脐带间充质干细胞在再生医学领域如骨损伤修复、骨质疏松治疗提供了新的研究策略。

Description

POSTN作为调控间充质干细胞分化能力的标志物及其应用

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种POSTN作为调控间充质干细胞分化能力的标志物及其应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是一类低免疫原性的成体干细胞，同时具有自我更新和多向分化潜能，MSC存在于全身多种组织和器官的间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，亦可从胎盘、脐带、肝脏、脂肪、肌肉、皮肤等多种组织中。MSC在维持骨形成和骨吸收平衡过程中起重要作用，且可在特定的微环境诱导下分化为软骨细胞和成骨细胞，其中成骨细胞可直接调节骨形成，对于骨缺损的修复再生和骨质疏松等骨科疾病的治疗有重要作用，因此MSC具有重要的临床应用价值。

POSTN是首先在小鼠成骨细胞系中发现的一种90kDa的细胞外基质蛋白，含有1个典型的信号序列、4个同源重复结构区域(FAS结构域)和一个C末端区域，缺少跨膜区域。最初发现，POSTN可促进成骨细胞和成骨前体细胞在骨膜的聚集分化；进一步研究结果表明，POSTN还可在***、骨组织和成纤维细胞中表达，在骨和心脏等组织的再生过程中发挥功能性作用，并可以促进伤口愈合。已有研究表明，POSTN通过与整合素家族FAK/AKT的细胞表面受体结合，转导细胞内的信号，促进各种组织或器官的发育或维持，是细胞生长分化重要调节蛋白。POSTN还可通过PI3K/AKT或Ras/p38MAPK/CREB等多个信号通路在多种细胞的增殖、迁移、血管生成、细胞因子产生和分化等各方面起调节作用。然而POSTN是否调控hUC-MSC(脐带间充质干细胞)成骨分化目前仍不清楚。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种调控间充质干细胞成骨和成脂分化的靶点POSTN及其在制备间充质干细胞成骨和成脂分化的产品中的应用。

本发明目的之二在于提供一种POSTN抑制剂或促进剂及其在骨缺损的修复再生和骨质疏松等骨相关疾病中的应用。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

本发明公开了POSTN可以调控脐带间充质干细胞成脂肪细胞和成骨细胞分化。脐带间充质干细胞是目前临床应用最为广泛的成体干细胞，其多向分化潜能用于再生医学领域，而本发明发现的POSTN敲低后脐带间充质干细胞成骨分化能力显著降低，影响其在骨损伤修复等领域的应用，因此发明人证实POSTN是脐带间充质干细胞成骨分化的重要调节分子，可以研发一种POSTN过表达的脐带间充质干细胞特异性用于骨损伤修复等疾病治疗。

首先，本发明提供了一种POSTN基因或蛋白作为调控间充质干细胞分化能力的标志物中的应用。

作为优选，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。

作为优选，所述分化能力为成骨分化能力和/或成脂分化能力。

本发明提供了一种POSTN基因或蛋白在制备间充质干细胞成骨和/或成脂诱导分化产品中的应用。

作为优选，所述产品包括POSTN基因或蛋白表达的抑制剂或促进剂。

本发明所述POSTN基因或蛋白表达的抑制剂或促进剂通过敲低或促进POSTN基因使得成骨和/或成脂分化标志物的表达显著发生变化，从而影响MSC成骨分化能力。

优选地，所述成骨分化标志物包括成骨细胞分化成熟的早期标志物ALP和成骨细胞分化成熟的晚期标志物OPN；所述成脂分化标志物包括ADI和PPARγ。

本发明还提供了一种调控间充质干细胞分化能力的制剂，所述制剂以POSTN的抑制剂或者POSTN的促进剂为活性成分。

优选地，所述POSTN的抑制剂或促进剂通过敲低或促进POSTN基因或蛋白表达，使得成骨分化标志物的表达显著发生变化，从而影响MSC成骨成脂分化能力。

优选地，所述POSTN促进剂为促进POSTN表达水平的试剂；

优选地，所述促进剂为过表达POSTN的载体。

作为优选，所述POSTN抑制剂包括POSTN shRNA；

优选地，所述POSTN shRNA的靶序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

进一步地，本发明提供了所述的间充质干细胞成骨分化的制剂通过调节间充质干细胞成骨分化在制备治疗骨缺损的修复再生和骨质疏松的药物中的应用。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本研究首次发现POSTN基因可以调控人脐带来源间充质干细胞的成脂肪细胞和成骨细胞分化功能，发现POSTN是脐带间充质干细胞成骨分化的重要调控基因，为脐带间充质干细胞在再生医学领域如骨损伤修复、骨质疏松治疗提供了新的研究策略，研发一种POSTN过表达的特异性可以特性用于治疗骨组织再生等。

附图说明

图1慢病毒感染hUC-MSC的效率验证；其中，图1A-F荧光显微镜观察结果，图1G流式细胞术检测结果，图1H q-PCR检测POSTN基因敲低效果。

图2稳定敲低POSTN的sh-POSTN-MSC的扩增与鉴定；图2A-F吉姆萨染色观察结果，图2G流式细胞术检测结果。

图3体外sh-POSTN-MSC的诱导分化能力鉴定，诱导组与自分化组比较；图3A-D油红O染色检测结果；图3E-F q-PCR检测成脂分化关键转录因子ADI和PPARγ表达结果，其中E是sh-NC-MSC，图3G-J ALP染色检测细胞ALP活性；图3K-L q-PCR检测成骨分化关键标志物ALP和OPN的表达结果。

图4体外sh-POSTN-MSC的成骨诱导分化能力鉴定，sh-NC-MSC诱导组与sh-POSTN-MSC诱导组比较；图4A-B ALP染色检测细胞ALP活性；图4C ALP染色面积；图4D q-PCR检测成骨分化关键标志物ALP和OPN。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明实施例3中ALP染色液实验的部分试剂配置：

固定液：移液器取柠檬酸40μl、去离子水2ml、丙酮3ml于青霉素瓶中混匀备用；

染色液：移液器取甲钴蓝62.5μl、磷酸萘酚AS-MX-二钠盐125μl、去离子水3ml于青霉素瓶中混匀备用。现配现用，染色液配制和使用时避光操作。

本发明实施例3中油红O染色液实验的部分试剂配置：

油红O染色液：量筒量取100ml去异丙醇于烧杯中，用天平称取油红O粉末0.5g，放入同一烧杯中，将烧杯至于磁力搅拌器室温搅1小时，使其充分溶解混匀，4℃避光保存。使用时，按照油红O与PBS缓冲液3:2的比例制成混合液。用滤纸过滤后进行染色。现配现用。

实施例1 hUC-MSC(人脐带来源间充质干细胞)的分离与培养

取无菌围产期废弃物的脐带组织，放在有α-MEM培养基的无菌蓝盖瓶，移到超净台后用PBS清洗组织血液，分离脐带组织；用高压灭菌三齿镊剥离脐带组织的2根动脉血管和1根静脉血管，将剥离的血管弃掉；用无菌手术剪刀将脐带剪成1cm的小段，在无菌的70％乙醇浸泡5min，然后放到含有PBS缓冲溶液的无菌培养皿；用上述无菌的三齿镊，将1cm脐带小段外层的羊膜剥离，然后在用镊子将剩余部分撕碎，然后用剪刀剪成1mm³小组织块，这些小组织放到0.1％胶原酶的EP管密封，放入37℃CO₂培养箱，消化40min；消化后的组织放入含有10％FBS的α-MEM的完全培养液的培养皿培养，3day更换新的完全培养基；组织爬出的长梭形贴壁细胞大约80％左右，加入冷的PBS缓冲液清洗2遍，0.25％胰酶消化贴壁，按1:3的比例传代，传代后的细胞即为P1代hUC-MSC。

实施例2慢病毒感染hUC-MSC及转染效率鉴定

1.慢病毒感染hUC-MSC

构建含有表达sh-POSTN基因的慢病毒载体(同时带有绿色荧光蛋白及抗嘌呤霉素基因序列)感染hUC-MSC(sh-POSTN-MSC)，用含有表达绿色荧光蛋白及抗嘌呤霉素基因序列的慢病毒感染hUC-MSC(sh-NC-MSC)作为对照。

所述shRNA序列如表1所示：

表1shRNA序列

基因	Target Seq
		POSTN	AAGCAGAAGATGACCTTTCAT，SEQ ID NO:1
NC	TTCTCCGAACGTGTCACGT，SEQ ID NO:2

具体方法如下：P3代hUC-MSC培养于75cm²培养瓶，待细胞融合度至60％左右，更换新鲜的α-MEM完全培养基，同时加入感染增强液HitransG A和慢病毒悬液，病毒感染指数MOI＝10，病毒悬液体积＝(MOI×病毒数目/病毒滴度)。24h后更换含嘌呤霉素(4×10^-6mol/L)的α-MEM完全培养基，4d后更换含嘌呤霉素(2×10^-6mol/L)的完全培养基培养。

2.转染效率鉴定

待细胞融合度达80％左右，荧光显微镜观察慢病毒载体感染hUC-MSC后绿色荧光蛋白(GFP)的表达；流式细胞术检测GFP荧光表达量。

所述流式细胞术检测GFP蛋白的表达方法如下：

细胞消化并离心后(悬浮细胞直接离心)，用PBS缓冲液重悬，计数细胞总量。去1.5ml EP管若干，根据实验目的将细胞加入相应数量的EP管中，每个EP管内的细胞在5×10⁵-1×10⁶之间。置于低温高速离心机离心，4℃，10分钟，转速3000转每分钟。离心后弃去上清，下层细胞沉淀用200μl PBS缓冲液重悬，用移液器充分混匀上机检测。

荧光显微镜下可见sh-NC-MSC和sh-POSTN-MSC胞内出现大量绿色荧光(图1A-F)。流式细胞术检测GFP蛋白的表达显示，未感染病毒的hUC-MSC组为(3.19±0.9)％，sh-NC-MSC组为(97.5±2.6)％、sh-POSTN-MSC组为(97.8±1.7)％(图1G)。

上述实验说明，慢病毒载体可以高效感染hUC-MSC，将携带的基因整合到hUC-MSC基因组并正常表达。

3.q-PCR检测POSTN基因mRNA水平的表达

将各组hUC-MSC继续用含嘌呤霉素(1×10^-6mol/L)的完全培养基进行扩增培养，收集部分细胞，提取总的RNA，q-PCR检测POSTN的mRNA水平表达情况，其余细胞扩增至P4代冻存备用。

所述q-PCR检测POSTN基因mRNA水平的表达方法如下：

根据实验需求选取需要的cDNA样本和引物，于MicroTM Optical 8-Tube Strip中配制qPCR体系：cDNA 1μl，2q-PCR Master Mix 10μl,引物(10μM)1μl，双蒸水8μl，总体积20μl。所述引物如表2所示。瞬时离心后于QuantStudio1 PCR仪上进行检测，程序：50℃，2分钟，95℃，10分钟；95℃，5s，60℃，1分钟，95℃，15秒，40个循环；60℃，1分钟，95℃，30s，60℃，15秒。所得数据，表示为x±s，用QuantStudio Design&Analysis软件处理q-PCR结果，SPSS 18.0软件分析数据，GraphPad Prism7.00作图。采用t检验分析组间差异，P值小于0.05即为具有统计学意义。

表2引物序列

结果表明，与hUC-MSC和sh-NC-MSC相比，sh-POSTN-MSC中POSTN的mRNA表达量显著降低(图1H)。所述sh-POSTN-MSC内POSTN基因mRNA表达量相较于hUC-MSC下降了86.3％，相较于sh-NC-MSC下降了86.0％。

以上结果证实带有POSTN敲减shRNA序列的慢病毒和对照组慢病毒均可高效感染hUC-MSC，且可有效抑制POSTN基因在hUC-MSC中的表达。

实施例3稳定敲低POSTN的sh-POSTN-MSC的扩增与鉴定

复苏P4代sh-NC-MSC和sh-POSTN-MSC，用含嘌呤霉素(1×10^-6mol/L)的α-MEM完全培养基培养并传代。培养至P5代或P6代时，更换不含嘌呤霉素的完全培养基培养，待细胞融合度达70％～80％，检测细胞形态、表型。

1.吉姆萨染色检测细胞形态

当细胞汇合度为70-80％时,弃去细胞上清，PBS缓冲液清洗细胞2次，加入70％乙醇固定15分钟，弃去乙醇，PBS缓冲液再次清洗细胞2次，根据细胞数量取适量的20×吉姆萨染色液，用PBS缓冲液稀释为1×吉姆萨染色液，加入细胞的培养容器中，染色1小时。染色结束后弃去染色液，PBS缓冲溶液清洗细胞2次，最后加入适量PBS缓冲液防止样本干燥，将染色好的细胞于倒置显微镜下观察。

2.流式细胞术检测细胞表型

所检测细胞消化并离心后(悬浮细胞直接离心)，用PBS缓冲液重悬，计数细胞总量。去1.5ml EP管若干，根据实验目的将细胞加入相应数量的EP管中，每个EP管内的细胞在5×105-1×106之间。置于低温高速离心机离心，4℃，10分钟，转速3000转每分钟。离心后弃去上清，下层细胞沉淀用200μl PBS缓冲液重悬，此时加入相应的流式抗体，每种抗体1μl，用移液器充分混匀抗体，4℃避光孵育30分钟。此后继续离心获得细胞沉淀，并用PBS缓冲液洗涤2次，离心机温度、离心时间、转速同上。最后用200μl PBS缓冲液重悬细胞，上机检测。加入流式抗体时及以后，所有的操作均在避光条件下进行。倒置显微镜观察感染慢病毒7d后的sh-NC-MSC和sh-POSTN-MSC，可见细胞均呈纤维样长梭形、涡旋状贴壁生长。

3.结果

吉姆萨染色观察(图2A-F)，培养的sh-NC-MSC和sh-POSTN-MSC在传至P6时仍呈纤维样长梭形、涡旋状贴壁生长；流式细胞术检测sh-NC-MSC和sh-POSTN-MSC的流式表型，结果表明(图2G)，sh-POSTN-MSC的表型没有发生变化。

上述结果均表明，sh-NC-MSC和sh-POSTN-MSC两组细胞与慢病毒感染前相比，细胞的形态及表型均未出现明显变化。

实施例4体外sh-POSTN-MSC的诱导分化能力鉴定与比较

1.体外sh-POSTN-MSC的成脂诱导分化能力鉴定

将P3代MSC接种至6孔板，进行成脂诱导分化的检测。

1.1成脂诱导

接种细胞数：自分化组2×10⁴/孔、诱导组8×10⁴/孔。自分化组用α-MEM完全培养基培养，诱导组用成脂诱导培养基培养，各组每3d全量换液。成脂诱导培养基：超净台中取含10％FBS的α-MEM培养基50ml于一次性离心管中，加入成脂诱导剂种类与终浓度如下：***1×10^-7mol/L，维生素C磷酸盐5×10^-5mol/L和β-磷酸甘油1×10^-2mol/L。4℃保存，一周内使用。

1.2成脂诱导分化检测

培养至16d时，成脂肪细胞进行油红O染色检测脂滴分布情况。在6孔板中的自分化组与成脂诱导组细胞弃去培养基，PBS缓冲液润洗2次，每孔加入4％中性甲醛缓冲液1ml固定20分钟,PBS缓冲液再次润洗2次，每孔加入1ml油红O染色液室温避光染色20分钟，加PBS缓冲液洗涤2次后，每孔再加入1ml PBS缓冲液，倒置显微镜下观察红色脂滴分布情况。拍照。

q-PCR检测成脂肪细胞中成脂标志物过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferator activated receptor gamma，PPARγ)和脂肪酶(adipsin，ADI)的mRNA表达量，所述方法参考实施例2中q-PCR检测方法，所述引物序列如表3所示。

结果如图3A-D所示，与自分化组相比，sh-NC-MSC和sh-POSTN-MSC细胞经成脂诱导分化后均出现大量脂滴，q-PCR检测成脂分化关键转录因子ADI和PPARγ的mRNA表达量均显著增加(图3E-F，P<0.001)。

2.体外sh-POSTN-MSC的成骨诱导分化能力鉴定

将P3代MSC接种至6孔板，进行成骨诱导分化的检测。

2.1成骨诱导

接种细胞数：自分化组2×10⁴/孔、诱导组2×10⁴/孔。自分化组用α-MEM完全培养基培养，诱导组用成骨诱导培养基培养各组每3d全量换液。成骨诱导培养基:超净台中取含10％FBS的α-MEM培养基50ml于一次性离心管中，加入成骨诱导剂种类与终浓度如下：***1×10^-6mol/L，胰岛素1×10^-5ng/L，IBMX 5×10^-4mol/L和吲哚美辛5×10^-4mol/L。4℃保存，一周内使用。

2.2成骨诱导分化检测

培养至16d时，成骨细胞进行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色检测胞内ALP活性，在6孔板中的对照组与成骨诱导组细胞弃去培养基，PBS缓冲液润洗2次，每孔加入丙酮1ml固定30s,PBS缓冲液再次润洗2次，每孔加入1ml ALP染色液室温避光染色30min，加PBS缓冲液洗涤2次后，每孔再加入1ml PBS缓冲液，倒置显微镜下观察ALP活性。拍照。

q-PCR检测成骨分化标志物骨桥蛋白(osteopontin，OPN)和ALP的mRNA相对表达量，所述方法参考实施例2中q-PCR检测方法，所述引物序列如表3所示。

表3引物序列

同样sh-NC-MSC和sh-POSTN-MSC经成骨诱导分化后，使用ALP染色检测细胞ALP活性，Image J分析ALP染色面积，结果表明，与自分化组相比，诱导组中的sh-NC-MSC和sh-POSTN-MSC细胞ALP活性均明显增加(图3G-J)；其中，在成骨诱导组中，sh-NC-MSC胞内ALP活性明显高于sh-POSTN-MSC(图4A-B)，Image J分析ALP染色面积的结果显示，sh-NC-MSC为(59.27±15.1％)，sh-POSTN-MSC为(26.49±6.75％)(图4C)。

q-PCR检测自分化组和诱导分化组中sh-NC-MSC和sh-POSTN-MSC内成骨分化关键标志物ALP和OPN的mRNA表达，结果显示，sh-NC-MSC诱导组的成骨标志物ALP和OPN的mRNA表达较sh-NC-MSC自分化组均显著增加(图3K,P<0.001)；sh-POSTN-MSC诱导组的OPN表达较sh-POSTN-MSC自分化组显著增加，但ALP的表达与自分化组不具有统计学差异(图3L)。同时，比较sh-NC-MSC诱导组和sh-POSTN-MSC诱导组中ALP和OPN的mRNA表达情况，结果发现与sh-NC-MSC诱导组相比，在sh-POSTN-MSC诱导组中ALP和OPN的mRNA表达均显著降低(图4D)。

上述结果表明，POSTN敲低后可抑制成骨分化标志物ALP和OPN表达。以上结果证实，敲低POSTN基因后，可抑制hUC-MSC成骨分化能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> POSTN作为调控间充质干细胞分化能力的标志物及其应用

<130> P210043

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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aagcagaaga tgacctttca t 21

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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ttctccgaac gtgtcacgt 19

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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tcaagatcat cagcaatgcc 20

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<212> DNA

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cgataccaaa gttgtcatgg a 21

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gaagaacgaa tcattacagg tcc 23

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cttcagagtt tcttctgttt ctcc 24

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cagaagaagg acaaactggg 20

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ccataccagt taaacaggct g 21

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tcagggttta gccatgtgg 19

Claims

1.一种POSTN基因或蛋白作为调控脐带间充质干细胞分化能力的标志物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述分化能力为成骨分化能力和/或成脂分化能力。

4.一种调控间充质干细胞分化能力的制剂，其特征在于，所述制剂以POSTN的抑制剂或者POSTN的促进剂为活性成分。

5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述分化能力为成骨分化能力和/或成脂分化能力。

6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述POSTN的抑制剂或促进剂通过敲低或促进POSTN基因或蛋白表达，使得成骨和/或成脂分化标志物的表达显著发生变化，从而影响MSC成骨成脂分化能力。

7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述POSTN促进剂为促进POSTN表达水平的试剂，优选的，所述促进剂为过表达POSTN的载体。

8.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述POSTN抑制剂包括POSTN shRNA，优选的，所述POSTN shRNA的靶序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

9.权利要求4-8任一项所述的间充质干细胞分化能力的制剂在制备间充质干细胞成骨和/或成脂诱导分化产品中的应用。

10.权利要求4-8任一项所述的间充质干细胞分化能力的制剂通过调节间充质干细胞成骨分化在制备治疗骨缺损的修复再生和骨质疏松的药物中的应用。