ES2628940T3

ES2628940T3 - Variantes de lipasa

Info

Publication number: ES2628940T3
Application number: ES07717346.6T
Authority: ES
Inventors: Jesper Vind; Jurgen Carsten Franz Knotzel; Kim Borch; Allan Svendsen; Thomas Honger Callisen; Debbie Yaver; Mads Eskelund Bjornvad; Peter Kamp Hansen; Haiyan Ge; Michael Lamsa
Original assignee: Novozymes AS; Novozymes Inc
Current assignee: Novozymes AS; Novozymes Inc
Priority date: 2006-01-23
Filing date: 2007-01-22
Publication date: 2017-08-04
Anticipated expiration: 2027-01-22
Also published as: EP2371949B1; EP2371948A1; DK2371948T3; CN105296445B; EP2371949A1; DK1979477T3; CN105296445A; ES2629332T3; DK2371948T5; DK2371949T3; EP1979477A2; WO2007087508A8; WO2007087508A3; EP1979477B1; CN101370933A; CN101370933B; JP2009523455A; JP5133899B2; EP2371948B1; ES2629334T3

Abstract

Variante de una lipasa progenitora, donde la lipasa variante es al menos 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 y comprende al menos tres sustituciones seleccionadas del grupo consistente en (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración): a) al menos dos sustituciones en la Región I, y b) al menos una sustitución en la Región II, y c) al menos una sustitución en la Región III, y d) al menos una sustitución en la Región IV; y donde la variante tiene actividad de lipasa y muestra un rendimiento de lavado y olor mejorados y comprende las sustituciones T231 R +N233R +I255Y.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de lipasa

CAMPO DE LA INVENCIÓN 5

[0001] La presente invención se refiere a variantes de lipasa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

10

[0002] Las lipasas son útiles, por ejemplo, como enzimas detergentes para eliminar manchas lipídicas o grasas de ropa y otros tejidos, como aditivos para masa de pan y otros productos horneados. De este modo, una lipasa derivada de Thermomyces lanuginosus (sinónimo Humicola lanuginosa, EP 258 068 y EP 305 216) se vende para usar en detergente con el nombre comercial de Lipolase® (producto de Novo Nordisk A/S). WO 0060063 describe variantes de la lipasa de T. lanuginosus con un rendimiento de primer lavado particularmente bueno en 15 una solución detergente. WO 9704079, WO 9707202 y WO 0032758 también revelan variantes de la lipasa de T. Lanuginosus.

imagen1

imagen2

[0003] En algunas aplicaciones, interesa minimizar la formación de ácidos grasos de cadena corta que generan olor. 20

Así, se sabe que los detergentes para ropa con lipasas a veces pueden dejar olores residuales fijados a telas manchadas con leche (EP 430315). WO 02062973 divulga variantes de lipasa en las que la generación de olor se ha reducido por la unión de una extensión en el extremo C-terminal.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN 25

[0004] Los inventores han descubierto que, mediante la introducción de mutaciones en ciertas regiones/posiciones de una lipasa, es posible mejorar las propiedades o características de la lipasa.

[0005] En una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a lipasas que tienen propiedades 30 mejoradas para usar en detergentes. Por ejemplo, la invención proporciona variantes con una tendencia reducida a la generación de olor obtenidas mediante la introducción de mutaciones en una o más regiones identificadas en la lipasa progenitora. En otra forma de realización preferida, la presente invención proporciona variantes de lipasa que, en comparación con la lipasa progenitora, tienen un potencial reducido para la generación de olor sin la fijación de una extensión en el extremo C-terminal. 35

[0006] En otro aspecto, la invención se refiere a una secuencia de ADN que codifica la variante de lipasa de la invención, un vector de expresión que alberga dicha secuencia de ADN y una célula huésped transformada que contiene la secuencia de ADN o el vector de expresión.

40

[0007] En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir la variante de lipasa de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

45

[0008] La Figura 1 muestra el alineamiento de lipasas.

LISTADOS DE SECUENCIAS

[0009] 50

SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de ADN que codifica la lipasa de Thermomyces lanoginosus.

SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Thermomyces lanoginosus.

SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Absidia reflexa.

SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Absidia corymbifera.

SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Rhizomucor miehei. 55

SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Rhizopus oryzae.

SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus niger.

SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus tubingensis.

SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Fusarium oxysporrum.

SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Fusarium heterosporum. 60

SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus oryzae.

SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Penicillium camemberti.

SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus foetidus.

SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus niger.

SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus oryzae. 65

SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Landerina penisapora.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Lipasas progenitoras

5

[0010] Se puede utilizar cualquier lipasa progenitora adecuada. En una forma de realización preferida, la lipasa progenitora puede ser una lipasa fúngica. En otra forma de realización preferida, la lipasa progenitora puede ser una lipasa con una secuencia de aminoácidos con al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso 100 % de homología tal y como se define en la sección "Homología y alineamiento" con la secuencia de la lipasa de T. Lanuginosus mostrada en la SEQ ID NO: 2. 10

[0011] La lipasa progenitora puede ser un polipéptido de levadura tal como un polipéptido de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o de Yarrowia; o más preferiblemente un polipéptido fúngico filamentoso tal como un polipéptido de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, 15 Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium o Trichoderma.

[0012] En un aspecto preferido, la lipasa progenitora es un polipéptido de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, 20 Saccharomyces norbensis, o Saccharomyces oviformis con actividad de lipasa.

[0013] En otro aspecto preferido, la lipasa progenitora es un polipéptido de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium 25 crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Thermomyces lanoginosus (sinónimo: Humicola lanuginose), Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, 30 Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0014] En otro aspecto preferido, la lipasa progenitora es una lipasa de Thermomyces.

35

[0015] En un aspecto más preferido, la lipasa progenitora es una lipasa de Thermomyces lanuginosus. En una forma de realización aún más preferida, la lipasa progenitora es la lipasa de la SEQ ID NO: 2.

Lipasas variantes

40

[0016] Las variantes de lipasa de la presente invención son al menos 80 % idénticas a la SEQ ID NO: 2 y comprenden, en comparación con la lipasa progenitora, al menos tres sustituciones seleccionadas del grupo consistente en:

a) al menos dos sustituciones en la región I, y 45

b) al menos una sustitución en la región II, y

c) al menos una sustitución en la región III, y

d) al menos una sustitución en la región IV,

y donde la variante tiene actividad de lipasa y un muestra rendimiento de lavado y olor mejorados y comprende 50 las sustituciones T231 R +N233R +I255Y.

[0017] En una forma de realización preferida, la lipasa variante es una variante de una lipasa de Thermomyces, más preferiblemente, una lipasa de T. Lanuginosus, e incluso más preferiblemente la lipasa de T. Lanuginosus mostrada en la SEQ ID NO: 2. En una forma de realización preferida, la lipasa variante tiene al menos 85 %, 90 55 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2. La lipasa variante puede ser una variante de una lipasa progenitora codificada por un gen derivado/obtenido de uno de los siguientes organismos progenitores: Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, 60 Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma. En una forma de realización preferida, la lipasa variante tiene al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con una lipasa progenitora codificada por un gen derivado/obtenido de uno de los siguientes organismos progenitores: Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, 65 Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum,

Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma.

[0018] En un aspecto preferido, la lipasa variante es una Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis variante. En una forma de realización preferida, la lipasa variante tiene al 5 menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con una lipasa progenitora codificada por un gen derivado/obtenido de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis.

10

[0019] La lipasa variante puede ser una variante de una lipasa progenitora codificada por un gen derivado/obtenido de uno de los siguientes organismos progenitores: Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, 15 Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Thermomyces lanoginosus (sinónimo: Humicola lanuginose), Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride. En una forma de 20 realización preferida, la lipasa variante tiene al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con una lipasa progenitora codificada por un gen derivado/obtenido de uno de los siguientes organismos progenitores: Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium 25 graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Thermomyces lanoginosus (sinónimo: Humicola lanuginose), Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma 30 longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0020] En otro aspecto preferido, la variante es una variante de una lipasa de Thermomyces.

[0021] En un aspecto más preferido, la lipasa progenitora es una lipasa de Thermomyces lanuginosus. En una 35 forma de realización aún más preferida, la lipasa progenitora es la lipasa de la SEQ ID NO: 2.

Identificación de regiones y sustituciones

[0022] Las posiciones a las que se hace referencia en la Región I hasta la Región IV a continuación son las 40 posiciones de los residuos de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2. Para encontrar las posiciones correspondientes (u homólogas) en una lipasa distinta, se usa el procedimiento descrito en "Homología and alineamiento".

Sustituciones en la Región I

45

[0023] La Región I consiste en residuos de aminoácidos que rodean el residuo de E1 en el extremo N-terminal. En esta región, se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa progenitora con un aminoácido más positivo. La variante de lipasa comprende al menos dos sustituciones en la Región I, tal como tres, cuatro, cinco o seis sustituciones en la Región I e incluye las sustituciones T231R y N233R.

50

[0024] Los residuos de aminoácidos correspondientes a las siguientes posiciones están comprendidos por la región I: 1, 2 a 11 y 223-239. Las siguientes posiciones son de interés particular: 1, 4, 8, 11, 223, 227, 229, 231, 233, 234, 236.

[0025] En particular se han identificado las siguientes sustituciones adicionales: X1N/* X4V y X227G. 55

[0026] En una forma de realización preferida, la lipasa variante tiene al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2

[0027] En una forma de realización más preferida, la lipasa variante es una variante de la lipasa que tiene la 60 secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Sustituciones en la Región II

[0028] La Región II consiste en residuos de aminoácidos en contacto con sustrato en un lado de la cadena de 65 acilo y un lado de la parte de alcohol. En esta región se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa progenitora

con un aminoácido más positivo o con un aminoácido menos hidrofóbico.

[0029] La variante de lipasa puede comprender al menos una sustitución en la Región II, tal como dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituciones en la Región II e incluye la sustitución I255Y.

5

[0030] Los residuos de aminoácidos correspondientes a las siguientes posiciones están comprendidos por la Región II: 202 a 211 y 249 a 269. Las siguientes posiciones son de interés particular: 202, 210, 211, 253, 254, 255, 256.

[0031] En particular, se han identificado las siguientes sustituciones: X202G, X210K/W/A, y X256K/R y 10 X259G/M/Q/V.

[0032] En una forma de realización preferida, la lipasa variante tiene al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2

15

[0033] En una forma de realización más preferida, la lipasa variante es una variante de la lipasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Sustituciones en la Región III

20

[0034] La Región III consiste en residuos de aminoácidos que forman una estructura flexible y, por lo tanto, permiten que el sustrato entre en el sitio activo. En esta región se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa progenitora con un aminoácido más positivo o un aminoácido menos hidrofóbico.

[0035] La variante de lipasa puede comprender al menos una sustitución en la Región III, tal como dos, tres, 25 cuatro, cinco o seis sustituciones en la Región III.

[0036] Los residuos de aminoácidos correspondientes a las siguientes posiciones están comprendidos por la Región II 82 a 102. Las siguientes posiciones son de interés particular: 83, 86, 87, 90, 91, 95, 96, 99.

30

[0037] En particular, se han identificado las siguientes sustituciones: X83T, X86V y X90A/R.

[0038] En una forma de realización preferida, la lipasa variante tiene al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2

35

[0039] En una forma de realización más preferida, la lipasa variante es una variante de la lipasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Sustituciones en la Región IV

40

[0040] La Región IV consiste en residuos de aminoácidos que se unen electrostáticamente a una superficie. En esta región se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa progenitora con un aminoácido más positivo.

[0041] La variante de lipasa puede comprender al menos una sustitución en la Región IV, tal como dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituciones en la Región IV. 45

[0042] Los residuos de aminoácidos correspondientes a las siguientes posiciones están comprendidos por la Región IV: 27 y 54 a 62. Las siguientes posiciones son de interés particular: 27, 56, 57, 58, 60.

[0043] En particular, se han identificado las siguientes sustituciones: X27R, X58N/AG/T/P y X60V/S/G/N/R/K/A/L. 50

[0044] En una forma de realización preferida, la lipasa variante tiene al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2

[0045] En una forma de realización más preferida, la lipasa variante es una variante de la lipasa que tiene la 55 secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Aminoácidos en otras posiciones

[0046] La lipasa progenitora opcionalmente puede comprender alteraciones adicionales, por ejemplo sustitución 60 de otros aminoácidos, particularmente menos de 10, menos de 9, menos de 8, menos de 7, menos de 6, menos de 5 alteraciones en comparación con una lipasa progenitora. Algunos ejemplos son sustituciones correspondientes a una o más de las posiciones 24, 37, 38, 46, 74, 81, 83, 115, 127, 131, 137, 143, 147, 150, 199, 200, 203, 206, 211, 263, 264, 265, 267 y 269 de la lipasa progenitora. En una forma de realización particular, hay una sustitución en al menos una de las posiciones correspondientes a la posición 81, 147, 150, 65 227 y 249. En una forma de realización preferida, al menos una sustitución se selecciona del grupo consistente

en X38R, X81Q/E, X143S/C/N/D/A, X147M/Y, X150G/K, X227G y X249R/I/L.

[0047] La variante puede comprender sustituciones fuera de la Región I a IV definida; el número de sustituciones fuera de la región I a IV definida es preferiblemente menos de seis, por ejemplo cinco, cuatro, tres, dos o una sustitución. 5

[0048] Otras sustituciones, por ejemplo, se pueden hacer según principios conocidos en la técnica, por ejemplo las sustituciones descritas en WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202.

Variantes de lipasa progenitora 10

[0049] Las lipasas variantes incluyen lipasas progenitoras idénticas a la SEQ ID NO: 2 que tienen las sustituciones enumeradas en la siguiente tabla (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

Región I: Región II Región III Región IV Regiones exteriores

T231 R + N233R: I255Y

15

Nomenclatura para modificaciones de aminoácidos

[0050] Al describir variantes de lipasa según la invención, se usa la nomenclatura siguiente para facilitar la referencia:

20

Aminoácido(s) original(es):posición(es):aminácido(s) sustituído(s)

[0051] Según esta nomenclatura, por ejemplo, la sustitución de ácido glutámico por glicina en la posición 195 se muestra como G195E. Una deleción de glicina en la misma posición se muestra como G195*, y la inserción de un residuo de aminoácido adicional tal como la lisina se muestra como G195GK. 25

[0052] Cuando una lipasa específica contiene una "deleción" en comparación con otras lipasas y se hace una inserción en esa posición, esto se indica como *36D para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36.

[0053] Las mutaciones múltiples se separan por el signo más, por ejemplo: R170Y+G195E, que representa 30 mutaciones en las posiciones 170 y 195 que sustituyen tirosina y ácido glutámico por arginina y glicina, respectivamente.

[0054] X231 indica el aminoácido en un polipéptido progenitor que corresponde con la posición 231, cuando se aplica el procedimiento de alineamiento descrito. X231 R indica que el aminoácido se sustituye con R. Para la 35 SEQ ID NO: 2, X es T, y X231 R indica de este modo una sustitución de T en la posición 231 con R. Cuando el aminoácido que está en una posición (por ejemplo 231) se puede sustituir por otro aminoácido seleccionado de un grupo de aminoácidos, por ejemplo el grupo consistente en R y P e Y, esto será indicado por X231R/P/Y.

[0055] En cualquier caso, se emplea la abreviatura de aminoácidos de una letra o de tres letras aceptada por la 40 IUPAC.

Agrupamiento de los aminoácidos

[0056] En esta especificación, los aminoácidos se clasifican como cargados negativamente, cargados 45 positivamente o eléctricamente neutros según su carga eléctrica a pH 10. De este modo, los aminoácidos negativos son E, D, C (cisteína) e Y, particularmente E y D. Los aminoácidos positivos son R, K y H, particularmente R y K. Los aminoácidos neutros son G, A, V, L, I, P, F, W, S, T, M, N, Q y C cuando forman parte de un puente disulfuro. Una sustitución con otro aminoácido del mismo grupo, (negativo, positivo o neutro) se denomina sustitución conservadora. 50

[0057] Los aminoácidos neutros se pueden dividir en hidrofóbicos o no polares (G, A, V, L, I, P, F, W y C como parte de un puente disulfuro) e hidrofílicos o polares (S, T, M, N, Q).

Identidad de los aminoácidos 55

[0058] La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad".

[0059] Para los fines de la presente invención, el alineamiento de dos secuencias de aminoácidos se determina 60 usando el programa Needle del paquete EMBOSS (http://emboss.org) versión 2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo de alineamiento global descrito en Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453.

La matriz de sustitución usada es BLOSUM62, la penalización por apertura de gap es 10, y la penalización por

extensión de gap es 0,5.

[0060] El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos de la presente invención ("secuencia de la invención"; por ejemplo, los aminoácidos 1 a 269 de la SEQ ID NO: 2) y una secuencia de aminoácidos diferente ("secuencia extraña") se calcula como el número de coincidencias exactas en un alineamiento de las dos 5 secuencias, dividido por la longitud de la "secuencia de la invención" o la longitud de la "secuencia extraña", la que sea más corta.

El resultado se expresa en identidad porcentual.

[0061] Una correspondencia exacta ocurre cuando la "secuencia de la invención" y la "secuencia extraña" tienen 10 residuos de aminoácidos idénticos en las mismas posiciones de la superposición. La longitud de una secuencia es el número de residuos de aminoácidos de la secuencia (por ejemplo, la longitud de la SEQ ID NO: 2 es 269).

[0062] El procedimiento anterior se puede utilizar para el cálculo de la identidad, así como de la homología y para el alineamiento. En el contexto de la presente invención, la homología y el alineamiento se han calculado como 15 se describe a continuación.

Homología y alineamiento

[0063] Para los fines de la presente invención, el grado de homología se puede determinar adecuadamente 20 mediante programas informáticos conocidos en la técnica, tales como GAP proporcionado en el paquete de programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE. UU. 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45), usando GAP con los siguientes ajustes para la comparación de secuencias de polipéptidos: penalización por creación de gap de 3,0 y penalización por extensión de gap de 0,1. 25

[0064] En la presente invención, las posiciones correspondientes (u homólogas) en las secuencias de lipasa de Absidia reflexa, Absidia corymbefera, Rhizmucor miehei, Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus tubigensis, Fusarium oxysporum, Fusarium heterosporum, Aspergillus oryzea, Penicilium camembertii, Aspergillus foetidus, Aspergillus niger, Thermomyces lanoginosus (sinónimo: Humicola lanuginose) y Landerina 30 penisapora se definen por el alineamiento mostrado en la figura 1.

[0065] Par encontrar las posiciones homólogas en secuencias de lipasa no mostradas en el alineamiento, la secuencia de interés se alinea con las secuencias mostradas en la figura 1. La nueva secuencia se alinea con el presente alineamiento de la figura 1 usando el alineamiento de gaps con la secuencia más homóloga encontrada 35 por el programa GAP. GAP se encuentra en el paquete de programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE. UU. 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45) Los siguientes ajustes se usan para la comparación de secuencias de polipéptidos: penalización por creación de gap de 3,0 y penalización por extensión de gap de 0,1. 40

Hibridación

[0066] La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de lipasa que son codificados por polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones de astringencia muy baja, condiciones de 45 astringencia preferiblemente baja, más preferiblemente condiciones de astringencia media, más preferiblemente condiciones de astringencia media-alta, aún más preferiblemente condiciones de astringencia alta, y de la forma más preferible condiciones de astringencia muy alta con (i) los nucleótidos 178 a 660 de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 178 a 660 de la SEQ ID NO: 1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii), o (iv) una cadena complementaria de (i); (ii), o (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, 50 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, Nueva York). Una subsecuencia de la SEQ ID NO: 1 contiene al menos 100 nucleótidos contiguos o, preferiblemente, al menos 200 nucleótidos contiguos. Además, la subsecuencia puede codificar un fragmento de polipéptido que tiene actividad de lipasa.

[0067] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia muy baja a 55 muy alta se definen como prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3 %, 200 ug/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y o bien formamida al 25 % para astringencias muy baja y baja, o bien formamida al 35 % para astringencias media y media-alta, o bien formamida al 50 % para astringencias alta y muy alta, siguiendo procedimientos Southern blot estándar durante 12 a 24 horas óptimamente.

60

[0068] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador finalmente se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2 % preferiblemente a al menos 45°C (astringencia muy baja), más preferiblemente a al menos 50°C (astringencia baja), más preferiblemente a al menos 55°C (astringencia media), más preferiblemente a al menos 60°C (astringencia media-alta), aún más preferiblemente a al menos 65°C (astringencia alta), y de la forma más preferible a al menos 70°C (astringencia 65 muy alta).

Secuencia de ADN, vector de expresión, célula huésped, producción de lipasa

[0069] La invención proporciona una secuencia de ADN que codifica la lipasa de la invención, un vector de expresión que alberga la secuencia de ADN y una célula huésped transformada que contiene la secuencia de 5 ADN o el vector de expresión. Estos se pueden obtener por métodos conocidos en la técnica.

[0070] La invención también proporciona un método para producir la lipasa mediante el cultivo de la célula huésped transformada bajo condiciones propicias para la producción de la lipasa y la recuperación de la lipasa del caldo resultante. El método se puede practicar según principios conocidos en la técnica. 10

Actividad de lipasa

Actividad de lipasa en tributirina a pH neutro (LU)

15

[0071] Se prepara un sustrato para lipasa emulsionando tributirina (tributirato de glicerina) utilizando goma arábiga como emulsionante. La hidrólisis de tributirina a 30 °C a pH 7 o 9 se observa en un análisis volumétrico pH-stat. Una unidad de actividad de lipasa (1 LU) es igual a la cantidad de enzima capaz de liberar 1 micromol de ácido butírico/min a pH 7.

20

Riesgo Beneficio

[0072] El factor de ries-beneficio que describe el rendimiento en comparación con el riesgo reducido de olor se define como: BR = RPmedio / R, como se describe a continuación.

25

Usos

[0073] Las enzimas de la presente invención pueden tener un uso industrial, por ejemplo incluirse en composiciones detergentes para eliminar materia grasa.

30

EJEMPLOS

[0074] Los productos químicos usados como tampones y sustratos fueron productos comerciales de al menos grado reactivo.

35

Medios y soluciones

[0075]

Producto: Nombre comercial

LAS:: Surfac PS

Zeolite A: Wessalith P

40

Otros ingredientes usados son reactivos estándar de laboratorio.

Materiales

[0076] 45

Producto: Proveedor

EMPA221: EMPA St. Gallen, Lerchfeldstrasse 5; CH-9014 St. Gallen, Suiza

Ejemplo 1

Producción de enzima

50

[0077] Un plásmido que contiene el gen que codifica la lipasa se construye y se transforma en una célula huésped adecuada usando métodos estándar de la técnica.

[0078] La fermentación se realiza como una fermentación por lote alimentado utilizando una temperatura de medio constante de 34°C y un volumen inicial de 1,2 litros. El pH inicial del medio se fija a 6.5. Una vez el pH ha 55 aumentado hasta 7.0, este valor se mantiene a través de la adición de H3PO4 al 10 %. El nivel de oxígeno disuelto en el medio se controla variando el índice de agitación y utilizando un índice de aireación fijo de 1,0 litro de aire por litro de medio por minuto. El ritmo de adición de la alimentación se mantiene a un nivel constante durante toda la fase de lote alimentado. El medio de lote contiene jarabe de maltosa como fuente de carbono, urea y extracto de levadura como fuentes de nitrógeno y una mezcla de sales y trazas metálicas. La alimentación 60 añadida continuamente durante la fase de lote alimentado contiene jarabe de maltosa como fuente de carbono,

mientras que se añade extracto de levadura y urea para asegurar un suministro suficiente de nitrógeno.

[0079] La purificación de la lipasa puede realizarse usando métodos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo mediante filtración del sobrenadante de fermentación y, posteriormente, cromatografía hidrofóbica y cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo como se describe en EP 0 851 913 EP, ejemplo 3. 5

Ejemplo 2

AMSA - ensayo de esfuerzo mecánico automatizado - para el cálculo del rendimiento relativo (RP)

10

[0080] Las variantes de enzimas de la presente aplicación se evalúan utilizando el ensayo de esfuerzo mecánico automatizado (AMSA). Con la prueba AMSA se puede examinar el rendimiento de lavado de una gran cantidad de soluciones de detergente enzimático de pequeño volumen. La placa del AMSA tiene varias ranuras para soluciones de prueba y una tapa que comprime firmemente la muestra de textil que se ha de lavar contra todas las aberturas de las ranuras. Durante el tiempo de lavado, la placa, las soluciones de prueba, el textil y la tapa se 15 agitan enérgicamente para poner la solución de prueba en contacto con el textil y aplicar tensión mecánica. Para una mayor descripción, véase WO02/42740, especialmente el párrafo "Special method embodiments" en la página 23-24. Los contenedores, que contienen la solución detergente de prueba, consisten en agujeros cilíndricos (6 mmv de diámetro, 10 mm de profundidad) en una placa metálica. El tejido manchado (material de prueba) descansa sobre la placa metálica y se usa como tapa y sello en los contenedores.Otra placa metálica 20 descansa sobre el tejido manchado para evitar cualquier vertido de cada contenedor.Las dos placas metálicas con el tejido manchado se someten a vibración vertical a una frecuencia de 30 Hz con una amplitud de 2 mm.

[0081] El ensayo se llevó a cabo bajo las condiciones experimentales específicas a continuación:

25

Tabla 3

Solución de prueba: 0,5 g/l de LAS 0,52 g/l de Na2CO3 1,07 g/l de Zeolite A 0,52 g/l Citrato de Na3

Volumen de la solución de prueba: 160 micro l

pH: Sin alterar (≈9.9)

Tiempo de lavado: 20 minutos

Temperatura: 30 °C

Dureza del agua: 15°dH Proporción de Ca2+/Mg2+/NaHCO3: 4:1:7,5

Concentración enzimática en la solución de prueba: 0,125, 0,25, 0,50,1,0 mg ep / l

Secado: Rendimiento: Después del lavado, la pieza de textil se enjuaga inmediatamente en agua del grifo y se seca al aire a 85C en 5 min Olor: después del lavado, la pieza de textil se enjuaga inmediatamente en agua de grifo y se seca a temperatura ambiente (20°C) durante 2 horas

Material de prueba: Muestra de cúrcuma-nata como se describe a continuación (EMPA221 usado como textil de algodón)

[0082] Se prepararon muestras de cúrcuma-nata mezclando 5 g de cúrcuma (Santa Maria, Dinamarca) con 100 g de nata (38 % de grasa, Arla, Dinamarca) a 50 °C, la mezcla se dejó a esta temperatura durante 30 aproximadamente 20 minutos y se filtró (50°C) para eliminar cualquier partícula no disuelta. La mezcla se enfrió hasta 20°C. Se sumergieron muestras de tejido de algodón, EMPA221, en la mezcla de nata-cúrcuma y después se dejaron secar a temperatura ambiente durante la noche y se congelaron hasta su uso. La preparación de las muestras de nata-cúrcuma se describe en la solicitud de patente WO 2006/125437.

35

[0083] El rendimiento de la variante de la enzima se mide como el brillo del color de las muestras de textil lavadas con esa variante de enzima específica. El brillo también se puede expresar como la intensidad de la luz reflejada desde la muestra cuando se la ilumina con luz blanca. Cuando el textil está manchado, la intensidad de la luz reflejada es menor que en un textil limpio. Por lo tanto, la intensidad de la luz reflejada puede utilizarse para medir el rendimiento de lavado de una variante de una enzima. 40

[0084] Las mediciones de color se hacen con un escáner profesional de superficie plana (PFU DL2400pro), que se usa para capturar una imagen de las muestras de textil lavadas. La toma de imágenes se realiza con una resolución de 200 dpi y con una intensidad del color resultante de 24 bits. Para obtener resultados precisos, a menudo el escáner se calibra con una carta IT8 reflectante de Kodak. 45

[0085] Para extraer un valor para la intensidad de luz de las imágenes escaneadas, se usa una aplicación de software especialmente diseñada (Novozymes Color Vector Analyzer). El programa recupera los valores de 24 bits por píxel de la imagen y los convierte en valores para rojo, verde y azul (RGB). El valor de intensidad (Int) se calcula sumando los valores RGB entre sí como vectores y luego tomando la longitud del vector resultante:

5

[0086] El rendimiento de lavado (P) de las variantes se calcula de acuerdo con la fórmula siguiente:

donde 10

Int(v) es el valor de la intensidad de la luz de la superficie del textil lavada con enzimas, y

Int(r) es el valor de la intensidad de la luz de la superficie del textil lavada sin enzimas.

Una puntuación de rendimiento relativo se da como el resultado del lavado AMSA conforme a la definición:

Las puntuaciones de rendimiento relativo (RP) recogen los rendimientos (P) de las variantes de enzima 15 de prueba respecto a la enzima de referencia:

RP = P(enzima de prueba) / P(enzima de referencia)

RPmedio indica el rendimiento relativo medio en comparación con la enzima de referencia en las cuatro 20 concentraciones enzimáticas (0,125; 0,25; 0,5; 1,0 mg de ep/l)

RPmedio = medio(RP(0,125), RP(0,25) RP(0,5), RP(1,0))

Se considera que una variante muestra un rendimiento del lavado mejorado si tiene un rendimiento 25 mejor que la referencia.

En el contexto de la presente invención, la enzima de referencia es la lipasa de la SEQ ID NO: 2 con las sustituciones T231 R + N233R.

Ejemplo 3 30

GC - Cromatógrafo de gases - para el cálculo del factor de riesgo

[0087] La liberación de ácido butírico de las muestras lavadas con lipasa se midió por microextracción en fase sólida - cromatografía de gases (SPME-GC) utilizando el método siguiente. Cuatro piezas de textil (5 mm de 35 diámetro), lavadas en la solución especificada en la Tabla 3 que contiene 1 mg/l de lipasa, se transfirieron a un vial de un cromatógrafo de gases (GC). Las muestras se analizaron en un Varian 3800 GC equipado con un Stabilwax- DA con columna Integra-Guard (30 m, 0,32 mm de ID y 0,25 micro-m de df) y una fibra Carboxen MEFS PDMS (75 micro-m). Cada muestra se preincubó durante 10 min a 40°C seguidos de 20 min de muestreo con la fibra MEFS en el espacio por encima de las piezas de textil. La muestra se inyectó posteriormente sobre la 40 columna (temperatura de inyector = 250°C). Flujo de columna = 2 ml de helio/min. Gradiente de temperatura de horno de columna: 0 min = 40°C, 2 min = 40°C, 22 min = 240°C, 32 min = 240°C. El ácido butírico se detectó con un detector de ionización de llama (FID) y la cantidad de ácido butírico se calculó en función de una curva estándar de ácido butírico.

45

[0088] El riesgo de rendimiento de olor, R, de una variante de lipasa es la proporción entre la cantidad de ácido butírico liberado desde la muestra lavada de variante de lipasa y la cantidad de ácido butírico liberado desde una muestra lavada con la lipasa de la SEQ ID NO: 2 con las sustituciones T231 R + N233R (enzima de referencia), después de que ambos valores hayan sido corregidos para la cantidad de ácido butírico liberado desde una muestra lavada sin lipasa. El riesgo (R) de las variantes se calcula según la fórmula siguiente: 50

Olor = medido en micro g de ácido butírico desarrollado en 1 mg de proteína enzimática / l corregido en blanco

Alfa enzima de prueba = Olor enzima de prueba - Blanco 55

Alfa enzima de referencia = Olor enzima de referencia - Blanco

R = Alfa enzima de prueba / Alfa enzima de referencia

Se considera que una variante muestra un olor reducido en comparación con la referencia si el R factor es inferior a 1. 60

Ejemplo 4

Actividad (LU) con respecto a la absorbancia a 280 nm

5

[0089] La actividad de una lipasa respecto a la absorbancia a 280 nm se determina mediante el ensayo siguiente:

LU/A280:

[0090] La actividad de la lipasa se determina como se ha descrito anteriormente en la sección Actividad de 10 lipasa.

Se mide la absorbancia de la lipasa a 280 nm (A280) y se calcula la proporción LU/A280. La relación LU/A280 se calcula como la LU/A280 de la variante dividida por la LU/A280 de una enzima de referencia. En el contexto de la presente invención, la enzima de referencia es la lipasa de la SEQ ID NO: 2 con las sustituciones T231 R + N233R. 15

Ejemplo 5

BR - Riesgo Beneficio

20

[0091] El factor de Riesgo-Beneficio que describe el rendimiento en comparación con el riesgo reducido de olor se define como:

BR = RPmedio / R

Se considera que una variante muestra un rendimiento de lavado mejorado y un olor reducido si el factor BR es 25 superior a 1.

[0092] Al aplicar los métodos anteriores, se obtuvieron los siguientes resultados:

30

Tabla 4

35

Variante: Mutaciones en la SEQ ID NO: 2 RP medio (RPmedio) BR LU/A280

1: I202G + T231R + N233R 0,84 1,41 no determinado

2: I86V + L227G + T231R + N233R + P256K 1,08 1,52 1700

3: Q4V + S58N + V60S + T231R + N233R 0,87 1,73 1950

4: S58N + V60S + I90R + T231R + N233R 1,06 1,27 2250

5: I255Y + T231R + N233R 1,19 1,17 3600

6: I90A + T231R + N233R + I255V 1,13 1,14 2700

Referencia: T231R + N233R 1,00 1,00 3650

7: G91A + E99K + T231R+N233R + Q249R + 270H + 271T + 272P + 273S + 274S + 275G + 276R + 277G + 278G + 279H + 280R 0,43 no determinado 850

8: G91A + E99K + T231 R, N233R + Q249R + 270H + 271T + 272P + 273S + 274S + 275G + 276R + 277G + 278G 0,13 no determinado 500

[0093] La lipasa de referencia y las variantes 7 y 8 de la Tabla 4 se describen en WO 2000/060063.

Ejemplo 6

40

BR - Riesgo Beneficio

[0094] Se midió el Riesgo-Beneficio para las variantes enumeradas en la Tabla 5. El factor de Riesgo-Beneficio se midió de la misma manera que se describe en el Ejemplo 5 y estuvo por encima de 1 para todas las variantes enumeradas. 45

Tabla 5

Variante: Mutaciones en la SEQ ID NO: 2

Referencia: T231R + N233R

9: L97V+ T231R+N233R

10: A150G+T231R+N233R

11: I90R+T231R+N233R

12: I202V+T231R+N233R

13: L227G+ T231R+ N233R+ P256K

14: I90A+ T231R+ N233R

15: T231R+N233R+ I255P

16: I90V+I255V+T231R+N233R

17: F211L+ L227G+ T231R+ N233R+ I255L+ P256K

18: S58N+ V60S+ T231R+ N233R+ Q249L

19: S58N+ V60S+ T231R+ N233R+ Q249I

20: A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

21: K46L+ S58N+ V60S+ T231R+ N233R+ Q249L+ D254I

22: Q4L+ E43T+ K46I+ S58N+ V60S+ T231R+ N233R+ Q249L+ D254I

23: Q4L+ S58N+ V60S+ T231R+ N233R+ Q249L+ D254I

24: K46I+ S58N+ V60S+ T231R+ N233R+ Q249L+ D254L

25: K46L+ S58N+ V60S+ K223I+ T231R+ N233R+ D254I

26: E43T+ K46I+ S58N+ V60S+ T231R+ N233R+ Q249L+ D254I

27: S58N+ V60S+ I86V+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

28: K24R+ K46R+ K74R+ I86V+ K98R+ K127R+ D137K+ A150G+ K223R+ T231R+ N233R

29: S58A+V60A+ I86V+T231R+N233R

30: K24R+ K46R+ S58N+ V60S+ K74R+ I86V+ K98R+ K127R+ D137K+ K223R+ T231R+ N233R

31: S58A+ V60A+ I86V+ A150G+ T231R+ N233R

32: S58N+ V60V+ D62G+ T231R+ N233R

33: Q4V+ S58N+ V60S+ I86V+ T231R+ N233R+ Q249L

34: Q4V+ S58N+ V60S+ I86V+ A150G+ T231R+ N233R+ I255V

35: Q4V+ S58N+ V60S+ I90A+ A150G+ T231R+ N233R+ I255V

36: Y53A+ S58N+ V60S+ T231R+ N233R+ P256L

37: I202L+ T231R+ N233R+ I255A

38: S58A+ V60S+ I86V+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

39: D27R+ S58N+ V60S+ I86V+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

40: V60K+ I86V+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

41: Q4V+ S58A+ V60S+ S83T+ I86V+ A150G+ E210K+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

42: Q4V+ V60K+ S83T+ I86V+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

43: D27R+ V60K+ I86V+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

44: Q4N+ L6S+ S58N+ V60S+ I86V+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

45: E1N+ V60K+ I86V+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

46: V60K+ I86V+ A150G+ K223N+ G225S+ T231R+ N233R+ P256K

47: E210V+ T231R+ N233R+ Q249R

48: S58N+ V60S+ E210V+ T231R+ N233R+ Q249R

49: Q4V+ V60K+ I90R+ T231R+ N233R+ I255V

50: Q4V+ V60K+ A150G+ T231R+ N233R

51: V60K+ S83T+ T231R+ N233R

52: V60K+ A150G+ T231R+ N233R+ I255V

53: T231R+ N233G+ D234G

54: S58N+ V60S+ I86V+ A150G+ E210K+ L227G+ T231R+ N233R+ Q249R+ P256K

55: S58N+ V60S+ I86V+ A150G+ E210K+ L227G+ T231R+ N233R+ I255A+ P256K

56: S58N+ V60S+ I86V+ A150G+ G156R+ E210K+ L227G+ T231R+ N233R+ I255A+ P256K

57: S58T+ V60K+ I86V+ N94K+ A150G+ E210V+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

58: S58T+ V60K+ I86V+ D102A+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

59: S58T+ V60K+ I86V+ D102A+ A150G+ E210V+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

60: S58T+ V60K+ S83T+ I86V+ N94K+ A150G+ E210V+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

61: S58A+ V60S+ I86V+ T143S+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

62: G91S+ D96V+ D254R

63: V60L+ G91M+ T231W+ Q249L

64: T37A+ D96A+ T231R+ N233R+ Q249G

65: E56G+E87D+T231R+N233R+D254A

66: E210K+T231R+N233R

67: D27H+E87Q+D96N+T231R+N233R+D254V

68: F181L+E210V+T231R+N233R

69: D27N+ D96G+ T231R+ N233R

70: D96N+ T231R+ N233R

71: T231R+ N233I+ D234G

72: S58K+ V60L+ E210V+ Q249R

73: S58H+ V60L+ E210V+ Q249R

74: Q4V+ F55V+ I86V+ T231R+ N233R+ I255V

75: Q4V+ S58T+ V60K+ T199L+ N200A+ E210K+ T231R+ N233R+ I255A+ P256K

76: Q4V+ D27N+ V60K+ T231R+ N233R

77: I90F+ I202P+ T231R+ N233R+ I255L

78: S58N+ V60S+ D158N+ T231R+ N233R

79: S58N+ V60S+ S115K+ T231R+ N233R

Claims

REIVINDICACIONES

1. Variante de una lipasa progenitora, donde la lipasa variante es al menos 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 y comprende al menos tres sustituciones seleccionadas del grupo consistente en (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración): 5

a) al menos dos sustituciones en la Región I, y

b) al menos una sustitución en la Región II, y

c) al menos una sustitución en la Región III, y

d) al menos una sustitución en la Región IV;

10

y donde la variante tiene actividad de lipasa y muestra un rendimiento de lavado y olor mejorados y comprende las sustituciones T231 R +N233R +I255Y.
2. Variante de lipasa según la reivindicación 1, donde la lipasa variante es al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2. 15
3. Variante de lipasa según la reivindicación 1, donde la lipasa progenitora es la lipasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
4. Variante de lipasa según la reivindicación 1, donde la lipasa comprende otra sustitución en la posición que 20 corresponde a la posición 4 y/o a la posición 227 de la SEQ ID NO: 2.
5. Variante de lipasa según la reivindicación 4, donde la lipasa tiene una sustitución que corresponde con X4V y X227G (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

25
6. Variante de lipasa según la reivindicación 1, donde al menos una sustitución en la Región II de la lipasa progenitora comprende sustituciones seleccionadas del grupo consistente en sustituciones en posiciones que corresponden con las posiciones 202, 210, 211, y 256 (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).
7. Variante de lipasa según la reivindicación 6, donde al menos una sustitución en la lipasa progenitora se 30 selecciona del grupo consistente en X202G, X210K, X211 L, y X256K (usando SEQ ID NO: 2 para la numeración).
8. Variante de lipasa según la reivindicación 1, donde al menos una sustitución en la Región III de la lipasa progenitora comprende sustituciones seleccionadas del grupo consistente en sustituciones en posiciones que 35 corresponden con las posiciones 83, 86 y 90 (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).
9. Variante de lipasa según la reivindicación 8, donde al menos una sustitución en la lipasa progenitora se selecciona del grupo consistente en X83T, X86V y X90A/R (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

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10. Variante de lipasa según la reivindicación 1, donde al menos una sustitución en la Región IV de la lipasa progenitora comprende sustituciones seleccionadas del grupo consistente en sustituciones en posiciones que corresponden con las posiciones 27, 58 y 60 (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).
11. Variante de lipasa según la reivindicación 10, donde al menos una sustitución en la Región IV de la lipasa 45 progenitora comprende sustituciones seleccionadas del grupo consistente en X27R, X58N/A/G/P/T y X60S/V/G/N/R/K/A/L (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).
12. Variante de lipasa según la reivindicación 1, donde la variante de lipasa comprende además al menos una sustitución en la lipasa progenitora seleccionada del grupo consistente en sustituciones en posiciones que 50 corresponden con la posición 81, 147, 150, 227 y 249 (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).
13. Variante de lipasa según la reivindicación 12, donde la variante de lipasa comprende además al menos una sustitución seleccionada del grupo consistente en X81Q/E, X147M/Y, X150G y X249R/I/L (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración). 55
14. Secuencia de ADN que codifica la variante de lipasa de las reivindicaciones 1-13.
15. Vector de expresión que alberga la secuencia de ADN según la reivindicación 14.

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16. Célula huésped transformada que contiene la secuencia de ADN según la reivindicación 14.
17. Método para producir una variante de lipasa, método el cual comprende cultivar la célula huésped transformada de la reivindicación 16 bajo condiciones propicias para la producción de la variante de lipasa y recuperar la variante de lipasa del caldo resultante. 65