CN111269888A - 一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞，所述adipsin基因修饰的脂肪干细胞，包括adipsin重组基因，所述adipsin重组基因表达adipsin蛋白；本发明还提供上述脂肪干细胞的制备方法及其应用。本发明采用adipsin基因修饰的脂肪干细胞，可以提高胰岛细胞活力，本发明的adipsin基因修饰的脂肪干细胞和胰岛细胞共培养后，和普通的脂肪干细胞和胰岛细胞共培养相比，胰岛细胞的活力提高1倍。本发明采用adipsin基因修饰的脂肪干细胞，利用脂肪干细胞的旁分泌作用和再生修复作用，分泌多种生长因子，使胰岛β细胞增殖能力翻倍，同时分泌的adipsin蛋白可以增加胰岛细胞分泌胰岛素。

Description

一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞、制备方法及其应用，属于生物医药领域技术领域。

背景技术

随着人们生活水平的提高及饮食结构的改变，我国糖尿病发病率飞速增长，最新的研究数据表明，我国约有1.14亿成人患糖尿病，患病率高达11.6%，位居世界第一。糖尿病的常规治疗方法是口服或注射抗糖尿病药物，可以暂时改善高血糖症及胰岛素敏感性，但不能逆转胰岛素抵抗（胰岛素调控的葡萄糖代谢能力下降）, 也不能修复胰岛β细胞的功能衰竭，而且长期使用胰岛素，易形成耐药性。通过异体胰腺移植是一种可选择的治疗糖尿病方法，但因供体缺乏和移植后免疫排斥等问题限制了其应用。体外诱导胚胎干细胞或诱导性多能干细胞分化为胰岛细胞移植到体内，可改善外周胰岛素抵抗同时促进胰岛细胞的再生，但因伦理问题、免疫排斥、致瘤性风险等因素限制了其使用。近年来，来源于不同组织的间充质干细胞（MSCs）在糖尿病治疗方面引起了广泛关注。MSCs已被证实用于治疗多种组织缺损性疾病的修复与再生，通过其旁分泌作用分泌多种细胞因子，可以修复受损的胰岛β细胞，促进内源性胰岛β细胞再生，缓解胰岛素抵抗，使糖尿病患者血糖维持平衡，从根本上解决因胰岛细胞功能衰退或凋亡引起的糖尿病这一难题。

现有技术多采用脂肪干细胞（ADSCs）与胰岛细胞体外接触式共培养方式，即将分离、培养的脂肪干细胞与纯化后的胰岛细胞体外接触式共培养，观察ADSCs对体外培养的胰岛β细胞的存活率、胰岛素的分泌功能的影响。

ADSCs与胰岛β细胞共培养细胞，培养过程中细胞易成团，细胞生长受到抑制，导致胰岛β细胞分泌胰岛素降低，不能长期维持血糖平衡。同时脂肪干细胞对促进胰岛细胞的增殖及胰岛细胞分泌胰岛素的效果不佳。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞、制备方法及其应用，通过基因编辑手段将adipsin***腺病毒并转染至脂肪干细胞，使其表达adipsin（脂肪素）蛋白，并与胰岛细胞非接触式共培养。携带adipsin基因的ADSCs即可分泌HGF、VEGF、TGF-1和b-FGF等多种生长因子，又可分泌adipsin蛋白，其中各个营养因子能够改善损伤局部的微环境，抑制细胞凋亡，实现以下发明目的：

促进胰岛细胞增殖；促进胰岛β细胞分泌胰岛素及改善胰岛素抵抗。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞，所述adipsin基因修饰的脂肪干细胞，包括adipsin重组基因，所述adipsin重组基因表达adipsin蛋白。

人工合成获得的adipsin基因序列，构建至pAAV-IRES-ZsGreen1腺病毒表达载体上，然后将pAAV-IRES-adipsin基因转入脂肪干细胞，使其表达adipsin蛋白，即为pAAV-adipsin脂肪干细胞，验证其促进胰岛细胞分泌胰岛素的能力、调控葡萄糖代谢情况。

所述adipsin重组基因包括信号肽和adipsin基因；所述adipsin基因为序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

所述adipsin蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

本专利对Adipsin蛋白结构的自行抑制的假性底物区域进行了优化，该区域可与催化区序列结合以抑制激酶活性。

与NCBI上已公布的FD因子（登录号：NM_001317335）相比，本发明对Adipsin基因序列进行了优化，选取编码假性底物区域的8个核酸位点进行了优化，其指导合成的蛋白质发生了3个氨基酸位点的改变。优化后的假性底物区域可与催化区序列结合以抑制激酶活性。

Adipsin的核苷酸序列，具体优化为第15位采用A替代G，245位采用T替代C，246位采用A替代C，447位采用C替代G，562位采用C替代T，564位采用A替代C，650位采用A替代T，651位采用T替代C；具体对比结果见附图3。

Adipsin的氨基酸序列，具体优化为82位L替代P，188位P替代S，217位N替代I，氨基酸序列的具体对比结果见附图4。

所述信号肽为序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞的制备方法，所述制备方法，包括制备含adipsin基因表达载体的质粒、脂肪干细胞的制备、腺病毒包装及滴度检测、腺病毒感染脂肪干细胞。

所述制备含adipsin基因表达载体的质粒，将包括信号肽和adipsin的核酸人工序列的融合基因，***到腺病毒表达载体pAAV-IRES-ZsGreen1中，经转化、测序正确后，提取并纯化质粒，获得含adipsin基因表达载体的质粒。

所述脂肪干细胞的制备，当原代细胞融合度为78-82%时，消化传代，传至P3或P4代；对P3或P4代人脂肪干细胞进行流式细胞仪表面标记物检测，向细胞（约1x10⁶个细胞）内分别加入抗小鼠抗人单克隆抗体：CD29、CD34、CD44、 CD105、CD90和HLA⁃DR，使用流式细胞仪检测分析，当CD29、、CD44、 CD105和CD90表达率高达98%以上，CD34和HLA⁃DR表达率不足1%时，即鉴定为脂肪干细胞；

所述腺病毒包装及滴度检测，将含adipsin基因表达载体的质粒采用腺病毒包装后，得到重组腺病毒；重组腺病毒滴度为3.36×10⁷ pfu/mL；

所述腺病毒感染脂肪干细胞，包括以下步骤：

（1）将脂肪干细胞消化计数后稀释至密度为4.5-5.5×10⁵细胞/mL，培养20-28h；

（2）取重组腺病毒液（病毒滴度为3.3-3.4×10⁷ pfu/mL）加入终浓度为7.5-8.5μg/mL的聚凝胺，得到待感染病毒液；

（3）将脂肪干细胞，去掉培养基，加入待感染病毒液，继续培养20-28h，去掉病毒液，添加完全培养基进行培养，同时加入2.8-3.2ug/mL的嘌呤霉素进行筛选，继续培养，培养4-6天，得到腺病毒感染的脂肪干细胞，命名为pAAV–adipsin-脂肪干细胞。流式细胞仪检测pAAV–adipsin-脂肪干细胞GFP表达率，结果表明有23.5％的细胞是GFP(腺病毒载体本身表达GFP蛋白)阳性，说明利用本发明构建的adipsin能够在脂肪干细胞表面表达，且转染效率为23.5％。

一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞的应用，所述adipsin基因修饰的脂肪干细胞与胰岛细胞进行非接触式共培养；所述非接触式共培养，培养板下室接种adipsin基因修饰的脂肪干细胞，胰岛细胞接种于培养板的上室，用9.5-10.5% FBS的RPMI-1640培养基调整脂肪干细胞和胰岛细胞至相同的细胞密度，进行培养，定期换液。

所述培养板为带有***层的Transwell6孔板，所述adipsin基因修饰的脂肪干细胞和胰岛细胞的细胞密度均为0.8-1.2×10⁴个细胞/孔；所述胰岛细胞为INS-1细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明采用adipsin基因修饰的脂肪干细胞，可以提高胰岛细胞活力，本发明的adipsin基因修饰的脂肪干细胞和胰岛细胞共培养后，和普通的脂肪干细胞和胰岛细胞共培养相比，胰岛细胞的活力提高1倍。

（2）本发明采用adipsin基因修饰的脂肪干细胞，利用脂肪干细胞的旁分泌作用和再生修复作用，分泌多种生长因子，使胰岛β细胞增殖能力翻倍，同时分泌的adipsin蛋白可以增加胰岛细胞分泌胰岛素，分泌胰岛素量是未经基因修饰的脂肪干细胞的1.78-2.1倍。

本发明adipsin基因修饰的脂肪干细胞和胰岛细胞（INS-1细胞）共培养，在葡萄糖刺激下，胰岛素分泌量第3d时为23.3mIU/L，第7d时为29.5mIU/L，第14d时为28.2mIU/L。

附图说明

图1为pAAV-IRES-adipsin表达载体结构示意图；

图2为P3代脂肪干细胞在光学显微镜的细胞形态图；

图3为本发明adipsin核苷酸序列和现有的登录号为NM_001317335的FD因子的对比图；

图4为本发明adipsin氨基酸序列和现有的登录号为NM_001317335的FD因子的对比图；

图5 CellTiter-Glo法检测胰岛细胞的活性图。

图6低糖及高糖培养时胰岛素分泌含量比较图。

图7为脂肪干细胞表面分子标记CD29表达量的流式图；

图8为脂肪干细胞表面分子标记CD44表达量的流式图；

图9为脂肪干细胞表面分子标记CD105表达量的流式图；

图10为脂肪干细胞表面分子标记CD90表达量的流式图；

图11为脂肪干细胞表面分子标记CD34表达量的流式图；

图12为脂肪干细胞表面分子标记HLA-DR表达量的流式图；

图13为流式细胞仪检测pAAV–adipsin-脂肪干细胞的GFP表达量的流式图；

图14为adipsin核酸人工序列（SEQ ID NO.2）；

图15为adipsin蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

实施例1：含adipsin基因表达载体的构建

修饰脂肪干细胞的融合基因，包括signal核酸人工序列（SEQ ID NO.1）和adipsin核酸人工序列（SEQ ID NO.2），分别按SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的核酸编码序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，***到腺病毒表达载体pAAV-IRES-ZsGreen1（SEQ ID NO.3） 的BamHI-EcoRI位点（见附图1），转化到E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用Invitrogen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒。

更详细的说，本实施例提供的制备方法包括如下步骤：

将融合基因adipsin的核酸人工序列，委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并***标准载体pUC上，因此命名为pUC-adipsin，同时将pUC-adipsin和pAAV-IRES-ZsGreen1载体进行Fast Digest BamHI（购自ThermoFisher公司）和Fast Digest EcoRI（购自ThermoFisher公司）双酶切，37℃，酶切1小时。100µl酶切体系为：10×buffer：10µl；DNA6µg；BamHI酶：3µl；EcoRI酶：3µl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有adipsin的 DNA片段和线性化的pAAV-IRES-ZsGreen1 DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。

采用DNA extraction kit（购自Thermo Fisher公司）将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500ml DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500ml Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25µl Elution Buffer，室温静置2分钟后，12000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的adipsin片段和线性化的pAAV-IRES-ZsGreen1 DNA片段。

将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pAAV-IRES-adipsin质粒。连接体系为：10×buffer：1µl；T4连接酶：1µl；adipsin：4µl；线性化的pAAV-IRES-ZsGreen1 DNA：4µl。

将上述pAAV-IRES-adipsin转化到E.coli(DH5α)。筛选鉴定出阳性克隆，选取阳性克隆37℃、250rpm摇菌（12h-16h），按照质粒提取纯化试剂盒（购自Invitrogen公司）提取pAAV-IRES-adipsin质粒，具体步骤见说明书。将上述的pAAV-IRES-adipsin质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。

实施例2：脂肪干细胞的制备

从志愿者腹部抽取脂肪组织，无菌条件下用PBS液洗去红细胞，手术刀剪碎至细小颗粒，加入胰蛋白酶和胶原酶（v/v 1:1），振荡消化后收集液体，1500rpm/10min，培养基重悬沉淀，200目细筛过滤，1500rpm/10min，所得细胞提取物用10% FBS+DMEM培养液重悬，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养，5天后，首次换液。之后，3天换一次液，当原代细胞融合度为80%时，消化传代，传至P3代用于后续试验，光学显微镜下观察细胞生长及形态（见图2）。对P3代人脂肪干细胞进行流式细胞仪表面标记物检测，向细胞（约1x10⁶个细胞）内分别加入抗小鼠抗人单克隆抗体：CD29、CD34、CD44、 CD105、CD90和HLA⁃DR，使用流式细胞仪检测分析，当CD29、、CD44、 CD105和CD90表达率高达98%以上，CD34和HLA⁃DR表达率不足1%时，即鉴定为脂肪干细胞（见附图7-12）。

实施例3：腺病毒包装及滴度检测

（一）293T细胞的复苏

1) 从液氮罐中取出冻存的293T细胞，迅速丢入37℃水浴锅中并快速晃动，直至细胞溶液完全溶解。

2) 将细胞溶液转移到50mL离心管中，并在其中加上10 mL新鲜的完全培养基，混匀后离心，1500 rpm，5 min。

3) 去掉上清，加入3 mL新鲜的DMEM培养基进行重悬细胞，平均转入六孔板中，每个孔中补足到3mL培养基。

4)将六孔板平稳放入37 ℃、5 %CO₂ 和95 %相对湿度的培养箱中培养。

5) 第二天观察细胞存活率，并更换新鲜培养基。以后每天观察细胞生长情况，细胞铺满孔底时，进行传代，待长满80%瓶底时用于实验。

（二）腺病毒包装

取两个1.5ml无菌 EP管，一个EP管中加入200µl无血清DMEM，加入2µg辅助质粒和1µgpAAV-IRES-adipsin质粒；另一个EP管中加入200µl无血清DMEM，加入6µl lipoLP2000，静止5min。然后将两管充分混匀，静置15-20min；将这400µl的混合液逐滴加入细胞培养皿中，轻轻摇动培养皿混匀后置于含37℃恒温箱孵育；6h后吸去培养基，加入适量37℃预热的DMEM完全培养基，继续将细胞放置37℃恒温箱孵育。转染后24h、48 h、72h各收集一次含腺病毒的上清，用0.45um小滤器过滤，收集滤液后进行浓缩纯化，-80℃低温冰箱中保存备用。

（三）病毒滴度测定

1) 将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×10⁵/mL，加入96孔板，100 μL/孔，为每个病毒稀释度准备6个孔。放入37 ℃，5 %CO2 培养箱中培养。

2) 第二天，准备6个1.5 mL EP管，第一个EP管中加入10 μL病毒液，然后做10倍梯度稀释，连续6个稀释度。吸取96孔板中原有的培养基，加入稀释好的病毒液，并做好标记。

3) 第三天，在每个孔中再加入100μL完全培养基，利于细胞的生长。

4) 第五天，荧光百分比在10-30 %的孔计算病毒滴度，用流式细胞仪检测GFP荧光百分比。根据公式：滴度（pfu/mL）=细胞数×荧光百分比×MOI(1)×病毒稀释倍数×10³ 计算病毒滴度，本发明中获得的重组腺病毒滴度为3.36×10⁷ pfu/mL。

实施例4：腺病毒感染脂肪干细胞

将生长状态良好的脂肪干细胞消化计数后稀释至密度为5×10⁵细胞/mL，加入六孔板中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24h。从-80℃取出2mL病毒液（病毒滴度为3.36×10⁷pfu/mL），加入终浓度为8μg/mL的聚凝胺（购自Sigma公司）。从培养箱中拿出六孔板，去掉六孔板中的培养基，加入准备好的病毒液，放入培养箱中继续培养24h。24h后，去掉六孔板中的病毒液，添加完全培养基（10%FBS，1%青链霉素，H-DMEM，均购自Gibco公司）进行培养，同时加入3ug/mL的嘌呤霉素进行筛选，放在37℃，5% CO₂ 培养箱中培养，每2天换液一次，培养5天，成活的细胞即为腺病毒感染的脂肪干细胞，命名为pAAV–adipsin-脂肪干细胞。流式细胞仪检测pAAV–adipsin-脂肪干细胞GFP表达率，结果表明有23.5％的细胞是GFP(腺病毒载体本身表达GFP蛋白)阳性，说明利用本发明构建的adipsin能够在脂肪干细胞表面表达，且转染效率为23.5％（见附图13）。

实施例4：胰岛β细胞增殖试验

（一）大鼠胰岛瘤细胞的培养

取1×10⁵个大鼠胰岛瘤细胞（INS-1，购自上海研谨生物科技有限公司），加 10 ml 含有10% FBS的RPMI-1640培养基（含10mM HEPES、2 Mm L-谷氨酰胺、1mm丙酮酸钠和0.05 mMβ-巯基乙醇）到10cm培养皿中， 置于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养，直到细胞长到细胞瓶的80%-90%时，进行传代培养，调整INS-1细胞浓度为1×10⁵个细胞/ml，用于后续实验。

（二）胰岛细胞与脂肪干细胞共培养

用0.4um孔径带有***层的Transwell6孔板组成非接触式共培养体系，按细胞比例1：1，调整接种细胞密度1×10⁴个细胞/孔进行细胞培养，共分为三组：

INS-1细胞与pAAV–adipsin-脂肪干细胞作为共同培养实验组；

INS-1细胞与脂肪干细胞（未转染）作为共同培养对照组；

相同量的INS-1细胞作为单独对照组。

Transwell 6孔培养板下室接种脂肪干细胞，加入 INS-1细胞接种于Transwell 6孔培养板的上室，用10% FBS的RPMI-1640培养基调整脂肪干细胞和INS-1细胞至相同的细胞密度（1×10⁴个细胞/孔），置于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养，每3天换一次液，体外培养14 d。分别在3d、7d、14 d时，反复取样3次。

（二）CellTiter-Glo荧光细胞活性检测

1) 将体外培养的共同培养实验组、共同培养对照组和单独对照组的INS-1细胞，用含10%FBS的RPMI-1640培养基将细胞调整到一定密度，接种到96 孔培养板上，每100μl细胞悬液中约 5×10⁴个细胞，在37℃、5%CO2培养箱中预培养4h。

2) 将 CellTiter-Glo的缓冲液室温溶解后倒入装有底物冻干粉的棕色瓶中混匀，将预培养后的细胞培养板拿出，在室温下平衡30min。

3) 向每孔中加入100μl CellTiter-Glo试剂（购自Promega）。

4) 震荡混匀 2min，孵育 10min，取细胞样品，酶标仪测定酶标板中各孔的荧光发光值（RLU）。

根据实验将细胞分为4组，每组3个重复：

A：调零组，只加RPMI-1640（含10%FBS）培养基

B：单独对照组，INS-1细胞单独培养

D：共培养对照组，INS-1细胞和脂肪干细胞（未转染）共培养

C：共培养实验组，INS-1细胞和pAAV–adipsin-脂肪干细胞共培养

结果表明，随着时间的增加，胰岛细胞活力逐渐增强，共培养实验组中INS-1细胞活性高于培养对照组中INS-1细胞，显著高于单独培养组中INS-1细胞，其细胞活力是单独培养组的3倍，是INS-1细胞和脂肪干细胞（未转染）共培养组的2倍。因而，表达adipsin的脂肪干细胞对INS-1细胞增殖具有显著影响（见图5）。

实施例4：胰岛素分泌试验

按照实施例3的培养方法，分别将培养3天、7天、14天的共同培养实验组胰岛细胞、共同培养对照组胰岛细胞和单独培养组胰岛细胞接种到24孔板，每孔约2×10⁵个细胞，孵育24h；离心，弃上清，在无糖RPMI-1640培养基中预孵育2小时；1500 rpm，5 min，进行平板离心，弃上清；每孔一次加入1ml低糖 KRBH溶液(2.7mmol/L葡萄糖)培养箱中孵育1 小时；离心弃掉低糖KRBH，然后每孔加入1ml高糖 KRBH (16.7mmol/L葡萄糖)溶液培养箱中继续孵育2小时；收集细胞上清进行ELISA检测，根据试剂盒操作方法进行检测胰岛素分泌量(mIU/L)，分析adipsin基因修饰的脂肪干细胞对胰岛素分泌的影响。

根据实验将细胞分为以下3组，每组3个重复：

A：单独对照组，单独培养INS-1细胞

B：共培养对照组，INS-1细胞与脂肪干细胞（未转染）共培养

C：共培养实验组，INS-1细胞与pAAV–adipsin-脂肪干细胞共培养

胰岛素分泌量比较：结果见图6，低糖KRBH及高糖KRBH培养的共培养实验组INS-1细胞和pAAV–adipsin-脂肪干细胞组胰岛素分泌量由3d时的23.3mIU/L升为7d时的29.5mIU/L，又降低为14d时的28.2mIU/L，共培养对照组胰岛素分泌分别为13.1mIU/L、15.8mIU/L、13.6mIU/L，单独对照组胰岛素分泌分别为9.2mIU/L、11.6mIU/L、10.6mIU/L，共培养实验组INS-1细胞胰岛素分泌量均显著高于共培养对照组INS-1细胞和单独培养组INS-1细胞，高达2倍以上，差异具有统计学意义，第3d，本发明组组胰岛素分泌量是共培养对照组胰岛素分泌量的1.78倍，第7d，本发明组组胰岛素分泌量是共培养对照组胰岛素分泌量的1.87倍，第14d，本发明组组胰岛素分泌量是共培养对照组胰岛素分泌量的2.1倍。

因此，adipsin基因修饰的脂肪干细胞能促进胰岛细胞分泌胰岛素，维持血糖平衡。

综上所述，本发明所制备的利用adipsin基因修饰的脂肪干细胞显著增加了胰岛β细胞的增殖能力和胰岛素分泌能力，初步证明了adipsin基因修饰的脂肪干细胞能促进胰岛细胞的增殖及胰岛细胞分泌胰岛素的功能，为临床应用干细胞治疗糖尿病提供了理论基础。

除非特殊说明，本发明采用的比例均为质量比例，采用的百分比，均为质量百分比。

序列表

<110> 山东兴瑞生物科技有限公司

<120> 一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞、制备方法及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 1

atgcacagct gggagcgcct ggcagtgctg gtcctcctag gagcggccgc ctgcgcgcca 60

<210> 2

<211> 701

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 2

cgccccgtgg tcgaatcctg ggcggcagag aggccgaggc gcacgcgcgg ccctacatgg 60

cgtcggtgca gctgaacggc gcgcacctgt gcggcggcgt cctggtggcg gagcagtggg 120

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tggcgagcta tgcggcctgg atcgacagcg tcctggccta g 701

<210> 3

<211> 5904

<212> DNA

<213> 腺相关病毒(adeno-associated virus-2)

<400> 3

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggagc tagttattaa tagtaatcaa 180

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cgattgaatt ccccggggat cccgcccctc tccctccccc ccccctaacg ttactggccg 1380

aagccgcttg gaataaggcc ggtgtgcgtt tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc 1440

gtcttttggc aatgtgaggg cccggaaacc tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag 1500

gggtctttcc cctctcgcca aaggaatgca aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt 1560

tcctctggaa gcttcttgaa gacaaacaac gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa 1620

ccccccacct ggcgacaggt gcctctgcgg ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc 1680

aaaggcggca caaccccagt gccacgttgt gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg 1740

gctcacctca agcgtattca acaaggggct gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat 1800

gggatctgat ctggggcctc ggtgcacatg ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa 1860

cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataatat 1920

ggcccagtcc aagcacggcc tgaccaagga gatgaccatg aagtaccgca tggagggctg 1980

cgtggacggc cacaagttcg tgatcaccgg cgagggcatc ggctacccct tcaagggcaa 2040

gcaggccatc aacctgtgcg tggtggaggg cggccccttg cccttcgccg aggacatctt 2100

gtccgccgcc ttcatgtacg gcaaccgcgt gttcaccgag tacccccagg acatcgtcga 2160

ctacttcaag aactcctgcc ccgccggcta cacctgggac cgctccttcc tgttcgagga 2220

cggcgccgtg tgcatctgca acgccgacat caccgtgagc gtggaggaga actgcatgta 2280

ccacgagtcc aagttctacg gcgtgaactt ccccgccgac ggccccgtga tgaagaagat 2340

gaccgacaac tgggagccct cctgcgagaa gatcatcccc gtgcccaagc agggcatctt 2400

gaagggcgac gtgagcatgt acctgctgct gaaggacggt ggccgcttgc gctgccagtt 2460

cgacaccgtg tacaaggcca agtccgtgcc ccgcaagatg cccgactggc acttcatcca 2520

gcacaagctg acccgcgagg accgcagcga cgccaagaac cagaagtggc acctgaccga 2580

gcacgccatc gcctccggct ccgccttgcc ctgaaagctt gcctcgagca gcgctgctcg 2640

agagatctac gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt 2700

tgccactcca gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga 2760

ctaggtgtcc ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt 2820

tgggaagaca acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc 2880

acaatcttgg ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc 2940

tcccgagttg ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg 3000

gtagagacgg ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat 3060

ctacccacct tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc 3120

tgtccttctg attttgtagg taaccacgtg cggaccgagc ggccgcagga acccctagtg 3180

atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 3240

gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 3300

ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 3360

atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 3420

tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 3480

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 3540

tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 3600

gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 3660

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 3720

cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 3780

agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 3840

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 3900

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 3960

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 4020

cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 4080

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 4140

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 4200

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 4260

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 4320

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 4380

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 4440

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 4500

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 4560

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 4620

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 4680

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 4740

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 4800

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 4860

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 4920

ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 4980

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 5040

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 5100

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 5160

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 5220

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 5280

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 5340

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 5400

tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 5460

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 5520

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 5580

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 5640

gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 5700

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 5760

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 5820

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 5880

tttgctggcc ttttgctcac atgt 5904

<210> 4

<211> 233

<212> PRT

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 4

Pro Pro Arg Gly Arg Ile Leu Gly Gly Arg Glu Ala Glu Ala His Ala

1 5 10 15

Arg Pro Tyr Met Ala Ser Val Gln Leu Asn Gly Ala His Leu Cys Gly

20 25 30

Gly Val Leu Val Ala Glu Gln Trp Val Leu Ser Ala Ala His Cys Leu

35 40 45

Glu Asp Ala Ala Asp Gly Lys Val Gln Val Leu Leu Gly Ala His Ser

50 55 60

Leu Ser Gln Pro Glu Pro Ser Lys Arg Leu Tyr Asp Val Leu Arg Ala

65 70 75 80

Val Leu His Pro Asp Ser Gln Pro Asp Thr Ile Asp His Asp Leu Leu

85 90 95

Leu Leu Gln Leu Ser Glu Lys Ala Thr Leu Gly Pro Ala Val Arg Pro

100 105 110

Leu Pro Trp Gln Arg Val Asp Arg Asp Val Ala Pro Gly Thr Leu Cys

115 120 125

Asp Val Ala Gly Trp Gly Ile Val Asn His Ala Gly Arg Arg Pro Asp

130 135 140

Ser Leu Gln His Val Leu Leu Pro Val Leu Asp Arg Ala Thr Cys Asn

145 150 155 160

Arg Arg Thr His His Asp Gly Ala Ile Thr Glu Arg Leu Met Cys Ala

165 170 175

Glu Ser Asn Arg Arg Asp Ser Cys Lys Gly Asp Pro Gly Gly Pro Leu

180 185 190

Val Cys Gly Gly Val Leu Glu Gly Val Val Thr Ser Gly Ser Arg Val

195 200 205

Cys Gly Asn Arg Lys Lys Pro Gly Asn Tyr Thr Arg Val Ala Ser Tyr

210 215 220

Ala Ala Trp Ile Asp Ser Val Leu Ala

225 230

Claims (10)

1.一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞，其特征在于：所述adipsin基因修饰的脂肪干细胞，包括adipsin重组基因，所述adipsin重组基因表达adipsin蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞，其特征在于：所述adipsin重组基因包括信号肽和adipsin基因；所述adipsin基因为序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞，其特征在于：所述adipsin蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求2所述的一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞，其特征在于：所述信号肽为序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

5.一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞的制备方法，其特征在于：所述制备方法，包括制备含adipsin基因表达载体的质粒、脂肪干细胞的制备、腺病毒包装及滴度检测、腺病毒感染脂肪干细胞。

6.根据权利要求5所述的一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞的制备方法，其特征在于：所述制备含adipsin基因表达载体的质粒，将包括信号肽和adipsin的核酸人工序列的融合基因，***到腺病毒表达载体pAAV-IRES-ZsGreen1中，经转化、测序正确后，提取并纯化质粒，获得含adipsin基因表达载体的质粒。

7.根据权利要求5所述的一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞的制备方法，其特征在于：所述

脂肪干细胞的制备，当原代细胞融合度为78-82%时，消化传代，传至P3或P4代；所述腺病毒包装及滴度检测，将含adipsin基因表达载体的质粒采用腺病毒包装后，得到重组腺病毒。

8.根据权利要求5所述的一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞的制备方法，其特征在于：所述

腺病毒感染脂肪干细胞，包括以下步骤：

（1）将脂肪干细胞消化计数后稀释至密度为4.5-5.5×10⁵细胞/mL，培养20-28h；

（2）取重组腺病毒液加入终浓度为7.5-8.5μg/mL的聚凝胺，得到待感染病毒液；

（3）将脂肪干细胞，去掉培养基，加入待感染病毒液，继续培养20-28h，去掉病毒液，添加完全培养基进行培养，同时加入2.8-3.2ug/mL的嘌呤霉素进行筛选，继续培养，培养4-6天，得到腺病毒感染的脂肪干细胞。

9.一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞的应用，其特征在于：所述adipsin基因修饰的脂肪干细胞与胰岛细胞进行非接触式共培养；所述非接触式共培养，培养板下室接种adipsin基因修饰的脂肪干细胞，胰岛细胞接种于培养板的上室，用9.5-10.5% FBS的RPMI-1640培养基调整脂肪干细胞和胰岛细胞至相同的细胞密度，进行培养，定期换液。

10.根据权利要求9所述的一种adipsin基因修饰的脂肪干细胞的应用，其特征在于：所述培养板为带有***层的Transwell6孔板，所述adipsin基因修饰的脂肪干细胞和胰岛细胞的细胞密度均为0.8-1.2×10⁴个细胞/孔；所述胰岛细胞为INS-1细胞。

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