CN113041258A

CN113041258A - 一种用于修复***的生物组合物及其制备方法

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Publication number: CN113041258A
Application number: CN202110331876.4A
Authority: CN
Inventors: 赵云霞; 林树
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2021-06-29

Abstract

一种用于修复***的生物组合物，包括ShakeGel^TM3D和通过流式、成脂诱导分化、成骨诱导分化、成软骨诱导分化鉴定的自体ADSCs，按体积1：1均匀混合而成。该生物组合物的制备方法包括：从分离提取自体ADSCs，通过流式、成脂诱导分化、成骨诱导分化、成软骨诱导分化鉴定ADSCs，再与ShakeGel^TM3D结合培养。本发明ShakeGel^TM3D可为自体ADSCs创造一个可行的三维生长环境，ShakeGel^TM3D与自体ADSCs组合物的联合移植通过增加BMP7‑Smad5信号转导促进受损子宫内膜组织的恢复，使子宫内膜增厚，腺体数量增加，纤维化减少，从而使***的小鼠生育能力恢复。

Description

一种用于修复***的生物组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及汽车生物技术领域，更为具体地说是指一种用于修复***的生物组合物及其制备方法。

背景技术

***(Intrauterine adhesion, IUA)是由于子宫内膜基底层损伤引起的子宫腔和/或子宫颈管部分或完全闭塞，它也是子宫***症最常见的原因。目前关于IUA的发病机制有多种假说，包括纤维化增生理论、神经反射理论、干细胞分化异常、宫腔微环境改变及纤维化、信号通路调控异常、促进炎症反应等。由于IUA的病理特征属于子宫内膜纤维化，因此纤维化增生理论是目前研究最广泛的假说。***是子宫手术的一种严重并发症，可导致女性生殖***成千上万的健康问题，如***、反复流产、周期性腹痛、***症和妊娠相关并发症。因此，重建一个正常的宫腔，恢复子宫功能是IUA治疗的目标。

***的传统治疗方法是宫腔镜下粘连切除后再结合各种辅助治疗的应用。然而，这些抗粘连策略有一些缺点和不足，如二次手术的复发、隔离面积有限、宫内炎症反应的诱导、子宫内膜再生困难等，这些迫使***的继续研究并探索新的治疗方案。为此，我们提供一种用于修复***的生物组合物及其制备方法。

发明内容

本发明提供一种用于修复***的生物组合物及其制备方法，为***患者提供良好的治疗药剂。

本发明采用如下技术方案：

一种用于修复***的生物组合物，包括ShakeGel^TM3D凝胶液和通过流式、成脂诱导分化、成骨诱导分化、成软骨诱导分化鉴定的自体脂肪间充质干细胞，按体积1：1均匀混合而成。

进一步地，所述自体脂肪间充质干细胞从动物腹股沟的白色脂肪组织中提取。

本发明还提供一种用于修复***的生物组合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）、提取与培养小鼠的自体脂肪间充质干细胞；（2）、对步骤（1）的脂肪间充质干细胞进行成骨诱导、成脂诱导分化以及成软骨诱导分化处理；（3）、取步骤（2）处理后的脂肪间充质干细胞上清培养液进行流式细胞分析；（4）、在状态良好的脂肪间充质干细胞加入GFP慢性病毒培养基混合液继续培养；（5）、将ShakeGel^TM3D凝胶液与步骤（4）培养得到的自体脂肪干细胞按体积1：1进行离心混匀，制得生物组合物。

进一步地，上述步骤（1）小鼠自体脂肪间充质干细胞的提取和培养过程如下：1）剥离并收集3-4周龄的雌性小鼠腹股沟脂肪组织，放入装有提前预热至37℃KRP buffer的离心管中；2）将脂肪组织从KRP buffer转移到细胞培养皿，采用预热的PBS洗涤两次，按照体积比4：1放入新的KRP buffer，并将脂肪组织剪碎成小块；3）吸取上层脂肪悬浮物加入到新的无菌试管，加入等体积浓度为0.75mg/ml的胶原酶Ⅱ；4）将无菌试管密封后放入37℃水浴缓慢摇动45分钟，使脂肪悬浮物消化到分离细胞层悬浮在液体最上层与其它沉淀的组织碎片分开时，加入预热的PBS，中和胶原酶Ⅱ，终止消化；5）离心分离脂肪干细胞沉淀，吸弃上层混合液；6）加入红细胞裂解液重悬沉淀，裂解10min，再离心摒弃上清液，留下脂肪干细胞沉淀；7）将脂肪干细胞培养基重悬细胞沉淀铺在细胞培养皿中。

进一步地，上述步骤（2）脂肪间充质干细胞的成骨诱导过程如下：1）将初代提取出的脂肪间充质干细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，当细胞融合度达到80-90%时，用0.25%Trypsin-0.04%EDTA进行消化；2）消化后的小鼠脂肪间质干细胞接种在预先包被0.1%明胶的六孔板中，每孔加入完全培养基；3）再将细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，当细胞融合度达到60%-70%时，将孔内完全培养基吸走，向六孔板中加入2 mL C57BL/6小鼠脂肪间质干细胞成骨诱导分化完全培养基；4）每隔3天换用新鲜的C57BL/6小鼠脂肪间充质干细胞成骨诱导分化完全培养基；5）诱导2-4周后用茜素红染色，并在显微镜下观察成骨染色效果。

进一步地，上述步骤（2）脂肪间充质干细胞的成脂诱导分化过程如下：1）将小鼠脂肪间质干细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，当细胞融合度达到80-90%时，用0.25%Trypsin-0.04%EDTA进行消化；2）消化后的小鼠脂肪间质干细胞接种在预先包被0.1%明胶的六孔板中，每孔加入完全培养基；3）再将细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，每隔三天换液，直到细胞融合度达到100%或者过融合，将间质干细胞完全培养基吸走，想六孔板中加入小鼠脂肪间充质干细胞成脂诱导分化培养基A 液；4）诱导3天后，吸走六孔板中的A液，加入2 mL C57BL/6小鼠脂肪间充质干细胞成脂诱导分化培养基B液；5）24h后，吸走B液，换回A液进行诱导，A液和B液交替作用3-5次后，继续用B液维持培养4-7天直到脂滴变得足够大、圆，B液维持培养期间，每隔2-3天需要换用新鲜的B液；6）成脂诱导分化结束后采用茜素红染色，并在显微镜下观察成骨染色效果。

进一步地，上述步骤（2）脂肪间充质干细胞的成软骨诱导分化过程如下：1) 将3-4×10⁵个细胞转移到离心管中离心4 min，2）吸去上清，加入0.5 mL预混液，重悬上一步离心所得沉淀，以清洗小鼠脂肪间充质干细胞，室温下150 g离心5 min；3) 重复步骤2)，再次清洗细胞；4) 将上一步所得沉淀用0.5 mL小鼠脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化完全培养基重悬；5) 室温下离心5 min，拧松离心管盖以便于气体交换，将其放置于37℃、5% CO2的培养箱中培养；6）当细胞团出现聚拢现象时，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中；7）自接种开始计算，每隔2-3 d更换新鲜的成软骨诱导分化完全培养基；8）换液之后，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中，稍加拧松离心管盖放入37℃、5% CO2的培养箱中继续诱导培养；9）持续诱导21-28天后，对软骨球进行***固定和石蜡包埋切片，最后进行阿利辛蓝染色，显微镜下观察阿利辛蓝染色效果。

进一步地，所述步骤（3）的具体过程如下：1）吸取脂肪间充质干细胞的上清培养液，加入预热的PBS进行洗涤；2）加入1 ml 胰蛋白酶，摇晃使细胞全部浸润后，在37℃、5%CO2细胞培养箱内消化2 min；3）加入脂肪间充质干细胞培养基终止反应，并充分将细胞转移到离心管，离心沉淀细胞；4）弃掉上清液后加入1 ml脂肪间充质干细胞培养基，重悬细胞后计数；5）取5 x10⁵脂肪间充质干细胞加入EP管，离心沉淀细胞；6）吸弃上清液，然后加入200 μl Facs buffer洗涤，再离心；7）吸掉上清液，加入50 μl细胞表面抗体染色液，冰上30min； 8）加入200 μl Facs buffer洗涤，离心，吸弃上清液，重复两次；9） 200 μl Facsbuffer重悬细胞，避光并准备上样检测。

所述步骤（4）的具体过程如下：1）将状态良好的脂肪间充质干细胞接种到24孔板中，以6*10⁴cells/孔的密度铺板，每孔加入500ul培养基，保证第二天感染病毒时融合率达到30%-40%；2）第二天，细胞长到30%-40%。吸掉原培养基，按照：细胞数×MOI值/病毒原液滴度×103=病毒感染量(UI)稀释病毒到2ml，同时加入5 μg/ml polybren，加病毒培养基混合液后继续培养；3）病毒感染8 h后，更换新鲜培养基，接着每隔48小时换一次液；4) 病毒感染细胞72 h后，在荧光显微镜下观察细胞，以确定细胞感染的效率。

进一步地，上述步骤（5）的具体过程如下：1) 将凝胶液与细胞悬液按体积比1:1于离心管中混匀，均匀吹打数次，并在涡旋仪上轻度迅速震荡1s使其充分混匀，重复震荡1~2次；2) 细胞培养板每孔经适量PBS 润湿后弃去，再用移液枪吸取已充分混匀的细胞凝胶混合物于板孔中，轻轻晃动使凝胶铺匀； 3) 将细胞板置于37℃恒温培养箱中孵育5-10 min，使细胞凝胶混合物形成凝胶；4) 待凝胶孵育完成，沿孔壁轻轻加入适量体积的培养液，继续放置培养箱中孵育以使细胞充分贴附在凝胶中；5) 培养24 h 后用移液枪轻轻吸弃约1/2 的培养液，并添加等量的新鲜培养液。

由上述对本发明的描述可知，和现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明的自体脂肪间充质干细胞（ADSCs）表达CD105(99.1%)、CD29(99.6%)、CD73(98.9%)、CD34 (0.46%)、CD45 (3.26%)，细胞能够诱导成脂、成骨、成软骨细胞，ShakeGel^TM3D凝胶液可维持自体ADSCs的功能，并给自体脂肪间充质干细胞创造一个可行的三维生长环境。ShakeGel^TM3D与自体ADSCs组合物的联合移植通过增加BMP7-Smad5信号转导促进受损子宫内膜组织的恢复，使子宫内膜增厚，腺体数量增加，纤维化减少，从而使***的小鼠生育能力恢复。

具体实施方式

下面说明本发明的具体实施方式。为了全面理解本发明，下面描述到许多细节，但对于本领域技术人员来说，无需这些细节也可实现本发明。对于公知的组件、方法及过程，以下不再详细描述。

以上用于修复***的生物组合物制备方法，包括如下步骤：

1、小鼠自体ADSCs的提取和培养

1）剥离并收集3-4周龄的雌性C57BL/6小鼠腹股沟脂肪组织，注意分离的脂肪组织要剔除动物毛发，血管以及***。将分离好的脂肪组织放入添加有KRP buffer的15 ml离心管中，KRP buffer提前预热至37 ℃。2) 将脂肪组织从KRP buffer转移到10 cm细胞培养皿，采用预热的PBS洗涤两次，进一步去除明显的血管和***。 3) 洗涤后的脂肪组织放入新的10 ml KRP buffer，脂肪和KRP buffer体积比4:1，干净剪刀把脂肪组织剪碎成小块，有助于脂肪组织与消化液充分接触和消化。 4) 1 ml胶头吸取上层脂肪悬浮物，加入新15 ml无菌试管，在新获取的悬浮物中加入等体积胶原酶II，终浓度是0.75 mg/ml。 5)拧紧试管盖，封口膜密封后放入37 ℃水浴缓慢摇动45分钟，每10分钟观察消化情况。消化到分离细胞层悬浮在液体最上层与其他沉淀的组织碎片分开时。 6) 加入预热1 x PBS终止反应到总体积为14 ml。轻轻颠倒试管，充分中和胶原酶，终止消化。7)离心5 min，分离脂肪干细胞沉淀，吸弃上层混合液。 8) 10 ml红细胞裂解液重悬沉淀，裂解10 min。 9)离心5min，吸弃上清液，留下脂肪干细胞沉淀。 10) 脂肪干细胞培养基重悬细胞沉淀，按照6x10⁴/cm²的比例铺在10 cm细胞培养皿。

2.1脂肪间充质干细胞的成骨诱导

(1)成骨诱导分化完全培养基的配制

1) 使用前，将血清置于2-8℃环境中过夜解冻直至血清完全溶解，轻晃试剂瓶以确保血清混合均匀。 2) 配制前30 min左右，室温溶解抗坏血酸，β-甘油磷酸钠，双抗和谷氨酰胺，轻轻地上下颠倒试剂管以确保试剂混合均匀。3) 使用前10 min，室温溶解***。4) 用70%乙醇擦拭试剂盒中各瓶/管的开口外壁，室温放置数秒使酒精挥发。5) 在超净台中无菌地打开以上各瓶/管。6) 将抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、C57BL/6小鼠脂肪间质干细胞专用胎牛血清、双抗和谷氨酰胺全部加入C57BL/6小鼠脂肪间质干细胞成骨诱导分化基础培养基中。7) 无菌吸取少量基础培养基洗涤各瓶/管，尽可能的将所有组分完整的加入基础培养基中。8) 最后将***加入基础培养基中，吸取0.5 mL基础培养基洗涤试剂管，将混合物一同加入基础培养基中。9) 重复操作步骤8)。10)轻晃配制好的完全培养基，确保混合均匀之后即可使用。

(2) 培养器皿表面的明胶包被。

1) 加适量0.1%明胶到培养器皿中，能覆盖整个培养器皿底面的量即可。2) 摇匀液体使其覆盖整个培养器皿的底面。3) 将铺有0.1%明胶的培养器皿放置在超净台至少30min。4) 30 min后弃去明胶，待培养器皿晾干后，即可用于接种细胞。

(3) 成骨诱导分化操作

1) 将原代提取出的脂肪间充质干细胞置于37℃，5% CO₂的培养箱中培养。2) 当细胞融合度达到80-90%时，用0.25%Trypsin-0.04%EDTA进行消化。3) 将消化下来的C57BL/6小鼠脂肪间质干细胞按照2×10⁴cells/cm²的细胞密度接种在事先包被0.1%明胶的六孔板中，每孔加入2 mL完全培养基。4) 将细胞置于37℃，5% CO₂的培养箱中进行培养。5) 当细胞融合度达到60%-70%时，小心的将孔内完全培养基吸走，向六孔板中加入2 mL C57BL/6小鼠脂肪间质干细胞成骨诱导分化完全培养基。6) 每隔3天换用新鲜的C57BL/6小鼠脂肪间充质干细胞成骨诱导分化完全培养基(使用前需预热至37℃)。7) 诱导2-4周后，视细胞的形态变化及生长情况，用茜素红进行染色。

(4) 茜素红染色分析

1) 成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用1×PBS冲洗1-2次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。2) 吸走中性甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次。每孔中加入1 mL茜素红染液染3-5 min。3) 吸走茜素红染液，用1×PBS冲洗2-3次。4) 将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。

2.2 脂肪间充质干细胞的成脂诱导分化

(1) 成脂诱导分化培养基A 液的配制

1) 使用前，请将血清置于2-8℃环境中过夜解冻直至血清完全溶解，轻晃试剂瓶以确保血清混合均匀。2) 配制前30 min左右，室温溶解***、胰岛素、IBMX、罗格列酮、双抗和谷氨酰胺，轻轻地上下颠倒试剂管以确保试剂混合均匀。3) 用70%乙醇擦拭试剂盒中各瓶/管的开口外壁，室温放置数秒使酒精挥发。4) 超净工作台中将C57BL/6小鼠脂肪间充质干细胞专用胎牛血清、双抗和谷氨酰胺全部加入C57BL/6小鼠脂肪间充质干细胞成脂诱导分化培养基A液基础培养基中。5) 无菌吸取少量A液基础培养基洗涤各瓶/管，尽可能的将所有组分完整的加入A液基础培养基中。6) 将***、胰岛素、IBMX和罗格列酮全部加入A液基础培养基中。7) 无菌吸取少量A液基础培养基洗涤各瓶/管，尽可能的将所有组分完整的加入A液基础培养基中。8) 重复操作步骤7)。9) 轻晃配制好的完全培养基，确保混合均匀之后即可使用。

(2) 成脂诱导分化培养基B液的配制

1) 使用前，将血清置于2-8℃环境中过夜解冻直至血清完全溶解，轻晃试剂瓶以确保血清混合均匀。2) 配制前30 min左右，室温溶解胰岛素、双抗和谷氨酰胺，轻轻地上下颠倒试剂管以确保试剂混合均匀。3) 用70%乙醇擦拭试剂盒中各瓶/管的开口外壁，室温放置数秒使酒精挥发。4) 超净工作台中将C57BL/6小鼠脂肪间充质干细胞专用胎牛血清、双抗和谷氨酰胺全部加入间质干细胞成脂诱导分化培养基B液基础培养基中。5) 无菌吸取少量B液基础培养基洗涤各瓶/管，尽可能的将所有组分完整的加入B液基础培养基中。6) 将胰岛素加入B 液基础培养基中。7) 无菌吸取少量B液基础培养基洗涤试剂管，尽可能的将所有组分完整的加入B液基础培养基中。8) 重复操作步骤7)。9) 轻晃配制好的完全培养基，确保混合均匀之后即可使用。

(3) 成脂诱导分化操作

1) 将C57BL/6小鼠脂肪间质干细胞置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。2) 当细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%Trypsin-0.04%EDTA进行消化。3) 将消化下来的间质干细胞按照2×10⁴ cells/cm²的细胞密度接种在六孔板中，每孔加入2 mL完全培养基。4) 将细胞置于37℃，5% CO₂的培养箱中进行培养。5) 每隔三天换液，直到细胞融合度达到100%或者过融合。6) 小心地将间质干细胞完全培养基吸走，向六孔板中加入C57BL/6小鼠脂肪间充质干细胞成脂诱导分化培养基A 液。7) 诱导3天后，吸走六孔板中的A液，加入2 mLC57BL/6小鼠脂肪间充质干细胞成脂诱导分化培养基B液。8) 24h后，吸走B液，换回A液进行诱导。9) A液和B液交替作用3-5次后( 12-20天)，继续用B 液维持培养4-7天直到脂滴变得足够大、圆。B 液维持培养期间，每隔2-3天需要换用新鲜的B液。

(4) 油红O 染色分析

1) 成脂诱导分化结束后，吸走六孔板中的脂肪间充质干细胞成脂诱导分化培养基，用1×PBS冲洗1-2次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。2) 吸走中性甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次。每孔中加入1 mL油红O染料工作液染色30 min (工作液配制方法：油红O贮存液:蒸馏水=3:2，混匀后用中性滤纸过滤即可)。3) 吸走油红O染液，用1×PBS冲洗2-3次。4) 将培养板置于显微镜下观察成脂染色效果。

2. 3 脂肪间充质干细胞的成软骨诱导分化

(1) 成软骨诱导分化完全培养基的配制

1) 用70%乙醇擦拭试剂盒中各瓶/管的开口外壁(***、抗坏血酸、ITS添加物、丙酮酸钠、脯氨酸、C57BL/6 小鼠脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化基础培养基)，室温放置数秒使酒精挥发。2) 超净工作台中将以上***、抗坏血酸、ITS添加物、丙酮酸钠、脯氨酸全部加入C57BL/6 小鼠脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化基础培养基中，制备成软骨诱导分化完全培养基的预混液。3) 无菌吸取少量成软骨诱导分化基础培养基洗涤各瓶/管，尽可能将所有组分完整地加入基础培养基中，少量残留可能会影响产品性能。4) 轻晃配制好的预混液，混合均匀之后即可使用。

(2) TGF-β3的稀释

1) 将TGF-β3 小量分装至耐低温储样管中，保存在-20℃或更低的温度下并于6个月之内使用完毕。2) 按照比例(1 mL预混液中加入10 μL TGF-β3)，吸取实验所需剂量的TGF-β3，加入相应体积的预混液中配制成软骨诱导分化完全培养基，轻轻地上下颠倒试剂管以确保试剂混合均匀。

(3) 成软骨诱导分化操作

1) 进行成软骨诱导分化实验之前，需要对常规消化后的细胞进行计数。2) 将3-4×10⁵个细胞转移到15 mL离心管中，250g离心4 min。3) 吸去上清，加入0.5 mL预混液，重悬上一步离心所得沉淀，以清洗C57BL/6 小鼠脂肪间充质干细胞，室温下150 g离心5 min。4) 重复步骤3)，再次清洗细胞。5) 将上一步所得沉淀用0.5 mL C57BL/6 小鼠脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化完全培养基重悬。6) 室温下150 g离心5 min。7) 拧松离心管盖以便于气体交换，将其放置于37℃，5% CO₂的培养箱中培养。8) 当细胞团出现聚拢现象时(一般为24 h或48 h后，实际视细胞生长情况而定)轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中。9) 自接种开始计算，每隔2-3 d 给细胞换用新鲜的成软骨诱导分化完全培养基，每管约0.5 mL成软骨诱导分化完全培养基。10) 换液之后，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中。稍加拧松离心管盖放入37℃，5% CO₂的培养箱中继续诱导培养。11)一般持续诱导21-28天后，可对软骨球进行***固定和石蜡包埋切片，最后进行阿利辛蓝染色。

(4) 阿利辛蓝染色分析

1) 软骨球经石蜡包埋后切片。2) 染色步骤：a) 脱蜡和脱水；b) 阿利辛蓝染液染色30 min；c) 自来水冲洗2 min；d) 蒸馏水冲洗1次。3) 显微镜下观察阿利辛蓝染色效果，阿利辛蓝染色部分显示的是软骨组织中的内酸性粘多糖。

3、流式细胞分析

1) 吸弃脂肪间充质干细胞的上清培养液，加入预热2 ml 1 X PBS，洗涤。 2) 加入1 ml 胰蛋白酶，前后左右摇晃可以全部浸润细胞后，在37 ℃，5% CO₂细胞培养箱内消化2 min。 3) 加入脂肪间充质干细胞培养基终止反应，并充分将细胞转移到15 ml离心管。4) 离心5 min，沉淀细胞。5) 弃掉上清后加入1 ml脂肪间充质干细胞培养基，重悬细胞后计数。6) 取5 x10⁵脂肪间充质干细胞加入1.5 ml EP管。300 g，5 min离心沉淀细胞。7) 吸弃上清然后加入200 μl Facs buffer洗涤，300 g，5 min离心。8) 弃掉上清，加入50 μl细胞表面抗体染色液，冰上30 min。9) 加入200 μl Facs buffer洗涤， 5 min离心，吸掉上清，重复两次。10) 200 μl Facs buffer重悬细胞，避光并准备上样检测。

4、GFP慢病毒感染脂肪间充质干细胞

1) 将状态良好的脂肪间充质干细胞接种到24孔板中，以6*10⁴cells/孔的密度铺板，每孔加入500ul培养基。保证第二天感染病毒时融合率达到30%-40%。 2) 第二天，细胞长到30%-40%，吸掉原培养基，按照：细胞数×MOI值/病毒原液滴度×10³=病毒感染量(UI)稀释病毒到2 ml，同时加入5 μg/ml polybren，加病毒培养基混合液后继续培养。 3) 病毒感染8 h后，更换新鲜培养基，接着每隔48小时换一次液。 4) 病毒感染细胞72h后，在荧光显微镜下观察细胞，以确定细胞感染的效率。然后这些细胞被注入子宫，做定位实验。

5、ShakeGelTM3D结合小鼠自体脂肪干细胞的制备

1) 将凝胶液与细胞悬液按体积比1:1(严格按照先加凝胶后加细胞悬液的顺序)于离心管中混匀，均匀吹打数次，并在涡旋仪(vortex)上轻度迅速震荡1s 使其充分混匀，可重复震荡1-2 次。2) 细胞培养板每孔经适量PBS 润湿后弃去，再用移液枪吸取已充分混匀的细胞凝胶混合物于板孔中，轻轻晃动使凝胶铺匀。此外，也可直接将制备的细胞凝胶混合物滴在任何无菌细胞培养器皿表面，制作微组织。3) 将细胞板置于37℃恒温培养箱中孵育5-10min，使细胞凝胶混合物形成凝胶。4) 待凝胶孵育完成，沿孔壁轻轻加入适量体积的培养液，继续放置培养箱中孵育以使细胞充分贴附在凝胶中。5) 培养24h 后用移液枪轻轻吸弃约1/2 的培养液，并添加等量的新鲜培养液。此后即可正常换液，开展后续实验。

6、Cell counting kit-8细胞活性检测

1) CCK8法一般用于检测细胞增殖或细胞毒性实验中活细胞数量的比色检测方法。细胞内线粒体的脱氢酶可还原试剂内的WST-8成橙黄色高度水溶性甲瓒，甲瓒数量和活细胞数成正比。 2) 100 μlCCK8染料结合900 μl DMEM F12培养基，充分混合。 3) 沿侧壁将原细胞培养基吸出，加入200 μl CCK8染料混合液，轻轻前后左右摇晃，帮助细胞和染料充分接触，注意不产生气泡，且不破坏细胞或者细胞-凝胶结构。 4) 37℃、5% CO₂饱和湿度细胞培养箱孵育反应4小时，取100 μl反应染色液到96孔板，注意避免孔中气泡产生，否则影响OD读数，引起实验误差。 5) 酶标仪测定450 nm吸光度。

上述主要试剂的配置如下：

KRP buffer溶液：将CaCl₂(0.0222g)、HEPES(0.5956g)、Na₂HPO₄·12H₂O(0.04296g)、MgSO₄(0.0288g)、NaH₂PO₄·12H₂O(0.0128g)、NaCl(1.404g)、KCl(0.08944g)溶于双蒸水，用0.22μm过滤器过滤，再使用前按照50ml第一步配的溶液再加BSA(1.5g)的比例，再用0.45μm过滤。

胶原酶Ⅱ的配制：按照DEME HIGH glucose(10ml)、collagen Ⅱ(0.015g)、BSA(0.1g)比例配用。

脂肪干细胞培养基：DMEM F12+0.5% NaHCO₃+2% P/S+10% FBS。

以上为采用本发明生物组合物对小鼠模型的具体试验案例。

1、IUA模型的建立

当脂肪间充质干细胞细胞长到第二代，也就是小鼠大约6-7周时，按照80mg/kg的剂量给予1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉后，小鼠取仰卧位固定于手术板上，下腹部备皮，75%酒精消毒，铺无菌洞单，下腹部正中切口，距耻骨联合上约0.5cm,切口长约1.5cm,一次性切开皮肤、腹壁各层进入腹腔，暴露子宫。将50只小鼠分为5组：假手术组(sham group，n=10)，子宫不进行任何处理，只是开腹腔，然后逐层缝合，观察等待至老鼠苏醒；PBS模型组(PBS组，n=10)，用24G的针头在双侧子宫中下段1/3处，来回反复搔刮20次，然后逐层缝合，观察等待至老鼠苏醒，造模7 d后再开腹，小鼠两个子宫角各注射10ul PBS，再逐层关腹，观察等待至老鼠苏醒；自体ADSCs治疗组(ADSCs组，n=10)，用24G的针头在双侧子宫中下段1/3处，来回反复搔刮20次，然后逐层缝合，观察等待至老鼠苏醒，造模7天后再次做麻醉下开腹手术, 按照老鼠耳标每一侧子宫分别沿肌壁注射对应耳标号码的第三代自体ADSCs(5*10⁶悬浮在10ul PBS中)，逐层关闭，观察等待至老鼠苏醒；ShakeGel^TM3D模型组(凝胶组，n=10)，用24G的针头在双侧子宫中下段1/3处，来回反复搔刮20次，然后逐层缝合，观察等待至老鼠苏醒，造模后7d后再次做麻醉下开腹手术，在小鼠两个子宫角各注射10ul ShakeGel^TM3D，逐层关闭，观察等待老鼠苏醒；ADSCs联合ShakeGel^TM3D治疗组(ADSCs+Gel组，n=10)，用24G的针头在双侧子宫中下段1/3处，来回反复搔刮20次，然后逐层缝合，观察等待老鼠苏醒，造模7天后再次开腹，将第三代ADSCs结合ShakeGel^TM3D (5*10⁶悬浮于10ul ShakeGel^TM3D中)按小鼠耳标分别注射到两侧子宫，逐层关腹，观察等待老鼠苏醒。各组治疗处理7 天后，在每组中随机选取5只老鼠，给予80mg/kg的1%戊巴比妥钠麻醉，开腹，收集子宫组织标本，将一部分标本放于4%甲醛中，用于石蜡切片，另一部分标本放于液氮中，随后置于-80℃保存，用于qRT-PCR实验。另外每组剩下5只小鼠做交配实验，具体步骤是，它们按照与C57雄鼠2：1合笼，以雌性小鼠出现***栓记为受孕首日，孕14天，给予80mg/kg 1%戊巴比妥钠，剖腹，观察记录宫角胎鼠个数。

2、子宫组织石蜡切片HE染色

1)取小鼠子宫组织，经固定后，常规石蜡包埋，切片。2) 二甲苯(Ⅰ)中脱蜡5min。3)换用新鲜的二甲苯(Ⅱ)，再次脱蜡5min。4)无水乙醇5min。5)95%乙醇2min。6)80%乙醇2min。7)70%乙醇2min。8)蒸馏水2min。9)苏木素染液染色5min。10)分化液分化30s。11)自来水浸泡15min。12)置伊红染液1min。13)95%乙醇(Ⅰ)2s。14)95%乙醇(Ⅱ)2s。15) 100%乙醇(Ⅰ)2s。16) 100%乙醇(Ⅱ)1min。17)二甲苯石炭酸(3：1)1min。18)二甲苯(Ⅰ)1min。19) 二甲苯(Ⅱ)1min。20)晾干，滴加少许中性树胶，放上盖玻片封固，再晾干，于显微镜下观察拍照。21) 使用图像分析软件Image pro plus6.0进行分析，计算子宫内膜厚度及子宫腺体数目。

3、Masson三色染色

1) 切片常规脱蜡至水。2) 用配置好的Weigert铁苏木素染色液染色5min. 3) 酸性乙醇分化液分化5s，水洗。4) Masson蓝化液返蓝3min，水洗。5) 蒸馏水水洗1min。6) 丽春红品红染色液染色5min。7) 在上述操作过程中按蒸馏水：弱酸溶液=2：1比例配置弱酸工作液，用弱酸工作液洗1min。8) 磷钼酸溶液洗1min。9) 用配置好的弱酸工作液洗1min。10)直接放入苯胺蓝染色液中染色1min。11) 用配置好的弱酸工作液洗1min。12) 95%乙醇快速脱水。13) 无水乙醇脱水3次，每次5s。14) 二甲苯透明3次，每次5s。15) 晾干，滴加少许中性树胶，放上盖玻片封固，再晾干，于显微镜下观察拍照。 16) 使用图像分析软件Imagepro plus6.0进行分析，计算检测子宫内膜纤维化染成蓝色的面积。

4、ADSCs在子宫组织的存活

1) 将新鲜的子宫组织标本置于4%多聚甲醛24h。2) 10%蔗糖24h。 3) 20%蔗糖12h。 4) 30%蔗糖12h。 5) 30%蔗糖12h。 6) 1/2 30%蔗糖和1/2 OCT 12h。 7) OCT 24h。8) OCT 24h,将子宫放入包埋模具内，加入足量OCT放入液氮罐中，迅速冻结，放入-80℃备用。 9) 切片：将冰冻切片机温度调为-20℃，包埋好的组织块放在样品托上，首先30um休整组织块形态，之后调整厚度为7um,切取组织切片，标号。 10) 滴一滴 (20-50ul) 抗荧光衰减封片液于组织切片上，盖上盖玻片，让切片接触封片液，尽量避免气泡。 11) 随后即可通过荧光显微镜观察切片，使用图像分析软件Image pro plus6.0进行分析，计算GFP细胞比例。

5、实时荧光定量逆转录-聚合酶连锁反应（qRT-PCR）

(1) 子宫组织总RNA的提取

1) 将新鲜的或超低温冻存的样品迅速加入到 1.5 ml 灭菌 tube 中，按照20mg组织加入350ul裂解 Buffer RL（使用前请确认已加入 50× DTT Solution）后利用组织破碎仪进行破碎，然后用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀。 2) 将裂解液在12000rpm，4℃离心5 min。3) 小心吸取上清液到新的1.5 ml RNase Free Tube 中。4) 将gDNAEraser Spin Column 安放到2 ml 的Collection Tube（试剂盒提供）上。5) 将上清液转移入到gDNA Eraser Spin Column 中。6) 12,000 rpm，离心1 min。7) 弃gDNA Eraser SpinColumn(进行基因组DNA 提取时请保留)。保留2 ml Tube 中的滤液。8) 向上述步骤3）或步骤7）中加入与液体等体积的70%乙醇(可能会出现沉淀)，使用移液枪将溶液混合均匀。9)立即将混合液(含沉淀)全部转入到RNA Spin Column (含2 ml Collection Tube) 中(如果混合液的体积大于600 μl，请分批加入，每次加入的体积不要大于600 μl) 。10) 12000rpm，离心1 min，弃滤液。将RNA Spin Column 放回到2 ml Collection Tube 中。11) 将500 μl 的Buffer RWA 加入至RNA Spin Column 中，12000 rpm 离心30 s，弃滤液。12) 将600 μl 的Buffer RWB 加入至RNA Spin Column 中，12000 rpm 离心30s，弃滤液。沿RNASpin Column 管壁四周加入Buffer RWB，有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。13) DNaseI 反应液的配制：取5 μl 10×DNase I Buffer，4 μl Recombinant DNase I (RNasefree，5 U/μ l)，41 μl RNase free dH2O 到新的1.5 ml RNase Free Tube中，混合均匀。向RNA Spin Column 膜中央加入50 μl DNase I 反应液，室温静置15 分钟。向RNA SpinColumn 膜中央加入350 μl 的Buffer RWB，12,000 rpm 离心30 s，弃滤液。14) 重复操作步骤12)。15) 将RNA Spin Column 重新安置于2 ml Collection Tube 上，12000 rpm 离心2 min。16) 将RNA Spin Column 安置于1.5 ml 的RNase Free Collection Tube (试剂盒提供) 上，在RNA Spin Column 膜中央处加入50～200 μl 的RNase Free dH2O 或0.1%DEPC 处理水，室温静置5 min。17) 12,000 rpm 离心2 min洗脱RNA。18) 若想提高RNA 的收量，可再向RNA Spin Column 膜中央加入50～200 μl 的RNase FreedH2O 或0.1% DEPC处理水洗脱RNA；若要得到高浓度的RNA，也可以将第一次的洗脱液重新加回至RNA SpinColumn 中，室温静置5 min，12,000 rpm 离心2 min洗脱RNA。19) RNA纯度与浓度检测：混匀RNA后，滴加1ul的液体于紫外分光光度仪进行检测，观察吸收曲线，260/280和260/230的比值以判断RNA的纯度和浓度。

(2) 逆转录

1)按照下表所示配置反转录体系

5X FastKing-RT superMix	4ul
		Total RNA	2ug
无酶水	补足到20ul

先配置成总的混合液，然后再分装到200ul的无酶EP管中，每个管为20ul。配置完后用离心机轻微离心，以甩下壁上粘附的液体。

2)混匀后置于PCR仪中，42℃15min，95℃3min，降至4℃后终止反应，将cDNA产物置于-20℃保存。

(3) 实时荧光定量PCR

1) 反应体系按照下表配置：

2xSupeuReal PreMix Plus	10ul
		正向引物（10uM）	0.6ul
反向引物（10uM）	0.6ul
		cDNA模板	1ul
无酶水	补至20ul

在冰上配置总的混合液，在每孔中加入19ul混匀的液体，最后向每孔加入1ul的cDNA模板，并尽量避免气泡产生，必要时可以离心一下。每一个引物设置3个复孔。

PCR的引物序列(Table1）

2）PCR扩增反应的具体程序如下：

反应结束后，根据溶解曲线判断引物的特异性，并以GAPDH为内参基因，采用2^-△△CT计算各组基因的相对表达量。

6、免疫组织化学

1) 烤片。2) 脱蜡水化：二甲苯Ⅰ5min----二甲苯Ⅱ5min----无水乙醇5min----95%乙醇2min----80%乙醇2min----75%乙醇2min----蒸馏水2min。3) 抗原修复：a) 柠檬酸10ml+双蒸水1000m；b) 向压力锅中加入合适的抗原修复缓冲液，将压力锅放在电热板上并开到最大功率。此时不要密闭压力锅盖，仅将其扣上即可。在等待压力锅沸腾时，可对切片进行脱蜡和复水处理。沸腾后，将载片从自来水转移到压力锅中。小心溶液高温(请使用镊子)。压力锅达到最大压力后，计时3 min。3 min后，关闭电热板，将压力锅放入空水槽。打开泄压阀并用冷水冲淋压力锅，压力下降后，打开锅盖并用冷水冲淋压力锅内部10 min。这样可以充分冷却载片，以便进行后续处理，同时使暴露至高温后的抗原位点能够重新还原。请小心处理热溶液。4) 通透:10XTBST与双蒸水ddh₂O按1：9的比例。Tween® 20在PBS 中配制终浓度为0.2%-0.5% 的溶液，3次3min。5) PBS冲洗。6) 使用免疫组化笔，把组织圈起来。滴加适量的内源性过氧化物酶阻断剂以覆盖组织块，室温干预10min，以去除组织内源性过氧化氢酶的影响。7) PBS浸洗5min，反复3次。8) 用PBS将封闭血清原液稀释10倍。每张切片滴加适量即用型山羊血清封闭液，室温封闭1h。9)甩去即用型山羊血清，分别滴加预先稀释好的一抗兔抗小鼠。10) 室温复温30min，甩去抗体，PBS浸洗5min，反复3次。11) 滴加反应增强液，室温孵育20min,PBS缓冲冲洗3min3次。12) 滴加增强酶标山羊抗小鼠/兔lgG聚合物，室温孵育20min,PBS缓冲液冲洗3min 3次。13) 配制DAB：在试剂专用瓶中依次加入DAB底物液1ml (试剂2)，浓缩DAB溶液50ul (试剂1)，混匀，配置好的DAB显色液2~8℃避光保存，现配现用。14) 加入适量新鲜配置的DAB显色液，室温孵育1min。镜下掌握显色时间，直至阳性区域显色为棕褐色，而阴性对照无着色。15) 流水冲洗5 min终止显色。16) 复染，自来水冲洗，苏木素染色液孵育20s。17) 流水冲洗10min，直至细胞核呈蓝色。18) 浸于70%的酒精2min。19) 浸于80%的酒精3min。20) 浸于90%的酒精4min。21) 浸于无水酒精4min。22) 再浸于新鲜无水酒精5min。23) 浸于二甲苯5min。24) 再浸于新鲜二甲苯5min。25) 滴加少许中性树胶，放上盖玻片封固，再晾干，于显微镜下观察拍照。26) 采用Image Pro-Plus 6.0进行免疫反应定量，每片随机选取3-5个视野，测定平均光密度(MOD)。

7、统计分析

数据分析采用F检验和t检验(等方差)进行两组间的比较。对于三组或更多组，采用one-way ANOVA和Tukey's post-hoc 检验分析组间差异。使用GraphPad Prism8(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)获取图形和统计数据。显着值指定如下:*p < 0.05, **p < 0.01,***P＜0.001，****P ＜0.0001，所有数据均以均数±标准差(SD)表示。

8、结果

8.1自体脂肪间充质干细胞在ShakeGel^TM3D上的表征、分化及安全性评价。

观察原代提取培养的脂肪间充质干细胞的第0代(P0)至P3代的形态，发现特别是第3代自体脂肪间充质干细胞的外观逐渐形成典型的纺锭形成纤维细胞样细胞，排列紧密，呈旋涡状生长。第三代的脂肪间充质干细胞的荧光激活细胞分选(FACS)显示，自体ADSCs表达CD105(99.1%)、CD29(99.6%)和CD73(98.9%)，很少表达CD34和CD45。脂肪间充质干细胞诱导分化结果，成骨诱导24天后，可见茜素红染成红色的矿化结节；成软骨诱导24天后，阿利辛蓝染成蓝色的内酸性粘多糖；成脂诱导24天后，可见脂肪滴的形成，油红O染为红色。

为了进一步评估自体脂肪间充质干细胞在ShakeGel^TM3D上的安全性，CCK-8结果验证了1*10^⁶细胞+ ShakeGel^TM3D培养的细胞OD值高于5*10⁵细胞+ ShakeGel^TM3D培养的细胞OD值。在共培养的第3天，OD值开始逐渐增加。到第7天，1*10⁶ cell+ ShakeGel^TM3D的OD值超过50%。

8.2自体脂肪间充质干细胞在ShakeGel^TM3D上的IUA模型效应

首先，GFP慢病毒感染的脂肪间充质干细胞我们在sham组、PBS组和Gel组的子宫组织切片中均未观察到GFP阳性细胞。而在ADSCs组(2.175%)和ADSCs +Gel组(9.215%)子宫组织切片中均观察到GFP阳性细胞。且ADSCs +Gel组子宫组织切片中GFP阳性细胞数量明显多于ADSCs组(P=0.0101)从子宫大体标本外观上看，PBS组的子宫外形明显比sham组的子宫萎缩，且不光滑。第七天移植ADSCs、ShakeGel^TM3D、ADSCs 结合ShakeGel^TM3D,这些组的子宫外观形态逐渐恢复像一个正常的子宫形态(Figure 7)。HE染色结果分析表明,子宫内膜厚度PBS组(163.8 ± 6.128 μm)明显变薄与假手术组的厚度相比较(264.5 ± 31.75 μm) (P< 0.0001, n = 7;)。ADSCs结合ShakeGel^TM3D联合移植子宫组的子宫内膜厚度明显厚于PBS组(ADSCs group 190.1 ± 8.389 μm, P＜0.05; ADSCs + Gel group 228.8 ± 2.254 μm, P ＜0.0001)。ADSCs +Gel组的子宫内膜比ADSCs组的子宫内膜更厚(p<0.001, n=7) 。与PBS组子宫内膜组织相比，ADSCs组腺体数量明显增加(9.182 ± 2.857 versus 1.545± 0.9342, respectively, per unit area, P < 0.0001)，Gel组(14.55 ± 1.293versus 1.545 ± 0.9342, respectively, per unit area, P < 0.0001)和ADSCs +Gel组((19.36 ± 2.063 versus 1.545 ± 0.9342, respectively, per unit area, P <0.0001)也增加。ADSCs +Gel组比ADSCs组的腺体数量更多(P < 0.0001)。为了进一步评估纤维化程度，采用Massons三色染色，PBS组出现大量纤维组织(56.89 ± 0.4425%)与sham组(29.44 ± 5.2305%)相比。ADSCs(50.10 ± 1.280%, P<0.05)、ShakeGelTM3D (45.17± 1.196%, P<0.0001)、ADSCs联合ShakeGelTM3D (39.55 ± 0.4125%, P<0.0001)治疗后纤维化面积百分比都比PBS组有所降低。此外，ADSCs +Gel组的纤维化面积百分比明显低于ADSCs组(P<0.001)。为了进一步证实实验的纤维化结果，结合α-SMA基因及蛋白表达情况。上述方法均表明，ADSCs +Gel组的纤维化程度明显小于ADSCs组。通过RT-PCR和免疫组化实验，我们发现ADSCs +Gel组和ADSCs组的α-SMA表达量存在显著差异，且前者小于后者。老鼠交配实验数据显示，只有Sham组和ADSCs +Gel组怀孕，其他三组均未见孕囊。

8.3ADSCs结合ShakeGel^TM3D可增强BMP7-Smad5信号来修复***。

QRT-PCR结果，BMP7表达在ADSCs组(0.06124 ± 0.006388)略高于PBS组(0.05062± 0.01281)，但差异无统计学意义(P=0.5302)。BMP7表达在ADSCs + Gel组(0.5575 ±0.06289) 高于PBS组且有统计学意义(P<0.0001)。与ADSCs组相比，ADSCs + Gel组比ADSCs组高表达BMP7,也有统计学意义(P<0.0001)。同样，smad5在ADSCs组(0.7127 ± 0.05734)的表达略高于PBS组(0.6843 ± 0.07691)，但差异无统计学意义(P=0.9820)。ADSCs+ Gel组Smad5 mRNA表达量(0.9066 ± 0.07593)显著高于PBS组(P<0.01)。ADSCs+ Gel组的Smad5的表达比ADSCs高，也有统计学意义(P=0.0167)。

同样，免疫组化结果显示，ADSCs组BMP7的MOD值(0.02330 ± 0.006284)略高于PBS组(0.002817 ± 0.002115)，但差异无统计学意义(P=0.1739)。BMP7的MOD 值在ADSCs+Gel组(0.1314 ±0.01210)高于PBS组，有统计学意义(P<0.0001)。与ADSCs组相比，ADSCs+Gel组的BMP7的MOD 值组显著升高(P<0.0001)。PBS组Smad5的MOD值(0.1676 ± 0.06002)低于ADSCs组(0.2391 ± 0.02442, P<0.0001)、凝胶组(0.2910 ± 0.009053, P<0.0001)、ADSCs +Gel组(0.3372±0.004266, P<0.0001)。ADSCs组smad5的MOD值显著高于ADSCs组(P<0.0001)和Gel组(P=0.0087)。

上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims

1.一种用于修复***的生物组合物，其特征在于：包括ShakeGel^TM3D凝胶液和通过流式、成脂诱导分化、成骨诱导分化、成软骨诱导分化鉴定的自体脂肪间充质干细胞，按体积1：1均匀混合而成。

2.如权利要求1所述的一种用于修复***的生物组合物，其特征在于：所述自体脂肪间充质干细胞从动物腹股沟的白色脂肪组织中提取。

3.一种如权利要求1所述的用于修复***的生物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）、提取与培养小鼠的自体脂肪间充质干细胞；

（2）、对步骤（1）的脂肪间充质干细胞进行成骨诱导、成脂诱导分化以及成软骨诱导分化处理；

（3）、取步骤（2）处理后的脂肪间充质干细胞上清培养液进行流式细胞分析；

（4）、在状态良好的脂肪间充质干细胞加入GFP慢性病毒培养基混合液继续培养；

（5）、将ShakeGel^TM3D凝胶液与步骤（4）培养得到的自体脂肪干细胞按体积1：1进行离心混匀，制得生物组合物。

4.如权利要求3所述的用于修复***的生物组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）小鼠自体脂肪间充质干细胞的提取和培养过程如下：

1）剥离并收集3-4周龄的雌性小鼠腹股沟脂肪组织，放入装有提前预热至37℃KRPbuffer的离心管中；

2）将脂肪组织从KRP buffer转移到细胞培养皿，采用预热的PBS洗涤两次，按照体积比4：1放入新的KRP buffer，并将脂肪组织剪碎成小块；

3）吸取上层脂肪悬浮物加入到新的无菌试管，加入等体积浓度为0.75mg/ml的胶原酶Ⅱ；

4）将无菌试管密封后放入37℃水浴缓慢摇动45分钟，使脂肪悬浮物消化到分离细胞层悬浮在液体最上层与其它沉淀的组织碎片分开时，加入预热的PBS，中和胶原酶Ⅱ，终止消化；

5）离心分离脂肪干细胞沉淀，吸弃上层混合液；

6）加入红细胞裂解液重悬沉淀，裂解10min，再离心摒弃上清液，留下脂肪干细胞沉淀；

7）将脂肪干细胞培养基重悬细胞沉淀铺在细胞培养皿中。

5.如权利要求3所述的用于修复***的生物组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）脂肪间充质干细胞的成骨诱导过程如下：

1）将初代提取出的脂肪间充质干细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，当细胞融合度达到80-90%时，用0.25%Trypsin-0.04%EDTA进行消化；

2）消化后的小鼠脂肪间质干细胞接种在预先包被0.1%明胶的六孔板中，每孔加入完全培养基；

3）再将细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，当细胞融合度达到60%-70%时，将孔内完全培养基吸走，向六孔板中加入2 mL C57BL/6小鼠脂肪间质干细胞成骨诱导分化完全培养基；

4）每隔3天换用新鲜的C57BL/6小鼠脂肪间充质干细胞成骨诱导分化完全培养基；

5）诱导2-4周后用茜素红染色，并在显微镜下观察成骨染色效果。

6.如权利要求3所述的用于修复***的生物组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）脂肪间充质干细胞的成脂诱导分化过程如下：

1）将小鼠脂肪间质干细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，当细胞融合度达到80-90%时，用0.25%Trypsin-0.04%EDTA进行消化；

3）再将细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，每隔三天换液，直到细胞融合度达到100%或者过融合，将间质干细胞完全培养基吸走，想六孔板中加入小鼠脂肪间充质干细胞成脂诱导分化培养基A 液；

4）诱导3天后，吸走六孔板中的A液，加入2 mL C57BL/6小鼠脂肪间充质干细胞成脂诱导分化培养基B液；

5）24h后，吸走B液，换回A液进行诱导，A液和B液交替作用3-5次后，继续用B液维持培养4-7天直到脂滴变得足够大、圆，B液维持培养期间，每隔2-3天需要换用新鲜的B液；

6）成脂诱导分化结束后采用茜素红染色，并在显微镜下观察成骨染色效果。

7.如权利要求3所述的用于修复***的生物组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）脂肪间充质干细胞的成软骨诱导分化过程如下：

1) 将3-4×10⁵个细胞转移到离心管中离心4 min，

2）吸去上清，加入0.5 mL预混液，重悬上一步离心所得沉淀，以清洗小鼠脂肪间充质干细胞，室温下150 g离心5 min；

3) 重复步骤2)，再次清洗细胞；

4) 将上一步所得沉淀用0.5 mL小鼠脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化完全培养基重悬；

5) 室温下离心5 min，拧松离心管盖以便于气体交换，将其放置于37℃、5% CO2的培养箱中培养；

6）当细胞团出现聚拢现象时，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中；

7）自接种开始计算，每隔2-3 d更换新鲜的成软骨诱导分化完全培养基；

8）换液之后，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中，稍加拧松离心管盖放入37℃、5% CO2的培养箱中继续诱导培养；

9）持续诱导21-28天后，对软骨球进行***固定和石蜡包埋切片，最后进行阿利辛蓝染色，显微镜下观察阿利辛蓝染色效果。

8.如权利要求3所述的用于修复***的生物组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）的具体过程如下：

1）吸取脂肪间充质干细胞的上清培养液，加入预热的PBS进行洗涤；

2）加入1 ml 胰蛋白酶，摇晃使细胞全部浸润后，在37℃、5% CO2细胞培养箱内消化2min；

3）加入脂肪间充质干细胞培养基终止反应，并充分将细胞转移到离心管，离心沉淀细胞；

4）弃掉上清液后加入1 ml脂肪间充质干细胞培养基，重悬细胞后计数；

5）取5 x10⁵脂肪间充质干细胞加入EP管，离心沉淀细胞；

6）吸弃上清液，然后加入200 μl Facs buffer洗涤，再离心；

7）吸掉上清液，加入50 μl细胞表面抗体染色液，冰上30 min；

8）加入200 μl Facs buffer洗涤，离心，吸弃上清液，重复两次；

9） 200 μl Facs buffer重悬细胞，避光并准备上样检测。

9.如权利要求1所述的用于修复***的生物组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）的具体过程如下：

1）将状态良好的脂肪间充质干细胞接种到24孔板中，以6*104cells/孔的密度铺板，每孔加入500ul培养基，保证第二天感染病毒时融合率达到30%-40%；

2）第二天，细胞长到30%-40%；吸掉原培养基，按照：细胞数×MOI值/病毒原液滴度×103=病毒感染量(UI)稀释病毒到2ml，同时加入5 μg/ml polybren，加病毒培养基混合液后继续培养；

3）病毒感染8 h后，更换新鲜培养基，接着每隔48小时换一次液；

4) 病毒感染细胞72 h后，在荧光显微镜下观察细胞，以确定细胞感染的效率。

10.如权利要求1所述的用于修复***的生物组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）的具体过程如下：

1) 将凝胶液与细胞悬液按体积比1:1于离心管中混匀，均匀吹打数次，并在涡旋仪上轻度迅速震荡1s使其充分混匀，重复震荡1~2 次；

2) 细胞培养板每孔经适量PBS 润湿后弃去，再用移液枪吸取已充分混匀的细胞凝胶混合物于板孔中，轻轻晃动使凝胶铺匀；

3) 将细胞板置于37℃恒温培养箱中孵育5-10 min，使细胞凝胶混合物形成凝胶；

4) 待凝胶孵育完成，沿孔壁轻轻加入适量体积的培养液，继续放置培养箱中孵育以使细胞充分贴附在凝胶中；

5) 培养24 h 后用移液枪轻轻吸弃约1/2 的培养液，并添加等量的新鲜培养液。