CZ349797A3 - Prací prostředek - Google Patents

Description

Prací prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká nových mutantních enzymů nebo variant enzymů použitelných při výrobě pracích prostředků, které mají 5 zlepšenou stabilitu při skladování při zachování nebo zlepšení prací schopnosti; čisticích a pracích prostředků s obsahem těchto enzymů; mutovaných genů kódujících expresi uvedených enzymů při vložení do vhodné hostitelské buňky nebo organismu; a hostitelských buněk transformovaných těmito geny a schopných exprese uvedených 10 enzymových variant.

Dosavadní stav techniky

V průmyslu pracích prostředků se již enzymy vyskytují ve složení pracích prostředků více než třicet let. Enzymy používané v takových prostředcích obsahují proteázy, amylázy, lipázy, celulázy a další enzymy nebo jejich směsi. Komerčně nejdůležitější jsou proteázy. Ačkoliv proteázy se používají v průmyslu pracích prostředků již více než třicet let, stále ještě není mnoho známo o podrobnostech interakce těchto enzymů se substráty a jinými látkami, přítomnými 2o například v pracích prostředcích. Některé faktory týkající se specifických zbytků a ovlivňování určitých vlastností, jako je oxidační a teplotní stabilita, byly obecně vyjasněny, ale ještě zbývá mnoho dalšího objevit. Rovněž ještě není přesně známo, které fyzikální nebo chemické vlastnosti jsou odpovědné za dobrý prací účinek nebo prací 25 schopnost proteázy ve specifickém pracím prostředku.

V současnosti používané proteázy byly z největší části nalezeny izolací proteáz z přírody a jejich testováním v pracích prostředcích.

• · • 0

Proteázv

Enzymy štěpící amidové vazby v proteinových substrátech jsou klasifikovány jako proteázy nebo (zaměnitelně) peptidázy (viz Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms, W.H. Freeman and Company, 5 San Francisco, kapitola 3).

Bakterie rodu Baciílus vylučují dva druhy extracelulárních proteáz, neutrální, nebo metaloproteázu a alkalickou proteázu, která je funkční serinovou endopeptidázou a obvykle se označuje jako subtilizin. Vylučování těchto proteáz je spojeno s růstovým cyklem io bakterií, přičemž nejvyšší exprese proteáz nastává v průběhu stacionární fáze, kdy se rovněž vyskytuje sporulace. Joliffe a další, (1980) J. Bacteriol 141 1199 -1208, předpokládají, že proteázy rodu Baciílus mají funkci při obměně buněčné stěny.

Subtilázv

Serinová proteáza je enzym, který katalyzuje hydrolýzu peptidických vazeb a pro které je nezbytný serinový zbytek přítomný v aktivním místě (White, Handler a Smith, 1973 Principles of Biochemistry, páté vydání, McGraw-Hill Hook Company, NY, str. 271 20 - 272).

Bakteriální serinové proteázy mají molekulové hmotnosti v rozmezí 20 000 až 45 000. Jsou inhibovány diizopropylfluorfosfátem. Hydrolyzují jednoduché koncové estery a jsou v účinku podobné eukaryotnímu chymotrypsinu, který je rovněž serinovou proteázou.

Užší název alkalická proteáza označující podskupinu, odráží vysoké optimální pH některých ze serinových proteáz, od pH 9,0 až 11,0 (pro přehled viz Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711 - 753).

Podskupina serinových proteáz předběžně označovaných jako subtilázy byla navržena autory Siezen a další, Protein Engng. 4 (1991) 30 719 - 737. Je definována homologní analýzou více než 40 sekvencí

- 3 aminokyselin serinových proteáz, dříve označovaných jako proteázy subtilizinového typu. Subtilizin byl dříve definován jako serinová proteáza, vytvářená grampozitivními bakteriemi nebo houbami a nyní je podle autorů Siezen a další podskupinou subtiláz. Byla 5 identifikována velká řada subtilizinů a byla stanovena aminokyselinová sekvence velkého počtu z nich. Zahrnují více než šest subtilizinů z kmenů rodu Bacillus, totiž subtilizin 168, subtilizin BPN', subtilizin Carlsberg, subtilizin Y, subtilizin amylosacchariticus, a mesenterikopeptidáza (Kurihara a další (1972) J. Biol. Chem. 247 io 5629 - 5631; Wells a další (1983) Nucleic Acids Res. 11 7911 - 7925;

Stáhl a Ferrari (1984) J. Bacteriol. 159 811 - 819, Jacobs a další (1985) Nud. Acids Res. 13 8913-8926; Nedkov a další (1985) Biol.

Chem. Hoppe-Seyler 366 421-430, Svendsen a další (1986) FEBS Lett. 196 228 - 232), jednu formu subtilizinů z Actinomycetales, 15 thermitáza z Thermoactinomyces vulgaris (Meloun a další (1985)

FEBS Lett. 198 195 - 200), a jeden houbový subtilizin, proteinázu K z Tritirachium album (Jany a Mayer (1985) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 584 - 492). Další reference je možno nalézt v tabulce I autorů Siezen a další, která je reprodukována níže.

Subtiliziny jsou fyzikálně a chemicky dobře charakterizovány.

Navíc ke znalosti primární struktury (sekvence aminokyselin) těchto enzymů bylo určeno více než 50 rentgenových struktur s vysokým rozlišením, které zobrazují vazbu substrátu, přechodný stav, produkty, alespoň tři různé inhibitory proteáz a definují strukturní důsledky přirozené variace (Kraut (1977) Ann., Rev. Biochem. 46 331 - 358).

V souvislosti této přihlášky by měly být substráty interpretovány v nejširším smyslu jako zahrnující sloučeninu obsahující alespoň jednu peptidovou vazbu, která podléhá hydrolýze subtilizinovou proteázou.

Rovněž výraz „produkt“ by měl být v souvislosti tohoto vynálezu 3o interpretován tak, aby zahrnoval produkty hydrolytické reakce, které

- 4 * β· · · · ·· ·· ··· · · 9 · i · · · ····* · · · ···· · • · · · · · · • · ·· · · · · · ·· se účastní subtilizinová proteáza. Produkt může být v následující hydrolytické reakci substrátem.

Jedna skupina subtiláza, I-S1, zahrnuje „klasické“ subtiliziny, jako je subtilizin 168, subtilizin BPN’, subtilizin Carlsberg s (ALCALASE®, NOVO NORDISK A/S), a subtilizin DY.

Další podskupinou subtiláz je I-S2, rozlišená autory Siezen a další (výše). Podskupina I-S2 proteáz se popisuje jako vysoce alkalické subtiliziny a obsahuje enzymy, jako je subtilizin PB92 (MAXACAL®, Gist-Brocades NV), subtilizin 309 (SAVINASE®, NOVO io NORDISK A/S), subtilizin 147 (ESPERASE®, NOVO NORDISK A/S), a alkalickou elastázu YaB.

V souvislosti tohoto vynálezu znamená varianta subtilázy nebo mutovaná subtiláza subtilázu, která byla vyprodukována organismem, exprimujícím mutantní gen, odvozený z rodičovského organismu, jehož 15 součástí je původní nebo rodičovský gen a který produkuje odpovídající rodičovský enzym, přičemž rodičovský gen byl mutován za účelem dosažení produkce mutantního genu, ze kterého je uvedená mutovaná subtilizinová proteáza produkována při expresi ve vhodném hostiteli.

Náhodné a místně zaměřené mutace subtilázového genu v obou případech vznikly ze znalosti fyzikálních a chemických vlastností enzymu a za přispění informací, týkajících se subtilázových katalytických účinků, substrátové specificity, terciární struktury apod. Jako prameny je možno uvést: Wells a další (1987) Proč. Nati. Acad.

Sci. USA 84; 1219 - 1223; Wells a další (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond.A. 317 415 - 423; Hwang a Warshel (1987) Biochem. 26 2669 2673; Rao a další (1987) Nátuře 328 551 - 554.

Mezi poslední publikace zabývající se touto oblastí patří Carter a další (1989) Proteins 6 240 - 248, týkající se návrhu variant, které 30 štěpí specifické cílové sekvence u substrátu (polohy 24 a 64); Graycar a další (1992) Annals of the New York Academy of Sciences 672 71 • · !

• *

79, zabývající se diskusí o velkém počtu dříve publikovaných výsledků; a Takagi (1993) Int. J. Biochem. 25 307 - 312, kde se rovněž shrnují předcházející výsledky.

Zvláště místně zaměřené mutagenezi subtilizinových genů byla 5 věnována velká pozornost a popis různých mutací je možno nalézt v následujících přihláškách patentů a patentech:

EP-A-130 756 (GENENTECH) (odpovídající US patentu No. 34,606 (GENENCOR)), týkající se místně specifických nebo náhodně generovaných mutací u „karbonylových hydroláz“ a následného io screeningu mutovaných enzymů na různé vlastnosti, jako je poměr kcat/K_m, profil aktivity v závislosti na pH a stabilita vůči oxidaci. V této publikaci se popisuje, že místně specifická mutace je uskutečnitelná a že mutací subtilizinu BPN’ v určitých specifických polohách, tj. ¹Tyr, ³²Asp, ¹⁵⁵Asn, ¹⁰⁴Tyr, ²²²Met, ¹⁶⁶Gly, ⁶⁴His, ¹⁶⁹Gly, ¹⁸⁹Phe, ³³Ser, ²²¹Ser, 15 ²¹⁷Tyr, ¹⁵⁶GIu nebo ¹⁵²Ala, je možno získat enzymy se změněnými vlastnostmi. Protože všechny tyto polohy kromě polohy 1 byly známy jako účastnící se funkce enzymu již před podáním této přihlášky a jejich volba tedy byla zřejmá, tato přihláška příliš nepřispívá k vyřešení problému rozhodnout, kde by měly být provedeny mutace pro 20 dosažení enzymů s požadovanými vlastnostmi.

EP-A-214 435 (HENKEL) se týká klonování a exprese subtilizinu Carlsberg a jeho dvou mutantů. Z této přihlášky nevyplývá žádný důvod pro mutaci ¹⁵⁸Asp na ¹⁵⁸Ser a ¹⁶¹Ser na ¹⁶¹Asp.

V mezinárodní publikaci patentu WO-A-87/04461 (AMGEN) se navrhuje snížit počet sekvencí Asn - Gly přítomných v rodičovském enzymu pro získání mutovaných enzymů se zlepšenou stabilitou vůči pH a teplu, přičemž v přihlášce se klade důraz na odstranění, mutování nebo modifikaci zbytků ¹⁰⁹Asn a ²¹⁸Asn v subtilizinu BPN’. V teto publikaci se neuvádějí žádné příklady delecí nebo modifikací 30 zbytků Gly.

-6 Mezinárodní publikovaná patentová přihláška WO-A-87/05050 (GENEX) popisuje náhodnou mutaci a následný screening velkého množství mutantů subtilizinu BPN’ s výhodnými vlastnostmi. V přihlášce se popisují mutace v polohách ²¹⁸Asn, ¹³¹ Gly, ²⁵⁴Thr, ¹⁶⁶Gly, ¹¹⁶Ala, ¹⁸⁸Ser, ¹²⁶Leu a ⁵³Ser.

V EP-A-251 446 (GENENCOR) se popisuje, jak je možno použít pro identifikaci ekvivalentních zbytků aminokyselin, ať konzervovaných nebo ne, homologie na úrovni jak primární, tak i terciární struktury. Tato informace spolu se znalostí terciární struktury subtilizinu BPN’ vedla autory vynálezu k výběru celé řady poloh, u kterých by mohla mutace přinést změnu vlastností. Takto identifikovanými polohami jsou: ¹²⁴Met, ²²²Met, ¹⁰⁴Tyr, ¹⁵²Ala, ¹⁵⁶Glu, ¹⁶⁶Gly, ¹⁶⁹Gly, ¹⁸⁹Phe, ²¹⁷Tyr. Rovněž polohy ¹⁵⁵Asn, ²¹Tyr, ²²Thr, ²⁴Ser, ³²Asp, ³³Ser, ³⁶Asp, ⁴⁶Gly, ⁴⁸Ala, ⁴⁹Ser, ⁵⁰Met, ⁷⁷Asn, ⁸⁷Ser, ⁹⁴Lys, ⁹⁵Val, ⁹⁶Leu, ¹⁰⁷lle, ¹¹⁰Gly, ¹⁷⁰Lys, ¹⁷¹Tyr, ¹⁷²Pro, ¹⁹⁷Asp, ¹⁹⁹Met, ²⁰⁴Ser, ²¹³Lys a ²²¹ Ser, byly identifikovány jako schopné ovlivnit různé vlastnosti enzymu. Pro podporu těchto hypotéz se uvádí v příkladech velké množství mutací. Navíc byly autory vynálezu provedeny kromě jednotlivých mutací v těchto polohách četné mnohonásobné mutace. Jako zajímavé uvádějí autoři také zbytky ²¹⁵Gly, ⁶⁷His, ¹²⁶Leu, ¹³⁵Leu, a zbytky aminokyselin uvnitř úseků 97 - 103, 126 - 129, 213 - 215 a 152 - 172, ale příklady mutací v těchto polohách se neuvádějí.

Pro účely předkládaného vynálezu je zvláště zajímavý návrh autorů vynálezu EP-A-251 446 nahradit ¹⁷⁰Lys (v subtilizinu BPN’ typu I-S1), zvláště aminokyselinami Glu nebo Arg. Zdá se, že varianta s náhradou Glu za Lys byla vytvořena a že bylo zjištěno, že velmi silně podléhá autolytické degradaci (viz str. 48, 121, 123 (tabulka XXI obsahuje zřejmou chybu, ale uvádí snížení poločasu autolýzy z 86 na 13 minut) a obrázek 32).

EP-A-260 105 (GENENCOR) popisuje modifikaci určitých vlastností enzymů obsahujících katalytické trojice volbou zbytku • 4· ·· 4 ···4 ··· 4 4 444 4 4 44

4 · 444444 « 44444 4 4 44«·4 • 4··444» • 44 4· 4 4 «44 4 · 4»

- 7 aminokyseliny ve vzdálenosti do přibližně 1,5 nm od katalytické trojice a náhradou zvoleného zbytku aminokyseliny jiným zbytkem. Enzymy subtilázového typu popisované v předkládané specifikaci jsou specificky uváděny jako náležející do třídy enzymů obsahujících katalytickou trojici. U subtilizinů jsou jako výhodné polohy pro náhradu uváděny polohy 222 a 217.

Jak také uváděli Thomas, Russell a Fersht (1985) Nátuře 318 375 - 376, záměna Asp na Ser v subtilizinu BPN’ mění závislost enzymu na pH.

V dalším článku (1987) J. Mol. Biol. 193 803 - 813, stejní autoři také diskutují náhradu ¹⁵⁶Ser místo ¹⁵⁶Glu. Obě tyto mutace jsou ve vzdálenosti přibližně 1,5 nm od aktivního ⁶⁴His.

V Nátuře 328 496 - 500 (1987) Russel a Fersht diskutují výsledky těchto experimentů a uvádějí pravidla pro změnu profilů účinnosti v závislosti na pH mutací enzymu zaměřenou na získání změny povrchového náboje.

WO-A-88/08028 (Genex) a WO-A-88/08033 (Amgen) se oba týkají modifikací zbytků aminokyselin ve vazebných místech pro vápník u subtilizinu PBN’. Uvádí se, že enzym je náhradou původních aminokyselin negativněji nabitými zbytky stabilizován.

V WO-A-89/06279 (NOVO NORDISK A/S) se označuje jako zajímavá poloha 170 a navrhuje se její náhrada tyrozinem. V souvislosti s touto variantou se však neuvádějí žádná data. V WOA-91/00345 (NOVO NORDISK A/S) se navrhuje totéž a uvádí se, že varianta s Tyr v poloze 170 u subtilizinu 309 (typ l-S2) má u detergentů s hodnotou pH přibližně 8 zlepšenou prací schopnost (varianta S003 v tabulkách III, IV, V, VI, Vlil, X). Zlepšenou prací schopnost má rovněž tato substituce v kombinaci s dalšími substitucemi v jiných polohách (S004, S011-S014, S022-S024, S019, S020, S203, S225, S227 ve stejné tabulce a tabulce VII), přičemž ··· · · ··· · · · · • i· ·· · · · · · • ··· · < · · · ··· · · • ·«»· ··· ·· ·· - · · · * · · 9 9

- 8 všechny tyto změny jsou v souladu s obecným konceptem uvedené přihlášky.

V EP-A-525 610 (SOLVAY) se navrhuje zlepšit stabilitu enzymu (typu I-S2 subtilázy, blízce příbuzné subtilizinu PB92) vůči iontovým tenzidům snížením hydrofobnosti v určitých povrchových oblastech tohoto enzymu. Dále se navrhuje nahradit v poloze 164 Gin za Arg (při použití číslování BPN’ jde o polohu 170). V přihlášce se však nepopisují žádné varianty, které by tuto substituci obsahovaly.

Ve WO-A-94/02618 (GIST-BROCADES N.V.) se popisuje velké množství variant v poloze 164 (při použití číslování BPN’ poloha 170) subtilizinu typu l-S2 PB92. Jsou uvedeny příklady ukazující substituci Met, Val, Tyr, lle za původní Arg. Je ukázáno mírné zvýšení prací schopnosti u práškových pracích prostředků u uvedených variant. Zvláště pro variantu s lle se u testu účinnosti na kakao uvádí zlepšení přibližně 20 až 30 %. Neuvádí se však žádná data týkající se stability.

Průmyslové použití subtiláz

Proteázy jako jsou subtiliziny nacházejí velké použití v průmyslu, zvláště při výrobě pracích prostředků, protože jsou použitelné při odstraňování zbarvení způsobeného proteiny.

V přítomnosti jsou komerčně dostupné alespoň následující proteázy, přičemž mnoho z nich se v mnoha zemích světa dodává ve velkých množstvích do obchodu:

Subtilizin BPN' nebo Novo, dostupný například od firmy SIGMA, St. Louis, U.S.A.

Subtilizin Carlsberg, dodávaný firmou NOVO NORDISK A/S (Dánsko) jako ALCALASE® a firmou IBIS (Holandsko) jako MAXATASE®; oba patřící do podskupiny I-S1 subtiláz.

Mezi subtiiázami podskupiny I-S2 jsou známé tyto výrobky:

- 9 Subtilizin Bacillus lentus, subtilizin 309, dodávaný firmou NOVO NORDISK A/S (Dánsko) jako SAVINASE®. Varianta tohoto enzymu získaná proteinovým inženýrstvím se dodává pod názvem DURAZYM®.

Enzymy blízce příbuzné SAVINASE®, jsou subtilizin PB92,

MAXACAL® dodávaný firmou Gist-Brocades N.V. (varianta tohoto enzymu získaná proteinovým inženýrstvím se dodává jako MAXAPEM®), OPTICLEAN®, dodávaný firmou SOLVAY et Cie. a PURAFECT®, dodávaný firmou GENENCOR International.

io Subtilizin Bacillus lentus, subtilizin 147, je dodáván firmou

NOVO NORDISK A/S (Dánsko) jako ESPERASE®.

Pro zachování účinnosti však tyto enzymy nesmí být aktivní pouze za podmínek praní, ale musí být také kompatibilní s jinými složkami detergentu v průběhu výroby pracího prostředku a jeho 15 skladování.

Například subtiliziny mohou být používány v kombinaci s jinými enzymy účinnými proti jiným substrátům a zvolený subtilizin by tedy měl být stabilní vůči těmto enzymům, a stejně tak by zvolený subtilizin s výhodou neměl katalyzovat degradaci jiných enzymů. Vybraný 2o subtilizin by měl být také odolný působení jiných složek v pracím prostředku, jako jsou bělicí prostředky, oxidační činidla a podobně a použitý enzym v pracím prostředku by měl být stabilní zejména s ohledem na oxidační schopnost, vazebné vlastnosti vůči vápníku a podmínky pH, vytvářených neenzymovými složkami v detergentu 25 v průběhu skladování a v prací lázni během praní.

Schopnost enzymu katalyzovat degradaci různých v přírodě se vyskytujících substrátů přítomných na čištěných předmětech v průběhu např. praní, se často označuje jako prací účinnost, schopnost praní, detergenční účinek nebo prací síla. V této přihlášce bude pro zahrnutí 30 této vlastnosti používán termín prací účinnost.

- 10 • ·· ··· ·* ··· · · ··· * « ·· • · · · · ♦ · · ·· • «·· ->« · · · · · · ·· • · · * · · ·· • « « · Ο · · · · · ·· · *

Schopnost enzymu zachovat aktivitu v přítomnosti jiných složek pracího prostředku před použitím (normálně přidáním vody při praní) se obvykle označuje jako skladovací stabilita nebo životnost při skladování. Často se měří jako poločas životnosti, ti_/2. V této přihlášce 5 bude pro označení této vlastnosti používán výraz skladovací stabilita.

Bylo zjištěno, že v přírodě se vyskytující subtiliziny mají velkou variabilitu co se týče jejich prací účinnosti nebo prací schopnosti při změnách parametrů, jako je pH. Některé z výše uváděných proteáz dodávaných pro prací prostředky však mají lepší účinnost než 10 proteázy dodávané na trh přibližně před dvaceti lety, ale každý enzym má pro dosažení optimálního účinku své vlastní specifické podmínky co se týče složení pracího prášku a podmínek praní, např. pH, teploty, iontové síly (= I), účinného systému (tensidy, povrchově aktivní látky, bělicí prostředky apod.), buildery apod.

Jako důsledek se zjišťuje, že enzym s požadovanými vlastnostmi při nízkém pH a nízké iontové síle může být méně výhodný při alkaličtějších podmínkách a vysoké iontové síle nebo enzym s vhodnými vlastnostmi při vysokém pH a vysoké iontové síle může být méně vhodný při nízkém pH a nízké iontové síle.

2o Bylo také zjištěno, že různé enzymy mají různou skladovací stabilitu a konkrétní enzym má velké variace ve skladovací stabilitě při použití v rozdílných pracích prostředcích v závislosti na řadě parametrů, jako je pH, pl, bělicí systém, tensidy apod., a na fyzikálním stavu pracích prostředků, které mohou být v práškové, prachové nebo kapalné formě. Prací prostředek může být navíc koncentrovaný nebo ředěný.

Příchod a vývoj technik rekombinantní DNA měl v oblasti proteinové chemie značný vliv.

Použitím této technologie je nyní možné konstruovat enzymy 3o s požadovanými sekvencemi aminokyselin a jak již bylo uvedeno výše,

- 11 návrhu subtilizinů se změněnými vlastnostmi bylo věnováno značné úsilí při výzkumu.

Podle návrhů popisovaných v EP-A-130 756 (GENENTECH) (US patent No. 34,606 (GENENCOR)) a mezinárodní publikované patentové přihlášce WO-A-87/05050 (GENEX) znamená způsob výroby a screeningu velkého množství mutovaných enzymů velké rozšíření proti klasickým metodám izolace nativních enzymů, jejich vystavování klasickým programům mutageneze (s použitím radiace nebo chemických mutagenů) a screeningu jejich vlastností. Rozdíl spočívá v tom, že znalostí velkého počtu variant enzymů substituovaných ve specifických polohách se stávají tyto metody účinnějšími.

Subtilizinový enzym typicky obsahuje přibližně 275 zbytků aminokyselin. Na místě každého zbytku se může vyskytovat 1 z 20 možných v přírodě se vyskytujících aminokyselin. Velmi vážnou nevýhodou tohoto postupu tedy je, že musí být velmi vysoký počet vytvořených mutací podroben celé řadě předběžných kroků screeningu zaměřeného na určení jejich vlastností.

V důsledku toho je postup popisovaný v těchto patentových přihláškách pouze o málo lepší než tradiční postupy náhodné mutace známé již řadu let.

Další známé techniky se týkají změn specifických vlastností, jako je stabilita vůči oxidaci, teplotní stabilita, stabilita vůči vápníku, rychlost přeesterifikace a rychlost hydrolýzy (EP-A-260 105 (GENENCOR)), profil aktivity v závislosti na pH (Thomas, Russell a Fersht, výše), a substrátová specifita (zveřejněná mezinárodní patentová přihláška WO-A-88/07578 (GENENTECH)). Žádné z těchto publikací se nezabývají změnami prací schopnosti enzymů nebo jejich skladovací stability.

Mezinárodní patentová přihláška No. PCT/DK 88/00002 (NOVO NORDISK A/S) navrhuje pro určení, které aminokyselinové polohy by

- 12 • · · ·· · ·· »· • •V · · »·· 9 ♦ 9 · • ····· · · ♦ · « · · · • ··*· ··« • · * « · »9 0 · · « · 9 9 měly být vybrány pro mutace a které aminokyseliny by měl být v těchto polohách nahrazeny pro dosažení požadované změny v prací účinnosti, použít metodu porovnávání homologie.

Použitím tohoto postupu se drasticky sníží nároky kladené na screening, protože počet vytvářených mutantů je mnohem menší, ale s použitím tohoto postupu je možno pouze předvídat, že je možno získat enzymy, které mají užitečné vlastnosti kombinovány z rodičovského enzymu a enzymu použitého při srovnávání.

Jak je tedy uvedeno výše, dosud nebyl nalezen žádný vztah mezi dobře definovanými vlastnostmi enzymu jako jsou vlastnosti uvedené výše a prací účinností a skladovací stabilitou enzymu v různých pracích prostředcích.

Problém spočívá patrně v tom, že ačkoliv pro odhalení mechanismu účinku enzymů bylo podniknuto velké množství výzkumů, je stále ještě známo pouze velmi málo o faktorech ve struktuře a kombinaci zbytků aminokyselin, které ovlivňují vlastnosti enzymů ve vztahu k většině jejich charakteristik, jako je skladovací stabilita v pracích prášcích, zvláště pokud jsou enzymy přítomny v komplexních směsích.

Proto tedy stále existuje potřeba dalšího zlepšování a úpravy enzymů požadovaným směrem, aby vyhovovaly konkrétním pracím systémům, stejně jako lepšího porozumění mechanismu působení proteázy a degradace při praktickém použití čisticích nebo pracích prostředků. Porozuměním těmto mechanismům by mohlo dojít k získání pravidel, kterých by bylo možno použít pro volbu mutací, které by s přijatelným stupněm určitosti vedly k dosažení enzymu, který by měl zlepšenou skladovací stabilitu a/nebo prací účinnost za daných podmínek v detergentním prostředku.

- 13 4 *4 · · · 44· · ··· 4 9 9 9 9 9 9 99

99999 9 4 4 9999· • 4 « · 4 44 · 9 999 9 9 99

Podstata vynálezu

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že substitucí jedné nebo více aminokyselin umístěných v nebo v blízkosti hydrofobní domény rodičovské subtilázy za hydrofobnější zbytek aminokyseliny než zbytek původní, může být získána varianta subtilázy se zlepšenou skladovací stabilitou a/nebo prací schopností v pracích prášcích, přičemž uvedená hydrofobní doména obsahuje zbytky odpovídající zbytkům P129, P131, 1165, Y167 a Y171 BLS309 (číslování BASBPN) a uvedené zbytky v jejich blízkosti zahrnují zbytky odpovídající zbytkům E136, G159, S164, S164, R170, A194 a 195 BLS309 (číslování BASBPN) s výjimkou variant R170M, R170I a R170V BABP92.

Předkládaný vynález se tedy týká v prvním hledisku variant enzymů se zlepšenou stabilitou a/nebo prací schopností v pracích prostředcích, zvláště kapalných pracích prostředcích, a zejména koncentrovaných pracích prostředcích a v mýdlových kostkách.

Ve druhém hledisku se vynález týká konstruktů DNA, schopných exprimovat enzymy podle prvního hlediska, pokud jsou vloženy vhodným způsobem do hostitelské buňky, která je následně přivedena k expresi subtziiizinového enzymu (enzymů) podle prvního hlediska. Ve třetím hledisku se vynález týká výroby subtilizinových enzymů podle vynálezu vložením konstruktu DNA podle druhého hlediska do vhodného hostitele, kultivací hostitele pro dosažení exprese požadovaného subtilázového enzymu a izolací enzymového produktu.

Vynález se týká mutantů genů exprimujících enzymy subtilázové podskupiny I-S2 a odvozených enzymových variant, jak je uvedeno výše, ale není na tyto případy omezen.

Další varianty subtilázového genu zahrnované vynálezem jsou varianty genů subtilázové podskupiny I-S1, například subtilizinu BPN’ a subtilizinu Carlsberg a odvozených variant enzymů subtilizin BPN’, proteináza K a subtilizin Carlsberg, které mají v čisticích prostředcích zlepšenou stabilitu a/nebo prací schopnost.

- 14Ještě další varianty subtilázového genu zahrnované vynálezem jsou varianty jako varianta proteinázy K a jiných genů a odvozená varianta proteinázy K a jiných subtilázových enzymů, které mají v pracích prostředcích zlepšenou stabilitu a/nebo účinnost.

Další příklady rodičovských subtilázových enzymů, které mohou být modifikovány podle vynálezu, jsou uvedeny v tabulce I.

Vynález se dále týká použití mutantních enzymů v čisticích prostředcích a čisticích prostředků obsahujících mutantní enzymy, zvláště pracích prostředků obsahujících mutantní subtilizinové enzymy. Vynález se zvláště týká kapalných pracích prostředků, zvláště koncentrovaných pracích prostředků a mýdlových kostek, které tyto enzymové varianty obsahují.

Použité zkratky

Aminokyseliny

A	=	Ala =	alanin
V	=	Val	=	valin
L	=	Leu	=	leucin
I	=	lle	=	izoleucin
P	=	Pro	=	prolin
F	-	Phe	-	fenylalanin
W	=	Trp	-	tryptofan
M	=	Met	-	methionin
G	=	Gly	=	glycin
S	=	Ser	=	serin
T	=	Thr	=	threonin
c	=	Cys	-	cystein
Y	=	Tyr	=	tyrozin
N	-	Asn	=	asparagin
Q	=	Gin	=	glutamin

D	Asp =	kyselina asparagová
E	Glu =	kyselina glutamová
K	Lys =	lyzin
R	Arg =	arginin
H	His =	histidin

Báze nukleových kyselin

A	adenin
G	guanin
C	cytozin
T	thymin	(pouze v DNA)
u	uráčil	(pouze v DNA)

Varianty

Při popisu různých variant enzymů produkovaných nebo uvažovaných podle vynálezu byla pro přehlednost použita a upravena následující nomenklatura: původní aminokyselina (aminokyseliny) poloha (polohy) - nahrazená aminokyselina (aminokyseliny).

Podle toho substituce kyseliny glutamové za glycin v poloze 195 je označena jako:

Gly 195 Glu nebo G195E a delece glycinu ve stejné poloze je popsána:

Gly 195 * nebo G195* a inzerce dalšího zbytku aminokyseliny, jako například lyzin je označena:

Gly 195 GlyLys nebo G195GK

Kde je v tabulce I označena delece nebo je přítomna v subtilizinu neuvedeném v tabulce I, inzerce v této poloze je označena jako: * 36 Asp nebo *36D, což znamená inzerci kyseliny asparagové v poloze 36.

Vícečetné mutace jsou odděleny znaménkem +, tj:

- 16 Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu nebo R170Y+G195E, což označuje mutace v polohách 170 a 195 nahrazující tyrozin a kyselinu glutamovou za arginin a glycin.

Polohy

Při popisu variant v této přihlášce a přiložených nárocích se využívá uspořádání různých subtiláz podle Siezen a další, výše. V dalších publikacích týkajících se subtiláz bylo používáno jiného uspořádání nebo číslování specifických enzymů. Pro odborníka v io oboru je určení polohy konkrétního zbytku v takovémto odlišném číslování rutinní záležitostí. Je také používáno odkazů na obrázek 1, ve kterém se ukazuje uspořádání zbytků relevantní pro předkládaný vynález velkého množství subtiláz. Je také používáno odkazů na tabulku I podle WO-A-91 /00345, ukazující uspořádání zbytků 15 relevantních pro předkládaný vynález velkého množství subtiláz.

Tabulka I

V současnosti známé subtilázy (podle Siezen a další, výše)

Organismus	cDNA,	Enzym	Akronym
	gen
PROKARYONTY
Gramoozitivní bakterie
Bacillus subtilis 168	apr A	subtilizin 1168,apr	ABSS168
Bacillus amyloliquefaciens
subtilizin BPN’ (NOVO)	BASBPN
Bacillus subtilis DY	-	subtilizin DY	BSSDY
Bacillus licheniformis	+	subtilizin Carlsberg	BLSCAR
Bacillus lentus	+	subtilizin 147	BLS147
Bacillus alcalophilus PB92		+
subtilizin PB92	BAPB92

Bacilius sp. DSM 4828	-	alkalická proteáza	BDSM48
Bacillus YaB	ale	alkal. elastáza YaB	BYSYAB
Bacillus subtilis 168	epr	min.extracel.prot.	BSEPR
Bacillus subtilis	bpf	bacilopeptidáza F	BSBPF
Bacillus subtilis IFO3013	ispl	intracel.ser.prot.1	BSISP1
Bacillus subtilis A50		intracel.ser.prot.	BSIA50
Bacillus thuringiensis		extracel.ser.prot.	BTFINI
Bacillus cereus		extracel.ser.prot.	BCESPR
Nocardiopsis dassonvillei		alkalic.ser.prot.	NDAPII
Thermoactinomyces vulg.		thermitáza	TVTHER
Enterococcus faecalis	cylA	složka cytolyzinu A	EFCYLA
Staphylococcus epidermidis	epiP	úvod.prot. epiderminu	SEEPIP
Streptococcus pyrogenes	scpA	C5a peptidáza	SPSCPA
Lactococcus lactis SK11	prtP	prot.buň.st.SK11	LLSK11
Gramneqativní bakterie
Dichelobacter nodosus	+	bazická proteáza	DNEBPR
Xanthomonas campestrís	+	extracel.prot.	XCEXPR
Serratia marcescens	+	extracel.ser.prot.	SMEXSP
Thermus aquaticus YT-1	pstl	aqualyzin I	TAAQUA
Thermus rT41A	+	T41A proteáza	TRT41A
Vibrio alginolyticus	proA	proteáza A	VAPROA
Streptomyces rutgersensis	-	proteináza D	SRESPD
Archaea
Halophilic strain 172P1	-	halofil extra.prot.	ARB172
Cvanobacteria
Anabaena variabilis	prcA	Ca-depend. proteáza	AVPRCA
NIŽŠÍ EUKARYONTY
Houby
Tritirachium album Limber	+	proteináza K	TAPROK
Tritirachium album	+	proteináza R	TAPROR
Tritirachium album	proT	proteináza T	TAPROT
Aspergillus oryzae	+	alkalická proteáza	AOALPR

·

Malbranchea pulchella Acremonium chrysogenum Kvasinky	alp	thermomykolin alkalická proteáza	MPTHMY ACALPR
Kluyveromyces lactis	kex1	Kex1 ser.proteináza	KLKEX1
Saccharomyces cerevisiae	kex2	Kex2 ser.proteináza	SCKEX2
Saccharomyces cerevisiae	prb1	proteáza B	SCPRB1
Yarrowia lipolytica	xpr2	alk.extracel.prot.	YLXPR2
VYŠŠÍ EUKARYONTY
Červi
Caenorhabditis elegans	bli4	proteáza kutikuly	CEBLI4
Hmvz
Drosophila (octomilka)	fur1	furin 1	DMFUR1
Drosophila (octomilka)	fur2	furin 2	DMFUR2
Rostliny
Cucumis melo (meloun)	-	kukumizin	CMCUCU
Savci
Člověk (též krysa, myš)	fur	furin	HSFURI
Člověk (též myš)	+	izulinom. proteáza PC2	HSIPC2
Myš	+	hypofyz. proteáza PC3	MMPPC3
Člověk	+	tripeptidyl. peptid.ll	HSTPPP

Reference použité v tabulce I

Reference vztahující se k sekvencím aminokyselin (přístupová čísla v databance GenBank®/EMBL jsou uvedena v závorkách):

ARB172 Kamekura a Seno (1990) Biochem. Cell. Biol. 68 352 - 359 (sekvenování aminokyselin u maturní proteázy u zbytků 1 35; zbytek I4 není určen).

BSS168 Stáhl a Ferrari (1984) J. Bacteriol. 158 411 - 418 (K01988). Yoshimoto, Oyama a další (I488) J. Biochem 103 1060 io 1065 (maturní subtilizin B. subtilis var. amylosacchariticus se liší tím, že obsahuje T130S a T162S). Svendsen, a další (1986) FEBS Lett. 196 228 - 232 (PIR A23624; sekvenování

- 19 aminokyseliny; maturní alkalická mesenterikopeptidáza B. mesentericus se liší tím, že obsahuje S85A, A88S, S89A, S183A a N259S).

BASBPN Wells, a další (1983) Nud. Adds Res. 11 7911 - 7925 5 (X00165). Vasantha, a další (1984) J. Bacteriol. 159 811 - 814 (K02496).

BSSDY Nedkov, a další (1983) Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 364 1537 - 1540 (PIR A00969; sekvenování aminokyselin).

BLSCAR Jacobs a další (1985) Nucleic Adds Res. 13 8913 - 8926 ίο (X03341). Smith a další (1968) J. Biol. Chem. 243 2184 2191 (PIR A00968; sekvenování aminokyselin; maturní sekvence proteázy se odlišuje tím, že obsahuje T103S, P129A, S158N, N161S a S212N).

BL5147 Hastrup a další (1989) PCT Patent Appl. WO 8906279. Pub. 15 July 13 1989 (Esperase® from B. lentus). Takami a další (1990) Appl. Microbiol. Biotechnol. 33 519 - 523 (sekvenování zbytků 1-20 maturní alkalické proteázy Badllus sp. no. AH101; tato sekvence se liší od BLS147 tím, že obsahuje N11S).

BABP92 van der Laan a další (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57 901 2o 909 (Maxacal®). Hastrup a další (1989) PCT Patent Appl. WO

8906279. Pub. 13 Jul 1989 (subtilizin 309, Savinase®, B. lentus se odlišuje pouze tím, že obsahuje N87S). Godette a další (1991) Abstracts 5th Protein Society Symposium, June 6, Baltimore; abstrakt M8 (vysoce alkalická proteáza B. lentus 25 se odlišuje tím, že obsahuje N87S, S99D, S101R, S103A,

V104I a G159S).

BDSM4B Rettenmaier a další (1990) PCT Patent Appl. WO 90/04022. Publ. Apríl 19, 1990.

BYSYAB Kaňko a další (1989) J. Bacteriol. 171 5232 - 5236 (M28537). 30 BSEPR Sloma a další (1988) J. Bacteriol. 170 5557 - 5563 (M22407).

Bruckner (1990) Mol. Gen. Genet. 221 486 - 490 (X53307).

-20 BSBPF Sloma a další (1990) J. Bacteriol. 172 1470 - 1477 (M29035; corrected). Wu a další (1990) J. Biol. Chem. 265 6845 6850 (J05400; tato sekvence se liší tím, že obsahuje A169V a 586 bez C-koncových zbytků v důsledku posunu čtecího rámce).

BSISPI Koide a další (1986) J. Bacteriol. 167 110 - 116 (M13760).

BSIA50 Strongin a další (1978) J. Bacteriol. 133 1401 - 1411 (sekvenování zbytků 1-54 maturní proteázy; zbytky 3. 39, 40. 45, 46, 49 a 50 nebyly určeny).

io BTFINI Chestukhina a další (1985) Biokhimiya 50 1724 - 1730 (sekvenování zbytků 1-14 maturní proteázy B. thuringiensis variety israeliensis, a zbytků 1-16 a 223-243 variety finitimus). Kunitate a další (1989) Agric. Biol. Chem. 53 3251 - 3256 (sekvenování aminokyselin zbytků 6 - 20 maturní proteázy variety kurstaki. BTKURS).

BCESPR Chestukhina a další (1985) Biokhimiya 50 1724 - 1730 (sekvenování aminokyselin maturních zbytků 1-16 a 223-243).

NDAPII Tsujibo a další (1990) Agric. Biol. Chem. 54 2177 - 2179 (sekvenování aminokyselin maturních zbytků 1-26).

TVTHER Meloun a další (1985) FEBS Lett. 183 195 - 200 (PIR A00973; sekvenování aminokyselin zbytků maturní proteázy 1-274).

EFCYLA Segarra a další (1991) Infect. Immun. 59 1239 - 1246. SEEPIP Schnell a další (1991) osobní sdělení (Siezen a další (výše)).

SPSCPA Chen a další (1990) J. Biol. Chem. 265 3161 - 3167 (J05224).

DNEBPR Kortt a další (1991) Abstracts 5th Protein Society Symposium, June 22 - 26, Baltimore, abstrakt S76.

LLSK11 Vos a další (1989) J. Biol. Chem. 264 13579 - 13585 (J04962). Kok a další (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 231

- 238 (M24767; sekvence kmene Wg2 se liší ve 44 polohách včetně 18 rozdílů v proteázové doméně a delecí zbytků 1617 -21 ····· · · · ···* ·

9 · · 9 9 9

9 9 99 9 9 9 9 9

1676). Kiwaki a další (1989) Mol. Microbiol. 3 359 - 369 (X14130; sekvence kmene NCD0763 se liči v 46 polohách včetně polohy 22 v proteázové doméně a delecí zbytků 1617 1676).

s XCEXPR Liu a další'(I990) Mol. Gen. Genet. 220 433 - 440.

SMEXSP Yanagida a další (1986) J. Bacteriol. 166 937 - 994 (M13469).

TAAQUA Terada a další (1990) J. Biol. Chem. 265 6576 - 6581 (J05414).

io TRT41A McHale a další (1990) Abstracts 5th Eur. Congr. Biotechn. Christiansen, Munck a Villadsen (red.), Munksgaard Int. Publishers, Copenhagen.

VAPROA Deane a další (1989) Gene 76 281 - 288 (M25499).

SRESPD Lavrenova a další (1984) Biochemistry USSR 49 447 - 454 15 (sekvenování aminokyselin zbytků 1-23; zbytky 13, 18 a 19 nebyly určeny).

AVPRCA Maldener a další (1991) Mol. Gen. Genet. 225 113 - 120 (publikovaná sekvence má 28 neurčitých zbytků v blízkosti polohy 200-210 v důsledku chyby čtení v důsledku posunu 20 čtecího rámci).

TAPROK Gunkel a Gassen (1989) Eur. J. Biochem. 179 185 - 194 (X14688/XI4689). Jany a další (1986) J. Biol. Chem. HoppeSeyler 367 87 (PIR A24541; sekvenování aminokyselin; maturní proteáza se odlišuje tím, že obsahuje S745G, 25 SILST2O4-208DSL a VNLL264-267FNL).

TAPROR Samal a další (1990) Mol. Microbiol. 4 1789 - 1792 (X56116).

TAPROT Samal a další (1989) Gene 85 329 - 333.

AOALPR Tatsumi a další (1989) Mol. Gen. Genet. 219 33 - 38. 3o Cheevadhanarah a další (1991) EMBL Data Library (X54726).

-22 MPTHMY Gaucher a Stevenson (1976) Methods Enzymol. 45 415 433 (sekvenování aminokyselin zbytků 1-28, a hexapeptidu LSGTSM se serinem v aktivním místě).

ACALPR Isogai a další (1991) Agric. Biol. Chem. 55 471 - 477. 5 Štěpánov a další (1986) Int. J. Biochem. 18 369 - 375 (sekvenování aminokyselin zbytků 1-27: maturní proteáza se odlišuje tím, že obsahuje H13[1]Q, R13 [2]N a S13[6]A).

KLKEX1 Tanguy-Rougeau, Wesoiowski-Louvel a Fukuhara (1988) FEBS Lett. 234 464 - 470 (X07038).

io SCKEX2 Mizuno a další (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 156 246 -254 (M24201).

SCPRBI Moehle a další (1987) Mol. Cell. Biol. 7 4390 - 4399 (M18097).

YLXYPR2 Davidow a další (1987) J. Bacteriol. 169 4621 - 4629 15 (M17741). Matoba a další (1988) Mol. Cell. Biol. 8 4904 -4916 (M23353).

CEBL14 Peters a Rose (1991) The Worm Breedeťs Gazette 11 28.

DMFUR1 Roebroek a další (1991) FEBS Lett. 289 133 - 137 (X59384).

DMFUR2 Roebroek a další (1992) 267 17208 - 17215.

CMCUCU Kaneda a další (1984) J. Biochem. 95 825 - 829 (sekvenování aminokyselin oktapeptidu NIISGTSM se serinem v aktivním místě).

HSFURI van den Ouweland a další (1990) Nud. Acids Res. 18 664 25 (X04329) (sekvence myšího furinu se liší v 51 polohách včetně 5 v katalytické doméně: A15E, Y21F, S223F, A232V a N258[2]D). Misumi a další (1990) Nud. Acids Res. 18 6719 (X55660: sekvence krysího furinu se liší ve 49 polohách včetně tří v katalytické doméně: A15E, Y21F, H24R).

HSIPC2 Smeekens a Steiner (1990) J. Biol. Chem. 265 2997 3000(J05252). Seidah a další (1990) DNA Cell Biol. 9 415 424 (sekvenování myší hypofyzární proteázy PC2 se liší ve

- 23 • ·· <·* · ·· ·· ···· « · ·· ···· ······ ·· ·· • ··· » · · · · ···· · • ···· ··· ··· ·· *· ··· ·» ·· polohách včetně 3 v proteázové doméně: 14F, S42[2]Y,

E45D, N76S, D133E, V134L a G239(1]D).

MMPPC3 Smeekens a další (1991) Proč. Nati. Acad. Sel. USA 88

340 - 344 (M58507). Seidah a další (1990) DNA Cell Biol. 9

415 - 424 (M55668/M55669; částečná sekvence).

HSTPP Tomkinson a Jonsson (1991) Biochemistry 30 168 - 174 (J05299).

Překvapivě bylo zjištěno, že skladovací stabilita a/nebo účinnost subtiláz v pracích prostředcích se zlepšuje náhradou aminokyselin v blízkosti hydrofobní domény obsahující zbytky P129, P131, 1165,

Y167, Y171 subtilizinu 309 za hydrofobnější zbytky. Zbytky, které přicházejí v úvahu, jsou zvláště E136, G159, S164, R170, A194 a G195.

Obr. 2 ukazuje hydrofobní doménu u subtilizinu 309 a zbytky v její blízkosti, z nichž velký počet má být substituován pro zvýšení hydrofobnosti této domény. Toho může být dosaženo substitucí hydrofobních zbytků za nehydrofobní zbytky a/nebo substitucí zbytků tak, aby byly ještě hydrofobnější než v rodičovském enzymu.

Stejný princip platí pro odpovídající hydrofilní domény jiných subtiláz, jejichž identifikaci odborník v tomto oboru s průměrnými znalostmi a zkušenostmi snadno zvládne. Grafické zobrazení podobně jako v obr. 2 může být vytvořeno pro další subtilázy, aby bylo možno určit cílové zbytky pro provedení substituce podle vynálezu.

Některé z těchto zbytků jsou uvedeny v následující tabulce II:

• ·>

• · · • · · • · •· •· •· •·

-24 Tabulka II

Zbytky v hydrofobní doméně a v její blízkosti

Pol/Enz.	BASBPN	BLSCAR	BLS309	BLS147	TVTHER
Doména
129	P	A	P	T	T
131	G	G	P	G	G
165	V	I	I	V	P
167	Y	Y	Y	Y	Y
171	Y	Y	Y	Y	Y
Okolí
136	K	K	E	R	Q
159	S	S	G	G	T
164	T	T	S	G	A
170	K	K	R	R	Y
194	P	A	A	P	S
195	E	E	G	E	V

Tabulka II byla vytvořena s použitím uspořádání ukázaného v obr. 2. Je zřejmé, že mohou být odborníky v oboru vytvořeny podobné nebo větší tabulky, pokrývající jiné subtilázy.

Vynález se tedy týká variant subtiláz, ve kterých může být sekvence aminokyselin změněna mutací genu subtilizinového enzymu, který je potřeba modifikovat (rodičovský enzym nebo gen) v kodonu, odpovědném za expresi zbytku aminokyseliny v polohách 129, 131, io 165, 167, 171, 136, 159, 164, 170, 194 a 195, přičemž zbytky jsou hydrofobnější než zbytek (zbytky) v rodičovském enzymu a jde zvláště o takové hydrofobní zbytky, které obsahují relativně dlouhý hydrofobní řetězec, jako je lle, Leu a Val, a při expresi mutovaného genu je nahrazen zbytek aminokyseliny hydrofobnějším zbytkem, zvyšujícím 15 hydrofobičnost domény jako takové.

• ♦ · · • · · · • · · · • · · · 4 • · · • · · ·

Hydrofobní zbytky aminokyselin jsou obecně následující: Val (V), lle (I), Leu (L), Met (M), Phe (F), Pro (P) a Trp (W). Mezi nimi jsou výhodné aminokyseliny Val, lle a Leu. Použitím tabulky II a podstaty vynálezu vyplyne řada kandidátů na substituce.

Jak pro BASBPN, tak i BLSCAR se zdá výhodné provést substituce v polohách 136, 159, 164, 167, 170 a 195. V BLS309 by byly první na řadě polohy 136, 164, 167 a 170 a dále polohy 159 a 195. V BLS147 by byly první na řadě polohy 136, 167, 170 a 195, zatímco na druhém místě by byly polohy 159 a 164. Na prvním místě io jsou konečně u TVTHER polohy 136, 167 a 194 a po nich následuje poloha 164.

Podle vynálezu by bylo výhodné nahradit zbytky Gly v hydrofobní doméně objemnějšími a hydrofobnějšími zbytky.

Tyto úvahy platí pro jakýkoliv hydrofilní nebo hydrofobní zbytek, 15 který může zaujmout kteroukoli z výše uvedených poloh, pokud se zdá, že nějaké zvýšení hydrofobičnosti je výhodné. To znamená, že například velmi hydrofilní zbytek, jako jsou nabité zbytky Arg (R), Asp (D), Glu (E) nebo Lys (K) mohou být nahrazeny zbytkem, který je méně hydrofilní. Tyto méně hydrofilní zbytky zahrnují zbytky Gly (G), 2o Cis (C), Ser (S), Ala (A), Thr (T), Tyr (Y), Gin (Q), His (H) nebo Asn (N).

Podobné úvahy je možno použít na další subtilázy s hydrofobní doménou v této části povrchu enzymu.

V souvislosti tohoto vynálezu je subtiláza definována ve shodě 25 s autory Siezen a další, výše. V užším smyslu, použitelné na mnoho provedení vynálezu, jsou zajímavé subtilázy takové, které patří do podskupin I-S1 a I-S2. V konkrétnějším smyslu se mnoho provedení vynálezu týká serinových proteáz grampozitivních bakterií, které mohou být přivedeny do v podstatě jednoznačné homologie 30 primární struktury se subtilázami uvedenými v tabulce I výše.

• ·

........ · i·· ·«···· ···♦ • · · · · « · · · ···· · • · · · · ··· ··· ·· ·· ·«♦ ·· ··

-26 Předkládaný vynález také zahrnuje jakoukoliv substituci nebo více substitucí ve výše uvedených polohách v kombinaci s jakýmikoliv jinými substitucemi, delecemi nebo adicemi aminokyselinové sekvence rodičovského enzymu. Jsou vhodné zvláště kombinace 5 s dalšími substitucemi, o kterých je známo, že poskytují zlepšené vlastnosti enzymů.

Tyto kombinace zahrnují polohy 222 (zlepšená stabilita vůči oxidaci), 218 (zlepšená termální stabilita), substituce ve vazebných oblastech pro vápník stabilizují enzym (například poloha 76) a mnoho io dalších, které jsou zřejmé ze stavu techniky. Navíc se specificky uvádějí kombinace s variantami uvedenými v EP-A-405 901.

VARIANTY

A: Jednoduché varianty:

Varianty subtilizinu BPN', subtilizinu Carlsberg, subtilizinu 168, a subtilizinu DY:

K136V, K136I, K136L, K136M, K136F,

S159V, S159I, S159L, S159M, S159F,

T164V, T164I, T164L, T164M, T164F,

K170V, K170I, K170L, K170M, K170F,

E195V, E195I, E195L, E195M, E195F,

Varianty termitázy:

Q136V, Q136I, Q136L, Q136M, Q136F,

T159V, T159I, T159L, T159M, T159F,

A164V, A164I, A164L, A164M, A164F,

Y167V, Y167I, Y167L, Y167M, Y167F,

Y170V, Y170I, Y170L, Y170M, Y170F,

S194V, S194I, S194L, S194M, S194F,

Varianty subtilizinu 309, subtilizinu 147 a proteázy Bacillus PB92

E136V, E136I, E136L, E136M, E136F,

G159V, G159I, G159L, G159M, G159F,

G164V, G164I, G164L, G164M, G164F, (BLS147) * · • ·

-27 S164V, S164I, S164L, S164M, S164F,(BLS 309 a BAPB 92)

Y167V, Y167I, Y167L, Y167M, Y167F,

R170V, R170I (pro PAPB 92 obě vyloučeny),

R170L, R170M (pro PAPB 92 obě vyloučeny), R170F, R170G, s R170C

A194V, A194I, A194L, A194M, A194F

P194V, P194I, P194L, P194M, P194F

E195V, E195I, E195L, E195M, E195F

G195V, G195I, G195L, G195M, G195F

B: Kombinované varianty:

Jakékoliv z výše uvedených variant se mohou ukázat výhodné v kombinaci s dalšími variantami v jakékoliv z poloh: 27, 36, 57, 76, 101, 104, 123, 218, 222, 224 a 274.

Pro kombinace jsou zvláště vhodné následující varianty

BLS309: K27R, *36D, S57P, N76D, S101G, V104A, V104N, V104Y, N123S, A194P, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S a T274A.

Výhodné jsou také takové varianty, které obsahují jednu nebo dvě substituce X167L, X167I, X170L a/nebo X170I v kombinaci s 2o jednou nebo více dalšími substitucemi, delecemi a/nebo inzercemi uváděnými výše.

Zlepšené vlastnosti budou také pravděpodobně mít varianty obsahující některou z variant V104N+S101G, K27R+V104Y+

N123S+T274A, nebo N76D+V104A, v kombinaci s jednou nebo více 25 substitucemi, delecemi a/nebo inzercemi uvedenými výše.

Je třeba se zmínit zvláště o následujících specifických kombinacích:

a) S57P+R170L a’) S57P+R170I

b) R170L+N218S

	b’)	R170I+N218S
	c)	S57P+R170L+N218S
	C’)	S57P+R170I+N218S
	C”)	S57P+V104Y+R170L+N218S
5	ď”)	S57P+V104Y+R170I+N218S
	d)	R170L+N218S+M222A
	ď)	R170I+N218S+M222S
	d”)	R170L+N218S+M222A
	ď“)	R170I+N218S+M222S
10	e)	S57P+R170L+S188P+A194P
	θ’)	S57P+R170I+S188P+A194P
	f)	Y167L+R170L
	f’)	Y167L+R170I
	g)	Y1671+R170L
15	g’)	Y167I+R170I
	h)	N76D+R170L+N218S
	h')	N76D+R170I+N218S
	i)	S57P+N76D+R170L+N218S
	i’)	S57P+N76D+R170I+N218S
20	j)	N76D+R170L+N7218S+M222A
	i’)	N76D+R170I+N218S+M222S
	j“)	N76D+R170L+N218S+M222A
	Γ)	N76D+R170L+N218S+M222S
	k)	S57P+R170I+S188P+A194P+N218S
25	k’)	S57P+R1701+S188P+A194P+N218S
	i)	*36D+N76D+H120D+R170L+G195E+K235L
	i’)	*36D+N76D+H120D+R170l+G195E+K235L
	m)	N76D+H120D+R170L+G195E+K235L
	m’)	N76D+H120D+R170I+G195E+K235L
30	n)	*36D+G97N+V104Y+H120D+R170L+A194P+G195E+K235L
	n’)	*36D+G97N+V104Y+H120D+R170l+A194P+G195E+K234L
	o)	S57P+R170L+Q206E

• ·

0’)	S57P+R170I+Q206E
P)	R170L+Q206E
P’)	R170I+Q206E
q)	Y167I+R170L+Q206E
q’)	Y167I+R170I+Q206E
r)	Y167F+R170L
r’)	Y167F+R170I
t)	Y167I+R170L+A194P
ť)	Y167I+R170I+A194P
u)	Y167I+R170L+N218S
u)	Y167I+R170I+N218S
v)	Y167I+R170L+A194P+N218S
V)	Y167I+R170I+A194P+N218S
X)	R170L+P131V
X')	R170I+P131V
y)	*36D+Y167l+R170L
y’)	*36D+Y167l+R170l
z)	Y167I+Y171I
aa)	Y167V+R170L
aa')	Y167V+R170I

Prací prostředky obsahující mutantní enzymy

Předkládaný vynález také zahrnuje použití mutantních enzymů podle vynálezu v čisticích a pracích prostředcích a prostředky, obsahující mutantní subtilizinové enzymy. Tyto čisticí a prací prostředky mohou být v principu v jakékoliv fyzikální formě, ale subtilázové varianty se s výhodou přidávají do tekutých pracích prostředků nebo do pracích prostředků ve formě tyčinek, tablet, kostek apod. pro přímé použití, kde mají zlepšenou enzymovou stabilitu.

Mezi prací prostředky podle předkládaného vynálezu patří především kapalné prací prostředky, které například mají homogenní • ·

- 30 fyzikální charakter, například mohou sestávat z micelárního roztoku povrchově aktivních látek ve spojité vodné fázi, tedy tzv. izotropní kapaliny.

Alternativně a s výhodou mohou obsahovat heterogenní fyzikální fázi a mohou být strukturovány, například mohou obsahovat disperzi lamelárních kapiček ve spojité vodné fázi, například mohou obsahovat deflokulační polymer s hydrofilní kostrou a alespoň jedním hydrofobním postranním řetězcem, jak se popisuje v EP-A-346 995 (Unilever), uváděném zde jako referenční. Uvedené druhé kapaliny jsou heterogenní a mohou obsahovat suspendované pevné částice, jako jsou částice builderů, jak se například uvádí dále.

S výhodou by měl kapalný čisticí a detergentní prostředek podle vynálezu mít vysokou koncentraci elektrolytu, jak se například popisuje v EP-A-328 177, EP-A-359 308, EP-A-328 176, EP-A-346 995 (všechny Unilever).

Takové prostředky obsahují navíc k jedné nebo více variantám subtilizinového enzymu podle předchozích hledisek vynálezu, samotných nebo v kombinaci, jakékoliv použitelné složky přidávané do těchto prostředků, které jsou odborníkům v oboru dobře známy.

Tyto složky zahrnují buildery, jako jsou fosfátové nebo zeolitové buildery, povrchově aktivní látky jako povrchově aktivní látky aniontového, kationtového, neiontového nebo zwitteriontového typu, polymery jako akrylové nebo ekvivalentní polymery, bělicí systémy, jako perboritany nebo prekurzory bělení nebo aktivátory s obsahem aminů, strukturovací látky, jako jsou křemičitanové strukturovací látky, alkalické látky nebo kyseliny pro nastavení pH, stabilizátory vlhkosti a/nebo neutrální anorganické soli.

Navíc jsou v prostředcích podle vynálezu normálně přítomny další případné složky, jako například:

A. Případné další pomocné povrchově aktivní látky ·

• ·

B. Builder na bázi kyseliny vinné nebo jantarové

C. Neutralizační systém

D. Prostředek pro zamezení usazování

E. Jiné enzymy

F. Případné jiné další složky

Hmotnostní poměr syntetické aniontové povrchově aktivní látky k neiontové povrchově aktivní látce je od 1 : 1 do 5 : 1. Prostředky mají pH v roztoku 10 % hmotnostních ve vodě při 20 °C pod 7,0 do 9,0, kritickou koncentraci micel méně než nebo rovnu 200 ppm io a mezipovrchové napětí vzduch/voda při kritické koncentraci micel méně než nebo rovné 32 x 10’⁵ N/cm při 35 °C v destilované vodě. Prostředky jsou s výhodou čiré, homogenní a fázově stabilní a mají velmi dobrou čisticí schopnost a stabilitu enzymu.

Různé složky:

1. Syntetická aniontová povrchově aktivní látka

Kapalné čisticí prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují od přibližně 10 % do přibližně 50 %, s výhodou od přibližně 15 % do přibližně 50 %, ještě výhodněji od přibližně 20 % do 40 % a nejvýhodněji od 20 % do přibližně 30 % hmotnostních přírodní nebo 20 syntetické aniontové povrchově aktivní látky. Vhodnými přírodními nebo syntetickými aniontovými povrchově aktivními látkami jsou například mýdla a povrchově aktivní látky, popisované v US-A-4 285 841 a v US-A-3 929 678.

Použitelné aniontové povrchově aktivní látky zahrnují ve vodě 25 rozpustné soli, zvláště alkalických kovů, amoniové a alkylolamoniové (např. monoethanolamoniové nebo triethanolamoniové) soli organických reakčních produktů kyseliny sírové, které mají ve své molekulární struktuře alkylovou skupinu obsahující od přibližně 10 do přibližně 20 atomů uhlíku a esterovou skupinu kyseliny sulfonové 30 nebo kyseliny sírové (termín „alkyl“ zahrnuje také alkylovou část arylových skupin). Příklady této skupiny syntetických povrchově * · • ·

- 32 aktivních látek jsou alkylsulfáty, zvláště sloučeniny získané sulfatací vyšších alkoholů (C₈ - C₁₈ atomů uhlíku) jako jsou alkoholy, vyráběné redukcí glyceridů lojového nebo kokosového oleje; a alkylbenzensulfonáty, ve kterých alkylová skupiny obsahuje od přibližně 9 do přibližně 15 atomů uhlíku s přímým nebo větveným řetězcem, například sloučeniny popsané v US patentech 2 220 099 a 2 477 383. Zvláště cenné jsou alkylbenzensulfonáty s přímým řetězcem, které mají průměrný počet atomů uhlíku v alkylové skupině od přibližně 11 do 14.

Další používané aniontové povrchově aktivní látky jsou ve vodě rozpustné soli: sulfonátů parafinů, obsahující od 8 do přibližně 24 (s výhodou přibližně 12 až 18) atomů uhlíku; alkylglycerylethersulfonáty, zvláště ethery C₈ až Ci₈ alkoholů (například odvozených z lojového a kokosového oleje); alkylfenolethylenoxidethersulfáty, obsahující od 1 do přibližně 4 jednotek ethylenoxidu na molekulu a od 8 do 12 atomů uhlíku v alkylové skupině; a alkylethylenoxidethersulfáty, obsahující 1 až 4 jednotky ethylenoxidu na molekulu a od 10 do 20 atomů uhlíku v alkylové skupině.

Další použitelné aniontové povrchově aktivní látky zahrnují ve vodě rozpustné soli esterů α-sulfonovaných mastných kyselin, obsahující ve skupině mastné kyseliny od 6 do 20 atomů uhlíku a ve skupině esterů od 1 do 10 atomů uhlíku; ve vodě rozpustné soli kyselin 2-acyloxy-alkan-1-sulfonových, obsahujících v acylové skupině od 2 do 9 atomů uhlíku a v alkanové skupině od 9 do 23 atomů uhlíku; ve vodě rozpustné soli olefinových sulfonátů obsahující od 12 do 24 atomů uhlíku; a β-alkoxyalkansulfonáty, obsahující od 1 do 3 atomů uhlíku v alkylové skupině a od 8 do 20 atomů uhlíku v alkanové skupině.

Výhodné aniontové povrchově aktivní látky jsou C₁₀ až Ci₈ alkylsulfáty a alkylethoxysulfáty, obsahující v průměru až do 4 • ·

- 33 jednotek ethylenoxidu na mol alkylsulfátu, Cn až C13 přímé alkylbenzensulfonáty, a jejich směsi.

2. Ethoxylovaná neiontová povrchově aktivní látka

Druhou popřípadě přítomnou složkou je od 2 % do 14 %, s výhodou od 2 % do 8 %, nejvýhodněji od 3 % do 5 % hmotnostních ethoxylované neiontové povrchově aktivní látky. Hmotnostní poměr syntetické aniontové povrchově aktivní látky (na bázi kyseliny) k neiontové povrchově aktivní látce je od 1 : 1 do 5 : 1, s výhodou od 2 : 1 do 5 : 1, nejvýhodněji od 3 : 1 do 4 : 1. Pro dosažení dobrého odstranění tukového/olejovitého znečištění je třeba zajistit vytvoření a adsorpci dostatečně tvrdých povrchově aktivních látek na rozhraní vzduch/voda.

Ethoxylovaná neiontová povrchově aktivní látka má vzorec R¹(0C2H₄)_n0H, kde Ri znamená Ci₀ až Ci₆ alkylovou skupinu nebo C₈ až C₁₂ alkylfenylovou skupinu, n je od 3 do 9 a uvedená neiontová povrchově aktivní látka má HLB (hydrofilně-lipofilní rovnováha) od 6 do 14, s výhodou od 10 do 13. Tyto povrchově aktivní látky se podrobněji popisují v US-A-4 285 841 a US-A-4 284 532. Zvláště výhodné jsou kondenzační produkty Ci₂ až C15 alkoholů s 3 až 8 mol ethylenoxidu na mol alkoholu, například Ci₂ až C13 alkohol, kondenzovaný s přibližně 6,5 mol ethylenoxidu na mol alkoholu. Mezi další neiontové povrchově aktivní látky, které je třeba uvést patří APG, EGE a glukamidové povrchově aktivní látky.

3. Deterqentní builder

Mezi obvyklé složky detergentů, které mohou být v obvyklých množstvích v pracích prostředcích podle vynálezu přítomny, jsou následující: sloučeniny mohou být složené nebo jednoduché a mohou být s nulovým obsahem fosforu. Prostředek tedy může obsahovat v agregátu například od 1 až 50 %, například alespoň přibližně 5 % a často až do přibližně 35 až 40 % hmotnostních jednoho nebo více organických a/nebo anorganických builderů. Typické příklady buiiderů • · • ·

- 34 zahrnují výše zmíněné buildery a obecněji ortho-, pyro- a tripolyfosfáty alkalického kovu, uhličitany alkalických kovů, buď samotné nebo ve směsi s kalcitem, citráty alkalického kovu, nitrilotriacetáty alkalického kovu, karboxymethyloxysukcináty, zeolity, polyacetalkarboxyláty apod.

Prostředky konkrétněji obsahují od 5 % do 20 %, s výhodou od 10 % do 15 % hmotnostních detergentního builderu, kterým může být mastná kyselina obsahující od 10 do 18 atomů uhlíku a/nebo polykarboxylát, zeolit, polyfosfonát a/nebo polyfosfátový builder. Výhodné je 0 až 10 % (výhodněji od 3 % do 10 %) hmotnostních nasycených mastných kyselin s 12 až 14 atomy uhlíku spolu s 0 až 10 %, výhodněji od 2 % do 8 % a nejvýhodněji od 2 do 5 % polykarboxylátového builderu, nejvýhodněji kyseliny citrónové, v hmotnostním poměru od 1 : 1 do 3 : 1.

Protože použité proteolytické enzymy se zdají mít optimální skladovací stabilitu ve srovnání s jinými enzymy, když builderová tvrdost k tvrdosti vody je v poměru blízkém 1, prostředky s výhodou obsahují dostatečné množství builderu pro sekvestraci tvrdosti vody (0,28 až 1,42, s výhodou 0,426 až 1,136) . 10‘³ mol/l Ca²⁺.

Vhodné nasycené mastné kyseliny je možno získat z přírodních zdrojů jako jsou rostlinné nebo živočišné estery (například palmojádrový olej, palmový olej a kokosový olej), nebo mohou být připraveny synteticky (například oxidací ropy nebo hydrogenací oxidu uhličitého Fischer-Tropschovou metodou). Příklady vhodných nasycených mastných kyselin použitelných v prostředcích podle vynálezu jsou kapronová, laurová, myristová, kokosová a palmojádrová mastná kyselina. Výhodné jsou nasycené kokosové mastné kyseliny; směsi kyseliny laurové a myristové v hmotnostním poměru od 5 : 1 do 1 : 1 (s výhodou přibližně 3 : 1); směsi výše uvedených sloučenin s malým množstvím (např. 1 až 30 % z celkové mastné kyseliny) kyseliny olejové; a palmojádrová mastná kyselina.

• · · · • · · « · • · · • · · ·

- 35 Zde popisované prostředky obsahují s výhodou také polykarboxylátové, polyfosfonátové a polyfosfátové buildery, popisované v US-A-4 284 532. V této skupině jsou výhodné ve vodě rozpustné polykarboxylátové buildery, zvláště citráty. Vhodnými polykarboxylátovými buildery jsou různé aminopolykarboxyláty, cykloalkanpolykarboxyláty, etherpolykarboxyláty, alkylpolykarboxyláty, epoxypolykarboxyláty, tetrahydrofuranpolykarboxyláty, benzenpolykarboaxyláty a polyacetalpolykarboaxyláty.

Příklady takových polykarboxylátových builderů jsou ethylendiamintetraacetát sodný a draselný; nitrilotriacetát sodný a draselný; ve vodě rozpustné soli kyseliny fytové, například fytáty sodný a draselný, popisované v US-A-1 739 942, polykarboxylátové materiály popisované v US-A-3 364 103; a ve vodě rozpustné soli polykarboxylátových polymerů a kopolymerů popsaných v US-A3 308 067.

Dalšími použitelnými detergentními buildery jsou ve vodě rozpustné soli polymerních alifatických polykarboxylových kyselin s následujícími strukturními a fyzikálními vlastnostmi: (a) minimální molekulová hmotnost přibližně 350, vypočteno vzhledem ke kyselé formě; (b) ekvivalentní hmotnost 50 až 80 vypočteno vzhledem ke kyselé formě; (c) alespoň 45 % molárních monomerního typu s alespoň dvěma karboxylovými radikály vzájemně oddělenými ne více než 2 atomy uhlíku; (d) místo připojení polymerního řetězce jakéhokoliv radikálu obsahujícího karboxyl je odděleno ne více než 3 atomy uhlíku podél polymerního řetězce od místa připojení dalšího radikálu obsahujícího karboxyl. Specifické příklady těchto builderů jsou polymery a kopolymery kyseliny itakonové, akonitové, maleinové, mezakonové, fumarové, methylenmalonové a citrakonové.

Další vhodné polykarboxylátové buildery zahrnují ve vodě rozpustné soli, zvláště soli sodné a draselné, kyseliny mellitové, citrónové, pyromellitové, benzenpentakarboxylové, oxydioctové,

-36 • ·· ·· • · · · · · • · · ·· • · · · · · · • · · · • · · · · · · karboxymethyloxyjantarové, karboxymethyloxymalonové, ciscyklohexanhexakarboxylové, cis-cyklopentantetrakarboxylové a oxydijantarové.

Další polykarboxyláty jsou karboxyláty polyacetalů popisované 5 v US-A-4 144 226 a US-A-4 146 495.

Dalšími detergentními buildery jsou zeolity, jako hlinitokřemičitanový iontoměničový materiál, popisovaný v US-A-4 405 483.

Dalšími výhodnými buildery jsou sloučeniny obecného vzorce Rio CH(COOH)CH₂(COOH), tj. deriváty kyseliny jantarové, kde R znamená C10 až C₂o alkyl nebo alkenyl, s výhodou Ci₂ až Ci₆, nebo kde R může být nahrazeno hydroxylovými, sulfo, sulfoxy nebo sulfonovými substituenty. Tyto sukcinátové buildery se s výhodou používají ve formě ve vodě rozpustných solí, včetně solí sodných, draselných 15 a alkanolamonných. Výhodnými příklady sukcinátových builderů jsou: laurylsukcinát, myristylsukcinát, palmitylsukcinát, 2-dodecenylsukcinát apod.

4. Proteolytický enzym

Enzymy podle vynálezu mohou být v pracích prostředcích 2o používány v dobře známých standardních množstvích. Tato množství mohou mít velmi široké rozmezí, například přibližně 0,0002 - 0,1, např. přibližně 0,005 až 0,05 Ansonových jednotek na gram pracího prostředku.

Vyjádřeno v alternativních jednotkách proteáza může být 25 v prostředcích přítomna v množství řádově od přibližně 0,1 až 100 GU/mg (například 1 až 50, zvláště 5 až 20 GU/mg) pracího prostředku nebo v množství v širokém rozmezí v okruhu přibližně 0,01 až 4, například 0,1 až 0,4 KNPU na gram pracího prostředku.

Může být například výhodné používat předkládané enzymy 3o v dávce přibližně 0,25 mg proteinu enzymu na litr prací lázně, což • ·

- 37 odpovídá aktivitě enzymu 0,8 KNPU na litr. Odpovídající prací prostředky mohou obsahovat enzymy v množství například řádově 0,1 až 0,4 KNPU/gram.

Jinak vyjádřeno, prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují od přibližně 0,01 % do přibližně 5 %, s výhodou od přibližně 0,1 % do přibližně 2 % hmotnostních proteolytických enzymů podle vynálezu.

Popisovaný proteolytický enzym je s výhodou přítomen v množství dostatečném pro poskytnutí aktivity od 0,05 do přibližně 1,0, výhodněji od přibližně 0,1 do 0,75, nejvýhodněji od přibližně 0,125 do přibližně 0,5 mg aktivního enzymu na gram prostředku.

5. Systém stabilizace enzymu

Kapalné prací prostředky podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat systém pro stabilizaci enzymu obsahující ionty vápníku, kyseliny borité, propylenglykolu a/nebo karboxylové kyseliny s krátkým řetězcem. Systém stabilizace enzymu tvoří od přibližně 0,5 % do přibližně 15 % hmotnostních prostředku.

Prostředek s výhodou obsahuje od přibližně 0,01 do přibližně 50, s výhodou od přibližně 0,1 do přibližně 30, nejvýhodněji od přibližně 1 do 20 mmol vápenatého iontu na litr. Množství vápenatého iontu by mělo být zvoleno tak, že pro enzym zůstává k dispozici vždy určité minimální množství i po vytvoření komplexů s buildery apod. v prostředku. Jako zdroj vápníkových iontů může být použita jakákoliv ve vodě rozpustná sůl vápníku včetně chloridu vápenatého, mravenčanu vápenatého a octanu vápenatého. Malé množství vápenatých iontů, obvykle od přibližně 0,05 do 0,4 mmol na litr je také často v prostředku přítomno díky vápníku obsaženému v enzymové kaši a použité vodě. Výhodné je množství od přibližně 0,03 % do přibližně 0,6 % mravenčanu vápenatého. Druhým výhodným stabilizátorem enzymu jsou polyoly obsahující pouze uhlík, vodík a kyslík. Obsahují s výhodou od 2 až 6 atomů uhlíku a od 2 do 6

- 38 hydroxylových skupin. Mezi příklady patří polyethylenglykol (zvláště 1,2-propandiol, který je preferován), ethylenglykol, glycerol, sorbitol, mannitol a glukóza. Polyol obvykle tvoří od přibližně 0,5 % do 15 %, s výhodou od 1,5 do přibližně 8 % hmotnostních prostředku.

Hmotnostní poměr polyolu k jakékoliv přidané kyselině borité je s výhodou alespoň 1, výhodněji alespoň 1,3.

Prostředky také s výhodou obsahují ve vodě rozpustné karboxyláty s krátkým řetězcem, popisované v US-A-4 318 818. Výhodné jsou mravenčany, které mohou být použity v množstvích od io přibližně 0,05 % do přibližně 5 %, s výhodou od přibližně 0,2 % do přibližně 2 %, nejvýhodněji od 0,4 % do 1,5 % hmotnostních prostředku. Výhodný je mravenčan sodný.

Prostředky podle vynálezu také popřípadě obsahují od přibližně

0,25 % do přibližně 5 %, nejvýhodněji od přibližně 0,5 % do přibližně 15 3 % hmotnostních kyseliny borité. Kyselina boritá může být, ale s výhodou není tvořena sloučeninou schopnou kyselinu boritou v prostředku vytvářet. Kyselina boritá je výhodná, ačkoliv vhodné jsou také další sloučeniny, jako je oxid boritý, borax a jiné boritany alkalických kovů (např. ortho-, meta- a pyroboritany, například 2o pentaboritan sodný). [Namísto kyseliny borité mohou být také použity substituované kyseliny borité (např. kyselina fenylboritá, butanboritá a p-bromofenylboritá).]

6. Voda

Kapalné prací prostředky podle předkládaného vynálezu mohou 25 být vodné nebo nevodné kapaliny. Pokud jsou kapaliny vodné, obsahují od přibližně 15 % do přibližně 60 %, s výhodou od přibližně 25 % do přibližně 45 % hmotnostních vody.

- 39 Případné další složky

A. Případné další pomocné povrchově aktivní látky

Případné další pomocné povrchově aktivní látky pro použití s výše uvedenými ethoxylovanými neiontovými povrchově aktivními 5 látkami zahrnují amidy vzorce

O R²

II I

R¹ - C - N - R³ kde R¹ znamená alkylový, hydroxyalkylový nebo alkenylový 10 radikál s 8 až 20 atomy uhlíku a R² a R³ se volí ze skupiny atom vodíku, methyl, ethyl, propyl, izopropyl, 2-hydroxyethyl, 2hydroxypropyl, 3-hydroxypropyl, a uvedené radikály navíc obsahují až 5 ethylenoxidových jednotek za předpokladu, že alespoň jeden radikál R² a R³ obsahuje hydroxylovou skupinu.

Výhodnými amidy jsou C₈ až C₂o alkylolamidy mastných kyselin, ve kterých každá alkylolová skupina obsahuje od 1 do 3 atomů uhlíku a navíc může obsahovat až dvě jednotky ethylenoxidu. Zvláště výhodné jsou monoethanol- a diethanolamidy 0_Ί2 až C₁₆ mastných kyselin.

2o Pokud jsou přítomny, amidy jsou s výhodou v takovém množství, že výše uvedená ethoxyfovaná neiontové povrchově aktivní látka a amidová povrchově aktivní látka jsou v hmotnostním poměru od 4 : 1 do 1 : 4, s výhodou od 3 : 1 do 1 : 3.

Výhodné případné další pomocné povrchově aktivní látky, 25 používané v množství od 0,15 % do 1 %, jsou aminoxidové povrchově aktivní látky, aminové povrchově aktivní látky a povrchově aktivní látky na bázi kvarterních aminů, popisované v US-A-4 507 219.

Z výše uvedených látek jsou výhodné C10 až Ci₄ alkyltrimethylamoniové soli, například decyltrimethylamonium·· • · • · ··· ·* *· •· •· • ·· ·· ·· ··

9 9· •· ·· • 999 99

99

9999

- 40 methylsulfát, lauryltrimethylamoniumchlorid, myristiltrimethylamoniumbromid a kokosový trimethylamoniumchlorid a methylsulfát. Výhodné je od 0,2 % do 0,8 % monoalkyltrimethylamoniumchloridu.

B. Vínan - iantaranovy builder

Prostředky podle vynálezu s výhodou obsahují od 0 do přibližně 10 %, s výhodou od 0 do přibližně 6 % hmotnostních, vztaženo na základ kyseliny, vínan - jantaranového buiideru (tartrate succinate builder), zvoleného ze skupiny:

i) I	HOCH - I I	CH - I	0 -	CH -CH2
I coox	I I COOX COOX	I coox
kde X je kationt tvořící sůl;
ii)	CH2- CH - I I	0 - I	CH - I	CH -0 - CH - I
I coox	I I coox coox	I coox	I coox	I coox

kde X je kationt tvořící sůl; a iii) jejich směsí

Vínan - jantaranové sloučeniny používané v předkládaném vynálezu se popisují v US-A-4 663 071.

C. Neutralizační systém

Předkládané prostředky mohou také případně obsahovat od přibližně 0 do přibližně 0,04 mol, s výhodou od přibližně 0,01 do 0,035 mol, výhodněji od přibližně 0,015 do přibližně 0,03 mol/100 g prostředku alkanolaminu zvoleného ze skupiny monoethanolamin, diethanolamin, triethanolamin a jejich směsí. Malé množství alkanolaminú, zvláště monoethanolaminu, jsou výhodná pro zvýšení stability produktu, prací schopnosti a vůně. Množství alkanolaminu ·«· · · · · * · ··· • * · · o ····· • ··<»·· · · · · · · ·· • ·«>«· · ·· ··· ♦ · · · ··· · · · ·

-41 však by mělo být minimalizováno pro nejlepší kompatibilitu s bělícími látkami na bázi chlóru.

Prostředky podle vynálezu obsahují navíc sodné ionty a s výhodou draselné ionty v dostatečném množství pro neutralizaci 5 aniontových látek a dosažení požadovaného pH produktu.

D. Látky potlačující pěnivost

Další složkou případně použitelnou v kapalných detergentech podle vynálezu je od 0 do přibližně 1,5 %, s výhodou od přibližně 0,5 % do přibližně 1,0 % hmotnostních látek potlačujících pěnění na bázi io silikonů.

Silikony jsou dobře známy a používají se jako vysoce účinné prostředky pro řízení pěnivosti. Odpěňovacími prostředky a způsoby odpěňování vodných roztoků přídavkem malých množství polydimethylsiloxanových kapalin se zabývá například US-A-3 455 15 839.

Použitelnými silikony pro řízení pěnivosti jsou směsi silikonu a silanovaného oxidu křemičitého, jak se například popisuje v německé patentové přihlášce DE-A-2 124 526.

Silikonová odpěňovadla a látky řídící pěnivost se úspěšně 2o přidávají do granulárních pracích prostředků tak, že se chrání před povrchově aktivními látkami obsaženými v detergentu, jako v US patentech 3 933 672 a 4 652 392.

Výhodný prostředek pro potlačení pěnivosti na bázi silikonu pro použití v předkládaném vynálezu je množství prostředku řídícího 25 pěnivost dostačující k požadovanému potlačení pěnivosti, které sestává z:

(i) kapalného polydimethylsiloxanu s viskozitou 20 χ 10⁶ až přibližně 1500 x W⁶ m²s‘¹ (20 cs. - 1500 cs.) při 25 °C;

(ii) od přibližně 5 do přibližně 50 dílů na 100 dílů hmotnostních

3o látky (i) siloxanové pryskyřice složené z jednotek (CH₃)₃SiOi/₂ a

-42SiO₂ v poměru (CH₃)₃ SiO_1/2 k SiO₂ přibližně 0,6 : 1 až přibližně 1,2 : 1; a (iii) od přibližně 1 do přibližně 20 dílů na 100 dílů hmotnostních látky (i) pevného silikagelu.

Termín „množství dostačující k potlačení pěnivosti“ znamená, že osoba vytvářející prostředek může zvolit množství tohoto prostředku řídícího pěnivost tak, aby bylo dosaženo potlačení pěnivosti v požadované míře. Množství prostředku pro řízení pěnivosti bude záviset na zvolené povrchově aktivní látce v pracím prostředku.

io Například pokud se použije povrchově aktivních látek s vysokou pěnivosti, pro dosažení požadovaného stupně pěnivosti se použije relativně větší množství prostředku pro řízení pěnivosti než v případě povrchově aktivní látky s nízkou pěnivosti.

E. Další enzymy

Prací prostředek podle vynálezu může také obsahovat další enzymy.

Mohou být například s úspěchem přidány lipázy ve formě granulárního prostředku nebo alternativně roztoku nebo kaše lipolytického enzymu ve směsi s nosným materiálem (například jako 2o v EP-A-258 068 (Novo Nordisk A/S)).

Množství přidané lipázy je možno zvolit v širokých mezích, například 50 až 30 000 LU/g na gram povrchově aktivního systému nebo pracího prostředku, například alespoň 100 LU/g, velmi výhodně alespoň 500 LU/g, někdy však výhodněji více než 1000, více než 2000 25 nebo více než 4000 LU/g nebo více, tedy často v rozmezí 50 až 4000 LU/g, například v rozmezí 200 až 1000 LU/g. V této specifikaci jsou lipázové jednotky definovány stejným způsobem jako v EP-A-258 068.

Lipolytický enzym je možno zvolit z široké škály lipáz. Vhodné jsou zvláště lipázy popisované například v následujících patentech: 3o EP-A-214 761 (Novo Nordisk A/S), EP-A-258 068 a zvláště lipázy

-43 9 · · «· · ··* * • · · · · ··· · ♦ · · ··· 9 9 · O · · · • ··· 9 · 9 · · ····· _M ··*· · · · • · · ·· 9 9 9 9 9 9 O9 9 vykazující imunologickou křížovou reaktivitu s antiséry proti lipáze Thermomyces lanuginosus ATCC 22070, EP-A-205 208 a EP-A-206 390 a zvláště lipázy s imunologickou křížovou reaktivitou s antiséry proti lipáze Chromobacter viscosum var lipolyticum NRRL B-3673, 5 nebo proti lipáze Alcaligenes PL-679, ATCC 31371 a FERM-P 3783, a také lipázy popisované v WO 87/00859 (Gist-Brocades) a EP-A-204 284 (Sapporo Breweries). Vhodné jsou zvláště následující komerčně dostupné lipázové preparáty: Lipolase® Novo Nordisk A/S, Amano lipases CE, P, B, SP, M-AP, AML a CES a Meito lipases MY-30, OF a io PL, a také Esterase® MM, Lipozym, SP225, SP285 (všechny Novo

Nordisk), Saiken lipase, Enzeco lipase, Toyo Jozo lipase a Diosynth lipase (obchodní známky) , Lumafast® (Genecor lne.), Lipomax® (Gist-Brocades N. V.), a lipázy jak se popisují v WO-A-94/03578 (Unilever).

Amyláza může být například použita v případě potřeby v množství v rozmezí od přibližně 1 do přibližně 100 MU (maltózové jednotky) na gram pracího prostředku (nebo 0,014 až 1,4, například 0,07 až 0,7 KNU/g (jednotky Novo)). Vhodné amylázy jsou např Termamyl® a BAN (Novo Nordisk A/S). V případě potřeby mohou být 2o například použity celulázy v množství v rozmezí od přibližně 0,3 do přibližně 35 jednotek CÉVU na gram pracího prostředku. Vhodnými celulázami jsou například Celluzyme® a Carezyme® (Novo Nordisk A/S).

Další enzymy, které je možno v předkládaném vynálezu použít 25 jsou oxidázy a peroxidázy.

F. Další případně použitelné složky

Další složky, které je možno případně použít v kapalných pracích prostředcích zahrnují prostředky pro odstranění nečistoty, polymery pro uvolnění nečistoty, prostředky proti opětnému ukládání 30 nečistot jako je tetraethylenpentaminethoxylát (od přibližně 0,5 % do 3 %, s výhodou od přibližně 1 % do přibližně 3 % hmotnostních), látky

-44 řídící pěnivost, látky upravující obsah vody jako je kumensulfonát sodný, zakalovací látky, antioxidanty, baktericidní látky, barviva, parfémy a opticky zjasňující látky známé v oboru. Takové případně přidávané složky obvykle tvoří méně než přibližně 15 %, s výhodou od 5 přibližně 0,5 % do 10 %, výhodněji od přibližně 1 % do přibližně 10 % hmotnostních prostředku.

Prostředky mohou obsahovat od 0 % do přibližně 8 %, s výhodou od 0 % do přibližně 5 % hmotnostních kyseliny C12 až C₁₄ alkenyljantarové nebo její soli. Tyto materiály mají obecný vzorec R10 CH(COOX)CH₂(COOX), kde R znamená C₁₂ až C_u alkenylovou skupinu a X znamená atom vodíku nebo vhodný kationt, jako je sodík, draslík, amonium nebo alkanolamonium (například mono-, di- nebo triethanolamonium). Konkrétními příklady jsou 2-dodecenylsukcinát (výhodná sloučenina) a 2-tetradecenylsukcinát.

Prostředky podle vynálezu dále popřípadě obsahují od přibližně

0,1 % do přibližně 1 %, s výhodou od přibližně 0,2 % do přibližně 0,6 % hmotnostních ve vodě rozpustných solí kyseliny ethylendiamintetramethylenfosfonové, diethylentriaminpentamethylenfosfonové, ethylendiamintetraoctové (výhodná sloučenina) nebo diethylentriaminpentaoctové (nejvýhodnější sloučenina) pro zvýšení prací schopnosti při předpírání tkanin.

Prací prostředky mohou dále obsahovat od 1 do 35 % bělícího prostředku nebo prekurzoru bělení nebo systém obsahující bělicí prostředek a/nebo prekurzor s jeho aktivátorem.

Další případné složky jsou látky upravující mydlivost, protikorozní látky, látky suspendující nečistoty, sekvestrační prostředky, prostředky proti znovuukládání nečistot (antiredepoziční látky) apod.

Popisované prostředky s výhodou obsahují až do přibližně 10 % 30 ethanolu.

- 45 • · · · · · · · « · • · · 0 · · · · · · · · • · · · · · · · ··· ·* ·· ·«« a· ··

G. Jiné vlastnosti

Prostředky podle vynálezu mají obvykle pH v roztoku s koncentrací 10 % hmotnostních ve vodě při teplotě 20 °C od přibližně 7,0 do 9,0, s výhodou od přibližně 8,0 do přibližně 8,5.

Prostředky podle vynálezu mohou také mít kritickou koncentraci micel (CMC) menší nebo rovnu 200 ppm a mezipovrchové napětí vzduch/voda nad CMC menší nebo rovno 32 x 10'⁵, s výhodou menší nebo rovno přibližně 30 x 10'⁵ N/cm při 35 °C v destilované vodě. Tato měření se popisují v publikaci „Measurement of Interfacial io Tension and Surface Tension - Generál Review for Practical Man“ C.

Weser, GIT Fachzeitschrift fůr das Laboratorium, 24 (1980) 642 - 648 a 734 - 742, FIT Verlag Ernst Giebeler, Darmstadt, a „Interfacial Phenomena - Equilibrium and Dynamifc Effects“, C. A. Miller a P. Neogi, kapitola 1, str. 29 - 36 (1985), Marcel Dekker, lne. New York.

Prostředky podle vynálezu mohou být použity pro praní textilu, zvláště bez omezení bavlněných a polyesterových tkanin a jejich směsí. Zvláště vhodné jsou například prací procesy prováděné při teplotách přibližně 60 až 65 °C nebo nižších, například přibližně 30 až 35 °C nebo méně. Může být velmi vhodné používat prostředky

2o v takovém množství, aby bylo v prací lázni přítomno přibližně například 0,4 až 0,8 g/l povrchově aktivní látky, ačkoliv je v případě potřeby samozřejmě možné používat nižších nebo vyšších koncentrací. Bez omezení je možno uvést, že pro podobné složení pracích prostředků jako v příkladech je vhodné používat od přibližně 1 až 10 g/l, například od přibližně 3 - 6 g/l pracího prostředku.

V tomto hledisku se vynález zvláště týká:

a) Pracího prostředku sestaveného jako vodný kapalný prací prostředek s obsahem aniontové povrchově aktivní látky, neiontové povrchově aktivní látky, stabilizátoru vlhkosti, organické kyseliny a žíravé alkálie s pH nastaveným na hodnotu mezi 9 a 10.

- 46 • ·· ·· · »9 * · ♦·♦ ♦ · ··· « ·« · • · ·· * · * · · »··· • · · » · · · • · · ·· 9 9 ·«· B ·

b) Pracího prostředku sestaveného jako nevodný kapalný prací prostředek obsahující kapalnou neiontovou povrchově aktivní látku sestávající v podstatě z lineárního alkoxylovaného primárního alkoholu, triacetinu, trifosforečnanu sodného, žíravé alkálie, prekurzoru bělení monohydrátu perboritanu a aktivátoru bělení terciárního aminu s hodnotou pH nastavenou mezi přibližně 9 a 10.

c) Enzymatického kapalného pracího prostředku sestaveného pro poskytnutí prací lázně s hodnotou pH 9 nebo méně při použití koncentrace odpovídající 0,4 až 0,8 g/l povrchově aktivní látky.

d) Enzymatického kapalného pracího prostředku sestaveného pro poskytnutí prací lázně s hodnotou pH 8,5 nebo více při použití koncentrace odpovídající 0,5 až 0,8 g/l povrchově aktivní látky.

e) Enzymatický kapalný prací prostředek sestavený pro poskytnutí prací lázně s iontovou sílou 0,03 nebo méně, například 0,02 nebo méně, při použití koncentrace odpovídající 0,4 až 0,8 g/l povrchově aktivní látky.

f) Enzymatický kapalný prací prostředek sestavený pro poskytnutí iontové síly prací lázně 0,01 nebo více, například 0,02 nebo více, při použití v koncentraci odpovídající 0,4 až 0,8 g/l povrchově aktivní látky.

Bylo zjištěno, že subtilázové varianty podle předkládaného vynálezu mohou být také přidávány do pracích prostředků ve formě kostek, tablet, tyčinek apod. pro přímé nanášení na tkaniny, tvrdé povrchy nebo jakékoliv jiné povrchy. Mohou být zvláště přidávány do mýdlových nebo mýdlo/syntetických prostředků ve formě kostek, kde mají pozoruhodnou enzymovou stabilitu.

Prací prostředky ve formě kostek, tablet, tyčinek apod., pro přímé nanášení se například popisují v jihoafrickém patentu 93/7274, který se zde uvádí jako referenční. Výhodné kostky podle tohoto vynálezu tedy obsahují navíc k variantám subtilázy:

• ·· ·· Λ · · 4 · ··· 4 · · · · * 4 4« • · · 9 9 « 9 99 9

V · 9 · · 4 9 9 9 9 9 9 9· « « · 9 · · ··

4·· 9 9 9 9 99 9 · » 9 9

i) 25 až 80 %, nejvýhodněji 25 až 70 % hmotnostních aktivního detergentního prostředku, kterým je mýdlo nebo směs mýdla a syntetického detergentně účinného prostředku, počítáno na bezvodé složky;

ii) 0 až 50 % a nejvýhodněji 10 až 30 % hmotnostních vody;

iii) 0 až 35 % a nejvýhodněji 0,1 až 30 % hmotnostních plnidla.

Obecně je množství subtilázové varianty přidávané k těmto prostředkům podle vynálezu takové, že odpovídá proteolytické aktivitě 0,1 až 100 GU/mg vztaženo na prostředek, s výhodou 0,5 až io 20 GU/mg, nejvýhodněji 1,0 až 10 GU/mg, kde GU/mg znamená glycinovou jednotku na miligram.

Způsoby vytváření mutací subtilázovych genů

V oboru je známo mnoho metod zavádění mutací do genů. Po krátké diskusi týkající se klonování subtilázových genů budou 15 probírány způsoby vytváření mutací jak v náhodných tak i specifických místech subtilázového genu.

Klonování subtilázového genu

Gen kódující subtilázu může být klonován z jakéhokoliv organismu uvedeného v tabulce I, zvláště grampozitivní bakterie 2o nebo houby, různými v oboru známými způsoby. Nejprve musí být s použitím chromozomální DNA nebo mRNA organismu, který produkuje studovanou subtilázu, vytvořena genomická a/nebo cDNA knihovna. Potom, pokud je známa sekvence aminokyselin subtilázy, mohou být syntetizovány homologní značené oligonukleotidové sondy 25 a použity pro identifikaci klonů z genomické knihovny bakteriální DNA nebo z knihovny cDNA, které kódují subtilizin. Alternativně mohou být jako sondy pro identifikaci subtilázu kódujících klonů použity značené oligonukleotidové sondy obsahující sekvence homologní vzhledem k subtiláze z jiného kmene bakterie nebo organismu s použitím 3o hybridizace s méně přísnými podmínkami odmývání.

• ·· 4» · · 4··

4·· 4 · 4 · 4 4 ··4

-48 4 444 4*4 44 ··· 44 · 4 · ·*44

44* *4 ·· 4·4 4*4·

Další způsob identifikace klonů produkujících subtilázu by zahrnoval vložení fragmentů genomové DNA do expresního vektoru jako je plazmid, transformaci bakterie nevytvářející proteázu výslednou knihovnou genomové DNA a následné vysetí transformovaných bakterií na agar se substrátem pro subtilázu, jako je odstředěné mléko. Bakterie obsahující plazmid nesoucí subtilázu budou tvořit kolonie, které mají v okolí halo čirého agaru, vytvořené štěpením odstředěného mléka vyloučenou subtilázou.

Vytváření náhodných mutací subtilázového genu

Jakmile byl subtilázový gen klonován do vhodného vektoru jako je plazmid, je možno pro zavedení náhodných mutací do genu použít několika metod.

Jedním způsobem by bylo zavedení klonovaného subtilázového genu jako části znovu vyštěpitelného vektoru do mutátorového kmene Escherichia coli.

Další způsob by zahrnoval teplotní hybridizaci jednořetězcové formy subtilázového genu a potom vazbu fragmentu DNA obsahujícího subtilázový gen s jiným fragmentem DNA tak, aby část subtilázového genu zůstala jednořetězcové. Tato diskrétní jednořetězcové oblast by pak mohla být vystavena jakémukoliv z velkého počtu mutagenů, včetně bez omezení hydrogensiřičitanu sodného, hydroxylaminu, kyseliny dusité, kyseliny mravenčí nebo hydralazinu. Specifický příklad tohoto způsobu vytváření náhodných mutací se popisuje u autorů: Shortle a Nathans (1978, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 75 2170 - 2174). Podle způsobu uvedených autorů by byl plazmid nesoucí subtilázový gen štěpen restrikčním enzymem, který štěpí uvnitř tohoto genu. Toto rozštěpení by bylo rozšířeno s použitím působení exonukleázy DNA polymeráza I. Výsledný jednořetězcový úsek by potom byl vystaven mutagenezi s použitím některého z výše uvedených mutagenů.

- 49 • · · ·· · · ·· · ··· « · · · 4 · 4 44 ♦ · · «. · 4 ·4 4 · * ··· 4 4 · · Λ 444 44

4 · 4 444«

444 4 4 «4 444 ·Λ 444

Alternativně by mohl být klonován subtilizinový gen z bakterie rodu Bacillus spolu s přirozeným promotorem a jinými řídícími sekvencemi do plazmidového vektoru obsahujícího replikony jak pro E. coli, tak i B. subtilis, selektovatelný fenotypový markér a počátek M13 replikace pro produkci jednořetězcové plazmidové DNA po superinfekci pomocným fágem IR1. Jednořetězcové plazmidová DNA s obsahem klonovaného subtilizinového genu je izolována a teplotně hybridizována s fragmentem DNA obsahujícím vektorové sekvence, ale ne kódovací oblast subtilizinu, čímž vznikne duplexní molekula s mezerami. Do subtilizinového genu se pak zavádějí mutace hydrogensiřičitanem sodným, kyselinou dusitou nebo kyselinou mravenčí nebo replikací v mutátorovém kmenu E. coli jak bylo popsáno výše. Protože hydrogensiřičitan sodný reaguje výlučně s cytozinem v jednořetězcové DNA, tímto mutagenem vytvořené mutace jsou omezeny pouze na kódovací oblasti. Doba působení a koncentrace hydrogensiřičitanu se mění v různých experimentech tak, že se v průměru vytvoří od 1 do 5 mutací na gen subtilizinu. Inkubace 10 pg duplexní DNA s jednořetězcovými úseky ve 4 M hydrogensiřičitanu sodném 9 min při pH 6,0 a teplotě 37 °C v reakčním objemu 400 μΙ deaminuje přibližně 1 % cytozinů jednořetězcového úseku. Kódovací oblast maturního subtilizinu obsahuje přibližně 200 cytozinů v závislosti na řetězci DNA.. Reakční doba se s výhodou pohybuje kolem 4 minut (pro vytvoření četnosti mutace přibližně jedna ze 200) až do 20 min (přibližně 5 ze 200).

Po mutagenezi jsou molekuly s jednořetězcovými úseky vystaveny in vitro působení DNA polymerázy I (Klenowův fragment) pro doplnění molekul na dvojřetězcové a fixaci mutací. Potom se mutovanou DNA transformují kompetentní buňky E. coli pro vytvoření amplifikované knihovny mutantních subtilizinů. Amplifikované knihovny mutantů mohou být také vytvořeny pěstováním plazmidové DNA v kmenu Mut D E. coli, ve kterém dochází ke zvyšování rozsahu mutací v důsledku jeho DNA polymerázy náchylné k chybám.

- 50 • ··« »* « * · · · · · · • · · · · ··· «·· · · <· · ·· « * *»

Pro vytvoření knihoven mutantů mohou být také použity jako mutageny kyselina dusitá a kyselina mravenčí. Protože tyto látky nejsou jako hydrogensiřičitan sodný specifické pro jednořetězcovou DNA, mutagenní reakce se provádějí následujícím způsobem. Kódující část subtilizinového genu se standardními metodami klonuje do fága M13 a připraví se jednořetězcová fágová DNA. Jednořetězcová DNA potom reaguje s 1 M kyselinou dusitou 15 až 60 min při teplotě 23 °C a pH 4,3 nebo 2,4 M kyselinou mravenčí 1 až 5 min při 23 °C. Rozmezí reakčních dob způsobí četnost mutací od 1 z 1000 do 5 z 1000. Po mutagenezi se připojí k DNA M13 univerzální primer a s použitím mutagenizované jednořetězcové DNA jako templátu se vytvoří duplexní DNA tak, že kódovací část subtilizinového genu se stane úplně dvouřetězcovou. V tomto místě může být vyštěpena kódovací oblast z vektoru M13 restrikčními enzymy a ligována do nemutagenizovaného expresního vektoru tak, že se mutace vyskytují pouze v restrikčním fragmentu (Myers a další, Science 229 242 - 257 (1985)).

Vytváření místně specifických mutací subtilázověho genu

Jakmile byl subtilázový gen klonován a identifikována požadovaná místa pro mutace a bylo rozhodnuto, kterými zbytky se nahradí původní aminokyseliny, je možno zavést tyto mutace s použitím syntetických nukleotidů. Tyto oligonukleotidy obsahují nukleotidové sekvence obklopující požadovaná místa mutace; mutantní nukleotidy se vkládají v průběhu syntézy oligonukleotidu. Ve výhodné metodě se vytvoří ve vektoru nesoucím subtilázový gen jednořetězcový úsek DNA přemosťující subtilázový gen. Potom se naváže na homologní část jednořetězcové DNA syntetický nukleotid nesoucí požadovanou mutaci. Zbývající mezera se potom vyplní DNA polymerázou I (Klenowův fragment) a konstrukt se liguje s použitím T4 ligázy. Konkrétní příklad tohoto postupu se popisuje u autorů: Morinaga a další, (1984, Biotechnology 2 646 - 639). Podle uvedených • · ··· · · · · · V · ·· • · · * · · · ·· · • ··· » 9 · · · ··· ·· • *«·· · ·· «·· ·· «· ··» * · ··

- 51 autorů se fragment uvnitř genu odstraní pomocí restrikční endonukleázy. Vektor/gen nyní nesoucí mezeru se potom denaturuje a hybridizuje k vektoru/genu, který neobsahuje mezeru, ale byl štěpen jinou restrikční endonukleázou na místě vně oblasti, kterou zaujímá mezera. Jednořetězcová oblast genu je potom přístupná hybridizaci mutovanými oligonukleotidy, zbývající mezera se vyplní Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I, vložené úseky se ligují T4 DNA ligázou a po jednom cyklu replikace se vytvoří dvouřetězcový plazmid nesoucí požadovanou mutaci. Z metody Morinagy dále vyplývají dodatečné manipulace s tvorbou nových restrikčních míst a tím umožnění vytváření mutací ve více místech. Oligonukleotidy nesoucí vícečetné mutace je možno zavádět podle US patentu číslo 34,606 autorů Estell a další, z 10. 5. 1994, provedením menších změn v kazetě, avšak metodou podle Morinagy je možno zavést ještě větší škálu mutací najednou, protože je možno zavést větší množství oligonukleotidů různých délek.

Exprese subtilázovych mutantů

Podle vynálezu může být mutovaný subtilázový gen vyprodukovaný výše popisovanými způsoby nebo alternativními v oboru známými způsoby exprimován ve formě enzymu s použitím expresního vektoru. Expresní vektor obvykle spadá do definice klonovacího vektoru, protože expresní vektor obvykle zahrnuje složky typického klonovacího vektoru, totiž prvek, který dovolí autonomní replikaci vektoru v mikroorganismu nezávisle na jeho genomu a jeden nebo více fenotypových markérů pro účely selekce. Expresní vektor obsahuje kontrolní sekvence kódující promotor, operátor, vazebné místo pro ribozomy, signál iniciace translace a případně represorový gen nebo různé aktivátorové geny. Pro umožnění sekrece exprimovaného proteinu mohou být vloženy před kódovací sekvenci genu nukleotidy kódující „signální sekvenci“. Pro expresi za řízení řídících sekvencí musí být cílový gen upravovaný podle vynálezu

- 52 • ··· · · · · · ··· · ♦ • ···» · · · ·· ··· ·· 0· operativně připojen k řídícím sekvencím ve správném čtecím rámci. Promotorové sekvence, které mohou být přidány do plazmidových vektorů a které mohou podporovat transkripci mutantního subtilázového genu, zahrnují bez omezení prokaryotický βlaktamázový promotor (Villa-Kamaroff a další (1978) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75 3727 - 3731) a tac promotor (DeBoer a další (1983) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80 21 - 25). Další prameny je možno nalézt v publikaci „Useful proteins from recombinant bacteria“ v Scientific Američan (1980) 242 74 - 94.

Podle jednoho provedení je B. subtilis transformován expresním vektorem nesoucím mutovanou DNA. Jestliže má docházet k expresi v sekretujícím mikroorganismu jako je B. subtilis, po signálu iniciace translace a před exprimovanou sekvencí DNA může být vložena signální sekvence. Signální sekvence umožní transport expresního produktu do buněčné stěny, kde se při sekreci z produktu odštěpí. Termín „řídící sekvence“ jak je definován výše má zahrnovat i signální sekvenci, pokud je přítomna.

Pro expresi a výrobu proteázových variant podle vynálezu je také možno použít jiných hostitelských systémů známých odborníkům v oboru. Mezi tyto hostitelské systémy patří houby včetně vláknitých hub, rostliny, ptačí a savčí buňky i další organismy.

Materiály a metody

Bakteriální kmeny:

B. subtilis 309 a 147 jsou varianty Baciílus lentus, uložené u NCIB pod depozitními čísly NCIB 10309 a 10147 a popisované v USA-3 723 250, který se zde uvádí jako referenční.

E. coli MC 1000 (M. J. Casadaban a S. N. Cohen (1980); J. Mol. Biol. 138 179 - 207) byl běžnými způsoby připraven jako r*, m⁺ a rovněž se popisuje v US patentové přihlášce No. 039,298.

Proteolytická aktivita

V rámci tohoto vynálezu je proteolytická aktivita vyjádřena v jednotkách Kilo NOVO Protease Units (KNPU). Aktivita se stanovuje vzhledem k enzymovému standardu (SAVINASE®) a stanovení je založeno na štěpení roztoku dimethylkaseinu (DMC) proteolytickým enzymem za standardních podmínek, tj. 50 °C, pH 8,3, reakční doba 9 min, doba měření 3 min. Na požádání je k dispozici u firmy Novo Nordisk A/S, Dánsko složka AF 220/1, která se zde uvádí jako referenční.

GU je glycinová jednotka, která je definována jako aktivita proteolytického enzymu, která za standardních podmínek v průběhu 15 minutové inkubace při 40 °C s N-acetylkaseinem jako substrátem vytvoří množství skupiny NH₂, ekvivalentní 1 pmol glycinu.

Enzymová aktivita může také být měřena s použitím testu PNA reakcí s rozpustným substrátem sukcinyl-alanin-alanin-prolin-fenylalanin-para-nitrofenol, popisovaným v Journal of Američan Oil Chemists Society, Rothgeb, T. M., Goodlander, B. D., Garrison, P. H. a Smith, L. A. (1988).

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje uspořádání některých subtiláz uvedených v tabulce I;

Obr. 2 je trojrozměrný obraz uspořádání subtilizinu 309, který ukazuje umístění hydrofobní domény a některých zbytků aminokyselin v její blízkosti, které mají být substituovány podle vynálezu.

- 54 Příklady provedení vynálezu

Pro vytvoření variant enzymu podle vynálezu se používá stejných materiálů a metod jako například v WO-A-89/06279 (Novo Nordisk A/S), EP-A-130 756 (Genentech), EP-A-479 870 (Novo 5 Nordisk A/S), EP-A-214 435 (Henkel), WO-A-87/04461 (Amgen), WOA-87/05050 (Genex), EP přihláška No. 87303761 (Genentech), EP-A260 105 (Genencor), WO-A-88/06624 (Gist-Brocades NV), WO-A88/07578 (Genentech), WO-A-88/08028 (Genex), WO-A-88/08033 (Amgen), WO-A-88/08164 (Genex), Thomas a další (1985, Nátuře, io 318 375 - 376; Thomas a další (1987) J. Mol. Biol. 193, 803 - 813;

Russel a Fersht (1987) Nátuře 328 496 - 500. Je také možno použít jiných v oboru dobře známých metod.

Příklad 1

Konstrukce a exprese variant enzymů:

Byl zkonstruován vektor vhodný pro kódování syntetického genu pro subtilázu 309 a její mutanty. Jde v podstatě o plazmid pUC19 (Yanish-Perron a Messing (1985) Gene; 33 103 - 119), ve kterém byl větší počet klonovacích míst nahrazen linkerem obsahujícím restrikční 2o místa, použitá pro oddělení pěti subfragmentů tvořících gen. Nový linker byl vložen do štěpu EcoRI - Hindlll plazmidu pUC19 a tím byla tato místa odstraněna. Detaily uvedené konstrukce se popisují ve WO 92/19729 na str. 25 až 26 a v obr. 1 (výkresy 1/7 - 7/7), jejíž obsah se zde uvádí jako referenční.

Každý subfragment byl vyroben z 6 až 12 nukleotidů.

Oligonukleotidy byly syntetizovány na automatickém syntezátoru BNA s použitím fosforamiditové metody na řízeném skleněném nosiči (Beaucage a Carruthers (1981); Tetrahedron Letters 22 1859 - 1869).

Pět subfragmentů bylo izolováno na dvouprocentním 3o agarózovém gelu a vloženo do pSX191. Sekvence byla ověřena • ·

dideoxynukleotidovým sekvenováním. Byly izolovány fragmenty A-E a ligovány se štěpem Kpnl - BamHI pSX191. Ligační směsi byly použity pro transformaci kompetentních buněk E. coli MC1000 r’, m⁺ se selekcí na ampicilinovou rezistenci. Potom byl použit fragment Kpnl 5 - BamHI o velikosti 850 bp, tvořící část genu subtilizinu 309, kódující maturní část enzymu, pro náhradu genu standardního typu na pSX212 za vzniku pSX222, kterým pak byly transformovány kompetentní buňky kmene B. subtilis. Po fermentaci transformovaného kmene a vyčištění enzymu se ukázalo, že produkt nebyl rozlišitelný od produktu io standardního typu.

Proteázové varianty odvozené ze syntetického genu se připravují s použitím oligonukleotidů se změněnou sekvencí v místě (místech) požadované mutace (například sekvencemi udanými níže) a jejich smísením se zbytkem vhodných oligonukleotidů za vytvoření 15 syntetického genu. Sestavení genu varianty se provádí s materiály variant jinak podobným způsobem jako byl popsán výše. Další informace týkající se syntetických genů obecně je dostupná v: Agarval a další (1970); Nátuře; 227 27 - 34.

Na počátek syntetického genu subtilázy 309 kódující maturní 20 část enzymu bylo vloženo místo Kpnl. Použitá metoda se nazývá „oligonucleotide directed double-strand break repair mutagenesis“ a popisuje se v: Mandecki (1986) Proč. Nat. Acad. Sci. USA 83 7177 7181. pSX172 se otevře na počátku maturní části genu subtilázy 309 enzymem Ncol a smísí se s oligonukleotidem NOR 789 (viz WO-A25 92/19729), zahřeje se na 100 °C, ochladí na 0 °C a transformuje do E.

coli. Po retransformaci je možno provést screening rekombinantů hybridizací kolonií s použitím NOR 789 značeného 32-P. Rekombinanty, které se ukázaly v průběhu screeningu jako pozitivní, měly místo Kpnl vloženo právě před Ncol změnou dvou bází bez 30 změny sekvence aminokyselin. pSX172 se popisuje v publikované EP přihlášce No. 405 901. Místo Kpnl vytvořené tímto způsobem se vloží

- 56 do pSX120 na fragmentu Pvul - Nhel za vzniku pSX212. pSX120 se rovněž popisuje v EP-A-405 901.

Syntetický gen se vkládá mezi Kpnl a BamHI plazmidu pSX212 a tím vzniká pSX222. Příklady mutací a odpovídajících sekvencí oligonukleotidů jsou následující:

R170L (fragment D1)

5'- AATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCGCTCTAT - 3'

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIHIII ' - GTCCACGTCCGAGTTAGTCGATAGGCCGCGAGATACGCTTG - 3 '

R170I (fragment D1)

5'- AATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCGATCTAT - 3' lllllllllllllllllllllllllllll**llll ' - GTCCACGTCCGAGTTAGTCGATAGGCCGCTAGATACGCTTG - 3 '

S57P (fragment B1

5’ - AGCTITGTACCAGGGGAACCGCCGACTCAAGATGGG - 3'

3' - AACATGGTCCCCTTGGCGGCTGAGTTCTACCCTTACCC - 5

Tyto oligonukleotidy byly kombinovány se zbytkem oligonukleotidů syntetického genu, které se neměnily.

Příklad 2

Čištění variant enzymu

Tento postup se týká čištění enzymu subtilizin 147, enzymu subtilizin 309 nebo jejich mutantů zfermentace v 10 I měřítku.

Přibližně 8 I fermentačního média se centrifuguje při 5000 ot/min po dobu 35 min v 1 I kyvetách. pH supernatantů se nastaví

použitím 10 % kyseliny octové na 6,5 a zfiltruje na filtračních deskách Seitz Supra S100.

Filtráty byly zakoncentrovány na jednotce Amicon CH2A UF vybavené patronou S1Y10 UF na přibližně 400 ml. Koncentrát byl 5 centrifugován a filtrován a potom při pokojové teplotě absorbován na bacitracinovou afinitní kolonu při pH 7. Proteáza byla z bacitracinové kolony eluována při pokojové teplotě s použitím 25 % 2-propanolu a 1 M chloridu sodného v pufru s 0,01 M kyselinou dimethylglutarovou, 0,1 M kyselinou boritou a 0,002 M chloridem io vápenatým, přičemž pH bylo nastaveno na 7.

Frakce s proteázovou aktivitou z bacitracinového purifikačního kroku byly spojeny a naneseny na 750 ml kolonu Sephadex G25 (průměr 5 cm), ekvilibrovanou pufrem s 0,01 M kyselinou dimethylglutarovou, 0,2 M kyselinou boritou a 0,002 M chloridem 15 vápenatým, přičemž pH bylo nastaveno na 6,5.

Frakce s proteolytickou aktivitou z kolony Sephadex G25 byly spojeny a naneseny na kationtovou kolonu 150 ml o průměru 5 cm CM Sepharose CL 6B, ekvilibrovanou pufrem s 0,01 M kyselinou dimethylglutarovou, 0,2 M kyselinou boritou a 0,002 M chloridem 20 vápenatým, přičemž pH bylo nastaveno na 6,5.

Proteáza byla eluována lineárním gradientem chloridu sodného 0-0,1 M ve 2 I stejného pufru (v případě subtilizinu 147 0 - 0,2 M chlorid sodný).

V posledním kroku purifikace byly frakce z kolony CM 25 Sepharose obsahující proteázu spojeny a zakoncentrovány v ultrafiltrační cele Amicon, opatřené membránou GR81PP (firmy Danish Sugar Factories lne.).

Použitím technik příkladu 1 pro konstrukci a výše uvedeného postupu izolace byly vytvořeny a izolovány následující varianty 30 subtilizinu 309:

A:G159I

B:S164I

C:Y167I

D:R170I

E:R170L

F:R170M

G: R170F

H: G195F

I: S57P+R170L

J: R170L+N218S

K: S57P+R170L+N218S

L: R170L+N218S+M222A

M: S57P+R170L+S188P+A194P

N: Y167I+R170L

O: S57P+R170L+Q206E

P: R170L+Q206E

Q: Y167I+R170L+Q206E

R: Y167I+R170L+A194P

S: Y167I+R170L+N218S

T: Y167I+R170L+A194P+N218S

U: Y167I+Y171I

V: R170G

W: R170C

Příklad 3

Prací prostředky s obsahem variant enzymu

Příklad D1:

Připraví se (izotropní) vodný kapalný prací prostředek podle provedení vynálezu v následujícím složení:

Složka	%
Na LAS	8,0
Neodol 25-9	8,0
AES 25-3S	14,0
Citran sodný dihydrát	5,0
Propylenglykol	5,0
Sorbitol	4,5
F-barvivo Tinopal UNPA-GX	0,15
Zakalovací látka Lytron 614	0,03
Ochranný prostředek Kathon	0,0003
Kyselá modř 80	0,00117
Kyselá violeť 48	0,0033
Savináza 16L	0,25
Lipoláza 100L	0,70
Parfém	0,15
Voda	do 100,0

Hodnota pH se nastaví na 7,1.

• ·

Tabulka III

Zbytková enzymová aktivita (v procentech původní aktivity) po

skladování při 37 °C pro příklad D1 obsahující variantu BLS 309
S57P+R170L+N218S.
Doba skladování (dny)	Standardní typ	S57P+R170L+N218S
0	100		100
3	44		74
7	11		50
10	5		36
14	7		21

Z tabulky III je jasné, že varianta S57P+R170L+N218S má u tohoto typu detergentu významně zlepšenou stabilitu. Navíc je varianta S57P+R170L+N218S vynikajícím způsobem kompatibilní s lipázou.

Tabulka IV

Zbytková aktivita lipázy (v procentech původní aktivity) po skladování při 37 °C pro příklad D1 obsahující variantu BLS 309 S57P+R170L+N218S a enzym Lipolase™.

Doba skladování (dny)	Standardní typ	S57P+R170L+N218S
0	100	100
3	38	67
7	24	44
10	22	33
14	21	27

Z výše uvedené tabulky IV je zřejmé, že navíc ke stabilitě proteázy se získá zlepšená kompatibilita proteázy vůči lipoláze.

• ·

- 61 Příklad D2:

Vytvoří se nevodný kapalný prací prostředek podle jednoho provedení vynálezu s použitím 38,5 % C13 až C15 primárního alkoholu 5 s přímým řetězcem, alkoxylovaného 4,9 mol/mol ethylenoxidu a 2,7 mol/mol propylenoxidu, 5 % triacetinu, 30 % trifosforečnanu sodného, 4 % bezvodé sody, 15,5 % monohydrátu perboritanu sodného s malým podílem oxoboritanu, 4 % TAED, 0,25 % EDTA, ze kterého 0,1 % je ve formě fosfonové kyseliny, 0,6 % Aerosilu, SCMC 1 % 10 a 0,6 % proteázy. pH se nastaví na hodnotu mezi 9 a 10, například přibližně 9,8.

Příklad D3

Strukturované kapalné prací prostředky mohou například 15 obsahovat navíc k proteáze jak bylo popsáno 2 až 15 % neiontové povrchově aktivní látky, celkem 5 až 40 % povrchově aktivní látky, obsahující neiontovou a popřípadě aniontovou povrchově aktivní látku, 5 až 35 % fosfátového nebo nefosfátového builderu, 0,2 až 0,8 % polymerního zahušťovadla, například zesítěného akrylového 20 polymeru s molekulovou hmotností větší než 10⁶, alespoň 10 % křemičitanu sodného, například ve formě neutrálního vodního skla, alkálie, například obsahující draslík, pro nastavení požadovaného pH s výhodou v rozmezí 9 až 10 nebo výše, například pH vyšší než 11, s hmotnostním poměrem sodíkového kationtu ku křemičitanovému 25 aniontu (jako volný oxid křemičitý) menším než 0,7 : 1 a viskozitou 0,3 až 30 Pas (při 20 °C a 20 s'¹).

Vhodné příklady obsahují přibližně 5 % neiontové povrchově aktivní látky Ci₃ až C15 alkoholu alkoxylovaného s přibližně 5 EO skupinami na mol a s přibližně 2,7 PO skupinami na mol, 15-23 % 30 neutrálního vodního skla s hmotnostním poměrem mezi oxidem

-62křemičitým a oxidem sodným 3,5, 13 až 19 % KOH, 8-23 % STPP, 0 - % uhličitanu sodného a 0,5 % Carbopolu 941™.

Proteáza může být přidána v množství například 0,5 %.

Příklad D4 (Polymerní kapalina s potlačením vazby (Decoupling polymer liquid)

Priolene 69074,5

KOH10

Ethoxylovaný alkohol.7EO (Synperonic A7)4,5

Ethoxylovaný alkohol.3EO (Synperonic A3)4,5

Zeolit 4A15

Opticky zjasňující látka Tinopal CBS-X0,08

Narlex DC11

Kyselina citrónová8,23

Odpěňovadlo silikon DB1000,3

Kyselina LAS16,5

Parfém0,5

Voda do 100 %

Tabulka V io Zbytková enzymová aktivita (v procentech původní aktivity) po skladování příkladu D4 obsahujícího variantu R170L BLS 309 při 37 °C.

Doba skladování (dny)		R170L	Standardní typ
0	100		100
2	98		73
4	96		66
10	94		46

33	87	8
81	78	2,1
101	71	0

Z tabulky V je jasné, že v tomto typu pracího prostředku má varianta R170L významně zlepšenou stabilitu.

Příklad D5 (Polymerní kapalina s potlačením vazby (Decoupling polymer liquid)

Priolene 69074,5

KOH10

Ethoxylovaný alkohol.7EO (Synperonic A7)4,5

Ethoxylovaný alkohol.3EO (Synperonic A3)4,5

Zeolit 4A15

Opticky zjasňující látka Tinopal CBS-X0,08

Narlex DC11

Kyselina citrónová8,23

Odpěňovadlo silikon DB1000,3

Kyselina LAS16,5

Lipolase 100L0,6

Parfém0,5

Voda do 100 %

Tabulka VI

Zbytková enzymová aktivita (v procentech původní aktivity) po io skladování příkladu D5 obsahujícího variantu BLS 309 S57P+R170L+N218S při 37 °C.

Doba Zbytková aktivita proteázy Zbytková aktivita lipázy skladování

- 64 (dny)

	S*	W*	w'1	S*
0	100	100	100	100
2	-	75	41	94
5	97	50	15	76
8	87	30	7	71
12	91	20	12	78
28	100	18	12	70

S* S57P+R170L+N218S

W* standardní typ

Z tabulky VI je jasné, že v tomto typu pracího prostředku má varianta S57P+R170L+N218S významně zlepšenou stabilitu. Navíc varianta S57P+R170L+N218S má vynikající kompatibilitu vůči lipáze.

Příklad D6

Byly vyrobeny mýdlové kostky, obsahující 49,7 % hmotnostních io lojového/kokosového mýdla 80/20, 49,0 % vody, 20 % citrátu sodného,

1,0 % kyseliny citrónové a 0,031 % proteázy. Mýdlové kostky byly potom skladovány při pokojové teplotě a v určitých časových intervalech byly odebírány vzorky, ve kterých byla měřena aktivita proteázy. Údaje o stabilitě obsahuje následující tabulka VII:

Doba skladování (dny)	Standardní typ	R170L	R170L + N218S + S57P	R170L + Y167I
0	100	100	100	100
1	50	100	97	94
2	25	91	100	83
3		100	94	80
6		98	89	90

10	0	100	94	71
17		93	80	73
27		95	86	70

Z tabulky VII je zřejmé, že subtilázové varianty R170L, R170L+N218S+S57P a R170L+Y167I mají v tomto typu pracího prostředku výrazně zlepšenou stabilitu.

s Příklad D7

Byly vyrobeny mýdlové kostky, obsahující 63,88 % hmotnostních lojového/kokosového mýdla 80/20, 1 % kokosové mastné kyseliny, 25,1 % vody, 10 % citrátu sodného a 0,021 % proteázy. Mýdlové kostky na praní byly potom skladovány při teplotě 37 °C a v určitých io časových intervalech byly odebírány vzorky, ve kterých byla měřena aktivita proteázy.

Údaje o stabilitě:

Doba skladování (dny)	Standardní typ	R170L+N218S+S57P
0	100	100
10		90,1
14		81,5
10	10
20	0	91,4
31		72,8
35		79
45		78

Z tabulky Vlil je zřejmé, že subtilázová varianta

R170L+N218S+S57P má v tomto typu pracího prostředku výrazně zlepšenou stabilitu.

• *

-66 • · ·

Příklad 4

Prací účinnost prostředku obsahujícího varianty enzymu.

Následující příklady uvádějí výsledky získané velkým množstvím pracích testů, provedených za následujících podmínek.

Tabulka IX: Experimentální podmínky pro vyhodnocení variant subtilizinu 309.

Prací prostředek	Proteázový modelový prací prostředek ‘95
Dávka prostředku	3 g/l
pH	9,5
Doba praní	15 min
Teplota	15 °C
Tvrdost vody	9 °dH ~ 1,61 mM Ca2+/Mg2+
Enzymy	Varianty subtilizinu 309 uvedené níže
Koncentrace enzymu	0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 mg/l
Testovací metoda	Miniwash *(SOP DEF-SM-0026.01/01)*
Vzorek/Objem	5 vzorků (φ 2,5 cm)/50 ml
Testovaný materiál	Tráva na bavlně (smočené ve vodě); *DF9417718*

Výše uvedený modelový prací prostředek představuje jednoduché složení pracího prostředku. Nejcharakterističtější rysy jsou, že jako builder je použit STP a obsah aniontového tensidu (LAS) io je poměrně vysoký. Dále je hodnota pH nastavena na 9,5, což je pro práškový prací prostředek poměrně nízká hodnota.

Složení modelového pracího prostředku je následující:

Tabulka X
25 %	STP (Na5P3O10)
25 %	Na2SO4
10 %	Na2CO3
20 %	LAS (Nansa 80S)

• ·

	• ····· · · · ···· • · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· ·· -67 -
5 %	Neiontové povrchově aktivní látky (Dobanol 25-7)
5 %	Na2Si2Os
0,5 %	Karboxymethylcelulóza (CMC)
9,5 %	Voda
Dávkování: 3 g/l pH upraveno na	9.5

Měření odrazivosti (R) testovaného materiálu bylo prováděno při 460 nm s použitím fotometru Elrepho 2000 (bez UV). Měřené hodnoty byly dosazeny do výrazu:

AJ? «

Faktor zlepšení se vypočte s použitím počáteční směrnice křivky: _{Jp a} a ^ar»ť.

AR je prací účinek enzymu v jednotkách odrazivosti.

a je počáteční směrnice proložené křivky (c->0).

a_ref je počáteční směrnice pro referenční enzym.

c je koncentrace enzymu v mg/l.

AR_max je teoretický maximální prací účinek enzymu v jednotkách odrazivosti (c->oo).

Tabulka XI:

Jednotlivé varianty subtilizinu a jejich faktory zlepšení

Označení

S003

S004*

S012*

Varianta

R170Y

2,8

R170Y+G195E 2,6

R170Y+G195E+K251E|1,6

Ϊ3

R170F

IF

E	R170L	3,8
F	R170M	2,4
D	R170I	4,1
I	S57P+R170L	3,9
J	R170L+N218S	1,6
K	S57P+R170L+N218S	2,3
N	Y167I+R170L	6,2
P	R170L+Q206E	2,6
V	R170G	2,0
W	R170C	3,4
0	S57P+R170L+Q206E	2,9
Q	Y167I+R170L+Q206E	2,4

* Popsané v WO-A-91/00345.

Jak je vidět z tabulky XI, všechny varianty subtilizinu 309 podle vynálezu mají zlepšený účinek při praní.

Zastupuje:

Claims (5)

1. Prací prostředek vyznačující se tím,

5 že obsahuje subtilázovou variantu, ve které je jeden nebo více zbytků aminokyselin, umístěných v nebo v okolí hydrofobní domény rodičovské subtilázy, substituován zbytkem hydrofobnější aminokyseliny než byl původní zbytek, přičemž uvedená hydrofobní doména obsahuje zbytky P129, P131, io 1165, Y167 a Y171 BLS 309 podle číslování BASBPN a zbytky v jejím okolí zahrnují zbytky odpovídající zbytkům E136, G159, S164, R170, A194 a G195 BLS 309 podle číslování BASBPN, s výjimkou variant R170M, R170I a R170V BABP92.

15

2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e obsahuje variantu subtilázy, ve které jsou původní zbytky aminokyselin nahrazeny zbytky ze skupiny zahrnující Val (V), lle (I), Leu (L), Met (M), Phe (F) a Trp (W), s výhodou Val, lle nebo Leu.

3. Prostředek podle některého z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že rodičovská subtiláza je zvolena z podskupiny I-S1.

25 4. Prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, ž e rodičovská subtiláza je zvolena ze skupiny zahrnující ABSS168, BASBPN, BSSDY a BLSCAR.

4 4

5.

- 70 • 4 4

Prostředek podle některého vyznačující se tím, zvolena z podskupiny I-S2.

nároků 1 nebo 2, rodičovská subtiláza je

6.

7.

8.

9.

Prostředek podle nároku 5, vy ž e rodičovská subtiláza je zvolena ze skupiny zahrnující BLS147, BLS309, BAPB 92 a BYSYAB.

Prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, ž e rodičovskou subtiiázou je TVTHER.

Prostředek podle některého vyznačující se tím, popřípadě uvedené substituce substitucemi, inzercemi nebo delecemi v některé jiné poloze.

z nároků 1 až 7, ž e uvedená substituce, je/jsou kombinovány se

Prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, ž e uvedená substituce, popřípadě uvedené substituce je/jsou kombinovány se substitucemi, inzercemi nebo delecemi v některé z poloh 36, 222, 218 a 76.

10. Prostředek podle některého z nároků 1 až 9, kterým je některá z následujících variant:

K136V, K136I, K136L, K136M, K136F,

25 S159V, S159I, S159L, S159M, S159F,

T164V, T164I, T164L, T164M, T164F,

K170V, K170I, K170L, K170M, K170F,

E195V, E195I, E195L, E195M, E195F,

Q136V, Q136I, Q136L, Q136M, Q136F, • ·

T159V, T159I, T159L, T159M, T159F,

A164V, A164I, A164L, A164M, A164F,

Y170V, Y170I, Y170L, Y170M, Y170F,

S194V, S194I, S194L, S194M, S194F,

5 E136V, E136I, E136L, E136M, E136F,

G159V, G159I, G159L, G159M, G159F,

G164V, G164I, G164L, G164M, G164F,

S164V, S164I, S164L, S164M, S164F,

R170V, R170I, R170L, R170M, R170F, ίο A194V, A194I, A194L, A194M, A194F

P194V, P194I, P194L, P194M, P194F

E195V, E195I, E195L, E195M, E195F

G195V, G195I, G195L, G195M, G195F

15

11. Prostředky podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že uvedená varianta je kombinována s dalšími substitucemi, delecemi a/nebo inzercemi na jedné nebo více z následujících poloh: 36, 57, 76, 218, 222 a 224.

12. Prostředky podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedená subtiláza náleží do podskupiny I-S2 a uvedená další změna se volí ze skupiny *36D, S57P, N76D, N218S, M222S, M222A a T224S.

13. Prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že varianta se volí ze skupiny variant zahrnujících:

a) S57P+R170L a’) S57P+R170I

30 b) R170L+N218S

b’) R170I+N218S c) S57P+R170L+N218S C’) S57P+R170I+N218S C”) S57P+V104Y+R170L+N218S 5 ď”) S57P+V104Y+R170I+N218S d) R170L+N218S+M222A ď) R170I+N218S+M222S d”) R170L+N218S+M222A ď“) R170I+N218S+M222S 10 e) S57P+R170L+S188P+A194P e’) S57P+R170I+S188P+A194P f) Y167L+R170L Ό Y167L+R170I g) Y167I+R170L 15 g’) Y167I+R170I h) N76D+R170L+N218S h') N76D+R170I+N218S i) S57P+N76D+R170L+N218S <’) S57P+N76D+R170I+N218S 20 j) N76D+R170L+N7218S+M222A Γ) N76D+R170I+N218S+M222S j“) N76D+R170L+N218S+M222A j“’) N76D+R170L+N218S+M222S k) S57P+R170I+S188P+A194P+N218S 25 k’) S57P+R1701+S188P+A194P+N218S i) *36D+N76D+H120D+R170L+G195E+K235L i’) *36D+N76D+H120D+R170l+G195E+K235L m) N76D+H120D+R170L+G195E+K235L m’) N76D+H120D+R170I+G195E+K235L 30 n) *36D+G97N+V104Y+H120D+R170L+A194P+G195E+

K235L • ·

n’) *36D+G97N+V104Y+H120D+R170I+A194P+G195E+ K235L o) S57P+R170L+Q206E o’) S57P+R170I+Q206E 5 P) R170L+Q206E P) R170I+Q206E q) Y167I+R170L+Q206E q’) Y167I+R170I+Q206E r) Y167F+R170L 10 r’) Y167F+R170I t) Y167I+R170L+A194P ť) Y167I+R170I+A194P u) Y167I+R170L+N218S u) Y167I+R170I+N218S 15 V) Y167I+R170L+A194P+N218S v') Y167I+R170I+A194P+N218S x) R170L+P131V x’) R170I+P131V y) *36D+Y167l+R170L 20 y’) *36D+Y167l+R170l z) Y167I+Y1711 aa) Y167V+R170L aa') Y167V+R170I

25

14. Prostředek podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že subtilázovou variantou je R170L nebo R170I a prostředkem je kapalný prací prostředek a obsahuje deflokulační polymer.

15. Prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že subtilázovou variantou je S57P+V104Y+R170L+ N218S nebo S57P+V104Y+R170I+N218S.

5 16. Prostředek podle některého z nároků 1 až 13 ve tvarované pevné formě.