CN110577931B - 间断缺氧处理干细胞来源外泌体及在心肌组织中的应用 - Google Patents

Abstract

一种间充质干细胞来源的外泌体，对间充质干细胞进行间断缺氧刺激制得。本发明制得的外泌体具有更强的组织器官缺血‑再灌注损伤保护作用，提高了单位外泌体的生物学效应，更有利于对缺血性心脏疾病等的治疗。

Description

间断缺氧处理干细胞来源外泌体及在心肌组织中的应用

技术领域

本发明涉及一种经诱导产生的细胞外膜泡，尤其是涉及一种经诱导产生的外泌体，具有特定的组成和含量，适用于组织修复，如：心肌组织。

背景技术

作为旁分泌的重要媒介，外泌体(exosome)由于其特殊的生物学作用，越来越受到关注。外泌体是由活细胞分泌的膜泡，其具有执行蛋白、核酸的运输，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件，参与细胞间的通讯等功能，而不断受到重视。由于外泌体在细胞外环境中可长期存在而不被降解或稀释，并且能通过组织液或血液输送到较远的靶细胞中，且外泌体几乎无免疫原性，不会发生排斥反应。因此，外泌体作为理想的信息传递分子可用于组织修复的调控，如：对心肌缺血再灌注损伤进行调控。

为了对心肌缺血再灌注损伤的进行调控，有学者将研究着眼于间充质干细胞来源的外泌体对于心肌缺血再灌注损伤的修复作用，并取得了非常显著的成果。外泌体具有非常显著的临床转化优势。首先外泌体几乎没有抗原性，在目前的大规模外泌体研究中，大多是采用同种异体和异种异体的外泌体进行研究。外泌体在机体内不易募集免疫细胞的攻击，能够很好的包裹其内的内容物，作为一种极具潜力的药物载体，其能保护内容物而不至于在血液循环中被降解，具有极高的临床转化价值。

此外，目前研究发现大多数具有分化潜能的细胞，诸如：骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪间充质干细胞(ADMSC)、诱导多功能干细胞等都具有改善心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

然而，外泌体的分离技术目前尚在逐步发展中，因此外泌体得率低是阻碍外泌体转化临床应用的一大难题。如何获得单位保护作用更显著(即使单位外泌体所携带更丰富的心肌细胞保护因子)外泌体成为了目前必须要面对的挑战。

为此，通过参阅了近年来相关研究发现，目前对于外泌体的修饰多是采用慢病毒亦或是腺相关病毒在母体细胞中过表达某种已经证明对心肌缺血再灌注损伤有保护作用的蛋白分子、非编码RNA或通过脂质体、电穿孔等手段加载上述分子直接导入外泌体，进而提高单位外泌体对心肌损伤的保护作用。虽然，取得了一定的成效，但却对外泌体的临床应用转化设置了另外的一些障碍：一方面，外泌体其产生生物学作用是其内含物所产生的“合力”，单独的过表达或敲剪某单个分子，可能并不能在很大程度上产生外泌体生物学作用的变化；另一方面，目前提取外泌体的手段以及技术尚不成熟，得量不高，通过病毒感染或电穿孔等方式导入核酸进行外泌体修饰会对间充质干细胞生存状态产生影响，进而可能影响其外泌体合成的功能。第三，从临床转化角度而言，病毒感染等生物修饰手段目前存在很大的生物安全隐患，且成本过高，不利于临床转化。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种干细胞来源外泌体，其具有更高效、更显著的心脏保护作用。

本发明的另一个目的在于提供一种外泌体的制备方法，通过物理干预手段，以求改变间充质干细胞所分泌的外泌体内所含心脏保护分子如miRNA丰度及表达谱。

本发明的再一个目的在于提供一种脂肪来源间充质干细胞经过预处理，而分离获得的外泌体在制备心肌缺血-再灌注损伤药物中的应用。

本发明的又一个目的在于提供一种脂肪来源间充质干细胞经过预处理，而分离获得的外泌体在制备心肌缺血-再灌注损伤器械中的应用。

本发明的又一个目的在于提供一种脂肪来源间充质干细胞经过预处理，而分离获得的外泌体在制备调控心肌缺血-再灌注损伤中心肌细胞的凋亡水平的药物中的应用。

本发明的又一个目的在于提供一种脂肪来源间充质干细胞经过预处理，而分离获得的外泌体在制备调控心肌缺血-再灌注损伤中心肌细胞的凋亡水平的器械中的应用。

多种组织来源的间充质干细胞可应用于本发明。考虑到相较于其他间充质干细胞而言，在脂肪组织中间充质干细胞含量更高，而且ADMSC的固有生物学特征也较其他种类的MSCs更为稳定。就临床转化潜力而言，脂肪组织也是自体外泌体提取的最方便途径，也较其他组织来源的MSCs更容易被患者接受，因此具有较其他组织来源的MSCs无法比拟的临床转化潜力。在本发明中，优选选择ADMSC作为提取外泌体的母细胞，以及以此通过物理诱导的手段获得外泌体。

一种间充质干细胞来源的外泌体，其主要含有microRNA 224-5p。

另一种间充质干细胞来源的外泌体，其主要含有microRNA 224-5p与microRNA141-3p、microRNA 34a-5p、microRNA 23a-3p、microRNA 130a-3p、microRNA 23b-3p、microRNA 200a-3p、microRNA 93-5p、microRNA 301a-3p和microRNA 152-3p等非编码RNA，这些物质单独或组合具有心肌(细胞)保护作用的。

本发明提供的间充质干细胞来源的外泌体对心肌缺血-再灌注损伤具有显著的修复的功能，对心脏保护作用更高效、更显著。

本发明提供的间充质干细胞来源的外泌体能以细胞焦亡的机制调控心肌缺血-再灌注损伤中心肌细胞的凋亡水平。

将本发明提供的间充质干细胞来源的外泌体制成药物，用于调控心肌缺血-再灌注损伤中心肌细胞的凋亡水平，实现对心肌缺血-再灌注损伤的修复。

将本发明提供的间充质干细胞来源的外泌体施于载体(如：但不限于PLGA和金属等材料制成的支架)上制成医疗器械，用于调控心肌缺血-再灌注损伤中心肌细胞的凋亡水平，实现对心肌缺血-再灌注损伤的修复。

本发明的间充质干细胞来源的外泌体通过对间充质干细胞进行间断缺氧(即2次以上缺氧/复氧刺激，比如：至少缺氧→复氧→缺氧→复氧→缺氧→复氧共3个循环)干预制得，具有心肌保护作用。

一种间充质干细胞来源的外泌体的制取方法，包括如下步骤：

当P2～P3代的间充质干细胞汇合率达85％～90％时，通过缺氧小室对容器(如：培养皿)中的细胞进行间断的缺氧刺激，即通过缺氧→复氧→缺氧→复氧→缺氧→复氧共3个循环后，将细胞培养基更换为含有5v/v去除外泌体的胎牛血清的DMEM-F12完全培养基后于培养箱中孵育24小时～36小时后收集培养基，获取细胞培养上清液，并进行膜过滤(如：0.22μm)后，收集滤液；再将滤液置于300g～100000g转速下差速离心后获得沉淀，即为外泌体。

缺氧，即将脂肪间充质干细胞置于缺氧小室中，把细胞培养基更换为无糖无血清的DMEM培养基后，对小室内通入80v/v％～95v/v％氮气和0v/v％～5v/v％二氧化碳的混合气体并通过氧电池检测缺氧小室内气体氧浓度直至氧气浓度为0v/v％后关闭小室通气阀门隔绝细胞糖分及氧气供应45分钟～60分钟。

复氧，即打开缺氧小室阀门，并将培养基更换为具有糖分的DMEM-F12培养基后移入5v/v％二氧化碳、37℃培养箱中孵育1小时。

为了提高外泌体的富集效率，一种具体的差速离心实施方式，4℃，分别于转速300g、2,000g、10,000g、100,000g和100,000g离心，最后所得沉淀即为外泌体。

另一种具体的差速离心实施方式，4℃，分别于转速300g、2,000g、10,000g和100,000g离心10分钟～60分钟，将所得沉淀重悬后，于100,000g离心70分钟，最后所得沉淀即为外泌体。

另一种具体的差速离心实施方式，先在4℃300g转速离心10分钟，取上清液；然后于4℃2,000g转速离心10分钟，取上清液；再于4℃10,000g转速离心60分钟，取上清液；接着于4℃100,000g转速离心70分钟，弃去上清，PBS重悬沉淀；最后于4℃100,000g转速离心70分钟后沉淀即为外泌体。

本发明提供的间断缺氧的预处理方法干预脂肪间充质干细胞后所获取的外泌体，具有较未干预的间充质干细胞来源的外泌体更为显著的细胞和组织修复的作用，可制成药物或医疗器械用于细胞和组织修复，尤其是在心肌细胞损伤修复及心肌组织缺血-再灌注损伤保护中的应用。

本发明技术方案实现的有益效果：

使用本发明提供的预处理方法所干预的脂肪间充质干细胞所分泌的外泌体(INTEXO)，从组织或细胞来源方面，本发明使用脂肪间充质干细胞，该组织取材容易，间充质干细胞富集程度高，且容易在临床应用中被人群接受，具有良好的临床转化潜力。在预处理方法方面，本发明摒弃了通过利用病毒、质粒等生物学手段改变外泌体内含成分的方法，而通过物理的手段，用短暂的、间断的、非损伤性的缺氧/复氧刺激来预处理脂肪间充质干细胞，使之对缺氧刺激产生反馈，进而加载更丰富的具有心肌保护作用的miRNA入外泌体，产生更显著的心肌细胞及心肌组织缺血再灌注损伤的保护作用。

本发明方法的制取的外泌体对细胞和组织具有修复作用，尤其是对心肌细胞增殖和损伤修复有重要的改善作用，有用于治疗心肌梗死、组织器官栓塞、血管再通后再灌注损伤的临床转化潜力，具有较高的安全性及临床实用性及可行性。

附图说明

图1为脂肪间充质干细胞表面标志物的流式鉴定图；

图2为脂肪间充质干细胞来源的外泌体电镜鉴定图；

图3为Western Blot对外泌体表面抗原分子的鉴定图；

图4为脂肪间充质干细胞来源的外泌体NTA粒径分析鉴定图；

图5A为心肌细胞缺氧/复氧后焦亡通路信号分子表达变化，经过诱导生成的外泌体(INTEXO)及未干预脂肪间充质干细胞来源的外泌体(EXO)在体外心肌细胞缺氧复氧损伤模型中产生的对细胞焦亡的Western Blot结果图；其中，“A”图为心肌细胞缺氧/复氧干预后焦亡通路信号分子表达变化情况；“B”图为统计学分析，*代表与IR组相比P＜0.05；CON代表正常心肌细胞；IR代表缺氧复氧干预后的心肌细胞组；IR+EXO代表缺氧复氧干预后的心肌细胞组加入ADMSC来源的外泌体组；IR+INTEXO代表缺氧复氧干预后的心肌细胞组加入间断缺氧处理后的ADMSC来源的外泌体组；

图5B为心肌细胞缺氧/复氧后凋亡通路信号分子表达变化，经过诱导生成的外泌体(INTEXO)及未干预脂肪间充质干细胞来源的外泌体(EXO)在体外心肌细胞缺氧复氧损伤模型中产生的对细胞凋亡的Western Blot结果图；其中，“A”图为心肌细胞缺氧/复氧干预后凋亡通路信号分子表达变化情况；“B”图为统计学分析，*代表与IR组相比P＜0.05；CON代表正常心肌细胞；IR代表缺氧复氧干预后的心肌细胞组；IR+EXO代表缺氧复氧干预后的心肌细胞组加入ADMSC来源的外泌体组；IR+INTEXO代表缺氧复氧干预后的心肌细胞组加入间断缺氧处理后的ADMSC来源的外泌体组；

图5C为INTEXO及EXO在体外心肌细胞缺氧复氧损伤模型中对心肌细胞的凋亡的保护作用的AnnexinV-PI流式结果图；其中，“A”图CON代表正常心肌细胞；“B”图IR代表缺氧复氧干预后的心肌细胞组；“C”图IR+EXO代表缺氧复氧干预后的心肌细胞组加入ADMSC来源的外泌体组；“D”图IR+INTEXO代表缺氧复氧干预后的心肌细胞组加入间断缺氧处理后的ADMSC来源的外泌体组；“E”图为统计学分析；“A”图、“B”图、“C”图和“D”图，其左上象限表示死亡细胞比例；右上象限表示晚期凋亡细胞比例；左下象限表示正常存活细胞比例；右下象限表示早期凋亡细胞比例；与IR相比，*P＜0.05；

图6A为INTEXO及EXO在体内小鼠心肌缺血再灌注(IR)模型中对心肌细胞焦亡及凋亡的Western Blot结果图；其中，“A”图为小鼠心肌缺血再灌注术后焦亡通路信号分子表达变化情况；“B”图为统计学分析，*代表与IR组相比P＜0.05；CON代表正常小鼠心肌组织组；IR代表小鼠心肌缺血再灌注术后组；IR+EXO代表小鼠心肌缺血再灌注术后组通过尾静脉注射入ADMSC来源的外泌体组；IR+INTEXO代表小鼠心肌缺血再灌注术后组尾静脉注射入间断缺氧处理后的ADMSC来源的外泌体组；

图6B为INTEXO及EXO在体内小鼠心肌缺血再灌注(IR)模型中对心肌细胞焦亡及凋亡的Western Blot结果图；其中，“A”图为小鼠心肌缺血再灌注术后焦亡通路信号分子表达变化情况；“B”图为统计学分析，*代表与IR组相比P＜0.05；CON代表正常小鼠心肌组织组；IR代表小鼠心肌缺血再灌注术后组；IR+EXO代表小鼠心肌缺血再灌注术后组通过尾静脉注射入ADMSC来源的外泌体组；IR+INTEXO代表小鼠心肌缺血再灌注术后组尾静脉注射入间断缺氧处理后的ADMSC来源的外泌体组；

图6C为INTEXO及EXO在体内小鼠IR模型中评估各组小鼠心肌组织梗死比例的Evensblue/TTC染色结果图；其中，IR为心肌缺血再灌注组；IR+EXO为心肌缺血再灌注后注射ADMSC来源的外泌体组；IR+INTEXO为心肌缺血再灌注后注射间断缺氧预处理的ADMSC来源的外泌体组；AAR即Area in risk为危险面积；IS为梗死面积；Total Area为总面积；与IR组相比，*P＜0.05；

图6D为INTEXO及EXO在体内小鼠IR模型中评估各组小鼠心脏收缩功能的心脏超声结果图；其中，“A”图术后第3天小鼠心功能；“B”图术后第7天小鼠心功能；IR为心肌缺血再灌注组；IR+EXO为心肌缺血再灌注后注射ADMSC来源的外泌体组；IR+INTEXO为心肌缺血再灌注后注射间断缺氧预处理的ADMSC来源的外泌体组；EF：左心室射血分数；FS：左心室短轴收缩率；与野生(WT)小鼠组比，*P＜0.05；

图6E为INTEXO及EXO在体内小鼠IR模型中评估各组小鼠心脏原位凋亡TUNEL染色结果图；其中，IR为心肌缺血再灌注组；IR+EXO为心肌缺血再灌注后注射ADMSC来源的外泌体组；IR+INTEXO为心肌缺血再灌注后注射间断缺氧预处理的ADMSC来源的外泌体组；“A”图为心肌缺血再灌注后Tunnel染色检测心肌组织中原位心肌细胞凋亡变化；“B”图为细胞凋亡例统计学分析；与IR组相比，*P＜0.05；

图7为INTEXO及EXO两组外泌体内miRNA表达差异测序结果；其中，EXO代表ADMSC来源的外泌体组；INTEXO代表间断缺氧预处理的ADMSC来源的外泌体；具体样本单元数值为其Z-SCORE数据标准化后的相对表达量；右侧列为miRNA名称，下侧列各组样本名称；

图8为INTEXO及EXO中表达差异最显著的miRNA224-5p与其靶位点TXNIP的双荧光素酶报告基因结合验证结果；其中，3’UTR-NC代表TXNIP 3’UTR过表达质粒的阴性对照；3’UTR-WT代表TXNIP 3’UTR过表达质粒；3’UTR-Mut代表TXNIP 3’UTR突变型过表达质粒；MiR224-5p代表MicroRNA 224-5p质粒；MiR 224-5p-NC代表MicroRNA 224-5p质粒的阴性对照；与其他各组相比，*P＜0.05。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明实施例其它所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。

本实施例中获取P2～P3代脂肪间充质干细胞的方法如下：

步骤1：获取临床脂肪样本或提取实验动物腹股沟处脂肪组织；

步骤2：将脂肪组织剪碎为小块；

步骤3：加入等体积IV型胶原酶消化(胶原酶溶于DMEM/F12完全培养基中)；

步骤4：置于37℃恒温摇床中，充分振荡；

步骤5：离心后吸取上层油脂、中层培养基及组织、胶原酶混合溶液后，用DMEM/F12完全培养基重悬底层沉淀细胞，分离得到脂肪间充质干细胞，接种(如：于T25em²型细胞培养瓶中)，并进行原代培养和传代培养。

步骤6：取P2～P3细胞进行流式表面抗原鉴定；

步骤7：取P2～P3细胞接种并进行培养细胞；

步骤8：当P2～P3脂肪间充质干细胞汇合率达85％～90％时，对ADMSC进行间断缺氧干预后，孵育24h后收集上清。

胶原酶的终浓度0.1w/v％～0.2w/v％，消化时间为100分钟～120分钟，消化温度为37℃±1℃，还配合采用速率为200rpm～220rpm的振荡。

间充质干细胞培养过程中每隔3天更换一次培养基，直至细胞愈合度达到85％～90％进行培养基收集。

流式表面抗原鉴定使用的抗体为下列鼠抗人单克隆抗体：CD29、CD45、CD90为阳性指标，以CD34、CD105、CD106为阴性标志物，以同种属、标记的非特异性抗体作为同型对照。

实施例1脂肪间充质干细胞分离制备、间断缺氧处理及鉴定

取4-6周龄的SD大鼠；处死(麻醉处死)不用剪毛；75％的酒精浸泡10mins，不宜过长时间，以免影响细胞活性。

配置消化液(含双抗及10％FBS的DMEM-F12完全培养基，胶原酶)：将胶原酶(经过测试，胶原酶I、II和IV型均可用于本步骤)以0.075％～0.1％比例加入F-12完全培养基中，一般一次实验大鼠数量在1只需要5ml消化液，以此类推，混匀后，0.22um滤网过滤，过滤后备用。

通风橱内将大鼠从酒精溶液中取出，俯卧位至于无菌培养皿中，沿着背部冠状轴从大鼠尾部上方1em处剪开背部皮肤，剪到胸腔水平即可，然后用两把16cm的弯镊子夹用镊子弯曲部位夹住两侧皮肤，向两侧扯开大鼠背部皮肤，扯开至大鼠下肢根部，暴露腹股沟皮下组织，可见大鼠两侧腹股沟近背侧，有大约1cm平方左右的白色脂肪团，用眼科镊，将之小心剥离，勿刺破腹膜以免污染；将采取的脂肪团块放置于无菌培养皿中，上面滴入几滴完全F12培养基，以免脂肪组织变干，用眼科剪或超声组织破碎仪将脂肪组织剪成极细小的肉糜样即可，将上述剪碎的脂肪组织置于之前配置的胶原酶培养基中，37℃摇床上以180～200转速摇动90分钟，结束后可见整个胶原酶培养基呈现乳白色。

将上述溶液于离心机37℃离心1000rpm 5mins后，可见三层分层，由上至下分别是棉絮状的脂肪层，培养基层，游离细胞(包括脂肪干细胞)及较大的组织块。将棉絮状的脂肪层小心的用巴氏管吸出(第一层只能吸出不能倒出，否则会粘附在管壁上)，待第一层脂肪吸完后，可以倒出第二层培养基，然后用F12完全培养基重悬第三层细胞层后，传于培养皿中即可(按一只大鼠两个10cm皿铺细胞即可)；用F12完全培养基培养上述细胞3-5天，3天内不要动细胞(比如拿出来去显微镜下看看，因为移动时液体的波动会影响脂肪间充质干细胞(ADMSC)贴壁，待3日后可观察细胞贴壁情况，若发现细胞已经贴壁，则可以进行第一次换液，若发现细胞贴壁较少，则可以继续培养2d，至提取后5d再进行换液，一般第一次换液后就能迅速生长。一般到了P2就能获得95％纯度以上的脂肪干细胞了。可用于后续实验。

将ADMSC弃去上清后，加入适量无糖无血清的DMEM培养基。然后将该细胞置于缺氧复氧小室中，扣紧盖子。将缺氧复氧小室的两个进气口分别连接至氮气和二氧化碳出气孔，根据流量计显示读数指导同时充入氮气和二氧化碳数(比例为95∶5)数分钟直至氧气从排气口完全排出，采用氧电极测得出气口氧浓度为零后，关闭氮气和二氧化碳出气孔，并夹闭缺氧复氧小室所有管道，以保持密闭状态。然后将缺氧复氧小室置入37℃培养箱中继续缺氧培养1小时，而后将缺氧复氧小室打开，取出细胞板置入37℃5％CO₂培养箱中继续复氧培养1小时，将上述步骤重复3次，将无糖无血清培养基置换为F12-DMEM+10％FBS(无外泌体血清)的完全培养液，即完成对ADMSC间断缺氧刺激，24h后收集上清液，提取外泌体。

原代脂肪间充质干细胞生长接近瓶底的80％时，吸去上清，加入0.125％胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000rpm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1∶2比例接种到新的培养瓶，置于5％CO₂，37℃，饱和湿度95％的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80％时，重复以上操作，再次传代。

取第3代细胞以0.125％胰酶消化，离心，PBS洗涤收获细胞，计数调整细胞密度为5×10⁶/ml，取100μl细胞悬液分别与CD29，CD34，CD45，CD90，CD105，CD106单克隆抗体室温闭光反应30min，用洗涤液洗涤2次，离心，送流式细胞仪检测表面标记(参见图1)，结果可见，阳性对照CD29、CD45、CD90；以及阴性对照CD34、CD105、CD106，其中CD29阳性比例为98.6％；CD45阳性比例为98.7；CD90阳性比例为97.7％。而阴性对照中，CD34阳性比例为99.2％；CD105阳性比例为99.7；CD106阳性比例为87.2％。

因此，根据流式结果所示，阳性对照和阴性对照比例均高于70％，这说明本次研究所提取的ADMSC的纯度及表型均符合实验的要求，可以从之提取外泌体进行下一步研究。

实施例2脂肪间充质干细胞外泌体的提取和鉴定

外泌体的提取：提取细胞上清，将上清液移至一个新的管中离心(200g，20分钟，4℃)；小心地再将上清液移至新的管中离心(10,000g，30分钟，4℃)来去除较大的囊泡；此阶段的样品可以用0.22μm的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110,000g(Sorvall WXULTRA SERIES，rotor F65L)2小时4℃，用冷的PBS重悬后再次超速离心(110,000g，1小时，4℃)，将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬，外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏。

外泌体的电镜鉴定：将外泌体溶液和4％多聚甲醛按1∶1混合(总体积10～20μl足够)，滴在干净的塑料薄膜上形成液滴，然后将电镜碳网的正面扣在液滴上，放置20min；将碳网放置于100ul PBS液滴上，洗两次，每次3min；将碳网放置于100μl 50mM甘氨酸液滴上，3min，重复3次；封闭：将碳网放置于100μl 5％BSA封闭液上，封闭10min；一抗用一抗稀释液进行稀释，碳网置于20μl一抗液滴上孵育30min；将碳网置于100μl wash buffer液滴上，3min，洗6次；标记有胶体金的二抗(抗鼠、兔等与一抗对应)按1∶20稀释，碳网放置其上30min；碳网置于0.5BSA 100μl液滴，3min，洗6次；碳网置于100μl PBS液滴上，2min，洗6次；碳网置于100μl 1％戊二醛液滴上，放置2min；碳网置于100μl去离子水液滴上，2min，洗6次；10μl醋酸双氧铀负染90s，烤干碳网，上机检测(参见图2)。

外泌体标志物的流式检测：本实施例使用BD accuri C6 flow cytomenter仪器分析样品ADMSC来源的外泌体溶液中的微粒CD63和CD81两个特异性抗体的表达情况。通过超滤管尽可能浓缩外泌体溶液，每个流式检测的外泌体需要包含500ng的蛋白，每次上洋取100ul溶液，同时准备同型对照的样本；样本管中加入5ng的CD63-APC和CD81-APC流式抗体；对照管中加入5ng对应的同型对照抗体，避光，4℃持续混匀孵育1小时后上机检测。

如表1所示，CD63和CD81两个特异性抗体的表达情况，得到的经染色后外泌体均呈阳性，阳性率在76.8％～81.7％。其中，CD63和CD81在溶液微粒中表达比例较高，故认为外泌体提取成功(详见表1)。

表1外泌体流式鉴定表面标志物CD63、CD81阳性微粒的比例

另采用western blot的方法鉴定了ADMSC及ADMSC来源的外泌体表面标志物TSG101和CD9分子，以及外泌体阴性对照Calcexin。如图3所示，在外泌体组中均有TSG101及CD9表达，而作为外泌体的阴性对照钙联接蛋白Calcexin呈阴性，故westernblot结果同样表明，外泌体提取成功。

外泌体NTA粒径检测：将外泌体溶解于500μL充分吹打混匀后取300μl上机，采用NanoSight LM10-HS纳米颗粒分析仪进行粒径和浓度分析。加入450μl PBE重悬样本装备上机检测。如图4所示，外泌体溶液中微粒直径分布曲线呈单峰曲线，表明外泌体溶液中微粒呈一致性分布，杂质较少，而121.7nm直径的微粒占总体微粒总数的98.2％，此内径在30nm～15nm内，说明本研究外泌体提取成果，且外泌体溶液中杂质较少，符合实验条件。

实施例3INTEXO及EXO体外心肌细胞保护作用的研究

实验分四组，分别为：正常细胞组(NC组)、缺氧/复氧组(IR)、缺氧/复氧+外泌体组(IR+EXO)和缺氧/复氧+经过间断缺氧预处理ADMSC来源的外泌体组(IR+INTEXO)

焦亡及凋亡通路相关蛋白的表达变化：将ADMSC及经过本发明预处理后的ADMSC所分泌的外泌体30μg加入6孔板中相对应的已经经过缺氧处理的大鼠心肌细胞培养基中，孵育12小时后，收集细胞；蛋白裂解液的配制：取一支洁净的离心管，加入10ml的RIPA强裂解液，而后向其中加入1片蛋白酶抑制剂和1片磷酸酶抑制剂，充分溶解混匀后，分装至数个EP管中，于-20℃冰箱中保存待用。

细胞裂解：将细胞培养板从37℃培养箱中取出，弃掉6孔培养板中的细胞上清，每孔中加入1ml的1×PBS，清洗培养细胞，而后弃去清洗液，如此重复洗涤两次。最后一次洗涤后一定要尽量将PBS清除干净，不要有残留。然后，每个细胞孔加入200μl的RIPA强裂解液，将6孔板置于冰上5分钟，用细胞刮刮下细胞裂解液，并将所有液体转移至新的EP管中，并放置于冰上继续裂解20分钟，期间每10mins震荡一次使细胞充***解。后在4℃12000g离心10分钟，提取上清至另一个EP管中，加入5×SDS loading buffer后95℃煮5分钟；蛋白样本可用来WesternBlot检测或保存在-80℃；Western Blot鉴定心肌细胞焦亡及凋亡通路相关蛋白。

对于心肌细胞缺氧/复氧后及加入ADMSC来源的外泌体的各组进行了焦亡通路相关分子信号的Western Blot检测。结果如图5A所示，缺氧1小时，复氧2小时后，IR组心肌细胞TXNIP、NLRP3、Cleaved caspase-1和IL-1β均较CON组明显升高。而在IR+EXO及IR+INTEXO组中，其TXNIP、Cleaved caspase-1和IL-1β水平与IR组比较则明显降低，而且IR+INTEXO组下降趋势更为明显。此外，在加入外泌体的两组中，其NLRP3水平较IR组有下降趋势，但无统计学差异。ASC水平在四组中无明显差异。

对于心肌细胞缺氧/复氧后及加入ADMSC来源的外泌体的各组进行了凋亡通路相关分子信号的Western Blot检测。结果如图5B所示，缺氧1小时，复氧2小时后，IR组心肌细胞BAX和Cleaved caspase-3表达水平均较CON组明显升高，而GATA4及Bcl-2水平明显下降。而在IR+EXO及IR+INTEXO组中，其BAX和Cleaved caspase-3表达水平均较IR组明显降低，而且IR+INTEXO组下降趋势更为明显；GATA4及Bcl-2水平明显升高，IR+INTEXO组升高趋势更为明显。

AnnexinV-PI检测心肌细胞凋亡水平：先用胰酶消化四组细胞，细胞计数后取约1×10⁶个/ml细胞，1000rpm，室温离心5分钟，弃上清；加入1ml冷的PBS洗涤细胞，轻轻震荡使细胞悬浮；1000rpm，室温离心5分钟，弃上清；重复两次；将细胞重悬于200μl BindingBuffer；加入5ul AnnexinV-FITC轻轻混匀；避光室温反应15分钟；加入300μl BindingBuffer(总反应体积500μl)以及5μl PI，在1小时内上机检测。如图5C所示，心肌细胞在经历缺氧复氧后早期细胞凋亡比率为30.133％±2.579％，较对照组明显增多；加入EXO的H9C2细胞缺氧复氧后凋亡比例下降至21.067％±2.838％，明显减少。而加入INTEXO的心肌细胞在缺氧复氧过程中的凋亡更显著下降，达到15.700％±1.539％。这一结果说明，本实施例诱导生成的外泌体能够发挥其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

实施例4INTEXO及EXO体内心肌细胞保护作用的研究

小鼠心肌缺血再灌注损伤模型予以外泌体干预后焦亡及凋亡通路相关蛋白的表达变化：随机选取IR组、IR+EXO、IR+INTEXO组小鼠，每种小鼠各取3只建立在体心肌缺血再灌注损伤模型，开胸暴露心脏后，结扎冠状动脉左前降支以造成心肌缺血30min，而后抽结予以再灌注2小时。在心肌缺血再灌注时间末后，再次将小鼠麻醉、固定、开胸、暴露心脏，用镊子和剪刀将心脏整颗摘下后，仔细切取左心室结扎线下以下白色梗死区域心肌组织，将取下的心肌组织用PBS漂洗后置于冻存管中，液氮迅速降温后，立即提取心肌组织蛋白，或置于-80℃冰箱中保存待用。结果表明小鼠心肌缺血再灌注术后及尾静脉注射入ADMSC来源的外泌体的各组进行了焦亡通路相关分子信号的Western Blot检测。结果显示，缺血30分钟，再灌注2小时后，IR组心肌细胞TXNIP、NLRP3、Cleaved caspase-1和IL-1β均较CON组明显升高。而在IR+EXO及IR+INTEXO组中，其TXNIP、Cleaved caspase-1和IL-1β水平与IR组比较则明显降低，而且IR+INTEXO组下降趋势更为明显。此外，在加入外泌体的两组中，IR+INTEXO组中NLRP3水平较IR组有明显下降趋势，而IR+EXO组中与IR组相比，NLRP3存在下降趋势，但无统计学差异。ASC水平在四组中无明显差异(参见图6A和图6B)。

Evans Blue/TTC染色检测小鼠缺血及梗死心肌面积变化。实验分为3组：缺血30分钟/再灌注2小时组(IR组)、缺血30分钟/再灌注2小时组+ADSC外泌体200μg组(IR+EXO)、缺血30分钟/再灌注2小时组+间断缺氧预处理的ADSC所分泌的外泌体200μg组(IR+INTEXO)组，雄性，年龄匹配，每组各5只。利用WT小鼠建立在体心肌缺血再灌注损伤模型。在缺血30分钟再灌注4小时后应用Evans Blue/TTC染色法观察比较两组小鼠缺血及心梗心肌面积的差异。如图6C所示，IR组危险区域面积(缺血面积+梗死面积)占总体心肌面积的比例为60.129％±4.509％，IR+EXO组小鼠的为60.206％±2.517％，IR+INTEXO组小鼠的为58.732％±5.686％三组危险区域面积相当，均在60％左右(P＞0.05)，说明三组所造模型具有可比性。而比较梗死面积所占危险面积比例时发现，IR组梗死面积比例56.000％±5.292％较IR+EXO组的45.667％±4.041％及IR+INTEXO组的31.667％±4.059％明显增多(P＜0.05)，且IR+INTEXO组梗死面积小于IR+EXO组，差异具有统计学意义。

心脏彩超检测小鼠心脏功能变化：实验分组同上，小鼠建立在体心肌缺血再灌注损伤模型。分别在再灌注术后3天、7天后应用心脏彩超评估两组小鼠间的心功能差异：即使用Acuson Sequoia 512小动物超声成像***(西门子公司，德国)及707B(15MHz)超声探头检测两组小鼠左心室射血分数(Ejection Fraction，EF)、左心室短轴收缩率(ShorteningFraction，FS)的变化。结果如图6D所示，再灌注3天后三组小鼠的左室射血分数EF和短轴收缩率FS在注射外泌体的两组要高于在体心肌缺血再灌注损伤模型组，而IR+INTEXO组的EF及FS均高于IR+EXO组，差异具有统计学意义；术后第7天三组小鼠EF和FS均有不同程度回升，而IR+EXO及IR+INTEXO组的EF及FS都高于IR组，差异具有统计学意义。而术后第7天后注射外泌体的两组中，IR+INTEXO组的EF及FS较IR+EXO组有升高趋势，但无统计学差异。

TUNEL检测小鼠原位心肌细胞凋亡变化：在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，荧光素标记的dUTP可连接至凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并且与HRP标记的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物反应产生深棕色。如图6E中A图所示，在心肌缺血30分钟再灌注3小时后利用Tunel法对四组小鼠进行了原位心肌细胞凋亡检测，比较了各组凋亡心肌细胞所占总细胞的比例。如图6E中B图所示，发现IR组原位心肌细胞凋亡比例达13.533％±0.837％，而IR+EXO组及IR+INTEXO组分别为8.267％±1.888％和4.933％±1.201％，较IR组的凋亡比例明显减少，差异具有统计学意义。而IR+INTEXO组凋亡比例较IR+EXO组更低，差异具有统计学意义。

实施例5间断缺氧干预的充质干细胞源外泌体相关分子机制的研究

INTEXO及EXO内差异miRNA的筛选：提取本发明所生成的外泌体INTEXO及正常培养状态下ADMSC所分泌的外泌体EXO的总RNA，依照定量和质检→cRNA合成、测序文库的构建标记→锚定桥接→预扩增→单碱基延伸测序→差异筛选→非监督层次聚类；Go和KEGG分析的步骤进行测序分析，结果如图7所示。接着，根据测序结果，本实施例选取了表达差异倍数最高的miR-224-5p作为研究对象，首先构建了MicroRNA 224-5p质粒和含有荧光素酶基因的TXNIP基因过表达野生型及突变型质粒，然后在工具细胞293T上进行共转染，双荧光素酶报告基因验证二者之间是否结合、MicroRNA 224-5p是否可抑制TXNIP的表达。本发明采用萤火虫荧光与内参海肾荧光的比值倍数来比较各组的荧光强弱。根据研究结果图8，可看出，MicroRNA 224-5p与Med1-3’UTR-WT共转染组的萤火虫荧光/海参荧光4.463±0.324较MicroRNA 224-5p+Med1-3’UTR-MUT组的10.688±1.650、MicroRNA224-5p+Med1-3’UTR-NC组的10.726±0.376、MicroRNA 224-5p-NC+Med1-3’UTR-WT组的8.704±1.518、MiR-224-5p-NC+3′UTRNC组的11.677±1.903、MiR-224-5p-NC+3′UTR MUT组的9.809±1.388明显下降，差异具有统计学意义；而其他五组之间无显著改变。这一结果说明，MicroRNA 224-5p可与TXNIP-3’UTR-WT结合，并目的mRNA片段无法翻译亦或是降解，故TXNIP-3’UTR-WT质粒中的荧光素酶生成减少，即使有荧光素加入，但是因无荧光素酶将之降解而激发出荧光。而当TXNIP-3’UTR发生突变后无法与MicroRNA 224-5p结合，荧光素酶表达未受影响，故荧光强度无显著变化。

Claims (9)

1.一种脂肪间充质干细胞来源的外泌体，其特征在于对脂肪间充质干细胞进行间断缺氧刺激制得，所述外泌体含有microRNA 224-5p、microRNA 141-3p、microRNA 34a-5p、microRNA 23a-3p、microRNA 130a-3p、microRNA 23b-3p、microRNA 200a-3p、microRNA93-5p、microRNA 301a-3p和microRNA 152-3p。

2.根据权利要求书1所述的脂肪间充质干细胞来源的外泌体，其特征在于具有组织器官缺血-再灌注损伤保护作用。

3.根据权利要求书1所述的脂肪间充质干细胞来源的外泌体在制备对组织器官缺血-再灌注损伤修复的药物或器械中的应用。

4.一种对组织器官缺血-再灌注损伤修复的组合物，其特征在于以权利要求书1所述的脂肪间充质干细胞来源的外泌体为活性成分。

5.一种对组织器官缺血-再灌注损伤修复的医疗器械，其特征在于以权利要求书1所述的脂肪间充质干细胞来源的外泌体为活性成分。

6.一种制取权利要求1所述的脂肪间充质干细胞来源外泌体的方法，其特征在于包括如下步骤：

当P2～P3代的脂肪间充质干细胞汇合率达85％～90％时，通过缺氧小室对容器中的细胞进行间断的缺氧刺激，即通过缺氧→复氧→缺氧→复氧→缺氧→复氧共3个循环后，将细胞培养基更换为含有5％v/v去除外泌体的胎牛血清的DMEM-F12完全培养基后于培养箱中孵育24小时后收集培养基，获取细胞培养上清液，并进行膜过滤后，收集滤液；再将滤液置于300g～100000g转速下差速离心后获得沉淀，即为所述的外泌体。

7.根据权利要求书6所述的方法，其特征在于所述的缺氧，即将脂肪间充质干细胞置于缺氧小室中，把细胞培养基更换为无糖无血清的DMEM培养基后，对小室内通入80％v/v～95％v/v氮气和0％v/v～5％v/v二氧化碳的混合气体并通过氧电池检测缺氧小室内气体氧浓度直至氧气浓度为0％v/v后关闭小室通气阀门隔绝细胞糖分及氧气供应45分钟～60分钟。

8.根据权利要求书6所述的方法，其特征在于所述的复氧，即打开缺氧小室阀门，并将培养基更换为具有糖分的DMEM-F12培养基后移入5％v/v二氧化碳、37℃培养箱中孵育1小时。

9.根据权利要求书6所述的方法，其特征在于所述的差速离心方法如下：先在4℃300g转速离心10分钟，取上清液；然后于4℃2,000g转速离心10分钟，取上清液；再于4℃10,000g转速离心60分钟，取上清液；接着于4℃100,000g转速离心70分钟，弃去上清，PBS重悬沉淀；最后于4℃100,000g转速离心70分钟后沉淀即为外泌体。

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