CN113018501A

CN113018501A - 一种内皮祖细胞外泌体医用敷料、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN113018501A
Application number: CN202110326254.2A
Authority: CN
Inventors: 张平; 李栋; 孙洪涛
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2021-06-25

Abstract

本发明提供了一种内皮祖细胞外泌体医用敷料、制备方法及其应用，包括以下步骤：三维培养得到内皮祖细胞、采用内皮祖细胞制备外泌体、通过外泌体得到外泌体医用敷料。本发明所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料，以健康的脐带血内皮祖细胞为原料，经过严格和安全的制备，包含高活力的外泌体，纳米级的磷脂囊泡中包裹着和细胞生长、修复等功能密切相关的数百种蛋白质和microRNA等生物活性分子，通过激活患者机体的内源性组织特异性干细胞、建立组织损伤修复的再生微环境，促进糖尿病足、褥疮、烧伤、烫伤等疾病的伤口组织修复，以及利器、工具等造成的各类战创伤的现场救治和伤口处理。

Description

一种内皮祖细胞外泌体医用敷料、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种内皮祖细胞外泌体医用敷料、制备方法及其应用。

背景技术

糖尿病在全世界范围内的高发，也伴随着糖尿病并发症等严重的问题，严重影响患者的健康和生活质量。糖尿病伤口愈合是临床治疗中的难题之一。通过生物活性敷料递送多种类型的干细胞和内皮祖细胞衍生的外泌体，是糖尿病伤口修复的一种潜在策略。

高血糖引起的微血管功能障碍是导致糖尿病并发症的主要原因之一，造成缺血以及伤口愈合速度减慢。一般来说，伤口愈合经历三个典型的阶段，包括炎症、增殖和基质重塑，这些需要血管为创伤修复提供营养和氧气支持。因此，改善糖尿病患者伤口的血管生成和血运重建对于加速伤口愈合至关重要。

糖尿病性伤口的传统临床治疗方法包括控制血糖、手术清创、血运重建和创伤敷料，而血管生成及其血运重建决定了手术成功和后期愈合情况。通常，生长因子治疗如碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子能帮助血管生成以及糖尿病伤口愈合更快。然而，生长因子的递送、剂量和价格是其应用的障碍。因此，迫切需要新的策略和产品通过促进伤口组织中的血管生成来治疗糖尿病伤口。

研究表明，来自间充质干细胞的外泌体有助于糖尿病足和褥疮等病症的伤口愈合。间充质干细胞衍生的外泌体是纳米级细胞外囊泡，具有与间充质干细胞类似的有益功能。此外，与间充质干细胞相比，外泌体显示出一些独特的优势，例如免疫原性低、稳定性高、易于储存。很多研究也证实了使用外泌体作为伤口愈合疗法的潜力，例如，与骨髓来源的间充质干细胞相比，脂肪来源的间充质干细胞具有特殊的优势，如易于获得和丰富的来源，能够通过优化成纤维细胞的功能加速皮肤伤口愈合。

然而，外泌体由于其在体内快速清除和相对较短的体内半衰期，将外泌体应用于伤口愈合仍然面临挑战。此外，由于组织再生过程通常需要很长时间，在此期间游离外泌体的存活率得不到保证。因此，开发一种能够维持外泌体活性以及持续释放的生物相容性外泌体医用敷料，将对外泌体治疗伤口愈合是至关重要的。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种内皮祖细胞外泌体医用敷料、制备方法及其应用，以刺激患者机体的内源性干细胞，加速糖尿病足、褥疮、烧伤、烫伤、切割伤、擦伤或战创伤的伤口组织修复及提高伤口愈合质量的应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种内皮祖细胞外泌体医用敷料的制备方法，包括以下步骤：

a.三维培养得到内皮祖细胞；

b.采用含无外泌体血清的培养基培养步骤a中得到的内皮祖细胞，得到上清液，将上清液通过差速离心后制备外泌体；

c.在聚己内酯高分子膜复合层表面涂覆一层步骤b中得到的外泌体及一层水凝胶溶液后静置，凝固后得到外泌体医用敷料，或将步骤b中得到的外泌体制成外泌体冻干粉，将外泌体冻干粉与纯化水和/或透明质酸钠混合后得到喷剂型外泌体医用敷料。

优选的，步骤a中三维培养的具体步骤包括：

(1)将人脐带血来源的内皮祖细胞使用完全培养基接种至培养瓶中，并使内皮祖细胞密度达到90％，得到原代内皮祖细胞；

(2)将原代内皮祖细胞接种至细胞培养器中，然后在水平转速为20rpm～40rpm条件下旋转培养内皮祖细胞，得到分散好的内皮祖细胞，其中，细胞培养器的底部的内表面为弧面且经过抗细胞贴附处理；

(3)采用聚氟乙烯合成纤维材料为载体，将分散好的内皮祖细胞按3x10⁵cells/mL的密度接种入装有载体的培养容器中，接种细胞，并充分混匀，且每10～30min混匀一次，持续3～6h，待细胞粘附于载体后，每日换液一次，持续4天，收集得到三维培养的内皮祖细胞。

优选的，所述载体为经过灭菌的，所述灭菌的具体步骤为：

将适量无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS溶液完全浸泡载体，并用玻璃质容器储存，然后在121℃高压蒸汽中灭菌30min，去除PBS溶液后，得到灭菌的载体。

优选的，所述载体的用量为25.0～30.0g/L。

优选的，步骤b中将上清液差速离心的具体步骤包括：

(1)用台式常温离心机，将所述培养上清液在常温下以1000g以下转速离心10分钟，得到离心液；

(2)将离心液在4℃温度下，以10000g以上转速离心30分钟，得到超滤液；

(3)将超滤液用0.22μm过滤器过滤，得到浓缩液；

(4)将所述浓缩液在4℃条件下，以100000g以上转速离心70分钟，弃上清得到所需外泌体。

一种内皮祖细胞外泌体医用敷料，根据上述任一所述的制备方法得到。

根据上述所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料在治疗糖尿病足、褥疮、烧伤、烫伤、切割伤、擦伤或战创伤时作为敷料促进伤口愈合的应用。

本发明的外泌体，来自健康的脐带血内皮祖细胞，经过严格和安全的制备，包含高活力的外泌体，纳米级的磷脂囊泡中包裹着和细胞生长、修复等功能密切相关的数百种蛋白质和microRNA等生物活性分子。内皮祖细胞外泌体主要是冻干粉产品，其中具有肌肤活性成分的物质基本为寡肽或者蛋白。这类物质很容易受到外界因素(包括高温度、极端pH值、微生物活动、潮湿空气等)的影响而活力逐渐减弱，最终完全失活，所以内皮祖细胞外泌体是一种修复创伤疗效强但是生物稳定性相对较差的物质。因此本发明将外泌体真空干燥保存在西林瓶中，以实现维持外泌体长久存储，可以避免外界因素影响它的活性，延长它的使用寿命。

相对于现有技术，本发明所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料、制备方法及其应用具有以下优势：

(1)本发明所述的制备方法通过建立三维培养体系，大量增殖内皮祖细胞，解决内皮祖细胞数量不足的难题，通过差速离心提取外泌体，高效地从人脐带血来源的内皮祖细胞培养上清液中提取到高浓度、高纯度的外泌体；

(2)本发明所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料，以健康的脐带血内皮祖细胞为原料，经过严格和安全的制备，包含高活力的外泌体，纳米级的磷脂囊泡中包裹着和细胞生长、修复等功能密切相关的数百种蛋白质和microRNA等生物活性分子，通过激活患者机体的内源性组织特异性干细胞、建立再生微环境，促进糖尿病足、褥疮、烧伤、烫伤等疾病的伤口组织修复，以及利器、工具等造成的各类战创伤的现场救治和伤口处理。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明实施例所述的内皮祖细胞的二维平面普通培养示意图；

图2为本发明实施例三维培养内皮祖细胞接种2小时后的扫描电镜图；

图3为本发明实施例三维培养内皮祖细胞接种1天后的扫描电镜图；

图4为本发明实施例三维培养的内皮祖细胞吖啶橙染色后生长状态图；

图5为本发明实施例中定量PCR检测二维和三维培养条件下内皮祖细胞的部分因子基因表达示意图；

图6为本发明实施例中外泌体的透射电镜图；

图7为本发明实施例中通过纳米颗粒跟踪分析测量外泌体粒径示意图；

图8为本发明实施例中蛋白质免疫印迹实验结果示意图；

图9为本发明实施例中荧光染色的外泌体处理内皮细胞示意图；

图10为本发明实施例中内皮祖细胞鉴定结果示意图；

图11为本发明实施例中原代内皮祖细胞的成管实验结果示意图；

图12为本发明实施例中原代内皮祖细胞的迁移实验结果示意图；

图13为本发明实施例中原代内皮祖细胞的划痕实验结果示意图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

对比例

1.1实验部分

在培养皿或者培养瓶的普通二维平面培养是传统的细胞培养，其利用密度梯度离心法从人脐带血中分离单个核细胞，接种至纤维连接蛋白包被的培养皿中，使用含20％FBS的内皮细胞特异性分化培养基EGM-2，放置在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，第3天半量换液，此后每2天全量换液1次。

1.2结果

在倒置显微镜下动态观察，脐带血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和典型的铺路石样形态。使用流式细胞术对细胞进行鉴定，同时满足CD133⁺CD34⁺VEGFR2⁺CD45^-的细胞被鉴定为内皮祖细胞，这些细胞具有进一步分化为血管内皮细胞并形成新生血管的能力，在其体外可扩增并向内皮细胞方向分化(如图1A和B)。

实施例

2.1实验部分

二维平面培养与细胞在机体内所处的三维生长环境有很大差异，细胞在生物体内处于复杂的三维环境，三维条件下细胞之间和细胞与基质间存在多方向相互作用，可以更好地模拟细胞在体内的生长状况及环境。三维培养的内皮祖细胞表现出较低的免疫原性表型和较高的免疫抑制能力，有利于三维培养的内皮祖细胞作为细胞治疗工具。

本发明采用聚氟乙烯巢状片进行三维培养：

1)将人脐带血来源的内皮祖细胞使用完全培养基接种至培养瓶中，并使内皮祖细胞密度达到90％，得到原代内皮祖细胞；

2)将原代内皮祖细胞接种至细胞培养器中，然后在水平转速为20rpm～40rpm条件下旋转培养内皮祖细胞，得到分散好的内皮祖细胞，其中，细胞培养器的底部的内表面为弧面且经过抗细胞贴附处理；

3)采用聚氟乙烯合成纤维材料(外观呈白色片形，内层为纤维状交织结构，已经广泛应用于企业的贴壁细胞规模化培养)作为载体，用量为25.0～30.0g/L；

4)使用前须灭菌处理。将适量无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS溶液完全浸泡载体，并用玻璃质容器储存，然后在121℃高压蒸汽中灭菌30min，灭菌后更换无菌PBS溶液，备用；

5)灭菌后的载体去除PBS溶液，并用适量的细胞生长液，37℃条件下孵育，使培养液的温度达到培养温度(37℃)，从而使载体表面完成从疏水性向亲水性转变，以保证细胞在载体表面粘附生长；

6)将分散好的细胞按3x10⁵cells/mL的密度接种入细胞培养微载体片的Cephodex培养容器中进行三维培养，并充分混匀，且每10～30min混匀一次，持续3～6h。放置在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，每2天换液1次，待细胞融合至80％后，收集细胞，用于后续的检测和外泌体提取。

2.2结果

1)三维培养的检测。待细胞粘附于三维微载体后，在尚未生长过密之前取出，在含2.5％戊二醛的0.1mol/L的PBS(pH7.2)中固定12～24h，0.1mol/L PBS清洗2h(中间换2～3次新液)；再用1％的锇酸固定1.5h，用双蒸水洗至无锇酸气味；梯度酒精脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥；IB－5离子溅射仪中镀铂；日立S-570扫描电镜观察并拍照；

2)换液次数增加至每日一次，接种4天后收集用于后续检测。接种于微载体片上的细胞对微载体有良好的粘附特性，如图2所示，接种2h后即可镜检到成串附着于微载体丝上，如图3所示，1天后可见细胞成团聚集生长，由于细胞层次较多，普通光学观察困难，如图4所示，本发明使用吖啶橙染色后照相观察，可见细胞在微载体片内部分布均匀，生长状态良好。

三维培养对内皮祖细胞部分因子基因表达的影响

3.1实验部分

传统的细胞培养是在培养皿或者培养瓶的二维普通平面培养，这与细胞在机体内所处的三维生长环境差别很大。本发明检测了两者之间的差异。

RNA提取和cDNA逆转录及qPCR：内皮祖细胞分别提取RNA，提取RNA使用TRrizol并按其说明书操作，测RNA浓度并定量逆转录合成cDNA，用SYBR-Green法Q-PCR检测。将cDNA稀释20倍，吸取4μl稀释后的cDNA样本，加入1μl上游引物，1μl下游引物，加水补足至12.5μl，加入12.5μl SYBRGreen Mix，95℃10s，60℃25s，39个循环。

引物如表1。采用2^－ΔΔC方法计算各基因在细胞中的相对表达量，以GAPDH为内参。

表1 Primer sequence for qPCR

3.2结果

定量PCR检测三维培养过程中部分因子相关基因的表达变化，将二维普通培养条件下EPC相关基因的表达设为1，与二维培养相比，三维培养结果表明SDF-1α、VEGF和IGF-1表达量均有所增加，如图5所示，证实了三维细胞培养的优势。

内皮祖细胞外泌体的提取

4.1实验部分

本发明采用含无外泌体血清的培养基培养人脐带血来源内皮祖细胞，得到培养上清液，所述培养上清液中含有外泌体，采用差速离心提取外泌体：

1)首先用台式常温离心机，将所述培养上清液在常温下以1000g的转速低速离心10分钟，去除死细胞和凋亡碎片，得到离心液；

2)然后将上一步所述离心液在4℃，以10000g以上转速高速离心30分钟，以去除细胞凋亡碎片，并得到超滤液；

3)将所述超滤液用0.22μm过滤器过滤除菌，并进一步去除细胞凋亡碎片，得到浓缩液，最后，所述浓缩液在4℃条件下，以100000g以上转速高速离心70分钟，弃上清得到所述外泌体；

4)在聚己内酯高分子膜复合层表面涂覆一层外泌体及一层水凝胶溶液后静置，凝固后得到外泌体医用敷料，此外，也可以将步骤3)中得到的外泌体制作成外泌体冻干粉，与纯化水和/或透明质酸钠混合后得到外泌体喷剂敷料。

本发明提供的外泌体的提取方法，先用含无外泌体血清的培养基对人脐带血来源内皮祖细胞进行饥饿培养，这样可使内皮祖细胞处于正常生长状态，其所分泌的外泌体所包含的有效物质也更贴近其自然状态下的外泌体，然后将含有外泌体的培养上清液进行低速差速离心以去除死细胞及其凋亡碎片，用超离管对低速差速离心后的离心液进行超滤浓缩得到外泌体浓度更高的超滤液，将超滤液经过第二离心处理去除杂质后，再用0.22μm过滤器过滤细胞凋亡碎片，过滤掉粒径为220nm以上的物质，进一步得到含颗粒粒径小于220nm的浓缩液，因超滤浓缩处理和第二离心处理使得液体量浓缩，这样过滤细胞凋亡碎片的效率得到大大提高，最后将浓缩液进行超速离心的第三离心处理分离提取到外泌体。该外泌体的提取方法，既结合了差速离心，又结合了超滤和超速离心，通过该提取流程，最终可高效地从人脐带血来源的内皮祖细胞培养上清液中提取到高浓度、高纯度的外泌体，具有操作简单、成本低，适合产业化生产的特点。

4.2结果

本发明通过三维培养内皮祖细胞，提取外泌体。如图6所示，本实施例提取到内皮祖细胞外泌体，使用透射电子显微镜观察，呈均一大小的圆杯形态，FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、EpCAM、ANXA5、TSG101等外泌体相关蛋白呈阳性表达，表明成功分离到人脐带血内皮祖细胞外泌体。电镜结果图可以发现该实施例提取的外泌体具有背景更干净，且拥有外泌体典型(具有明显的膜边界，呈典型的杯状结构)的结构，所获的外泌体大多形态结构典型，表明损伤小。

如图7所示，本发明使用纳米颗粒跟踪分析测定细胞外囊泡的浓度和颗粒大小分布，表明外泌体的平均粒径在30～150nm范围，证实本发明提取的外泌体质量良好。

此外，如图8所示，采用蛋白质免疫印迹实验鉴定外泌体，验证了阳性表达的外泌体表面标志物CD63和TSG101。

如图9所示，本发明使用荧光染色检测人血管内皮细胞HUVECs对内皮祖细胞外泌体的摄取，血管内皮细胞与PKH67标记的荧光染料外泌体孵育4小时，成功观察到绿色荧光染料进入到红色的血管内皮细胞。

本发明通过双免疫荧光染色，对人脐带血来源的内皮祖细胞进行了鉴定。我们使用CD34和VEGFR2特异性抗体检测内皮祖细胞，染色显示内皮祖细胞表达不仅是造血干细胞的标记CD34，而且是内皮细胞抗原VEGFR。本实验中红色荧光为CD34标志物蛋白，绿色荧光为VEGFR2标志物蛋白，DAPI是蓝染的细胞核，如图10所示，结果表明了CD34、VEGFR2与DAPI融合。通常干细胞标志物和内皮细胞的结合标记物是鉴定内皮祖细胞的常用方法，本发明进一步验证了人脐带血来源的内皮祖细胞。

内皮祖细胞外泌体促进血管生成

5.1实验部分

本发明使用人脐带血来源的内皮祖细胞，通过血管生成实验、迁移实验和划痕实验，从形态和功能分别验证外泌体促进血管生成的疗效。

5.1.1血管内皮细胞的血管生成实验

1)Matrigel在4℃解冻后，用4℃预冷的移液枪头混匀Matrigel基质成匀浆状；

2)将Matrigel基质包被于所需的培养器皿中，包被量至少覆盖整个器皿的生长表面，使用预冷的枪头和预冷的24孔板，每孔需要200μl Matrigel，37℃下孵育1h；

3)将原代内皮祖细胞经胰酶消化种板，2.5x10⁵cells/孔，同时治疗组的细胞加入25μg/ml外泌体，放孵箱中继续培养8-16h。从8小时开始注意观察成管情况，时间过久细胞就会成团；

4)每个孔随机选取5个100倍的视野，使用图形软件进行测量，计算视野内皮细胞形成的管状结构的总长度，并进行组间比较。

5.1.2内皮祖细胞迁移实验

1)迁移实验采用24孔板中transwell小室(小孔直径8μm)进行检测；

2)在小室外的孔里加入500μl含20％FBS的EGM-2培养基，或者10％FBS的DMEM培养基；

3)内皮祖细胞种至24孔板中transwell小室的上层，数量为2x10⁴cells/孔，体积为100μl，培养基为无血清的DMEM，同时治疗组加入25μg/ml外泌体，每组设三个复孔，放孵箱中继续培养12h；

4)换新孔，加入10％***500μl，将小室上层放入并固定30min；

5)配制0.5％的结晶紫染液：500mg结晶紫+25ml甲醇+75ml蒸馏水；

6)换新孔，加入500μl结晶紫染液，将小室放入染色30min；

7)将小室提出，在水杯中清洗，用镊子夹起小室水洗至不脱色，并棉签顺时针擦小室内膜表面，以擦掉未迁移的细胞；

8)用手术刀将膜切下放在载玻片上，细胞朝下，蒸馏水封片，拍照；

9)每个孔随机选取5个100倍的视野，计算视野内着色的内皮祖细胞的个数，并进行组间比较。

5.1.3内皮祖细胞划痕实验

1)将原代内皮祖细胞或者经过外泌体处理的内皮祖细胞(25μg/ml)种入6孔板，数量为2x10⁶cells/孔，每组设三个复孔；

2)细胞长满、生长接近100％，用200μl移液器吸头在板子底部划痕，每孔划三条；

3)然后用PBS洗两遍，换新培养基；

4)用显微镜在100倍的视野下拍照，并记录拍照部位；

5)放孵箱中继续培养24h后再次在相同部位拍照；

6)使用图形软件进行测量，计算划痕恢复百分比，并进行组间比较。

5.2结果

本发明表明，内皮祖细胞外泌体有效的促进了机体的血管生成。

如图11所示，体外血管形成实验的结果显示：与正常对照组相比，疾病模型组动物来源内皮祖细胞的体外血管形成能力显著降低(p<0.05)；然而，25μg/ml外泌体能够增加成管长度，明显改善疾病导致的内皮祖细胞血管形成能力的损伤(p<0.01)；上述原代内皮祖细胞的成管实验，从形态学上验证了外泌体对内皮祖细胞的血管形成能力的治疗作用。

另外，为了检测机体的内皮祖细胞在疾病条件下和外泌体治疗后的功能变化情况，我们又进行了迁移实验和划痕实验。迁移实验结果显示，与正常对照组相比，疾病模型组动物来源内皮祖细胞的迁移能力显著降低(p<0.001)；但是，如图12所示，25μg/ml的外泌体作用于细胞时，会明显促进内皮祖细胞的迁移能力(p<0.001)。如图13所示，与迁移实验结果相似，原代内皮祖细胞的划痕实验结果表明，与正常对照组相比，疾病模型组动物来源内皮祖细胞的创伤愈合能力显著减弱(p<0.001)；而25μg/ml的外泌体治疗能够明显挽救内皮祖细胞显著降低的创伤愈合能力(p<0.001)。上述实验结果说明：从功能学上验证了内皮祖细胞外泌体可以有效的促进机体的血管生成。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种内皮祖细胞外泌体医用敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.三维培养得到内皮祖细胞；

2.根据权利要求1所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料的制备方法，其特征在于，步骤a中三维培养的具体步骤包括：

3.根据权利要求2所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料的制备方法，其特征在于，所述载体为经过灭菌的，所述灭菌的具体步骤为：

4.根据权利要求2所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料的制备方法，其特征在于，所述载体的用量为25.0～30.0g/L。

5.根据权利要求1所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料的制备方法，其特征在于，步骤b中将上清液差速离心的具体步骤包括：

(3)将超滤液用0.22μm过滤器过滤，得到浓缩液；

6.一种内皮祖细胞外泌体医用敷料，其特征在于：根据权利要求1-5任一所述的制备方法得到。

7.根据权利要求6所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料在治疗糖尿病足、褥疮、烧伤、烫伤、切割伤、擦伤或战创伤时作为敷料促进伤口愈合的应用。