CN114591890B - 一种模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型及其构建方法 - Google Patents

一种模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型。本发明所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型包括：体外共培养的原代血管内皮细胞与原代血管平滑肌细胞；Transwell小室，其底层为聚碳酸酯膜；所述原代血管内皮细胞与所述原代血管平滑肌细胞以所述聚碳酸酯膜相隔，透过所述聚碳酸酯膜形成缝隙连接。本发明所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型，在体外存活时间显著增加，达到3‑7天；该模型可重复性好，并且容易批量构建；可在单一因素刺激后，分别观察平滑肌细胞内皮细胞蛋白表达或功能变化情况；可选择性在平滑肌细胞或内皮细胞侧给药，观察其对细胞蛋白表达或功能的作用。

Description

一种模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模 型及其构建方法
技术领域
本发明属于心血管疾病领域，涉及一种模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型。
背景技术
高血压是心血管疾病的一个独立危险因素，也是全球心血管死亡的主要原因之一。在中国高血压总体患病率为27.9％，且呈升高趋势，居世界首位。高血压患者呈现的血流动力学特征主要表现为心脏泵血功能增强和全身血管阻力升高。血管阻力的增加是导致高血压发生的直接原因。阻力血管(直径小于400μm)是产生血管阻力的主要血管。在阻力血管中，平滑肌细胞和内皮细胞是调控血管阻力的两大类细胞。这两类细胞的位置和功能各有不同。平滑肌细胞位于阻力血管外侧，有神经纤维分布，不直接接触循环血液。平滑肌细胞的主要功能是收缩血管。内皮细胞位于血管内侧，可直接接触循环血液。内皮细胞的主要功能是释放舒张因子、超极化因子和收缩因子，从而调控平滑肌细胞的收缩。生理情况下，阻力血管平滑肌细胞和内皮细胞共同协调调控血管阻力。因此，研究阻力血管平滑肌细胞和内皮细胞的相互作用的机制将可能为高血压进展的机制提供新信息，为防治高血压进展提供新靶标。
但是，在动物体内，阻力血管同时受循环因子、交感神经等多种因素的影响，无法观察单一因素的具体作用；同时目前仍无便捷手段在活体动物内分别观察平滑肌细胞和内皮细胞功能。而另一种观察阻力血管功能的方法，离体血管活性实验，虽然可以观察单一因素对血管功能的作用，但是离体血管在体外存活时间短(最长12-24小时)，并且无法分别观察平滑肌细胞和内皮细胞，尤其是单个细胞的生物学特性。
目前国内外学者仅有对大血管(脐动脉、腹主动脉等)血管平滑肌/内皮细胞共培养，尚无阻力血管平滑肌/内皮细胞的共培养模型。造成模型成功困难的主要原因为：1.肠系膜阻力血管，血管极细，直径小于400μm，需在体视学显微镜下进行；2.高血压动物的阻力血管较正常动物血管管壁僵硬，管腔变窄；血管周围脂肪组织减少，萎缩，显微镜下血管固有细胞数量减少，体积变小，造成了分离纯化操作困难；3.正常内皮细胞和平滑肌细胞是终末分化细胞，不易传代和扩增培养，故小鼠的阻力血管平滑肌/内皮细胞共培养更加困难。
发明内容
本发明的目的在于构建一种模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型，该体外模型有助于体外模拟动物体内的阻力血管状态，研究阻力血管细胞相互作用机制，高通量筛选有前景的治疗高血压的药物，研究潜在高血压药物的作用机制，为研究高血压发生、发展、治疗提供了新的工具和方法。
本发明所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型包括：体外共培养的原代血管内皮细胞与原代血管平滑肌细胞；Transwell小室，其底层为聚碳酸酯膜；所述原代血管内皮细胞与所述原代血管平滑肌细胞以所述聚碳酸酯膜相隔，透过所述聚碳酸酯膜形成缝隙连接。
根据本发明所述的体外模型的进一步特征，所述原代血管内皮细胞与所述原代血管平滑肌细胞均来自小鼠肠系膜二级动脉。
根据本发明所述的体外模型的进一步特征，所述原代血管内皮细胞是接种于所述聚碳酸酯膜的上层，所述原代血管平滑肌细胞是接种于所述聚碳酸酯膜的下层。
本发明还提供了所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型的构建方法。
本发明所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型的构建方法包括以下步骤：
A.原代血管平滑肌细胞的提取；
B.原代血管内皮细胞的提取；
C.取Transwell小室，倒扣于培养皿内，在倒扣的小室顶面接种步骤A所提取的原代血管平滑肌细胞；
D.反转所述的Transwell小室，将其正置于培养板中，在其底层上接种步骤B所提取的原代血管内皮细胞；
E.共培养后取所述Transwell小室的底层的部分聚碳酸酯膜，染色观察血管内皮细胞与血管平滑肌细胞透过聚碳酸酯膜的缝隙形成连接状态，所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型已经构建完成。
根据本发明所述的构建方法的进一步特征，所述步骤A包括以下步骤：
a.分离小鼠肠系膜上动脉及其分支血管，剔除周边脂肪和***，用HBSS-1缓冲液清除动脉腔内血液；
b.用第一消化酶(2mg胶原酶+2ml HBSS-2缓冲液)溶液消化肠系膜上动脉及其分支血管；所述第一消化酶溶液为每毫升HBSS-2缓冲液含有1mg胶原酶；
c.去除外膜，在解剖显微镜下纵向切开血管，刮拭内膜表面，除去内皮；
d.将血管转移到第二消化酶液中消化；所述第二消化酶溶液为每毫升HBSS-2缓冲液含有1mg胶原酶和0.5mg弹性蛋白酶；
e.重悬，分离出所述的原代血管平滑肌细胞。
根据本发明所述的构建方法的进一步特征，所述步骤B包括以下步骤：
a.分离小鼠肠系膜上动脉及其分支血管，分离血管周围静脉和脂肪。
b.将离体的血管放入含0.02％胶原酶的内皮细胞基础培养基中消化，分离出所述的原代血管内皮细胞。
根据本发明所述的构建方法的进一步特征，在所述步骤C之前预处理所述的Transwell小室，在其侧孔中加入纤连蛋白溶液，覆盖于小室底部的聚碳酸酯膜上，风干45分钟。
根据本发明所述的构建方法的进一步特征，所述步骤C中，在每毫升含10％胎牛血清的DMEM培养液中接种1.5×104个平滑肌细胞。
根据本发明所述的构建方法的进一步特征，所述步骤D中，在每毫升含10％胎牛血清、1％牛脑提取液内皮生长因子的DMEM培养液中接种3×104个血管内皮细胞。
根据本发明所述的构建方法，需要翻转transwell小室，在小室底部接种细胞时，液体容易溢出，导致接种细胞及培养液流失。因此本发明人进一步改进了方法，所述步骤C中，另取一个同样的Transwell小室，切去其底部的聚碳酸酯膜，叠放在已倒扣的Transwell小室上，从而防止液体流失，保证接种细胞密度。
本发明所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型，具体以下有益效果：(1)与离体血管相比，该体外模型在体外存活时间显著增加，达到3-7天；(2)该模型可重复性好，并且容易批量构建；(3)可在单一因素刺激后，分别观察平滑肌细胞内皮细胞蛋白表达或功能变化情况；(4)可选择性在平滑肌细胞或内皮细胞侧给药，观察其对细胞蛋白表达或功能的作用。
因此，本发明所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型可以用于：(1)研究平滑肌和内皮细胞间相互作用的机制，以期为防治高血压提供新靶点；(2)高通量筛选有前景的治疗高血压的药物；(3)研究潜在高血压药物的作用机制。
附图说明
图1是本发明所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型的示意图；图中，1为原代血管内皮细胞，2为原代血管平滑肌细胞，3为Transwell小室，4为聚碳酸酯膜。
图2是在本发明所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型的构建过程中的示意图；图中，1为原代血管平滑肌细胞，2为Transwell小室，3为聚碳酸酯膜，4为切去底部聚碳酸酯膜的Transwell小室，叠放在已倒扣的Transwell小室上。
图3是本发明所构建的血管平滑肌细胞-内皮细胞共培养模型的示意图，图中，1为原代内皮细胞，2为原代血管平滑肌细胞，3为血管平滑肌-内皮细胞缝隙连接。
图4是本发明所构建的血管平滑肌细胞-内皮细胞共培养模型的染色剖面图。图中，细胞骨架蛋白F-actin免疫荧光染色结果显示平滑肌-内皮缝隙连接形成；1为原代内皮细胞，2为原代血管平滑肌细胞，3为血管平滑肌-内皮细胞缝隙连接。
图5是Biocytin荧光染料转移图。图中，在已构建的血管平滑肌-内皮细胞共培养模型的平滑肌细胞侧加Biocytin荧光染料孵育，随后取出聚碳酸酯膜(厚度为10μm)，观察聚碳酸酯膜上Biocytin荧光染料从血管平滑肌细胞侧向内皮细胞侧的转移情况。以聚碳酸酯膜平滑肌细胞面为0μm，观察到距离平滑肌细胞面1-10μm处的荧光强度/最大荧光强度接近1，提示Biocytin染料可从血管平滑肌细胞侧向内皮细胞侧转移，证明平滑肌-内皮细胞缝隙连接形成，平滑肌-内皮细胞共培养模型建立成功。
具体实施方式
高血压是常见的心血管并发症，阻力血管(直径小于400μm)是产生血管阻力的主要血管。血管内皮细胞和血管平滑肌细胞是构成血管壁的主要成分，两种细胞之间相互作用、相互影响是维持血管生理功能和管壁自身结构稳定的关键。平滑肌细胞主要功能是收缩血管。内皮细胞主要功能是释放舒张因子、超极化因子和收缩因子，从而调控平滑肌细胞的收缩。
本发明人取小鼠肠系膜阻力血管平滑肌细胞和内皮细胞，在体外利用Transwell小室对血管细胞共培养，建立一种阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型，模拟体内阻力血管平滑肌-内皮细胞对话模式。
本发明所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型，如图1所示，包括：体外共培养的原代血管内皮细胞1与原代血管平滑肌细胞2；Transwell小室3，其底层为聚碳酸酯膜4。原代血管内皮细胞1与原代血管平滑肌细胞2以聚碳酸酯膜4相隔，透过该聚碳酸酯膜4形成缝隙连接。
缝隙连接的形成是平滑肌细胞和内皮细胞分别伸出突触，二者的突触在聚碳酸酯膜的微孔中相遇，随后二者形成缝隙连接，两种细胞通过缝隙连接进行物质交换。通常选取的Transwell小室的聚碳酸酯膜的孔径为0.1-3μm。
本发明所构建的模型与已知文献中的血管平滑肌/内皮细胞共培养模型不同，国内外研究者大多都取大血管(脐血管、主动脉等)进行共培养，而本发明所采用的原代血管内皮细胞与所述原代血管平滑肌细胞均来自小鼠肠系膜二级动脉。
患高血压的小鼠较正常小鼠血管管壁僵硬，管腔变窄；血管周围脂肪组织减少，萎缩，显微镜下脂肪细胞数量减少，体积变小，造成脂肪组织与血管黏连，难以细分出阻力血管，有时甚至脂肪组织消失，只剩系膜组织造成了分离纯化操作困难。本发明是在体视显微镜下，分离小鼠肠系膜阻力血管，血管极细，直径小于400μm。
实施例1：原代血管平滑肌细胞提取
实验动物：6-8周龄的C57BL/6J小鼠，购买自大学实验动物中心，对小鼠实施安乐死后，迅速开胸,显微镜下找到肠系膜上动脉，分离动脉周围静脉和脂肪后放入冰PBS中。
本实施例根据以下步骤从小鼠中提取原代血管平滑肌细胞。
(1)在体视学显微镜下分离出肠系膜上动脉及其分支血管，在离体动脉的两端保留相邻组织的小块，剔除周边脂肪和***。
使用新的无菌小剪刀和镊子在离体环境下分离并提取肠系膜上动脉的二级阻力血管，用细(眼科)剪刀从血管的一端开始仔细解剖并丢弃所有附着的脂肪和***。
分离期间要注意：1.避免牵拉血管(后期需单独取平滑肌细胞，需要划剥掉内皮细胞，牵拉损伤血管会造成划拨困难)；2.分清肠系膜阻力血管，阻力血管为较细小的动脉，肉眼区分时动脉比静脉有更丰富的纤维和肌层；3.正常长度小鼠阻力血管不超过4毫米，解剖肠系膜上动脉阻力血管和邻近组织(包括肠系膜静脉，神经，***等)，从腹主动脉的起点开始，一直向远端延伸至其分支，在离体血管的两端保留相邻组织的小块，这些组织将用于固定，随后进行精细解剖“清洁”的动脉；4.解剖期间，使用塑料巴斯德吸管定期用HBSS-1浸泡动脉。使用新的无菌剪刀仔细分离阻力血管并丢弃所有附着的脂肪和***。
(2)将分离的血管转移到装有3ml HBSS-1的细胞培养皿中冲洗，随后转移到第二个装有HBSS-1的培养皿，移到操作台。
(3)使用75％乙醇消毒手套；在操作台里将血管转移到装有HBSS-1的解剖皿(有硅胶的皿)中。用无菌针固定血管的两端(注意：不要牵拉血管)。
(4)使用带有25号针头的1ml注射器将HBSS-1缓慢注入内腔，从血管中清除血液。
(5)通过将2mg胶原酶(347U/mg)溶解在2ml HBSS-2中来制备第一消化酶溶液(最终浓度347U/ml)；将血管轻轻移至一个35毫米的培养皿，内含2毫升的酶溶液。
(6)将装有血管的皿置于孵箱中孵育，孵育30分钟，孵育完毕后使用巴斯德移液器将部分消化的血管转移到另一个装有1ml HBSS-1+1ml HBSS-2的培养皿，冲洗1分钟。由于所取的血管会有萎缩硬化，经过对比摸索上述浓度、时间温度最为合适，须避免吸入过多量的酶溶液，酶过量会导致细胞消化过度死亡。另外组织消化后已经柔软，不要使用镊子夹取防止损伤。
(7)使用移液吸管，将血管转移到装有HBSS-1的解剖皿中，然后轻轻地固定血管末端。
(8)在解剖显微镜下，用两个细镊子从血管中取出外膜。用两个镊子将血管的末端轻轻拉向血管的另一端。注意：为了获得纯的血管平滑肌细胞培养物，必须完全去除外膜；如果不能去除外膜的残留物，将被成纤维细胞污染，造成模型失败。
(9)用细剪刀纵向切开动脉，用无菌棉签轻轻擦拭内膜表面，以除去内皮。使用巴斯德移液器，将血管转移到包含预热培养基的35mm培养皿中。盖上盖子并将其放入培养箱中过夜。
(10)将血管转移到一个含有2ml第二消化酶溶液的35mm培养皿中，并将动脉切成小块件(1毫米×1毫米)；放入培养箱中孵育30–35分钟。第二消化酶：2mg胶原酶(347U/mg)+1mg弹性蛋白酶(6U/mg)溶解在2ml PSS-2缓冲液中。
(11)向培养皿中加入10ml培养基以停止消化；避免消化过度；离心；转速为1，800转，离心10分钟。
(12)丢弃上清液并用2ml培养基重悬细胞沉淀。这些分离的ASMC平铺在培养瓶中。孵箱里孵育20-30分钟，细胞贴壁每隔3-4d，换新鲜培养基，直到细胞长满，传代。
实施例2：原代血管内皮细胞提取
实验动物：同实施例1。
本实施例根据以下步骤从小鼠中提取原代血管内皮细胞。
(1)在体视学显微镜下找到肠系膜上动脉及其分支血管，分离周围静脉和脂肪后放入冰PSS中。
(2)将离体的血管放入含有0.02％胶原酶的内皮细胞基础培养基中，37℃孵箱中消化45分钟。
(3)1600转离心5分钟，沉淀下的细胞使用含有1％牛脑提取液的内皮细胞生长培养基，重悬后将重悬液放入细胞培养瓶中孵育1小时。去除未贴壁细胞。加入新鲜培养基培养。
(4)贴壁内皮细胞培养3-5天后长满。
实施例3：模拟阻力血管平滑肌细胞-内皮细胞体外模型的构建
(1)第一天，使用75％酒精消毒150mm培养皿，无菌纱布擦拭置于超净台中，使用紫外线消毒。取出Transwell小室，真空抽吸小室上的残留液体，将小室倒扣于150mm培养皿中备用。
Transwell小室的预处理：打开Transwell小室，从小室的侧孔中加入700ul5ug/ml的纤连蛋白溶液至小室内的聚碳酸酯膜的上层，室温风干45分钟。这一步是为了增加内皮细胞的粘附作用，而之后的细胞培养需要在37℃的培养箱中进行。
(2)取出培养好的血管平滑肌细胞，吸走培养基，PSS清洗两次后，胰酶消化细胞1分钟，加入培养基中止消化，500转离心5分钟，弃上清，用2ml培养基重悬细胞，细胞计数，在每个Transwell小室底部接种2ml的1.5×104个/ml血管平滑肌细胞混悬液，放入37℃、5％CO2孵箱孵育过夜。
(3)第二天，配置0.5％的明胶溶液备用，六孔板中加入2ml培养基，取出Transwell小室置于六孔板中，平滑肌细胞侧置于小室下侧，每个小室上侧加入1ml明胶溶液，37℃孵箱孵育半小时。
(4)取出培养好的血管内皮细胞，吸取培养基，加入PSS清洗细胞后，胰酶消化2分钟，加入培养基终止消化、离心，弃去上清、重悬，计数，于Transwell小室的上面接种2ml的3×104个/ml血管内皮细胞混悬液。
(5)Transwell小室接种平滑肌细胞和内皮细胞后，隔天换新鲜培养基，共培养实验的第五天，内皮平滑肌细胞连接形成。模型制备成功。
正常内皮细胞和平滑肌细胞是终末分化细胞，不易传代和扩增培养，高血压的小鼠的阻力血管平滑肌/内皮细胞共培养更加困难，本发明改变了接种密度和比例，提高模型的成功率。本发明揭示了平滑肌细胞和内皮细胞最佳接种密度。平滑肌细胞(接种于小室底部外侧)为1.5×104个/ml，内皮细胞(接种于小室底部内侧)3×104个/ml。也就是，1:2的接种数比例。
如图3所示，聚碳酸酯膜的上层为原代内皮细胞，中间层为平滑肌-内皮细胞缝隙连接，下层为平滑肌细胞。
实施例4：模拟阻力血管平滑肌细胞-内皮细胞相互作用的体外模型双培养的装置的改良
Transwell小室是细胞培养常用工具，本发明利用该小室建立平滑肌细胞和内皮细胞非接触共培养模型。实验需要在Transwell小室翻转后，在每个Transwell小室底部接种2ml的血管平滑肌细胞混悬液，孵育过夜。此时实验将会遇到一个问题，由于翻转的小室底面没有高出的边缘，因此含有细胞的培养液很容易溢出，因此，发明人将另一个Transwell小室底部聚碳酸酯膜切割掉，再叠放在已翻转的培养平滑肌细胞的Transwell小室底部，增高了小室底部的边缘，利用液体的表面张力让平滑肌细胞混悬不易流失，提高实验成功率。参见图2。
实施例5：模型缝隙连接功能检测
方法一：免疫荧光染色
(1)使用小刀将聚碳酸酯膜取出，冰冻包埋并切片；
(2)切片滴加Factin(细胞骨架蛋白)一抗，以及标记Alexfluo-594的二抗；
(3)共聚焦显微镜拍照。
结果如图4所示，细胞骨架蛋白F-actin免疫荧光染色结果显示平滑肌-内皮缝隙连接形成。
方法二：biocytin迁移实验
(1)配置高张溶液：37℃水浴无血清培养基5ml；80℃水浴加热PEG 2分钟；向每管PEG中加入4.7ml的无血清培养基、充分混匀5分钟；向以上配置液体中加入250μl的胎牛血清和50μl 1mol的HEPES缓冲液(pH 7.4)，充分混匀，配置成高张溶液；使用滤器过滤后备用。
(2)配置低张溶液：无血清培养基和无菌双蒸水按照6:4配置。
(3)使用配置好的高张溶液荧光染料Biocytin配置成5mg/ml工作液备用
(4)Biocytin需要通过促进胞饮试剂InfluxTMPinocytic Cell-Loading Reagent通过胞饮方式使染料进入细胞。具体实验步骤：将Transwell小室倒置，放于无菌的一次性水杯中，底部内皮细胞接触完全培养基，倒置小室使血管平滑肌细胞侧朝上，缓慢的在平滑肌细胞侧加入待孵育荧光染料的高张溶液，37℃孵育10分钟，真空抽吸高张溶液后，加入低张溶液，静置1分钟后，洗去低张液体，将小室放入完全培养基中，37℃孵育15分钟。实验结束。
(5)拍片：使用小刀将聚碳酸酯膜(厚度为10μm)取出，放置于载玻片中，使用荧光封片剂封片，平滑肌细胞面朝向盖玻片；使用共聚焦显微镜拍片。连续断层扫片。
(6)分析数据，通过断层扫描Transwell膜的横切面，使用Olympus共聚焦显微镜分析Biocytin荧光素转移到ECs的能力进行了评估。Olympus共聚焦显微镜每隔1μm进行一次扫描，以平滑肌细胞面作为起始点，设置为0μm，每个1μm共聚焦显微镜可以记录荧光强度。以正常状态下最强的荧光强度作为最大荧光强度，
结果如图5所示，以聚碳酸酯膜平滑肌细胞面为0μm，观察到距离平滑肌细胞面1-10μm处的荧光强度/最大荧光强度接近1，提示Biocytin染料可从血管平滑肌细胞向内皮细胞转移，证明平滑肌-内皮细胞缝隙连接形成，平滑肌-内皮细胞共培养模型建立成功。

Claims (5)

1.一种模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型，其特征在于，包括：
体外共培养的来自小鼠肠系膜二级动脉的原代血管内皮细胞与原代血管平滑肌细胞；
Transwell小室，其底层为聚碳酸酯膜；
所述原代血管内皮细胞与所述原代血管平滑肌细胞以所述聚碳酸酯膜相隔，透过所述聚碳酸酯膜形成缝隙连接；
所述原代血管内皮细胞是接种于所述聚碳酸酯膜的上层，所述原代血管平滑肌细胞是接种于所述聚碳酸酯膜的下层；
所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型是通过以下步骤构建的：
A．原代血管平滑肌细胞的提取，包括以下步骤：
a. 分离小鼠肠系膜上动脉及其分支血管，提取肠系膜上动脉的二级阻力血管，剔除周边脂肪和***，用HBSS-1缓冲液清除动脉腔内血液；
b．用第一消化酶溶液消化所提取的肠系膜上动脉的二级阻力血管；所述第一消化酶溶液为每毫升HBSS-2缓冲液含有1 mg胶原酶；
c. 在解剖显微镜下取出外膜，纵向切开血管，擦拭内膜表面，除去内皮；
d．将血管转移到第二消化酶液中消化；所述第二消化酶溶液为每毫升HBSS-2缓冲液含有1 mg胶原酶和0.5 mg弹性蛋白酶；
e．重悬，分离出所述的原代血管平滑肌细胞；
B．原代血管内皮细胞的提取，包括以下步骤：
a. 分离小鼠肠系膜上动脉及其分支血管，分离血管周围静脉和脂肪；
b．将离体的血管放入含0.02%胶原酶的内皮细胞基础培养基中消化，分离出所述的原代血管内皮细胞；
C．取Transwell小室，倒扣于培养皿内，在倒扣的小室顶面接种步骤A所提取的原代血管平滑肌细胞；
D．反转所述的Transwell小室，将其正置于培养板中，在其底层上接种步骤B所提取的原代血管内皮细胞；
E．共培养后取所述Transwell小室的底层的部分聚碳酸酯膜，染色观察血管内皮细胞与血管平滑肌细胞透过聚碳酸酯膜的缝隙形成连接状态，所述的模拟阻力血管平滑肌细胞与内皮细胞相互作用的体外模型已经构建完成。
2.根据权利要求1所述的体外模型，其特征在于：在所述步骤C之前预处理所述的Transwell小室，在其侧孔中加入纤连蛋白溶液，覆盖于小室底部的聚碳酸酯膜上，风干30-45分钟。
3.根据权利要求1所述的体外模型，其特征在于：所述步骤C中，在每毫升含10%胎牛血清的DMEM培养液中接种1.5×104个平滑肌细胞。
4. 根据权利要求1所述的体外模型，其特征在于：所述步骤D中，在每毫升含10%胎牛血清、1% 牛脑提取液内皮生长因子的DMEM培养液中接种3×104个血管内皮细胞。
5.根据权利要求1所述的体外模型，其特征在于：所述步骤C中，另取一个同样的Transwell小室，切去其底部的聚碳酸酯膜，叠放在已倒扣的Transwell小室上。
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