JP6204352B2 - α−アミラーゼ変異体 - Google Patents

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Description

配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは本明細書において参照により援用される。
本発明は、α−アミラーゼの変異体、この変異体をコードするポリヌクレオチド、この変異体の生成方法、および、この変異体の使用方法に関する。
α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、デンプンならびに他の直鎖および分岐１，４−グリコシドオリゴ糖および多糖類の加水分解を触媒する酵素群を構成する。
洗剤、製パン、醸造、例えば異性化糖の調製またはデンプンからのエタノール製造の一部におけるデンプン液化および糖化などの数々の公知の用途におけるα−アミラーゼの産業的な使用には長い歴史がある。α−アミラーゼのこれらの用途および他の用途は公知であり、特に細菌性α−アミラーゼといった微生物由来のα−アミラーゼが利用される。
用いられた最初の細菌性α−アミラーゼは、Ｔｅｒｍａｍｙｌとしても知られるＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼであり、これは広範に特徴付けが行われ、この酵素に係る結晶構造が判明している。ＡＡ５６０などのアルカリ性アミラーゼが、洗剤における用途が見出された特定の一群のα−アミラーゼを形成する。これらの公知の細菌性アミラーゼの多くは、特定の用途における機能が改善されるよう修飾されている。
α−アミラーゼの耐熱性を高める方法は詳細に研究されている。Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）には、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼの特定の領域がＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼの対応する領域で置換されたキメラα−アミラーゼが開示されている。このキメラα−アミラーゼは、耐熱性に関わる領域を特定するために構築された。このような領域は、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼのアミノ酸残基１７７−１８６およびアミノ酸残基２５５−２７０を含むことが見出された。Ｉｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．１９９８では、ＡｍｙＳ−タイプアミラーゼの耐熱性は、２つのアミノ酸残基Ｒ１７９−Ｇ１８０（ＡｍｙＳ番号）をループ（Ｆ１７８〜Ａ１８４）から欠失させることにより高められることが示されている。しかしながら、Ｓｈｉａｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）には、同一のループが欠失したＡｍｙＳ酵素は、高温でのコーンスターチ加水分解に対して親酵素よりも特異活性が低く、ＡｍｙＳアミラーゼの重要な利点の一つが犠牲になっていることが示されている。
環境保護のために、洗浄、皿洗いおよび／またはクリーニングプロセス中の温度を下げることがますます重要となっている。しかしながら、アミラーゼを含む大部分の酵素の至適温度は、低温洗浄において通常用いられる温度よりも高い。α−アミラーゼは洗剤組成物において用いられる重要な酵素であり、その使用は、ランドリーの洗濯または皿洗いの最中におけるデンプン質の汚れを除去するためにますます重要となっている。従って、温度が低い場合であっても洗浄性能、汚れ除去効果および／または活性が保持されるα−アミラーゼ変異体を見出すことが重要である。しかしながら、現在の洗剤酵素組成物の効率にも関わらず、多くの汚れは完全に除去することが困難である。これらの問題は、低い洗浄温度（例えば冷水）および短期間の洗浄サイクルの使用増加により悪化している。それ故、低温下で機能することが可能であり、同時に特異活性（デンプン分解活性）、安定性および／または洗浄性能などの他の望ましい特性が維持または増加可能であるデンプン分解酵素を得ることが望ましい。
それ故、本発明は、５〜３５℃の温度などの低温での洗浄、皿洗いおよび／またはクリーニングプロセスにおいて用いられることが可能であるα−アミラーゼ変異体を提供することを目的とする。さらに、本発明はまた、親α−アミラーゼと比して、または、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれかのα−アミラーゼと比して向上した洗浄性能を低温で有するα−アミラーゼ変異体を提供することを目的とする。
本発明は、配列番号１の成熟型ポリペプチドの位置Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７に対応する２つ以上（いくつか）の位置に改変を含む親α−アミラーゼの単離された変異体に関し、ここで、各改変は、独立して、置換、欠失または挿入であり、また、変異体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれかの成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％であるが１００％未満の配列同一性を有し、また、変異体はα−アミラーゼ活性を有する。
本発明はまた、変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド；核酸構築物、ベクターおよびポリヌクレオチドを含む宿主細胞；ならびに、変異体を生成する方法に関する。
本発明はまた、このような変異体を調製するための方法に関する。
本発明は、配列番号１の成熟型ポリペプチドの位置Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７に対応する２つ以上（いくつか）の位置に改変を含む親α−アミラーゼの単離された変異体に関し、ここで、各改変は、独立して、置換、欠失または挿入であり、また、変異体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれかの成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％であるが１００％未満の配列同一性を有し、また、変異体はα−アミラーゼ活性を有する。
定義
α−アミラーゼ活性：「α−アミラーゼ活性」という用語は、デンプンならびに他の直鎖および分岐１，４−グリコシドオリゴ糖および多糖類の加水分解を触媒する酵素群を構成するα−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）の活性を意味する。
変異体：「変異体」という用語は、改変（すなわち、置換、挿入および／または欠失）を１つまたは複数（いくつか）の位置で含むα−アミラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、ある位置のアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味し；欠失とは、ある位置のアミノ酸の除去を意味し；および、挿入とは、ある位置のアミノ酸に隣接して１〜３個のアミノ酸を付加することを意味する。
ミュータント：「ミュータント」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
野生型酵素：「野生型」α−アミラーゼという用語は、自然界において見出されるバクテリア、イースト菌または糸状真菌などの天然微生物によって発現されたα−アミラーゼを意味する。
親または親α−アミラーゼ：「親」または「親α−アミラーゼ」という用語は、本発明の酵素変異体をもたらすために改変が行われたα−アミラーゼを意味する。親は、天然（野生型）ポリペプチドまたはその変異体であり得る。
単離された変異体：「単離された変異体」という用語は、人工的に修飾された変異体を意味する。一態様において、この変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度および少なくとも９０％の純度といった、少なくとも１％の純度である。
実質的に純粋な変異体：「実質的に純粋な変異体」という用語は、最大で１０重量％、最大で８重量％、最大で６重量％、最大で５重量％、最大で４重量％、最大で３重量％、最大で２重量％、最大で１重量％および最大で０．５重量％の元々関連しているかまたは組換えにより関連している他のポリペプチド材料を含有する調製物を意味する。好ましくは、この変異体は、調製物中に存在するポリペプチド材料の総重量を基準として、少なくとも９２％の純度、例えば、少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％の純度および１００％の純度である。本発明の変異体は、実質的に純粋な形態であることが好ましい。これは、例えば、周知の組換え方法によって、または、古典的な精製方法によって変異体を調製することにより達成されることが可能である。
成熟型ポリペプチド：「成熟型ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等などの翻訳およびいずれかの翻訳後修飾に続くその最終形態にあるポリペプチドを意味する。
成熟型ポリペプチドコード配列：「成熟型ポリペプチドコード配列」という用語は、α−アミラーゼ活性を有する成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性が、「配列同一性」というパラメータによって記載される。
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられる任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳボージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（前述のＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（前述のＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いて判定される。用いられる任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
断片：「断片」という用語は、成熟型ポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端から欠失された１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸を有するポリペプチドを意味し；ここで、この断片はα−アミラーゼ活性を有する。
サブ配列：「サブ配列」という用語は、成熟型ポリペプチドコード配列の５’−および／または３’−末端から欠失された１つまたは複数（いくつか）のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを意味し；ここで、サブ配列はα−アミラーゼ活性を有する断片をコードする。
対立遺伝子変異体：「対立遺伝子変異体」という用語は、同一の染色体座を占有する遺伝子の２つ以上の代替的な形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異を介して自然に生じ、また、個体群中の多型性によりもたらされ得る。遺伝子突然変異は、サイレント（コードされるポリペプチドにおける変化無し）であることが可能であり、または、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがコードされ得る。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされたポリペプチドである。
単離されたポリヌクレオチド：「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、人工的に修飾されたポリヌクレオチドを意味する。一態様において、単離されたポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動による測定で、少なくとも１％の純度、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度、少なくとも９０％の純度および少なくとも９５％の純度である。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成由来、または、これらのいずれかの組み合わせであり得る。
実質的に純粋なポリヌクレオチド：「実質的に純粋なポリヌクレオチド」という用語は、他の外来性または不要なヌクレオチドを含まず、および、遺伝的に操作されたポリペプチド産生系における使用に好適な形態のポリヌクレオチド調製物を意味する。それ故、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、元々または組換え的に関連している他のポリヌクレオチド材料を最大で１０重量％、最大で８重量％、最大で６重量％、最大で５重量％、最大で４重量％、最大で３重量％、最大で２重量％、最大で１重量％および最大で０．５重量％含有する。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、プロモータおよびターミネータなどの天然の５’−および３’−非翻訳領域を含み得る。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、重量基準で、少なくとも９０％の純度、例えば、少なくとも９２％の純度、少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％の純度および少なくとも９９．５％の純度であることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、実質的に純粋な形態であることが好ましい。
コード配列：「コード配列」という用語は、そのポリペプチド生成物のアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームにより判定され、これは、通常は、ＡＴＧ開始コドン、または、ＧＴＧおよびＴＴＧなどの代わりの開始コドンで開始され、ＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成または組換えポリヌクレオチドであり得る。
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、真核細胞から得られる成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ分子からの逆転写により調製されることが可能であるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。初期の一次ＲＮＡ転写物は、成熟型のスプライシングされたｍＲＮＡとして出現する前にスプライシングを含む一連のステップを介して処理されるｍＲＮＡの前駆体である。
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、一重螺旋または二重螺旋を有する核酸分子を意味し、これは、天然の遺伝子から単離されるか、もしくは、そうでなければ自然に存在しないであろう様式で核酸のセグメントを含有するよう修飾されるか、または、合成される。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に要求される制御配列を含有する場合、用語「発現カセット」と同義である。
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に必要なすべての成分を意味する。各制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドに対して在来もしくは外来のものであっても、または、相互に在来もしくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、制御配列、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドのコード領域に対する制御配列の連結を促進させる特定の制限部位を導入する目的のためにリンカーを備えていてもよい。
作動可能にリンク：「作動可能にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列を発現させるよう、ポリヌクレオチドのコード配列と相対的に適切な位置に制御配列が位置する構造を意味する。
発現：「発現」という用語は、特にこれらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌物を含む変異体の生成に関与するいずれかのステップを含む。
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、また、その発現をもたらす追加のヌクレオチドに作動可能にリンクされている直鎖または環状ＤＮＡ分子を含む。
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入等に対する感受性を有するいずれかの細胞タイプを意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異による親細胞とは等しくない親細胞の子孫のいずれかを包含する。
デンプン除去プロセス：「デンプン除去プロセス」という表現は、ランドリーなどの例えば生地クリーニングといったデンプンが生地から除去される洗浄プロセスにおけるものなどの、デンプンが除去（または転化）されるいずれかの種類のプロセスに関する。デンプン除去プロセスはまた、皿洗浄などの硬質面クリーニングであることが可能であり、または、産業上もしくは組織的なクリーニングなどの一般的なクリーニングプロセスであることが可能である。この表現はまた、一般的に、他のデンプン除去プロセスまたはデンプン転化、エタノール製造、デンプン液化、生地糊抜き、紙およびパルプ製造、ビール製造、ならびに、洗剤を含む。
向上した特性：「向上した特性」という用語は、親と比して向上した変異体に関連する特徴を意味する。このような向上した特性としては、これらに限定されないが、熱活性、耐熱性、ｐＨ活性、ｐＨ安定性、基質／補助因子特異性、向上した表面特性、生成物特異性、前処理されたバイオマスの存在下での高い安定性または溶解度、保管条件下での向上した安定性および化学安定性が挙げられる。
洗浄性能：本文脈において、「洗浄性能」という用語は、例えばランドリー、または、皿洗浄などの硬質面クリーニングの最中にクリーニングされるべき対象物に存在するデンプンまたはデンプンを含有する汚れを除去する酵素の能力として用いられる。洗浄性能は、ＡＭＳＡの記載において、または、以下の方法の項におけるビーカ洗浄性能テストにおいて定義されるいわゆる強度値（Ｉｎｔ）を算出することにより定量化され得る。
向上した洗浄性能：「向上した洗浄性能」という用語は、例えば汚れ除去の向上により、親アミラーゼの洗浄性能と相対的な、または、前記変異体と同等のアミノ酸配列を有するが１つまたは複数の特定の位置に欠失を有さないα−アミラーゼと相対的な、または、配列番号４に示されているアミノ酸配列を有するα−アミラーゼの活性と相対的なアミラーゼ変異体の洗浄性能の改変を示す変異体酵素として本明細書において定義される。「洗浄性能」という用語は、一般的なクリーニング（例えば皿洗浄における硬質面クリーニング）を含むが、ランドリーなどの生地における洗浄性能、および、産業上もしくは組織的なクリーニングをも含む。
低温：「低温」は、５〜３５℃、好ましくは５〜３０℃、より好ましくは５〜２５℃、より好ましくは５〜２０℃、最も好ましくは５〜１５℃および特に５〜１０℃の温度である。好ましい実施形態において、「低温」は、１０〜３５℃、好ましくは１０〜３０℃、より好ましくは１０〜２５℃、最も好ましくは１０〜２０℃および特に１０〜１５℃の温度である。
従来の変異体の決定
本発明の目的のために、配列番号１において開示されている成熟型ポリペプチドが、他のα−アミラーゼにおける対応するアミノ酸残基を判定するために用いられる。他のα−アミラーゼのアミノ酸配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６において開示されている成熟型ポリペプチドとアラインされ、このアラインメントに基づいて、配列番号２に開示されている成熟型ポリペプチドにおけるいずれかのアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号が、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）において実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて、判定される。
他のα−アミラーゼにおける対応するアミノ酸残基の同定は、「ＣｌｕｓｔａｌＷ」（Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：２９４７−２９４８）を用いて複数のポリペプチド配列のアラインメントによって確認可能である。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６の成熟型ポリペプチドから他の酵素が分化して、従来からの配列に基づく比較による関係の検出ができない場合（Ｌｉｎｄａｈｌ ａｎｄ Ｅｌｏｆｓｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３−６１５）、他の対配列比較アルゴリズムを用いることが可能である。配列に基づくサーチにおける感度は、データベースのサーチにポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率表現を利用するサーチプログラムを用いることで高めることが可能である。例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベースサーチプロセスを介してプロファイルを生成し、離れた相同体を検出することが可能である（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。ポリペプチドに係るファミリーまたはスーパーファミリーがタンパク質構造データベースにおいて１つまたは複数の表現を有する場合には、感度をさらに高めることが可能である。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７９７−８１５；ＭｃＧｕｆｆｉｎ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９：８７４−８８１）などのプログラムは、問い合わせ配列に係るフォールド構造を予想するニューラルネットワークに対する入力として、多様なソース（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造アラインメントプロファイルおよび溶媒和ポテンシャル）からの情報を利用する。同様に、Ｇｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９０３−９１９による方法が、未知の構造の配列とＳＣＯＰデータベースに存在するスーパーファミリーモデルとのアラインに用いられることが可能である。次いで、これらのアラインメントを用いてポリペプチドに係る相同性モデルを生成することが可能であり、このようなモデルは、その目的のために開発された多様なツールを用いて正確に評価可能である。
公知の構造のタンパク質に関して、数々のツールおよびリソースが、構造アラインメントの検索および生成のために使用可能である。例えばタンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーが構造的にアラインされており、これらのアラインメントはアクセスおよびダウンロードが可能である。２つ以上のタンパク質構造は距離アラインメントマトリックス（Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３３：８８−９６）または組み合わせ拡張法（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：７３９−７４７）などの多様なアルゴリズムを用いてアラインすることが可能であり、これらのアルゴリズムを、可能性のある構造相同体を発見するために、対象の構造と共に問い合わせ構造データベースに対して追加的に実行することが可能である（例えば、Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｐａｒｋ，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：５６６−５６７）。
本発明のα−アミラーゼ変異体の記載において、以下の命名法が参照を容易とするために採用される。公認されているＩＵＰＡＣの１文字または３文字のアミノ酸略記が利用されている。
置換．アミノ酸置換に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、位置２２６でのスレオニンのアラニンでの置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」または「Ｔ２２６Ａ」と示される。複数の突然変異は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」または「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」とされ、それぞれ、グリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）による、および、セリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）による位置２０５および４１１での置換が表されている。
欠失．アミノ酸欠失に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置*。従って、位置１９５でのグリシンの欠失は「Ｇｌｙ１９５*」または「Ｇ１９５*」と示される。複数の欠失は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ｇｌｙ１９５*＋Ｓｅｒ４１１*」または「Ｇ１９５*＋Ｓ４１１*」とされる。
挿入．アミノ酸挿入に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、位置１９５でのグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」または「Ｇ１９５ＧＫ」と示される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸１番、挿入されたアミノ酸２番；等］と示される。例えば、位置１９５でのグリシンの後へのリシンおよびアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」または「Ｇ１９５ＧＫＡ」と示される。
このような事例において、挿入されたアミノ酸残基には、挿入されたアミノ酸残基の前のアミノ酸残基に下付文字を付与することにより番号が付される。それ故、上記の例において配列は以下のとおりとなる。
Figure 0006204352
複数の改変．複数の改変を含む変異体は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」または「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、それぞれ、アルギニンおよびグリシンに対する位置１７０および１９５でのチロシンおよびグルタミン酸の置換を表す。
異なる置換．１つの位置で異なる置換を導入可能である場合、異なる置換はコンマによって分けられ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、アルギニンのチロシンまたはグルタミン酸による位置１７０での置換を表す。それ故、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は以下の変異体を示す。
「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、および「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。
親α−アミラーゼ
親α−アミラーゼはまた、配列番号１の成熟型ポリペプチドＳＰ７２２に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドでもあり得る。
一態様において、この親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号１の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号１の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号１の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成されることが好ましい。
他の実施形態において、親は配列番号１の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号２の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号２の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号２の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号２の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号２の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号３の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号３の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号３の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号３の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号３の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号４の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号４の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号４の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号４の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号５の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号５の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号５の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号５の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号５の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号６の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号６の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号６の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号６の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号６の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号７の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号７の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号７の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号７の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号７の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号８の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号８の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号８の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号８の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号８の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号９の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号９の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号９の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号９の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号９の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号１０の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号１０の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号１０の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号１０の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号１０の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号１１の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号１１の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号１１の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号１１の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号１１の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号１２の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号１２の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号１２の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号１２の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号１２の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２のアミノ酸配列またはその断片は、技術分野において周知である方法に従って、異なる属もしくは種の系統から親をコードするＤＮＡを同定およびクローン化するために核酸プローブの設計に用いられ得る。特に、このようなプローブは、含まれる対応する遺伝子を同定および単離するために、標準的なサザンブロッティング法の後に、対象の属もしくは種のゲノムもしくはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに用いられることが可能である。このようなプローブは配列全体よりもかなり短いことが可能であるが、例えば、長さが少なくとも２５、少なくとも３５または少なくとも７０ヌクレオチドといった少なくとも１４ヌクレオチドであるべきである。好ましくは、核酸プローブは、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチドまたは少なくとも９００ヌクレオチドの長さといった、少なくとも１００ヌクレオチドの長さである。ＤＮＡおよびＲＮＡプローブの両方が用いられることが可能である。プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために標識化される（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチンまたはアビジンで）。このようなプローブは本発明によって包含される。
このような他の生体から調製したゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリは、上記のプローブとハイブリダイズし、親をコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。このような他の生体由来のゲノムまたは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または、他の分離技術によって分離され得る。これらのライブラリからのＤＮＡまたは分離されたＤＮＡが、ニトロセルロースもしくは他の好適なキャリア材料に移され固定化され得、これがサザンブロッティングにおいて用いられる。
本発明の目的に関して、ハイブリダイゼーションとは、低度〜きわめて高度の緊縮条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２またはそのサブ配列をコードするポリヌクレオチドに対応する標識化ヌクレオチドプローブにポリヌクレオチドがハイブリダイズすることを表す。プローブがハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルムまたは技術分野において公知であるいずれかの他の検出手段を用いて検出可能である。
一態様において、核酸プローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２またはその断片のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長鎖プローブに関して、きわめて低度〜きわめて高度の緊縮条件は、最適には１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃での、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および変性済みのサケ***ＤＮＡ、ならびに、きわめて低度および低度の緊縮性に対しては２５％ホルムアミド、中度および中度−高度の緊縮性に対しては３５％ホルムアミド、または、高度およびきわめて高度の緊縮性に対しては５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。キャリア材料は、最終的には、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、４５℃（きわめて低度の緊縮性）、５０℃（低度の緊縮性）、５５℃（中度の緊縮性）、６０℃（中度−高度の緊縮性）、６５℃（高度の緊縮性）または７０℃（きわめて高度の緊縮性）で、１５分間、３回洗浄される。
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短い短鎖プローブに関して、緊縮条件は、最適には１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、Ｂｏｌｔｏｎ ａｎｄ ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：１３９０）に従う計算を用いて算出したＴmよりも約５℃〜約１０℃低い温度で、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．６、６ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１×デンハート溶液、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭナトリウム一塩基性リン酸、０．１ｍＭ ＡＴＰおよび０．２ｍｇのイースト菌ＲＮＡ／ｍｌでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。キャリア材料は、最終的には、６Ｘ ＳＣＣ中で１度、また、０．１％ＳＤＳ中で１５分間、および、算出したＴmより５℃〜１０℃低い温度で６×ＳＳＣを用いて１５分間ずつ２回洗浄される。
親は、いずれかの属の微生物から得られ得る。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされた親がソースによって、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された細胞によって生成されることを意味することとする。一態様において、親は、細胞外に分泌される。
親は細菌性α−アミラーゼであり得る。例えば、親は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、もしくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）α−アミラーゼなどのグラム陽性細菌性ポリペプチド、または、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）またはウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）α−アミラーゼなどのグラム陰性細菌性ポリペプチドであり得る。
一態様において、親は、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）α−アミラーゼである。
他の態様において、親は、ストレプトコッカスエクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）またはストレプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）α−アミラーゼである。
他の態様において、親は、ストレプトマイセスアウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセスアベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）またはストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）α−アミラーゼである。
親は、真菌性α−アミラーゼであり得る。例えば、親は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）α−アミラーゼなどのイースト菌α−アミラーゼであり得る。例えば、親は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボトリオスペリア属（Ｂｏｔｒｙｏｓｐａｅｒｉａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、ケトミジウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス属（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コクリオボルス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、コプリノプシス属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）、コプトテルメス属（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、コリナスクス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリホネクトリア属（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ジプロディア属（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エクシディア属（Ｅｘｉｄｉａ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ギベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ホロマスチゴトイデス属（Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、イルペクス属（Ｉｒｐｅｘ）、レンチヌラ属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、レプトスパエリア属（Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、メラノカルプス属（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、メリピルス属（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ポイトラシア属（Ｐｏｉｔｒａｓｉａ）、シュードプレクタニア属（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ）、シュードトリコニムファ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、シタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコファエア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ）、ベルチシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ボルバリエラ属（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）またはキシラリア属（Ｘｙｌａｒｉａ）α−アミラーゼなどの糸状真菌性α−アミラーゼであり得る。
他の態様において、親は、サッカロマイセスカルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセスジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセスドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセスクルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセスノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）またはサッカロマイセスオビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼである。
他の態様において、親は、アクレモニウムセルロリチクス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルスアクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウムイノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウムケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウムルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウムメルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウムパンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウムクイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウムトロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウムゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、フザリウムバクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウムクロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウムクルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウムヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムレチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウムサムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムスポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムスルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウムトルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウムトリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラグリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、イルペクスラクテウス（Ｉｒｐｅｘ ｌａｃｔｅｕｓ）、ムコールミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウムフニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウムプルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、チエラビアアクロマチカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）、チエラビアアルボミセス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、チエラビアアルボピロサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｌｂｏｐｉｌｏｓａ）、チエラビアアウストラレインシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｕｓｔｒａｌｅｉｎｓｉｓ）、チエラビアフィメティ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｆｉｍｅｔｉ）、チエラビアミクロスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラビアオビスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｏｖｉｓｐｏｒａ）、チエラビアペルビアナ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｐｅｒｕｖｉａｎａ）、チエラビアセトサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｅｔｏｓａ）、チエラビアスペデドニウム（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｐｅｄｅｄｏｎｉｕｍ）、チエラビアスブテルモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｕｂｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビアテルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）α−アミラーゼである。
他の態様において、親は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６のα−アミラーゼといったバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）α−アミラーゼである。
前述の種について、本発明は、知られている種の名称に関わらず、完全および不完全世代、ならびに、例えば無性世代といった他の分類学上の均等物の両方を含むことが理解されるであろう。当業者は、適切な均等物の同一性を容易に認識するであろう。
これらの種の系統は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ：Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、および、農業研究局特許培養物コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、北方リサーチセンター（ＮＲＲＬ：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）などの多数の微生物保存機関において公共に容易に利用可能である。
親は、上記のプローブを用いて、自然（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から単離された微生物、または、天然材料（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から直接的に得られたＤＮＡサンプルを含む他のソースから同定および得られ得る。微生物およびＤＮＡを自然環境から直接的に単離する技術は技術分野において周知である。次いで、親をコードするポリヌクレオチドは、他の微生物または混合ＤＮＡサンプルのゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリを同じようにスクリーニングすることによりもたらされ得る。一旦、親をコードするポリヌクレオチドがプローブで検出されたら、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の技術（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照のこと）を利用することにより単離またはクローン化され得る。
親は、一のポリペプチドの一部分が、他のポリペプチドの一部分のＮ−末端またはＣ−末端で融合したハイブリッドポリペプチドであり得る。
親はまた、１個のポリペプチドが他のポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端で融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、技術分野において公知であると共に、フレーム中に収まり、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータおよびターミネータによる制御下にあるよう、ポリペプチドをコードするコード配列を連結するステップを含む。融合タンパク質はまた、翻訳後に融合が形成されるインテインテクノロジーを用いて構築されてもよい（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６−７７９）。
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチドの間に切断部位をさらに含んでいることが可能である。融合タンパク質が分泌される際に、この部位が切断されて２つのポリペプチドが遊離される。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：４９８−５０３；および、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：２４０−２４８；および、Ｓｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ ４：３５−４８に開示されている部位が挙げられる。
変異体の調製
本発明はまた：（ａ）親α−アミラーゼに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の成熟型ポリペプチドの位置１４０、１８１、１８９、１３４、１９５、２０６、２４３、２６０、２６２、２８４、３０４、３４７、４３９、４６９、４７６および４７７に対応する２つ以上（いくつか）の位置で改変を導入するステップであって、ここで、数は配列番号１に従い、および、変異体がα−アミラーゼ活性を有するステップ；ならびに、（ｂ）変異体を回収するステップを含む、α−アミラーゼ活性を有する変異体を入手する方法に関する。
一態様において、本発明は：（ａ）親α−アミラーゼに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の成熟型ポリペプチドのＷ１４０、Ｒ１８１、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｎ１９５、Ｖ２０６、Ｙ２４３、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｇ３０４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７に対応する２つ以上（いくつか）の位置で改変を導入するステップであって、ここで、数は、配列番号１に従い、および、変異体はα−アミラーゼ活性を有するステップ；ならびに、（ｂ）変異体を回収するステップを含む、α−アミラーゼ活性を有する変異体を入手する方法に関する。
一実施形態において、導入される改変は置換である。
さらに他の実施形態において、本発明は：（ａ）親α−アミラーゼに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の成熟型ポリペプチドのＧ３０４ＲＫＥＱ、Ｗ１４０ＹＦ、Ｗ１８９ＥＧＴ、Ｄ１３４Ｅ、Ｅ２６０ＡＤＣＱＬＭＦＰＳＷＶＧＨＩＫＮＲＴＹ、Ｆ２６２ＧＰ、Ｗ２８４ＤＨＦＹＲ、Ｗ３４７ＨＦＹ、Ｗ４３９ＲＧ、Ｇ４７６ＥＱＲＫ、Ｇ４７７ＥＱＫＭＲに対応する２つ以上（いくつか）の位置で置換を導入するステップであって、ここで、番号は、配列番号１に従い、および、変異体はα−アミラーゼ活性を有するステップ；ならびに、（ｂ）変異体を回収するステップを含む、α−アミラーゼ活性を有する変異体を入手する方法に関する。
好ましい実施形態において、導入された置換は、Ｇ３０４Ｒ、Ｗ１４０ＹＦ、Ｗ１８９ＥＧＴ、Ｄ１３４Ｅ、Ｅ２６０ＧＨＩＫＮＲＴＹ、Ｗ２８４ＤＦＲ、Ｗ４３９ＲＧ、Ｇ４７６ＥＫ、Ｇ４７７ＥＫＭＲの２つ以上である。さらに好ましい実施形態において、導入された置換は、Ｇ３０４Ｒ、Ｗ１４０ＹＦ、Ｅ２６０ＧＨＩＫＮＰＲＴＹおよびＧ４７６ＥＱＲＫである。さらに好ましい実施形態において、α−アミラーゼ活性を有する変異体を入手する方法は：（ａ）親α−アミラーゼに、Ｇ３０４Ｒ、Ｗ１４０Ｙ、Ｅ２６０ＧおよびＧ４７６Ｋの置換を配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２のいずれかにおいて導入するステップであって、ここで、番号は配列番号１に従い、および、変異体はα−アミラーゼ活性を有するステップ；ならびに、（ｂ）変異体を回収するステップを含む。変異体は、部位特異的突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、無作為突然変異誘発、シャッフリング等などの技術分野において公知であるいずれかの突然変異誘発法を用いて調製可能である。
部位特異的突然変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチドにおける１つまたは複数の規定の部位で１つまたは複数（いくつか）の突然変異を形成する技術である。
部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーが使用されるＰＣＲによってインビトロで達成されることが可能である。部位特異的突然変異誘発はまた、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドにおける部位が制限酵素により切断され、および、その後、ポリヌクレオチドに突然変異を含有するオリゴヌクレオチドが連結されるカセット式突然変異誘発によってインビトロで行われることが可能である。通常、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドで消化する制限酵素は同一であり、プラスミドの付着末端と挿入断片とを互いに連結させる。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４９４９−４９５５；および、Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７３４９−４９６６を参照のこと。
部位特異的突然変異誘発はまた、技術分野において公知である方法によってインビボで達成可能である。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Ｓｔｏｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３−７７６；Ｋｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５−２９０；および、Ｃａｌｉｓｓａｎｏ ａｎｄ Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５−１６を参照のこと。
いずれかの部位特異的突然変異誘発法が本発明において用いられることが可能である。変異体の調製に用いられることが可能である多くの市販のキットが入手可能である。
合成遺伝子構築には、対象のポリペプチドをコードするための設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成が伴う。遺伝子合成は、Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１０５０−１０５４）により記載されている多重マイクロチップ系テクノロジー、ならびに、オリゴヌクレオチドが合成されると共に光による制御が可能なマイクロ流体チップにアセンブルされる同様のテクノロジーなどの多数の技術を利用して行うことが可能である。
単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または、国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）が挙げられる。
突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築および／または部位特異的突然変異誘発および／またはランダム突然変異誘発および／またはシャッフリングの態様を組み合わせることにより達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わされる、合成されたポリヌクレオチド断片を利用するプロセスに代表される。それ故、遺伝子の定義された領域が新たに合成され得、一方で、他の領域が部位特異的突然変異誘発性プライマーを用いて増幅され得、一方で、さらに他の領域がエラープローンＰＣＲまたは非エラープローンＰＣＲ増幅に供され得る。次いで、ポリヌクレオチドサブ配列がシャッフルされ得る。
変異体
本発明はまた、配列番号１の成熟型ポリペプチドの位置Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７に対応する２つ以上（いくつか）の位置に改変を含む親α−アミラーゼの変異体を提供し、ここで、各改変は、独立して、置換、挿入または欠失（好ましくは置換）であり、および、変異体はα−アミラーゼ活性を有する。これにより、親α−アミラーゼと比して、または、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のα−アミラーゼと比して、低温で向上した洗浄性能を有する変異体が提供される。
実施形態において、変異体は、親α−アミラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
他の実施形態において、本発明は、配列番号１の成熟型ポリペプチドの位置Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７に対応する２つ以上（いくつか）の位置に改変を含むα−アミラーゼの単離された変異体に関し、ここで、各改変は、独立して、置換、欠失または挿入であり、および、変異体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれかの成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％であるが１００％未満の配列同一性を有し、および、変異体はα−アミラーゼ活性を有する。
他の実施形態において、変異体は、配列番号１の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％および少なくとも９９％などの少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるが１００％未満の配列同一性を有する。
他の実施形態において、変異体は、配列番号２の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％などの少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
他の実施形態において、変異体は、配列番号３の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％などの少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
他の実施形態において、変異体は、配列番号４の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％などの少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
他の実施形態において、変異体は、配列番号５の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％などの少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
他の実施形態において、変異体は、配列番号６の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％などの少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
他の実施形態において、変異体は、配列番号７の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％などの少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
他の実施形態において、変異体は、配列番号８の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％などの少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
他の実施形態において、変異体は、配列番号９の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％などの少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
他の実施形態において、変異体は、配列番号１０の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％などの少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
他の実施形態において、変異体は、配列番号１１の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％などの少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
他の実施形態において、変異体は、配列番号１２の成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％などの少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
一態様において、本発明の変異体における改変の数は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の改変などの例えば２〜１０および２〜５といった２〜２０である。
一態様において、変異体は、位置Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７に対応する２つ以上（いくつか）の位置に改変を含む。他の態様において、変異体は、位置Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７のいずれかに対応する２つの位置に改変を含む。他の態様において、変異体は、位置Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７のいずれかに対応する３つの位置に改変を含む。他の態様において、変異体は、位置Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７のいずれかに対応する４つの位置に改変を含む。他の態様において、変異体は、位置Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７のいずれかに対応する５つの位置に改変を含む。他の態様において、変異体は、位置Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７のいずれかに対応する６つの位置に改変を含む。他の態様において、変異体は、位置Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７に対応する各位置に改変を含む。位置は、配列番号１の位置に対応する。改変は置換であることが好ましい。
一実施形態において、変異体は、Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７からなる群から選択される２、３または４つの位置に置換を含む。
好ましい実施形態において、変異体は、Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｅ２６０およびＧ４７６からなる群から選択される２、３または４つの位置に置換を含む。
本発明の一態様において、変異体は、Ｇ３０４ＲＫＥＱ、Ｗ１４０ＹＦ、Ｗ１８９ＥＧＴ、Ｄ１３４Ｅ、Ｅ２６０ＡＤＣＱＬＭＦＰＳＷＶＧＨＩＫＮＲＴＹ、Ｆ２６２ＧＰ、Ｗ２８４ＤＨＦＹＲ、Ｗ３４７ＨＦＹ、Ｗ４３９ＲＧ、Ｇ４７６ＥＱＲＫ、Ｇ４７７ＥＱＫＭＲからなる群から選択される２つ以上（いくつか）の置換を含む。
本発明の変異体は、Ｇ３０４Ｒ、Ｗ１４０ＹＦ、Ｅ２６０ＧＨＩＫＮＰＲＴＹおよびＧ４７６ＥＱＲＫからなる群から選択される２、３または４つの位置に置換を含むことが好ましい。さらに好ましい実施形態において、２、３または４つの位置における置換は、Ｇ３０４Ｒ、Ｗ１４０Ｙ、Ｅ２６０ＧおよびＧ４７６Ｋからなる群から選択される。
一実施形態において、変異体は、Ｔ５１ＩＬ、Ｓ５２Ｑ、Ｎ５４Ｋ、Ｇ１０９Ａ、Ｅ１９４Ｄ、Ｎ１９５Ｆ、Ｖ２０６Ｙ、Ｙ２４３Ｆ、Ｇ１０９Ａ、Ｇ２７３ＤＶ、Ｇ３３７Ｎ、Ｋ７２Ｒ、Ｒ１８１Ｈ、Ｓ３０３ＧおよびＹ１００Ｉからなる群から選択される１つまたは複数の置換をさらに含む。好ましい実施形態において、１つまたは複数のさらなる置換は、Ｎ１９５Ｆ、Ｖ２０６Ｙ、Ｙ２４３Ｆからなる群から選択される。好ましくは、変異体は、これらの置換の２つまたは３つを含む。これにより、親α−アミラーゼと比して、または、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のα−アミラーゼと比して、低温で向上した洗浄性能、ならびに、Ｃａ2+欠乏に対する向上した安定性を有する変異体が提供される。
本発明の他の態様において、変異体は、Ｄ１３４Ｅ、Ｅ２６０Ｇ、Ｅ２６０Ｈ、Ｅ２６０Ｉ、Ｅ２６０Ｋ、Ｅ２６０Ｎ、Ｅ２６０Ｒ、Ｅ２６０Ｔ、Ｇ１０９Ａ、Ｇ２７３Ｄ、Ｇ２７３Ｖ、Ｇ３３７Ｎ、Ｇ４７６Ｅ、Ｇ４７７Ｅ、Ｇ４７７Ｍ、Ｇ４７７Ｒ、Ｋ７２Ｒ、Ｒ１８１Ｈ、Ｓ３０３Ｇ、Ｗ１４０Ｆ、Ｗ１４０Ｙ、Ｗ１８９Ｅ、Ｗ１８９Ｇ、Ｗ１８９Ｔ、Ｗ２８４ＤおよびＹ１００Ｉからなる群から選択される、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の成熟型ポリペプチドの２つ以上（いくつか）の置換を含む。
変異体は、１つまたは複数（いくつか）の他の位置に改変をさらに含んでいてもよい。例えば、変異体は、位置Ｇ１８２*＋Ｄ１８３*またはＤ１８３*＋Ｇ１８４*に対応する位置に改変を含んでいてもよい。
他の態様において、本発明は：
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７７Ｅ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｔ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｋ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｄ１３４Ｅ＋Ｇ４７６Ｅ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｇ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｓ３０３Ｇ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｙ１００Ｉ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３３７Ｎ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｅ１９４Ｄ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
Ｔ５１Ｉ＋Ｙ１００Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
Ｔ５１Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
Ｔ５１Ｉ＋Ｓ５２Ｑ＋Ｎ５４Ｋ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｇ４７６Ｋ
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｇ４７７Ｋ
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｇ４７７Ｒ、および
Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ
からなる群から選択される配列番号１のポリペプチドの位置に対応する位置に置換を含む変異体に関する。
他の態様において、本発明は：
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７７Ｅ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｔ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｋ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｄ１３４Ｅ＋Ｇ４７６Ｅ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｇ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｓ３０３Ｇ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｙ１００Ｉ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３３７Ｎ、
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｅ１９４Ｄ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
Ｔ５１Ｉ＋Ｙ１００Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
Ｔ５１Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
Ｔ５１Ｉ＋Ｓ５２Ｑ＋Ｎ５４Ｋ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｇ４７６Ｋ
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｇ４７７Ｋ
Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｇ４７７Ｒ、および
Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ
からなる群から選択される配列番号１のポリペプチドの位置に対応する位置における置換から構成される変異体に関する。
さらに他の態様において、本発明は：
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７７Ｅ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｔ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｋ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｄ１３４Ｅ＋Ｇ４７６Ｅ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｇ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｓ３０３Ｇ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｙ１００Ｉ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３３７Ｎ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｅ１９４Ｄ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｔ５１Ｉ＋Ｙ１００Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｔ５１Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｔ５１Ｉ＋Ｓ５２Ｑ＋Ｎ５４Ｋ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｇ４７６Ｋ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｇ４７７Ｋ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｇ４７７Ｒ、および
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ
からなる群から選択される配列番号１のポリペプチドの位置に対応する位置に改変を含む変異体に関する。
他の態様において、本発明は：
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７７Ｅ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｔ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｋ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｄ１３４Ｅ＋Ｇ４７６Ｅ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｇ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｓ３０３Ｇ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｙ１００Ｉ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３３７Ｎ、
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｅ１９４Ｄ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｔ５１Ｉ＋Ｙ１００Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｔ５１Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｔ５１Ｉ＋Ｓ５２Ｑ＋Ｎ５４Ｋ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｇ４７６Ｋ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｇ４７７Ｋ
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｇ４７７Ｒ、および
Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ
からなる群から選択される配列番号１のポリペプチドの位置に対応する位置における改変から構成される変異体に関する。
親における必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）などの技術分野において公知である手法に従って同定することが可能である。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子中のすべての残基に導入され、得られたミュータント分子が、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するためにα−アミラーゼ活性についてテストされる。また、Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８を参照のこと。α−アミラーゼの活性部位または他の生物学的相互作用は、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異が併用される、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折または光親和性標識などの技術によって判定される、構造の物理的分析によって判定されることも可能である。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。必須アミノ酸のアイデンティティは、親に関連するポリペプチドによるよるアイデンティティの分析から推測されることも可能である。
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の変異体のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドに関連する。
核酸構築物
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる１つまたは複数（いくつか）の制御配列に作動可能にリンクした本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
ポリヌクレオチドは、多様な方法で処置されて変異体の発現がもたらされ得る。ベクターへ挿入される前のポリヌクレオチドの処置が、発現ベクターに応じて、望ましいか、または、必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は技術分野において周知である。
制御配列は、ポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるプロモータ配列であり得る。プロモータ配列は、変異体の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
細菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）および原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）、ならびに、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）から得られるプロモータである。さらなるプロモータが、「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：７４−９４；および、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９に記載されている。
糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性タンパク分解酵素、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ Ｄａｒｉａ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ Ｑｕｉｎｎ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、ならびに、ＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（非翻訳リーダーがアスペルギリ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）におけるトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギリ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）における中性α−アミラーゼをコードする遺伝子を含む修飾プロモータ；非限定的な例としては、非翻訳リーダーがアスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）におけるトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）における中性α−アミラーゼをコードする遺伝子を含む修飾プロモータが挙げられる）の遺伝子から得られたプロモータ；ならびに、そのミュータント、切断およびハイブリッドプロモータである。
イースト菌宿主において、有用なプロモータは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。イースト菌宿主細胞に対する他の有用なプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８により記載されている。
制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる好適な転写ターミネータ配列であり得る。ターミネータ配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。
糸状真菌宿主細胞の好ましいターミネータは、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびフザリウムオキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素の遺伝子から得られる。
イースト菌宿主細胞の好ましいターミネータは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）チトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られる。イースト菌宿主細胞の他の有用なターミネータが、前述のＲｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２に記載されている。
制御配列はまた、宿主細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である好適なリーダー配列であり得る。リーダー配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの５’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのリーダー配列が用いられ得る。
糸状真菌宿主細胞の好ましいリーダーは、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
イースト菌宿主細胞の好適なリーダーは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
制御配列はまた、変異体をコードする配列の３’−末端に作動可能にリンクする配列であるポリアデニル化配列であり得、転写された場合に、ポリアデノシン残基を転写されたｍＲＮＡに付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される。宿主細胞において機能するいずれかのポリアデニル化配列が用いられ得る。
糸状真菌宿主細胞の好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびフザリウムオキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素の遺伝子から得られる。
イースト菌宿主細胞の有用なポリアデニル化配列が、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０に記載されている。
制御配列はまた、変異体のＮ−末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、および、変異体を細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’−末端は、変異体をコードするコード領域のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード領域を本質的に含有し得る。または、コード配列の５’−末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード領域を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード領域を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード領域が必要とされる場合がある。または、外来性のシグナルペプチドコード領域は単に、変異体の分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード領域を置き換えてもよい。しかしながら、発現変異体を宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード領域がもちいられてもよい。
細菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ１１８３７マルトジェニックアミラーゼ、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）サブチリシン、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）β−ラクタマーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドが、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１０９−１３７に記載されている。
糸状真菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼおよびリゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
イースト菌宿主細胞の有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列が、前述のＲｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２により記載されている。
制御配列はまた、変異体のＮ−末端でプロペプチド位置をコードするプロペプチドコード領域であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード領域は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性タンパク分解酵素（ａｐｒＥ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性タンパク分解酵素（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子の遺伝子から得られ得る。
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方が変異体のＮ−末端に存在する場合、プロペプチド領域は変異体のＮ−末端に隣接して位置されており、また、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のＮ−末端に隣接して位置されている。
宿主細胞の増殖に対した変異体の発現の調節を可能とする調節配列を付加することが望ましい場合もあり得る。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンオフさせるものである。原核系における調節系としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレータ系が挙げられる。イースト菌においては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が用いられ得る。糸状菌においては、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモータおよびアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモータが用いられ得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能とするものである。真核系において、これらの調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および、重金属を伴って増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの事例において、変異体をコードするポリヌクレオチドは、調節配列と作動可能にリンクしているであろう。
発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位で変異体をコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数（いくつか）の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体といった、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有し得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする１つまたは複数（いくつか）の選択マーカーを含有することが好ましい。選択マーカーは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。
細菌性選択マーカーの例は、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｄａｌ遺伝子、または、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシンまたはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与えるマーカーである。イースト菌宿主細胞の好適なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３である。糸状真菌宿主細胞において使用される選択マーカーとしては、これらに限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびに、これらの均等物が挙げられる。アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子、ならびに、ストレプトマイセスハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子がアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞における使用に好ましい。
ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有することが好ましい。
宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、変異体をコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のヌクレオチド配列を含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングヌクレオチド配列であり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。
自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするヌクレオチド配列を意味する。
細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、ならびに、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０およびｐＡＭβ１の複製起点である。
イースト菌宿主細胞において用いられる複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組み合わせ、および、ＡＲＳ４とＣＥＮ６との組み合わせである。
糸状真菌細胞において有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１（Ｇｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ ９８：６１−６７；Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９１６３−９１７５；国際公開第００／２４８８３号パンフレット）である。ＡＭＡ１遺伝子の単離およびＡＭＡ１遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットに開示されている方法に従って達成可能である。
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、変異体の生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。
実質的に純粋な変異体を得るために、上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照のこと）。
宿主細胞
本発明はまた、本発明の変異体の生成をもたらす１つまたは複数（いくつか）の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、変異体をコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。
宿主細胞は、例えば、原核生物または真核生物といった、変異体の組換え生成において有用ないずれかの細胞であり得る。
原核宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性バクテリアのいずれかであり得る。グラム陽性バクテリアとしては、これらに限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。グラム陰性バクテリアとしては、これらに限定されないが、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられる。
細菌宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含むいずれかのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトコッカスエクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）細胞のいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞を含むいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞であり得る。
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトマイセスアウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセスアベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞を含むいずれかのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞であり得る。
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換により（例えば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照のこと）、コンピテント細胞を用いることにより（例えば、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、またはＤｕｂｎａｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照のこと）、電気穿孔法により（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２−７５１を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照のこと）行われ得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換により（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照のこと）または電気穿孔法により（例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照のこと）行われ得る。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換および電気穿孔法により（例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照のこと）、接合により（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５を参照のこと）、または、形質導入により（例えば、Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６２８９−６２９４を参照のこと）行われ得る。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、電気穿孔法により（例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：３９１−３９７を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ ａｎｄ Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照のこと）行われ得る。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、天然コンピテンスにより（例えば、Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照のこと）、プロトプラスト形質転換により（例えば、Ｃａｔｔ ａｎｄ Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ ６８：１８９−２０７０を参照のこと）、電気穿孔法により（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６を参照のこと）行われ得る。しかしながら、ＤＮＡを宿主細胞に導入するための技術分野において公知である方法のいずれかを用いることが可能である。
宿主細胞はまた、哺乳類、昆虫、植物または真菌細胞などの真核生物であり得る。
宿主細胞は、真菌細胞であり得る。本明細書において用いられるところ、「真菌」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）および接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、ならびに、卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）およびすべての栄養胞子形成真菌を含む（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫに定義されているとおり）。
真菌宿主細胞はイースト菌細胞であり得る。本明細書において用いられるところ、「イースト菌」は、子嚢菌酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌イースト菌を含み、イースト菌は、不完全菌類（不完全酵母菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する。イースト菌の分類は将来において変更される可能性があるため、本発明の目的について、イースト菌は、Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｒ．Ｒ．，ｅｄｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．９，１９８０）に記載されているとおりに定義されるものとする。
イースト菌宿主細胞は、クルイベロマイセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセスカルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセスジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセスドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセスクルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセスノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセスオビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）またはヤロウイアリポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞であり得る。
真菌宿主細胞は糸状真菌細胞であり得る。「糸状菌」は、真菌植物門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門（前述のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５で定義されているとおり）のすべてのフィラメント形を含む。糸状菌は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナンおよび他の複雑な多糖類から組成される菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸の伸展によるものであり、および、炭素異化は絶対好気性である。対照的に、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのイースト菌による栄養成長は単細胞葉状体の出芽によるものであり、および、炭素異化は発酵性であり得る。
糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロツス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であり得る。
例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシスアネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシスカレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシスギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシスパンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシスリブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシススブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシススブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウムイノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウムケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウムルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウムメルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウムパンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウムクイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウムトロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウムゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌスシネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、クリオルスヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウムバクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウムクロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウムクルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウムヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムレチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウムサムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムスポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムスルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウムトルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウムトリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコールミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウムプルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビアラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツスエリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビアテルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテスビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテスベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）細胞であり得る。
真菌細胞は、それ自体公知の様式でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および、細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換され得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞の形質転換に好適な手法は、欧州特許第２３８０２３号明細書およびＹｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０−１４７４に記載されている。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の形質転換に好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７−１５６および国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載されている。イースト菌は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，ｐｐ １８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；および、Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２０に記載の手法を用いて形質転換され得る。
生成方法
本発明はまた：（ａ）本発明の宿主細胞を変異体の発現に好適な条件下で培養するステップ；および、（ｂ）変異体を回収するステップを含む変異体を生成する方法に関する。
宿主細胞は、技術分野において公知である方法を用いて変異体の生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中ならびにポリペプチドの発現および／または単離が許容される条件下で行われる、振盪フラスコ培養により、または、実験用もしくは産業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む）により培養され得る。培養は、炭素および窒素源および無機塩を含む好適な栄養培地において、技術分野において公知である手法を用いて行われる。好適な媒体は、商業的な供給者から入手可能であるか、または、公開された組成に従って調製され得る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。変異体が栄養培地に分泌される場合、変異体は培地から直接回収可能である。変異体が分泌されない場合、細胞ライセートから回収可能である。
変異体は、変異体に特異的な技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出方法は、特定の抗体の使用、酵素産生物の形成、または、酵素基質の消失を含み得る。例えば、酵素アッセイを用いて変異体の活性を判定してもよい。
変異体は技術分野において公知である方法により回収され得る。例えば、変異体は、特にこれらに限定されないが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む従来の手法により栄養培地から回収され得る。
変異体は、実質的に純粋な変異体を得るために、特にこれらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。
代替的な態様においては、変異体は回収されず、変異体を発現する本発明の宿主細胞が変異体のソースとして用いられ得る。
組成物
本発明はまた、本発明の変異体を含む組成物に関する。好ましくは、組成物は、このような変異体が富化されている。「富化」という用語は、組成物のα−アミラーゼ活性が、例えば１．１の富化因子で高められることを意味する。
組成物は、主な酵素成分として変異体を含み得る例えば単成分組成物である。または、組成物は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解性酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解性酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼなどの複数の酵素活性を含み得る。追加の酵素が、例えば、アスペルギルスアクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）といったアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）；例えば、フザリウムバクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウムクロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウムクルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウムヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムレチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウムサムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムスルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウムトルロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｅｕｍ）、フザリウムトリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）もしくはフザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）といったフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）；フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、例えば、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）もしくはフミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）；または、例えば、トリコデルマハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）といったトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に属する微生物によって例えば生成され得る。
組成物は、技術分野において公知である方法に従って調製され得、また、液体または乾燥組成物の形態であり得る。例えば、組成物は、粒質物または微粒剤の形態であり得る。変異体は、技術分野において公知である方法に従って安定化され得る。
本発明によれば、上記のα−アミラーゼ変異体は、典型的には、例えばランドリー洗剤組成物または皿洗い洗剤組成物といった洗剤組成物などのクリーニング組成物中の成分であり得る。液体ランドリー洗剤組成物が特に好ましい。
このようなクリーニング組成物は、クリーニング／洗剤補助剤、好ましくは成分の混合物を含む。典型的には、クリーニング補助剤は、０．００１〜９９．９重量％、さらに典型的には０．０１〜８０重量％の量のクリーニング補助剤で組成物中に存在するであろう。
他の好ましい態様において、組成物は、半極性および／またはアニオン性および／またはカチオン性および／または両性イオン性および／または両性および／または半極性ノニオン性および／またはこれらの混合物を含むノニオン性であり得る１種または複数種の界面活性剤を含む。界面活性剤は、典型的には、組成物の０．１％〜６０重量％または０．５〜５０重量％または１〜４０重量％のレベルで存在する。
使用
本発明はまた、α−アミラーゼ変異体の使用方法に関する。
本発明のα−アミラーゼ変異体は、低温で、洗剤組成物、ランドリーの洗濯、皿洗いおよび／またはクリーニングプロセスにおいて有用である。
α−アミラーゼ活性判定用のｐＮＰ−Ｇ７アッセイ
α−アミラーゼ活性は、Ｇ７−ｐＮＰ基質を利用する方法により判定し得る。Ｇ７−ｐＮＰは、α−アミラーゼなどのエンド−アミラーゼにより切断されることが可能であるブロックオリゴ糖（ｂｌｏｃｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）である４，６−エチリデン（Ｇ7）−ｐ−ニトロフェニル（Ｇ1）−α，Ｄ−マルトヘプタオシドに対する略記である。切断の後、キット中のα−グルコシダーゼが加水分解された基質をさらに消化して、黄色の遊離ｐＮＰ分子を遊離させ、これにより、λ＝４０５ｎｍ（４００〜４２０ｎｍ）での可視分光法による計測が可能である。Ｇ７−ｐＮＰ基質およびα−グルコシダーゼを含有するキットは、Ｒｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ（カタログ番号１１８７６４７３）により製造されている。
試薬：
このキットのＧ７−ｐＮＰ基質は、２２ｍＭの４，６−エチリデン−Ｇ７−ｐＮＰおよび５２．４ｍＭ ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）、ｐＨ７．０）を含有する。
α−グルコシダーゼ試薬は、５２．４ｍＭのＨＥＰＥＳ、８７ｍＭのＮａＣｌ、１２．６ｍＭのＭｇＣｌ2、０．０７５ｍＭのＣａＣｌ2、≧４ｋＵ／Ｌのα−グルコシダーゼ）を含有する。
基質処理溶液は、１ｍＬのα−グルコシダーゼ試薬を０．２ｍＬのＧ７−ｐＮＰ基質と混合することにより形成される。この基質処理溶液は、使用直前に形成される。
希釈緩衝剤：５０ｍＭのＭＯＰＳ、０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（Ｃ14Ｈ22Ｏ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）n（ｎ＝９〜１０）））、１ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ８．０。
手法：
分析されるアミラーゼサンプルを希釈緩衝剤中に希釈して、確実に希釈サンプル中のｐＨを７とした。アッセイを、２０μｌの希釈酵素サンプルを９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、８０μｌの基質処理溶液を添加することにより行った。溶液を混合し、室温で１分プレインキュベートし、ＯＤ４０５ｎｍで５分間にわたって２０秒毎に吸収を計測する。
時間依存吸収曲線の傾斜（吸光度／分）は、所与の一連の条件下で、対象のα−アミラーゼの特異活性（活性／ｍｇ酵素）と直接的に比例する。アミラーゼサンプルは、傾斜が０．４吸光度単位／分未満であるレベルまで希釈するべきである。
ランドリー用自動機械式応力アッセイ（ＡＭＳＡ）
ランドリーにおける洗浄性能を評価するために、自動機械式応力アッセイ（ＡＭＳＡ）を用いて洗濯実験を実施する。ＡＭＳＡでは、大量の小容量酵素−洗剤溶液の洗浄性能を試験可能である。ＡＭＳＡプレートは、テスト溶液用の多数のスロットと、洗浄されるランドリーサンプルである生地をすべてのスロット開口部に対してしっかりと押し込む蓋とを有する。洗浄時間の間、プレート、テスト溶液、生地および蓋を激しく振盪してテスト溶液と生地とを接触させ、規則正しい周期的な振動で機械的応力を加える。さらなる説明については、国際公開第０２／４２７４０号パンフレット、特に第２３〜２４頁の段落「Ｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ」を参照のこと。
一般的な洗浄性能の説明
水（１０°ｄＨ）、洗剤（例えば、以下に記載の欧州製の液体洗剤５．１ｇ／Ｌ）および本発明の酵素（例えば０、０．８および／または１．２ｍｇ酵素タンパク質／Ｌの濃度）を含むテスト溶液を調製する。デンプン（例えば、Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製のＣＳ−２８）で汚れた布地を加え、および、２０℃で２０分間洗浄した。水道からの流水で完全にすすぎ、暗中で乾燥させた後、洗浄性能の尺度として、汚れた布地の光強度または反射率値をその後に計測する。０ｍｇ酵素タンパク質／Ｌでのテストをブランクとして用いてΔレミッション値を得た。洗浄ステップの最中には、例えば洗浄溶液を布地と振盪、回転または攪拌する形態で機械的作用が加えられることが好ましい。
ＡＭＳＡ洗浄性能実験を以下に特定した実験条件下で実施した。
Figure 0006204352
アミラーゼ希釈緩衝剤：アミラーゼは、保管中のアミラーゼを安定化させる低濃度のカルシウム（０．１ｍＭ）、ならびに、容器およびピペットに酵素タンパク質が吸着する恐れを低減させる０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）で希釈した。
ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2およびＮａＨＣＯ3（Ｃａ2+：Ｍｇ2+：ＨＣＯ3 -＝３：１：４．５）をテスト系に添加することにより水硬度を１０°ｄＨに調節した。洗浄した後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
洗浄性能は、洗浄した生地の色の輝度として計測される。輝度はまた、白色の光を照射した際のサンプルからの反射光の強度として表されることが可能である。サンプルが汚れている場合、きれいなサンプルのものよりも反射光の強度は低い。従って、反射光の強度を用いて洗浄性能を計測することが可能である。
色の計測は、洗浄した生地のイメージを撮像するために用いられるプロ用の平面スキャナ（Ｋｏｄａｋ ｉＱｓｍａｒｔ，Ｋｏｄａｋ，Ｍｉｄｔａｇｅｒ ２９，ＤＫ−２６０５ Ｂｒｏｎｄｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で行われる。
スキャンしたイメージからの光強度の値を抽出するために、イメージからの２４ビットピクセル値をレッド、グリーンおよびブルー（ＲＧＢ）の値に変換する。強度値（Ｉｎｔ）は、ＲＧＢ値をベクターとして一緒に加算し、次いで、得られるベクターの長さから算出される。
Figure 0006204352
生地：生地サンプルＣＳ−２８（綿上の米デンプン）は、Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手される。
異なる変異体のＡＭＳＡランドリーテストの結果が表３に示されている。結果において、指数は１００である。親α−アミラーゼの性能結果が１００の値とされ、変異体の結果がこの値と比較される。
ＡＭＳＡ洗浄性能
変異体および対応する親α−アミラーゼの洗浄性能を、方法の項において記載のとおり、ＡＭＳＡ−試験法によりテストした。結果は、（変異体の性能からブランクの性能を減じた差）を（親の性能からブランクの性能を減じた差）で除した商に１００を乗じた積としてもたらされ、ここで、ブランクは、同一の条件ではあるが、α−アミラーゼの不在下で洗浄したことにより得られる性能である。最後に、２つの濃度（０．８および１．２Ｍｇ／Ｌ）での相対的な性能の平均を算出した。結果が表３に示されている。
Ｔｅｒｇ−Ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒ（ＴＯＭ）洗浄アッセイ
Ｔｅｒｇｏ−Ｔｏ−ｍｅｔｅｒ（ＴＯＭ）は、１２種の異なる洗浄条件を同時にテストするために適用可能であるミディアムスケールモデル洗浄系である。ＴＯＭは、基本的に、最大で１２個の開口した金属製ビーカが中に浸漬される大型の温調水浴である。各ビーカは１つの小型の縦型洗濯機を構成しており、実験の最中には、これらの各々に、性能がテストされる、特定の洗剤／酵素系の溶液、ならびに、汚染された布地および汚染されていない布地が入れられることとなる。機械的応力は、各ビーカ内の液体を撹拌する、回転する攪拌アームによって達成される。ＴＯＭビーカは蓋を有していないため、ＴＯＭ実験の最中にサンプルを取り出して、洗浄の最中にオンラインの情報についてアッセイすることが可能である。
ＴＯＭモデル洗浄系は主に、ＵＳまたはＬＡ／ＡＰ洗浄条件での洗剤および酵素のミディアムスケールテストにおいて用いられる。ＴＯＭ実験において、バラスト対汚染物比および布地対洗浄液比などの因子は変更することが可能である。従って、ＴＯＭは、ＡＭＳＡおよび小型洗浄などの小規模実験と、縦型洗濯機におけるより長時間が必要とされるフルスケール実験との間のリンクを提供する。
器具：５００または１２００ｍＬの洗剤溶液容量を有する１２個のスチール製ビーカおよびビーカ当たり１本の回転アームでの水浴。５〜８０℃の温度範囲。水浴は、脱イオン水で満たされていなければならない。回転速度は、７０〜１２０ｒｐｍ／分以下で設定可能である。
ＴＯＭ洗浄性能
ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2およびＮＡＨＣＯ3の添加により、以下に記載の強度に水硬度を調節した。洗浄溶液を、以下に記載のとおり、バケツ中に、所望の量の洗剤、温度および水硬度で調製した。洗剤を１０分間の磁気攪拌の最中に溶解させた。（洗浄溶液は、調製後３０〜６０分以内に用いた）。
Ｔｅｒｇ−Ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒ中の水浴中の温度および回転（ｒｐｍ）は、以下の設定に従って設定した。設定に従って温度を調節した場合（許容誤差は＋／−０．５℃）、洗浄溶液は以下に記載した量に従ってＴＯＭビーカに添加した。
ビーカ中での撹拌は１２０ｒｐｍであった。２枚の米デンプン布きれ（ＣＳ−２８）および汚染物バラストをビーカの各々に加え、以下に明記した時間に従って洗浄を行った。布きれを５分間冷たい水道水中ですすいだ。布きれを一晩暗中で乾燥させた。
生地：生地サンプルＣＳ−２８（綿上の米デンプン）は、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手した。
汚染物バラスト：綿／ポリエステル上の汚染物バラスト米デンプン（ＥＭＰＡ１６２）は、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手した。Ｂｉｓｔｒｏグレービー（０６３ＫＣ）、Ｆｒｉｊチョコレートミルクシェーク、Ｈｅｉｎｚ スパゲティー（１１３ＫＣ）、Ｈｅｒｓｅｙｓダブルチョコレートは、Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｑｕｅｓｔ Ｌｔｄ，Ｕｎｉｔ ５５，Ｃｏｎｓｅｔｔ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ，Ｃｏｎｓｅｔｔ，Ｃｏｕｎｔｙ Ｄｕｒｈａｍ，ＤＨ８ ６ＢＮ ＵＫから入手した。
異なる変異体のＴＯＭ洗浄テストの結果が表３に示されている。結果において、指数は１００である。親α−アミラーゼ（配列番号７）の性能結果が１００の値とされ、変異体の結果がこの値と比較される。
Figure 0006204352
Figure 0006204352
洗浄性能を、レミッション値で表した洗浄した生地の色の輝度として計測した。レミッション計測は、Ｍａｃｂｅｔｈ ７０００ Ｃｏｌｏｒ Ｅｙｅ分光測光計を用いて行った。乾燥した布きれの各々を計測した。バックグラウンドからの干渉の恐れがあるため、レミッションの計測中は、４層の布地の上に布きれを置いた。レミッションは４６０ｎｍで計測した。ＵＶフィルタは用いなかった。布きれに対するレミッションの平均結果を算出した。
実施例１
欧州（ＥＵ）（実施例１Ａ）および北米（実施例１Ｂ）（ＵＳ）液体洗剤におけるα−アミラーゼの洗浄性能
テストした変異体および対応する親α−アミラーゼ（配列番号７）の洗浄性能を上記の通りテストした。結果は、（変異体の性能からブランクの性能を減じた差）を（親の性能からブランクの性能を減じた差）で除した商に１００を乗じた積として得られ；ここで、ブランクは、同一の条件ではあるが、α−アミラーゼの不在下で洗浄したことにより得られる性能である。
実施例１Ａ：欧州重質液体ランドリー洗剤組成物
Figure 0006204352
実施例１Ｂ：北米重質液体ランドリー洗剤組成物
Figure 0006204352
Figure 0006204352
Figure 0006204352
洗浄性能テスト結果は、テスト温度では対応する親分子（配列番号７）に対して、変異体の性能が向上していることを明らかに実証している。
実施例２
液体洗剤中のアミラーゼ変異体のフルスケール洗濯機性能評価。
Ｉ．洗剤テスト組成物の調製
この実験においては、４種のテスト組成物を、液体洗剤実施例１Ａに基づいて調製した。洗剤基剤は実施例１Ａから調製し、酵素は含有させず、ｐＨ８．２に仕上げた。
以下の４種の洗剤配合物を調製した。
Figure 0006204352
ＩＩ．テスト布地
３種のアミラーゼ感受性汚れ；ＣＳ−２８米デンプン、ＰＣＳ−２８米デンプンおよびＣＳ−２９タピオカデンプン（Ｃｅｎｔｒｅ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製）を５ｃｍ×５ｃｍで、２０ｃｍ×２０ｃｍの白色の綿メリヤス（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｑｕｅｓｔ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ製）に付着させた。２種のアミラーゼ感受性汚れ；ＢＢＱソースおよびＦｒｉｊｊチョコレートミルクシェークを直径２．５ｃｍで、２０ｃｍ×２０ｃｍの白色の綿メリヤス（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｑｕｅｓｔ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ製）に付着させた。８回の反復（４種の異なる機械で２回の反復）をテスト配合物の各々について用いた。
Figure 0006204352
ＩＩＩ．テスト洗浄手法
この方法では、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｅｕｒｏｐｅ Ｈｏｔｐｏｉｎｔ洗濯機、モデルＡｑｕａｒｉｕｓ ＷＦ５４１が用いられる。上記のテスト配合物を用いて、上記のとおり混合汚染物および清浄なバラスト負荷を加えて、アミラーゼ感受性汚れを洗浄した。
洗濯機に、６ｇ／Ｌのテスト配合物、１３Ｌの１０°クラーク硬度の水、ならびに、テスト布地およびバラストを入れ、１５℃で、１時間１５分間かかる急速綿洗浄サイクルで洗浄を行った。洗浄の後、テスト布地を屋内で干して乾燥させた。
洗浄プロセスをさらに３回の洗浄サイクルで繰り返した。
汚れ除去指数（ＳＲＩ）（未洗浄対洗浄済Ｌ*ａ*ｂ*値を比較することにより計測）を、次いで、洗剤組成物の汚れ除去性能を定量化するために計測した。
性能指数もまた、（実施例Ｃまたは実施例Ｄの性能から比較例Ａの性能を減じた差）を（比較例Ｂの性能から比較例Ａの性能を減じた差）で除した商に１００を乗じた積を算出することにより計測した。
ＩＶ．サンプルの比較
Figure 0006204352
Figure 0006204352
実施例Ａの組成物（酵素は存在せず）で洗浄したサンプルを、実施例Ｂ（Ｎａｔａｌａｓｅを含有する）、ＣおよびＤ（それぞれ、変異体１および２を含有する）と比較すると、汚れ除去性能が、アミラーゼ酵素の追加によって向上することが明らかである。
基準としての実施例Ａ（無酵素）に従って、実施例Ｂの組成物（Ｎａｔａｌａｓｅを含有する）で洗浄したサンプルを、実施例ＣおよびＤ（それぞれ、変異体１および２を含有する）と比較することにより、本発明の変異体１および２の両方が、Ｎａｔａｌａｓｅ（登録商標）よりも顕著に高いレベルで汚れの除去を達成することが可能であることが明らかである。
実施例３
液体洗剤におけるアミラーゼ変異体のフルスケール洗濯機性能評価。
Ｉ．洗剤テスト組成物の調製
この実験においては、４種のテスト組成物を、上記の液体洗剤実施例１Ｂに基づいて調製した。洗剤基剤は実施例１Ｂから調製し、酵素は含有させず、ｐＨ８．２に仕上げた。
以下の４種の配合物を調製した。
Figure 0006204352
ＩＩ．テスト布地
３種のアミラーゼ感受性汚れ；ＰＣＳ−２８米デンプン、ＰＳ−２８米デンプンおよびＣＳ−２６コーンスターチ５ｃｍ×５ｃｍ（Ｃｅｎｔｒｅ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製）を、２０ｃｍ×２０ｃｍの白色の綿メリヤス（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｑｕｅｓｔ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ製）に付着させた。２種のアミラーゼ感受性汚れ；ＢＢＱソースおよびチョコレートプディングベビーフードを直径２．５ｃｍで２０ｃｍ×２０ｃｍの白色の綿メリヤス（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｑｕｅｓｔ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ製）に付着させた。８回の反復（４種の異なる機械で２回の反復）をテスト配合物の各々について用いた。
Figure 0006204352
ＩＩＩ．テスト洗浄法
この方法では、北米Ｋｅｎｍｏｒｅ洗濯機モデル６００シリーズが用いられる。上記のテスト配合物を用いて、上記のとおり混合汚染物および清浄なバラスト負荷を加えて、アミラーゼ感受性汚れを洗浄した。
洗濯機に、０．７８ｇ／Ｌのテスト配合物、６４Ｌの水（６°クラーク水硬度）、ならびに、テスト布地およびバラストを入れ、１５℃で、１２分間の強洗浄と１回のすすぎで洗浄を行った。洗浄の後、テスト布地を屋内で干して乾燥させた。
洗浄プロセスをさらに３回の洗浄サイクルで繰り返した。
汚れ除去指数（未洗浄対洗浄済Ｌ*ａ*ｂ*値を比較することにより計測）を、次いで、洗剤組成物の汚れ除去性能を定量化するために計測した。
性能指数もまた、（実施例Ｃまたは実施例Ｄの性能から比較例Ａの性能を減じた差）を（比較例Ｂの性能から比較例Ａの性能を減じた差）で除した商に１００を乗じた積を算出することにより計測した。
ＩＶ．サンプルの比較
Figure 0006204352
Figure 0006204352
実施例Ａの組成物（酵素は存在せず）で洗浄したサンプルを、実施例Ｂ（Ｎａｔａｌａｓｅを含有する）、ＣおよびＤ（それぞれ、変異体３および４を含有する）と比較することにより、汚れ除去性能が、アミラーゼ酵素の追加によって向上することが明らかである。
基準としての実施例Ａ（無酵素）に従って、実施例Ｂの組成物（Ｎａｔａｌａｓｅを含有する）で洗浄したサンプルを、実施例ＣおよびＤ（それぞれ、変異体３および４を含有する）と比較することにより、本発明の変異体３および４の両方が、Ｎａｔａｌａｓｅ（登録商標）よりも顕著に高いレベルで汚れの除去を達成することが可能であることが明らかである。
実施例４
液体洗剤におけるアミラーゼ変異体のフルスケール洗濯機性能評価
Ｉ．洗剤テスト組成物の調製
この実験においては、４種のテスト組成物を、以下の液体洗剤配合物４Ａに基づいて調製した。洗剤基剤は配合物４Ａから調製し、酵素は含有させず、ｐＨ８．２に仕上げた。
Figure 0006204352
以下の７種の洗剤配合物を調製した。
Figure 0006204352
ＩＩ．テスト布地
３種のアミラーゼ感受性汚れ；ＰＣＳ−２８米デンプン、ＣＳ−１２８熟成米デンプンおよびＣＳ−２６コーンスターチ（Ｃｅｎｔｒｅ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製）を５ｃｍ×５ｃｍで、２０ｃｍ×２０ｃｍの白色の綿メリヤス（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｑｕｅｓｔ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ製）に付着させた。２種のアミラーゼ感受性汚れ；チリコンカーンおよびＨｅｉｎｚスパゲティーを直径２．５ｃｍで、２０ｃｍ×２０ｃｍの白色の綿メリヤス（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｑｕｅｓｔ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ製）に付着させた。８回の反復（４種の異なる機械で２回の反復）をテスト配合物の各々について用いた。
Figure 0006204352
ＩＩＩ．テスト洗浄法
この方法では、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｅｕｒｏｐｅ Ｈｏｔｐｏｉｎｔ洗濯機、モデルＡｑｕａｒｉｕｓ ＷＦ５４１が用いられる。上記のテスト配合物を用いて、上記のとおり混合汚染物および清浄なバラスト負荷を加えて、アミラーゼ感受性汚れを洗浄した。
洗濯機に、６ｇ／Ｌのテスト配合物、１３Ｌの１０°クラーク硬度の水、ならびに、テスト布地およびバラストを入れ、１５℃で、１時間１５分間かかる急速綿洗浄サイクルで洗浄を行った。洗浄の後、テスト布地を屋内で干して乾燥させた。
洗浄プロセスをさらに３回の洗浄サイクルで繰り返した。
汚れ除去指数（ＳＲＩ）（未洗浄対洗浄済Ｌ*ａ*ｂ*値を比較することにより計測）を、次いで、洗剤組成物の汚れ除去性能を定量化するために計測した。
性能指数もまた、（実施例Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧの性能から比較例Ａの性能を減じた差）を（比較例Ｂの性能から比較例Ａの性能を減じた差）で除した商に１００を乗じた積を算出することにより計測した。
ＩＶ．サンプルの比較
Figure 0006204352
Figure 0006204352
実施例Ａの組成物（酵素は存在せず）で洗浄したサンプルを、実施例Ｂ（Ｎａｔａｌａｓｅを含有する）、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ（それぞれ、変異体５、６、７、８および９を含有する）と比較することにより、汚れ除去性能が、アミラーゼ酵素の追加によって向上することが明らかである。
基準としての実施例Ａ（無酵素）に従って、実施例Ｂの組成物（Ｎａｔａｌａｓｅを含有する）で洗浄したサンプルを、実施例Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ（それぞれ、変異体５、６、７、８および９を含有する）と比較することにより、本発明の変異体５、６、７、８および９が、Ｎａｔａｌａｓｅ（登録商標）よりも顕著に高いレベルで汚れの除去を達成することが可能であることが明らかである。
実施例５
液体洗剤におけるアミラーゼ変異体のフルスケール洗濯機性能評価。
Ｉ．洗剤テスト組成物の調製
この実験においては、４種のテスト組成物を、液体洗剤配合物５Ａに基づいて調製した。洗剤基剤は配合物５Ａから調製し、酵素は含有させず、ｐＨ８．２に仕上げた。
Figure 0006204352
Figure 0006204352
ＩＩ．テスト布地
３種のアミラーゼ感受性汚れ；ＰＣＳ−２８米デンプン、ＰＳ−２８米デンプンおよびＣＳ−２９タピオカデンプン（Ｃｅｎｔｒｅ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製）を５ｃｍ×５ｃｍで、２０ｃｍ×２０ｃｍの白色の綿メリヤス（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｑｕｅｓｔ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ製）に付着させた。１種のアミラーゼ感受性汚れ；Ｈｅｉｎｚスパゲティーを直径２．５ｃｍで、２０ｃｍ×２０ｃｍの白色の綿メリヤス（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｑｕｅｓｔ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ製）に付着させた。１種のアミラーゼ感受性汚れ；グレービーを直径２．５ｃｍで２５ｃｍ×２４ｃｍ白色の綿メリヤス（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ製）に付着させた。８回の反復（４種の異なる機械で２回の反復）をテスト配合物の各々について用いた。
Figure 0006204352
ＩＩＩ．テスト洗浄法
この方法では、北米Ｋｅｎｍｏｒｅ洗濯機モデル６００シリーズが用いられる。上記のテスト配合物を用いて、上記のとおり混合汚染物および清浄なバラスト負荷を加えて、アミラーゼ感受性汚れを洗浄した。
洗濯機に、０．７８ｇ／Ｌのテスト配合物、６４Ｌの水（６°クラーク水硬度）、ならびに、テスト布地およびバラストを入れ、１５℃で、１２分間の強洗浄と１回のすすぎで洗浄を行った。洗浄の後、テスト布地を屋内で干して乾燥させた。洗浄プロセスをさらに３回の洗浄サイクルで繰り返した。
汚れ除去指数（未洗浄対洗浄済Ｌ*ａ*ｂ*値を比較することにより計測）を、次いで、洗剤組成物の汚れ除去性能を定量化するために計測した。
性能指数もまた、（実施例Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦの性能から比較例Ａの性能を減じた差）を（比較例Ｂの性能から比較例Ａの性能を減じた差）で除した商に１００を乗じた積を算出することにより計測した。
ＩＶ．サンプルの比較
Figure 0006204352
Figure 0006204352
実施例Ａの組成物（酵素は存在せず）で洗浄したサンプルを、実施例Ｂ（Ｎａｔａｌａｓｅを含有する）、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ（それぞれ、変異体７、８、９および１０を含有する）と比較することにより、汚れ除去性能が、アミラーゼ酵素の追加によって向上することが明らかである。
基準としての比較例Ａ（無酵素）に従って、実施例Ｂの組成物（Ｎａｔａｌａｓｅを含有する）で洗浄したサンプルを、実施例Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ（それぞれ、変異体７、８、９および１０を含有する）と比較することにより、本発明の変異体７、８、９および１０が、Ｎａｔａｌａｓｅ（登録商標）よりも顕著に高いレベルで汚れの除去を達成することが可能であることが明らかである。
本明細書に記載され、特許請求されている本発明は、本明細書に開示されている特定の態様によって範囲が限定されるべきではなく、これは、これらの態様は本発明の数々の態様の例示であることが意図されているためである。いずれかの同等の態様は本発明の範囲内であることが意図されている。実際に、本明細書に示され、記載されているものに追加した本発明の種々の改変形態が、前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。このような改変形態もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に属することが意図されている。競合する場合には、定義を含む本開示が優先されることとなる。

Claims (22)

  1. 配列番号１の成熟型ポリペプチドの位置Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｗ２８４、Ｗ４３９、Ｇ４７６およびＧ４７７に対応する２つ以上の位置に置換を含む親α−アミラーゼの単離された変異体であって、前記置換が、Ｇ３０４Ｒ、Ｗ１４０ＹＦ、Ｗ１８９ＥＧＴ、Ｄ１３４Ｅ、Ｅ２６０ＧＨＩＫＮＲＴＹ、Ｗ２８４ＤＦＲ、Ｗ４３９ＲＧ、Ｇ４７６ＥＫ及びＧ４７７ＥＫＭＲからなる群から選択され、前記変異体が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれかの成熟型ポリペプチドに対して少なくとも９０％であるが１００％未満の配列同一性を有し、および、前記変異体がα−アミラーゼ活性を有する変異体。
  2. Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７からなる群から選択される３つの位置で置換を含む、請求項１に記載の変異体。
  3. Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７からなる群から選択される４つの位置で置換を含む、請求項１又は２に記載の変異体。
  4. Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｅ２６０およびＧ４７６からなる群から選択される２、３または４つの位置で置換を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
  5. Ｇ３０４Ｒ、Ｗ１４０ＹＦ、Ｅ２６０ＧＨＩＫＮＲＴＹおよびＧ４７６ＥＫからなる群から選択される２、３または４つの位置で置換を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体。
  6. ２、３または４つの位置の前記置換が、Ｇ３０４Ｒ、Ｗ１４０Ｙ、Ｅ２６０ＧおよびＧ４７６Ｋからなる群から選択される、請求項５に記載の変異体。
  7. Ｎ１９５Ｆ、Ｖ２０６Ｙ、Ｙ２４３Ｆ、Ｇ１０９Ａ、Ｇ２７３ＤＶ、Ｇ３３７Ｎ、Ｋ７２Ｒ、Ｒ１８１Ｈ、Ｓ３０３ＧおよびＹ１００Ｉからなる群から選択される１つまたは複数の置換をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異体。
  8. 前記置換の数が、２〜２０である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異体。
  9. 前記置換の数が、２〜１０である、請求項８に記載の変異体。
  10. 前記置換の数が、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個である、請求項８又は９に記載の変異体。
  11. 前記配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれかの成熟型ポリペプチドに対して、少なくとも９０％であるが、１００％未満の配列同一性を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体。
  12. Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７７Ｅ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｔ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｋ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｄ１３４Ｅ＋Ｇ４７６Ｅ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｇ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｓ３０３Ｇ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｙ１００Ｉ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３３７Ｎ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
    Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｅ１９４Ｄ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
    Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
    Ｔ５１Ｉ＋Ｙ１００Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
    Ｔ５１Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
    Ｔ５１Ｉ＋Ｓ５２Ｑ＋Ｎ５４Ｋ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｇ４７６Ｋ
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｇ４７７Ｋ
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｇ４７７Ｒ、および
    Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ
    からなる群から選択される配列番号１の前記ポリペプチドの前記位置に対応する位置に置換を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の変異体。
  13. Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７７Ｅ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｔ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｋ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｄ１３４Ｅ＋Ｇ４７６Ｅ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｇ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｓ３０３Ｇ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｙ１００Ｉ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３３７Ｎ、
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
    Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｅ１９４Ｄ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
    Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
    Ｔ５１Ｉ＋Ｙ１００Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
    Ｔ５１Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
    Ｔ５１Ｉ＋Ｓ５２Ｑ＋Ｎ５４Ｋ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｇ４７６Ｋ
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｇ４７７Ｋ
    Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｇ４７７Ｒ、および
    Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ
    からなる群から選択される配列番号１の前記ポリペプチドの前記位置に対応する位置の置換から構成される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の変異体。
  14. 配列番号１の位置Ｇ１８２*＋Ｄ１８３*またはＤ１８３*＋Ｇ１８４*に対応する位置に欠失をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の変異体。
  15. Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７７Ｅ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｔ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｋ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｄ１３４Ｅ＋Ｇ４７６Ｅ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｇ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｓ３０３Ｇ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｙ１００Ｉ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３３７Ｎ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｅ１９４Ｄ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｔ５１Ｉ＋Ｙ１００Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｔ５１Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｔ５１Ｉ＋Ｓ５２Ｑ＋Ｎ５４Ｋ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｇ４７６Ｋ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｇ４７７Ｋ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｇ４７７Ｒ、および
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ
    からなる群から選択される配列番号１の前記ポリペプチドの前記位置に対応する位置に改変を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異体。
  16. Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７７Ｅ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｔ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｋ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｄ１３４Ｅ＋Ｇ４７６Ｅ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｇ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｓ３０３Ｇ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｙ１００Ｉ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３３７Ｎ、
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｅ１９４Ｄ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｔ５１Ｉ＋Ｙ１００Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｔ５１Ｉ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｔ５１Ｉ＋Ｓ５２Ｑ＋Ｎ５４Ｋ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ４７６Ｅ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｇ４７６Ｋ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｇ４７７Ｋ
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｇ４７７Ｒ、および
    Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｄ
    からなる群から選択される配列番号１の前記ポリペプチドの前記位置に対応する位置における改変から構成される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の変異体。
  17. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  18. 請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
  19. 請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  20. 請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  21. 親α−アミラーゼの変異体を生成する方法であって、請求項２０に記載の宿主細胞を前記変異体の発現に好適な条件下で培養するステップ；および、前記変異体を回収するステップを含む方法。
  22. 親α−アミラーゼの変異体を入手する方法であって、
    前記親α−アミラーゼに、配列番号１の成熟型ポリペプチドの位置Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７に対応する２つ以上の位置で置換を導入するステップと、α−アミラーゼ活性を有する前記変異体を回収するステップとを含み、
    ここで前記変異体は、配列番号１の成熟型ポリペプチドの位置Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｗ２８４、Ｗ４３９、Ｇ４７６およびＧ４７７に対応する２つ以上の位置に置換を含む親α−アミラーゼの単離された変異体であって、前記置換が、Ｇ３０４Ｒ、Ｗ１４０ＹＦ、Ｗ１８９ＥＧＴ、Ｄ１３４Ｅ、Ｅ２６０ＧＨＩＫＮＲＴＹ、Ｗ２８４ＤＦＲ、Ｗ４３９ＲＧ、Ｇ４７６ＥＫ及びＧ４７７ＥＫＭＲからなる群から選択され、前記変異体が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれかの成熟型ポリペプチドに対して少なくとも９０％であるが１００％未満の配列同一性を有し、および、前記変異体がα−アミラーゼ活性を有する変異体である、方法。
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