CN110628854A - 一种用虾壳生产几丁寡糖、虾青素、蛋白质和钙粉的酶法绿色工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用虾壳生产几丁寡糖、虾青素、蛋白质和钙粉的酶法绿色工艺。所述的工艺联用蛋白酶、几丁质酶对虾壳进行高效水解后,打开其中的蛋白质‑几丁质‑矿物质的复合物结构,可有效回收利用其中的蛋白质和几丁质,不但使被蛋白质紧密包围的几丁质暴露,得到脱乙酰度低、几丁寡糖分布丰富、含有高聚合度几丁寡糖的几丁质水解产物;还使虾青素得以充分暴露而极易被抽提出,虾青素提取率达101.3μg/g虾壳粉,显著缩短提取时间的同时降低其与有机溶剂的接触时间,提高提取获得虾青素的品质,抗氧化活性强。同时,本发明的酶解方案科学巧妙,加酶量低,蛋白回收效果好,环保高效,在虾壳废弃物回收利用中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,特别涉及一种虾壳废弃物的新型绿色回收工艺。
背景技术
广东省是中国的水产大省,据统计,2016年广东水产品生产总量达到882万吨,其中包括了多种虾蟹等,仅虾产量就近100万吨。虾可食用部分不到50%,虾仁加工过程中会产生大量的虾头、虾壳等废弃物,虾头就占全虾重量的三分之一以上,每年广东省的虾加工下脚料就达数十万吨。而随着我国海产业及人工养殖虾、蟹业的发展,这些废弃物数量将越来越大,造成了严重的环境污染(Ferraro et al.,2010,Valorisation of naturalextracts from marine source focused on marine by-products:A review)。另一方面,它们又是一类宝贵的生物资源,废弃虾壳中含有丰富的生物资源,如几丁质、蛋白质、虾青素等,具有很高的开发利用价值(Shahidi and Synowiecki,1991)。因此,如何实现对废弃虾壳的综合利用,回收其中的活性成分已经成为了研发的热点。
作为一种优质的蛋白资源,虾壳经粉碎处理后就可直接作为饲料使用,但其被消化吸收的比率很低,影响了其应用。一般来说,虾壳蛋白可以通过脱蛋白获得蛋白水解液来回收,然后进一步的加工成为粉末、糊状和流体等用于作为饲料中虾风味的添加剂。不同于传统工艺的强酸强碱(如1M HCl和4%NaOH)处理,生物催化和微生物发酵作为新型的处理方式也被用于虾壳蛋白回收中。使用微生物发酵来回收虾壳蛋白,虾壳蛋白会作为微生物的碳氮源,容易使蛋白被过度水解和消耗,而且发酵时容易带入其他物质,所以酶法水解更受欢迎。近年来一些用酶法处理虾壳的工艺和效果如表1所示,从该表可以看出,目前使用酶法水解虾壳工艺,因为现有的商业酶水解效率低,而致使加酶量特别大(如商业碱性蛋白酶酶底物比为2万U/g,胃蛋白酶为5万U/g),成本过于昂贵,回收效果不够理想。而且使用碱性蛋白酶时,碱性条件会对虾壳中的蛋白、虾青素结构造成一定影响,影响它们的生物活性。另外,虾壳中的几丁质被蛋白质紧密包围,虾壳中的几丁质就难以被水解利用。
表1酶法回收虾壳蛋白的方法比较
目前的技术集中于利用虾蟹壳等生产几丁质(甲壳素),或利用几丁质生产聚合度较低的几丁寡糖,极少直接利用虾蟹壳来生产各种聚合度的几丁寡糖。几丁寡糖的制备一直是产业界的一个难题,目前国内尚未有几丁寡糖生产大规模产业化的企业。现有研究的技术,几丁寡糖的制备方法主要有化学降解法、壳寡糖乙酰化法和酶降解法。化学降解法一般用浓酸水解几丁质,常用浓盐酸,虽然其工艺简单,开展较早,但是该方法存在反应条件苛刻、不易控制、产量低、设备要求高和污染环境等缺点,且几丁寡糖产物聚合度都在4以下;壳寡糖乙酰化法(专利CN201110409312.4)步骤复杂费时费力,成本高昂,产业化的可能性很低;酶降解法是目前最有潜力的方法,然而现有酶降解法中所用到的专一性酶,如几丁质酶(专利CN2011102588936)和壳聚糖酶(专利CN200610080091.X),普遍都存在酶活力不够高和酶产量低的问题;而采用非专一性酶如纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶等约三十多种酶混合,对几丁质和壳聚糖可实现部分或完全水解,但非专一性酶相互之间需要协同作用,在实验中往往是多种酶的复合应用,不同批次水解产物均一性和稳定性低,产品质量无法控制,即使是同一种酶,不同批次或厂家的酶效果相差很大,不利于建立固定的实验工艺。因而获得高产和高酶活的几丁质酶,是制备几丁寡糖及其产业化的关键技术。获得高表达的几丁质酶以及其在虾壳几丁质回收中的使用具有重大的研究价值和应用潜力。另一方面,聚合度为6~8的几丁寡糖被认为具有最高的生物活性,特别是在与相关受体结合方面,5聚以下的几丁寡糖基本无结合活性。但目前报到水解获得的几丁寡糖的聚合度基本都在5以下(Fuet al.,2014,An acidic,thermostable exochitinase with beta-N-acetylglucosaminidase activity from Paenibacillus barengoltzii convertingchitin to N-acetyl glucosamine.;Nguyen et al.,2015,Microwave-IntensifiedEnzymatic Deproteinization of Australian Rock Lobster Shells(Jasus edwardsii)for the Efficient Recovery of Protein Hydrolysate as Food FunctionalNutrients.;Sinha et al.,2014,Microbial degradation of chitin waste forproduction of chitosanase and food related bioactive compounds.;Takiguchi andShimahara,1988,,N-Diacetylchitobiose production from chitin by Vibrioanguillarum strain E-383a.;Yang et al.,2016,Cloning,expression,purificationand application of a novel chitinase from a thermophilic marine bacteriumPaenibacillus barengoltzii.)。因此,如何获得较高聚合度的几丁寡糖也成为研究的难点。
虾壳中的虾青素与蛋白质和几丁质相互紧密结合而不易被抽提出。对虾青素的抽提,传统工艺中使用的强酸强碱处理,会破坏虾青素的结构。目前更倾向于使用酶法或微生物发酵法去除蛋白后,再提取虾青素。有报道使用胚牙乳杆菌发酵南美白对虾虾壳后,虾青素提取率达到2.4mg/g;使用内源酶水解南美白对虾虾壳的虾青素提取率达到0.8mg/g;使用戊糖片球菌发酵和赛威蛋白酶、丽波脂肪酶联合使用,虾青素提取率达到6.6mg/g。几丁质是甲壳类动物外骨骼的主要支撑结构,有报道表明用离子液体从蟹壳中洗出的几丁质(除去蛋白质和矿物质)仍然具有与天然蟹壳相似的结构(Pei Xu et al.,2019,Double-Chitinase Hydrolysis of Crab Shell Chitin Pretreated by Ionic Liquid toGenerate Chito-Oligosaccharide)。因此,除去蛋白质后的虾壳中的几丁质仍然有可能影响虾青素的提取。如CN1715255A中除去虾壳的蛋白质后,再用有机溶剂萃取虾青素需要6~12小时;CN103172763A中除去虾壳中的蛋白质和矿物质后,用乙醇提取虾青素需要先超声处理,再用有机溶剂萃取2~5小时。剧烈的物理化学处理会破坏虾青素的结构,而且有机溶剂也会降低虾青素的活性。
目前为止,尚未有人将联合酸性蛋白酶与几丁质酶应用于虾壳废弃物水解回收,更未有人同时从虾壳废弃物中同时回收得到虾壳蛋白水解物、几丁寡糖及虾青素。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种虾壳废弃物的新型绿色回收工艺。
本发明的又一目的在于提供通过所述的虾壳废弃物的新型绿色回收工艺制得的虾壳粉蛋白水解产物、几丁质水解产物、虾青素或钙粉。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种虾壳废弃物的新型绿色回收工艺,包括如下步骤:
(1)加入酸性蛋白酶对虾壳废弃物粉末进行第一次水解,固液分离后得到的第一上清液与第一沉淀物,所述的第一上清液为虾壳粉蛋白水解产物;
(2)加入几丁质酶对于第一沉淀物进行第二次水解,固液分离后得到的第二上清液与第二沉淀物,所述的第二上清液为几丁质水解产物;
(3)在第二沉淀物中加入有机溶剂进行提取,固液分离后收集提取液,干燥后即得虾青素。
步骤(1)中所述的酸性蛋白酶优选为中国专利申请CN201710088628.5所记载的酸性蛋白酶P6281和酸性蛋白酶Saccharopepsin(GeneBank登录号:EPB83353)中的至少一种。
所述的酸性蛋白酶P6281可通过中国专利申请CN201710088628.5所记载的异源表达、纯化方法得到。
所述的虾壳废弃物来源优选为虾、蟹、贝等甲壳类动物中的一种或至少两种。
步骤(1)中所述的虾壳废弃物粉末优选先配制成质量体积浓度为10%的溶液再进行所述的第一次水解;所用的溶剂优选为50mM乳酸钠缓冲液或磷酸钠缓冲液。
步骤(1)中所述的虾壳废弃物粉末的粒度优选为可过50目筛。
步骤(1)中所述的酸性蛋白酶的加酶量优选为1000U/g底物。
步骤(1)中所述的第一次水解的pH优选为pH 3~5;当所述的酸性蛋白酶为酸性蛋白酶P6281时,优选为pH 3;当所述的酸性蛋白酶为Saccharopepsin时,优选为pH 5。
步骤(1)中所述的第一次水解的温度优选为40℃。
步骤(1)中所述的第一次水解的时间优选为4~10h。
步骤(1)中所述的第一次水解优选先用酸性蛋白酶P6281进行第一阶段水解,固液分离得到的沉淀继续用酸性蛋白酶Saccharopepsin进行第二阶段水解。
步骤(2)中所述的几丁质酶优选为中国专利申请CN201910064040.5所记载的几丁质酶Chit46;可通过中国专利申请CN201910064040.5中所记载的表达、纯化方法得到。
步骤(2)中所述的几丁质酶的加酶量优选为50U/g底物。
步骤(2)中所述的第二次水解优选先将第一沉淀物配制为质量体积浓度为10%的溶液后再进行所述的水解;所用的溶剂优选50mM的磷酸钠缓冲液。
步骤(2)中所述的第二次水解的pH优选为pH 6。
步骤(2)中所述的第二次水解的温度优选为45℃。
步骤(2)中所述的第二次水解的时间优选为6h。
步骤(2)中所述的几丁质水解产物优选为聚合度至少为2的几丁寡糖;进一步优选为包括聚合度为4以上的几丁寡糖,尤其是包括聚合度为6以上的几丁寡糖。
步骤(3)中所述的有机溶剂优选为乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、石油醚中的至少一种。
步骤(3)中所述的提取的时间优选为2h。
步骤(3)中所述的提取的温度优选为16~30℃;进一步优选为25℃。
步骤(3)的烘干优选在避光条件下进行;烘干的温度优选为室温。
步骤(3)固液分离得到的沉淀进行脱色、烘干等步骤后,可得到钙粉。
步骤(1)、(2)、(3)中所述的固液分离优选通过离心实现;所述的离心的条件优选为12000rpm离心2分钟。
一种虾壳粉蛋白水解产物、几丁质水解产物、虾青素或钙粉,通过所述的虾壳废弃物的新型绿色回收工艺制得。
所述的虾壳粉蛋白水解产物还可以进一步加工为粉末、糊状和流体,例如,用作食品、饲料等的虾风味添加剂。
所述的蛋白水解产物的测定方法为BCA法测定蛋白浓度和茚三酮法测定氨基酸浓度。
所述的几丁质水解产物的测定方法为DNS法测定还原糖浓度和脱乙酰度测定。
所述的几丁质水解产物的检测方法为HPLC法,色谱柱为Asahipak NH2P-50 4E,色谱***为waters e2695。
所述的几丁质水解产物的检测条件优选为:流动相70%乙腈,上样量20μL,流速0.7mL/min,温度为30℃,洗脱时间40min,示差检测器。
所述的虾青素的抗氧化性测定方法为DPPH法。
所述的虾青素的纯度及产量的检测方法为HPLC法,色谱柱为Waters SunFireC18,色谱***为Shimadzu-LC-20A。
所述的虾青素的检测条件优选为:流动相甲醇:二氯甲烷:乙腈:水=85:5:5:5,上样量20μL,流速1.5mL/min,温度为37℃,洗脱时间20min,检测波长475nm。
本发明首次研究了虾壳的矿物质对蛋白酶水解的影响,先将虾壳中被蛋白质紧密包围的几丁质暴露,显著提高几丁质的利用率;相较于现有技术中仅在去除蛋白后进行虾青素的抽提,本发明首次在去除蛋白质和几丁质以后,再抽提虾青素。本发明研究发现,对虾壳进行蛋白酶、几丁质酶水解后,可打开其中的蛋白质-几丁质-矿物质的复合物结构,使虾青素得以充分暴露而极易被抽提出,其效率明显高于现有的方法。这种方法相对现有的酶法和发酵法操作更为简单,是一种更为理想的虾青素回收方式,提高虾青素提取效率并降低其与有机溶剂的接触时间能够提高提取获得虾青素的品质。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
1.目前尚未有人酸性蛋白酶和几丁质酶联合用于虾壳废弃物的蛋白质水解和几丁寡糖制备及虾青素提取。本发明首次成功将酸性蛋白酶P6281和Saccharopepsin,几丁质酶Chit46应用于虾壳废弃物回收。
2.本发明所用的酸性蛋白酶P6281和Saccharopepsin在虾壳废弃物的水解中,在同等加酶量的情况下水解效果好于商业酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶及中性蛋白酶rNpI。加酶量为1000U/g,低于大部分报道,且蛋白回收效果也好于大部分报道。
3.虾壳蛋白质被水解出来后,其中的几丁质容易被几丁质酶Chit46水解,避免了传统工艺中强碱试剂的使用。而且P6281和Saccharopepsin在pH 6.0的活性较差且热稳定性较差,在进行几丁质酶处理时残留的少量蛋白酶对Chit46并无明显影响。
4.几丁质酶Chit46的水解活性好,且水解产物稳定,脱乙酰度低,几丁寡糖分布丰富,能得到聚合度在6~8的几丁寡糖(活性最好,与相关受体的亲和力最强)。
5.虾壳蛋白质和几丁质被水解出来后,其中的虾青素容易被提取出来,虾青素提取率达101.3μg/g虾壳粉,避免了传统工艺中化学试剂对虾青素的破坏,并有效缩短了提取时间,降低了有机溶剂对虾青素的影响。
附图说明
图1是酸性蛋白酶P6281酶解虾壳废弃物的产物氨基酸分析结果图。
图2是酸性蛋白酶Saccharopepsin酶解虾壳废弃物的产物氨基酸分析结果图。
图3是几丁质酶Chit46水解虾壳废弃物的产物HPLC分析图,其中上方图为几丁质水解产物样品,下方图为标准品。
图4是在虾壳废弃物中提取的虾青素HPLC分析图,其中A为提取产物,B为皂化产物,C为标准品。
图5为虾壳废弃物回收产物照片图,其中A为第一步虾壳蛋白水解回收产物(P6281水解),B为第二步虾壳蛋白水解回收产物(Saccharopepsin水解),C为虾壳几丁质水解回收产物(几丁寡糖),D为虾青素提取物。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1虾壳废弃物各项成分测定
虾壳废弃物购买于湛江国联水产开发股份有限公司,粉碎过50目筛子,得到虾壳废弃物粉末,4℃保存备用。测定虾壳废弃物中的蛋白质、灰分、几丁质和水分的方法如下:
(1)蛋白质:因几丁质中含有氮元素,为排除干扰,先用1M NaOH溶液40℃处理虾壳粉3h,上清液使用凯氏定氮法测定蛋白质浓度(GB 50095-2010),测得虾壳中蛋白质含量为48.84%;
(2)灰分:使用食品安全国家标准(GB5009.4-2016)中的“第一法食品中总灰分的测定”,测得虾壳中灰分含量为20.75%;
(3)几丁质:先用1M NaOH溶液40℃处理虾壳粉3h除去蛋白质,沉淀再用1M HCl溶液室温处理3h,得到白色几丁质沉淀,测得虾壳中几丁质含量为18.9%;
(4)水分:使用直接干燥法(GB5009.3-2016),测得虾壳中水分含量为4.9%。
实施例2酸性蛋白酶水解虾壳粉及水解产物分析
参照中国专利申请CN201710088628.5实施例的异源表达及纯化方法制备得到酸性蛋白酶P6281。
所述的中性蛋白酶rNpI已在文献Ke,Y et al.,2012,Enzymaticcharacteristics of a recombinant neutral protease I(rNpI)from Aspergillusoryzae expressed in Pichia pastoris中公开,通过文献所记载的方法制备得到所述的中性蛋白酶rNpI。
Saccharopepsin的GeneBank登录号:EPB83353,可通过本领域常规的表达纯化技术手段制备得到;例如,可参照中国专利申请CN201710088628.5实施例的异源表达及纯化方法,克隆Saccharopepsin的编码基因,构建表达菌株后表达、纯化得到。
酸性蛋白酶P6281水解虾壳粉实施例中所用的底物为实施例1中制备的虾壳废弃物粉末。在虾壳废弃物粉末中加入50mM pH 3.0乳酸钠缓冲液,使虾壳粉浓度(质量体积分数)为10%,加酶量为1000U/g底物,pH 3.0,40℃条件下200rpm振荡反应4h,反应后在12000rpm离心2分钟,获得的上清为虾壳粉蛋白水解产物,沉淀作为下步反应底物。
在各自的最适反应条件下,酸性蛋白酶P6281水解虾壳粉的效果与其他蛋白酶的水解效果比较如表2所示;其中,蛋白回收率通过减重法测得,蛋白质回收率(%)=(虾壳粉重量-沉淀重量)/虾壳粉重量。
表2不同蛋白酶对虾壳蛋白的水解效果比较
利用酸性蛋白酶P6281水解虾壳粉,减重法测得蛋白回收率为71.2%,凯氏定氮法测得溶液总氮回收率为71.5%。采用购买于生工生物工程(上海)股份有限公司的BCA蛋白质定量检测试剂盒(C503021)测定水解产物的蛋白质浓度,测得蛋白质浓度为39.05mg/mL,占虾壳总蛋白的64%;水解产物用0.4M三氯乙酸沉淀后,上清液用GB/T 8314-1987(即茚三酮法)测定氨基酸总量,测得氨基酸浓度为3.07mg/mL,占虾壳总蛋白的6.3%。水解产物使用德国MembraPure A300 advanced氨基酸分析检测,水解产物中必需氨基酸占种氨基酸的35.33%,具有较高的营养价值;鲜味氨基酸占40.42%,具有良好的增鲜增味效果。
表3虾壳蛋白水解产物的氨基酸组成分析
沉淀继续使用酸性蛋白酶Saccharopepsin水解,虾壳粉浓度为5%(溶剂为50mMpH 5.0磷酸钠缓冲液),加酶量为1000U/g底物,pH 5.0,40℃条件下200rpm振荡反应4h,反应后在12000rpm离心2分钟,获得的上清即为虾壳粉蛋白水解产物,沉淀作为下步反应底物。减重法测得蛋白回收率为20.2%,凯氏定氮法测得溶液总氮回收率为19.6%。采用购买于生工生物工程(上海)股份有限公司的BCA蛋白质定量检测试剂盒(C503021)测定水解产物的蛋白质浓度,测得蛋白质浓度为4.16mg/mL,占虾壳总蛋白的15.9%;水解产物用0.4M三氯乙酸沉淀后,上清液用GB/T 8314-1987测定氨基酸总量,测得氨基酸浓度为0.85mg/mL,占虾壳总蛋白的3.5%。水解产物使用德国MembraPure A300 advanced氨基酸分析检测,水解产物中必需氨基酸占种氨基酸的38.13%,具有较高的营养价值,鲜味氨基酸占37.23%,具有良好的增鲜增味效果。
表4虾壳蛋白水解产物的氨基酸组成分析
在虾壳蛋白水解研究过程中,发明人曾分别用pH3.0乳酸钠缓冲液、pH4.0柠檬酸钠缓冲液和pH5.0柠檬酸钠缓冲液配制得到虾壳粉浓度(质量体积分数)为10%的酶解底物;在所述3种酶解底物中,分别同时加入酸性蛋白酶P6281(加酶量为1000U/g底物)和酸性蛋白酶Saccharopepsin(加酶量为1000U/g底物)在40℃条件下进行混合酶解6h,减重法测蛋白回收率分别是78.5%,76.3%和68.2%。由此可见,先用P6281水解,再用Saccharopepsin水解的效果更好(蛋白总回收率达91.4%)。
发明人还尝试过先用酸性蛋白酶Saccharopepsin水解,水解后得到的沉淀再用酸性蛋白酶P6281水解(除了酶解顺序及酶解时间不同外,其他条件同前文先用P6281水解再用Saccharopepsin水解的操作),发现要达到相同的蛋白回收率的时间会更长,第一步Saccharopepsin水解需要6小时,回收率54.8%;第二步P6281水解需要12小时,回收率34.1%,总回收率88.9%。此现象说明本发明的酶解顺序对酶解效果会产生影响,这可能是由于P6281和Saccharopepsin之间能够相互水解影响了它们共同发挥作用。而P6281在pH5.0的条件下活性较低,对Saccharopepsin的影响比较小。因此酶解顺序更优选为先用P6281水解,再用Saccharopepsin水解。
实施例3几丁质酶Chit46水解虾壳粉及水解产物分析
参照中国专利申请CN 201910064040.5实施例1记载的方法通过制得几丁质酶Chit46。
几丁质酶Chit46水解虾壳粉实施例中所用的底物为实施例2中经酸性蛋白酶P6281然后再经酸性蛋白酶Saccharopepsin水解后得到的沉淀。在原始虾壳粉(指未经过任何水解步骤的虾壳粉,以方便计算)浓度为10%(溶剂50mM pH6.0磷酸钠缓冲液),加酶量为50U/g底物,pH 6.0,45℃条件下150rpm振荡反应6h,反应后在12000rpm离心2分钟,获得的上清即为虾壳粉几丁质水解产物,沉淀作为下步反应底物。减重法测得沉淀质量减少了25.86%,几丁质回收率达88.92%。
采用Ghose的DNS法测定虾壳粉几丁质水解产物还原糖含量。取1mL以蒸馏水适当稀释的水解产物,加入1mL蒸馏水和3mL DNS试剂,沸水浴10分钟,在12000rpm离心2分钟后吸取上清在540nm波长下测量吸光值,并根据实验前作好的标准N-乙酰葡萄糖胺梯度浓度溶液-吸光值曲线计算还原糖含量,以蒸馏水作为空白对照。测得水解产物还原糖含量为5.08mg/mL,水解产物用1%蜗牛酶(购自生工生物工程(上海)股份有限公司,货号A600870)彻底消化后测得还原糖含量为16.25mg/mL,几丁质回收率达85.98%。
采用《GB 29941-2013食品安全国家标准食品添加剂脱乙酰甲壳素(壳聚糖)》测定水解产物的脱乙酰度,测得其脱乙酰度为8.6%,表明水解产物绝大部分确实为几丁寡糖。
水解产物加入2倍体积的乙醇以除去产物中的酶,在12000rpm离心2分钟,上清于65℃烘箱中放置1小时以除去乙醇,所得产物用HPLC检测,其中色谱柱为Asahipak NH2P-504E,色谱***为waters e2695。检测条件为流动相70%乙腈,上样量20μL,流速0.7mL/min,温度为30℃,洗脱时间40min,示差检测器。检测结果表明产物中由几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖、几丁五糖、几丁六糖及三个更高聚合度的几丁寡糖组成,其中几丁二糖占其中的大部分,其次为几丁四糖、几丁三糖、几丁五糖、几丁六糖等。
在虾壳几丁质水解过程中,在虾壳废弃物粉末中加入50mM pH 3.0乳酸钠缓冲液,使虾壳粉浓度(质量体积分数)为10%,加入酸性蛋白酶P6281,加酶量为1000U/g底物,pH3.0,40℃条件下200rpm振荡反应4h,反应后在12000rpm离心2分钟,固液分离得到沉淀,在该沉淀中按本实施例前述方法加入几丁质酶Chit46进行酶解。研究结果发现,只经过P6281处理而未经过Saccharopepsin处理的样品也能被Chit46水解并达到相似的效果(几丁质回收率85.6%),这表明只要虾壳蛋白的水解达到足以破坏蛋白质-几丁质复合物并使几丁质暴露出来能够与几丁质酶结合的程度就能得到相似的几丁寡糖回收效果,而不需完全除去虾壳中的蛋白质。
发明人团队在研究过程中,曾将表2中分别经酸性蛋白酶(夏盛饲用酸性蛋白酶M型SDG-2421 10000U/g)、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶rNpI的酶解产物经固液分离后所得到的沉淀作为Chit46水解的反应底物,结果发现几丁质回收率都在20%以下。
实施例4虾青素提取及产物分析
虾青素提取所用的底物为实施例3中制备的沉淀(即经过酸性蛋白酶P6281、酸性蛋白酶Saccharopepsin、几丁质酶Chit46水解后的沉淀)。在原始虾壳粉(未经过任何水解步骤)浓度为10%(溶剂为乙酸乙酯),室温条件下(25℃)用乙酸乙酯浸泡2h,反应后在12000rpm离心2分钟,获得的上清在室温中避光烘干,所得即为提取产物,在16~30℃温度范围内均可获得较好的虾青素提取效果;离心后得到的沉淀用乙醇脱色再烘干的产物,即可得到钙粉。
抗氧化性测定参考化妆品-自由基(DPPH)清除实验方法(T/SHRH006-2018),把其中溶剂从乙醇换为甲醇,测定维生素C的对DPPH清除的EC50为15.47μg/mL,所得提取产物对DPPH清除的EC50为0.21μg/mL,抗氧化性是维生素C的72倍。
所得产物先加入等体积10%KOH甲醇溶液室温反应15min以皂化虾青素,皂化产物用HPLC检测,其中色谱柱为waters sunfire C18,色谱***为Shimadzu-LC-20A。检测条件为流动相甲醇:二氯甲烷:乙腈:水=85:5:5:5,,上样量20μL,流速1.5mL/min,温度为37℃,洗脱时间20min,检测波长475nm。检测结果表明产物中虾青素纯度较高,虾青素产量为101.3μg/g虾壳粉。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种虾壳废弃物的新型绿色回收工艺,其特征在于,包括如下步骤:
(1)加入酸性蛋白酶对虾壳废弃物粉末进行第一次水解,固液分离后得到的第一上清液与第一沉淀物,所述的第一上清液为虾壳粉蛋白水解产物;
(2)加入几丁质酶对于第一沉淀物进行第二次水解,固液分离后得到的第二上清液与第二沉淀物,所述的第二上清液为几丁质水解产物;
(3)在第二沉淀物中加入有机溶剂进行提取,固液分离后收集提取液,干燥后即得虾青素。
2.根据权利要求1所述的虾壳废弃物的新型绿色回收工艺,其特征在于:
步骤(1)中所述的酸性蛋白酶为中国专利申请CN201710088628.5所记载的酸性蛋白酶P6281和GeneBank登录号为EPB83353的酸性蛋白酶Saccharopepsin中的至少一种;
步骤(2)中所述的几丁质酶为中国专利申请CN201910064040.5所记载的几丁质酶Chit46。
3.根据权利要求1或2任一项所述的虾壳废弃物的新型绿色回收工艺,其特征在于:
步骤(1)中所述的酸性蛋白酶的加酶量为1000U/g底物;
步骤(2)中所述的几丁质酶的加酶量为50U/g底物。
4.根据权利要求1所述的虾壳废弃物的新型绿色回收工艺,其特征在于:
所述的虾壳废弃物来源为虾、蟹、贝中的一种或至少两种;
步骤(1)中所述的第一次水解的时间为4~10h;
步骤(2)中所述的第二次水解的时间为6h;
步骤(3)固液分离得到的沉淀进行脱色、烘干步骤后,可得到钙粉。
5.根据权利要求1所述的虾壳废弃物的新型绿色回收工艺,其特征在于:
步骤(1)中所述的第一次水解的pH为pH 3~5;
步骤(2)中所述的第二次水解的pH为pH 6;
步骤(2)中所述的第二次水解的温度为45℃;
步骤(2)中所述的几丁质水解产物为聚合度至少为2的几丁寡糖。
6.根据权利要求1所述的虾壳废弃物的新型绿色回收工艺,其特征在于:
步骤(1)中所述的第一次水解的温度为40℃;
步骤(2)中所述的几丁质水解产物为包括聚合度为4以上的几丁寡糖;
步骤(3)中所述的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、石油醚中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的虾壳废弃物的新型绿色回收工艺,其特征在于:
步骤(1)中所述的第一次水解为先用酸性蛋白酶P6281进行第一阶段水解,固液分离得到的沉淀继续用酸性蛋白酶Saccharopepsin进行第二阶段水解;
步骤(1)中所述的虾壳废弃物粉末为先配制成质量体积浓度为10%的溶液再进行所述的第一次水解;
步骤(2)中所述的第二次水解为先将第一沉淀物配制为质量体积浓度为10%的溶液后再进行所述的水解;
步骤(2)中所述的几丁质水解产物为包括聚合度为6以上的几丁寡糖。
8.根据权利要求7所述的虾壳废弃物的新型绿色回收工艺,其特征在于:
当所述的酸性蛋白酶为酸性蛋白酶P6281时,第一次水解的pH为pH 3;
当所述的酸性蛋白酶为Saccharopepsin时,第一次水解的pH为pH 5;
步骤(1)中所述的虾壳废弃物粉末为先配制成质量体积浓度为10%的溶液所用的溶剂为50mM的乳酸钠缓冲液或磷酸钠缓冲液;
步骤(2)中所述的第二次水解为先将第一沉淀物配制为质量体积浓度为10%的溶液所用的溶剂为50mM的磷酸钠缓冲液。
9.根据权利要求1所述的虾壳废弃物的新型绿色回收工艺,其特征在于:
步骤(1)中所述的虾壳废弃物粉末的粒度为可过50目筛;
步骤(3)中所述的提取的时间为2h;
步骤(3)中所述的提取的温度为16~30℃;
步骤(3)的烘干在避光条件下进行。
10.一种虾壳粉蛋白水解产物、几丁质水解产物、虾青素或钙粉,其特征在于,通过权利要求1~9任一项所述的虾壳废弃物的新型绿色回收工艺制得。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111944787A (zh) * | 2020-07-30 | 2020-11-17 | 华南理工大学 | 一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶及其制备方法与应用 |
CN114557951A (zh) * | 2022-04-18 | 2022-05-31 | 南通大学 | 一种保湿角质活化护肤液及其制备方法 |
CN117304085A (zh) * | 2023-09-26 | 2023-12-29 | 湖北兴祥食品有限公司 | 一种利用复合酶从小龙虾废弃物中提取虾青素酯的方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1715255A (zh) * | 2005-05-20 | 2006-01-04 | 林大昌 | 一种用虾壳生产甲壳素、虾青素、蛋白质、钙粉和生物肥料的方法 |
WO2010012039A1 (en) * | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Mars, Incorporated | Process for recovering proteins from crustacean exoskeletons |
CN104140474A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-11-12 | 南京工业大学 | 一种综合利用虾蟹皮中有用物质的方法 |
CN106834336A (zh) * | 2017-02-20 | 2017-06-13 | 华南理工大学 | 一种哈茨木霉酸性蛋白酶p6281的异源表达及纯化方法 |
CN108588157A (zh) * | 2018-04-24 | 2018-09-28 | 大连理工大学 | 组合酶法降解脱脂南极磷虾粉回收多肽中间产物及制备n-乙酰葡萄糖胺的方法 |
CN109679938A (zh) * | 2019-01-23 | 2019-04-26 | 华南理工大学 | 一种几丁质酶Chit46及其表达纯化方法与应用 |
-
2019
- 2019-09-20 CN CN201910893308.6A patent/CN110628854B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1715255A (zh) * | 2005-05-20 | 2006-01-04 | 林大昌 | 一种用虾壳生产甲壳素、虾青素、蛋白质、钙粉和生物肥料的方法 |
WO2010012039A1 (en) * | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Mars, Incorporated | Process for recovering proteins from crustacean exoskeletons |
CN104140474A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-11-12 | 南京工业大学 | 一种综合利用虾蟹皮中有用物质的方法 |
CN106834336A (zh) * | 2017-02-20 | 2017-06-13 | 华南理工大学 | 一种哈茨木霉酸性蛋白酶p6281的异源表达及纯化方法 |
CN108588157A (zh) * | 2018-04-24 | 2018-09-28 | 大连理工大学 | 组合酶法降解脱脂南极磷虾粉回收多肽中间产物及制备n-乙酰葡萄糖胺的方法 |
CN109679938A (zh) * | 2019-01-23 | 2019-04-26 | 华南理工大学 | 一种几丁质酶Chit46及其表达纯化方法与应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
CUOMO,C.等: "ACCESSION:EPB83353,saccharopepsin[Mucor circinelloides 1006PhL]", 《GENBANK》 * |
YI-SU OH等: "Protease produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab shell wastes", 《ENZYME & MICROBIAL TECHNOLOGY》 * |
时杰: "废弃虾蟹壳的资源化利用技术研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111944787A (zh) * | 2020-07-30 | 2020-11-17 | 华南理工大学 | 一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶及其制备方法与应用 |
CN111944787B (zh) * | 2020-07-30 | 2022-03-29 | 华南理工大学 | 一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶及其制备方法与应用 |
CN114557951A (zh) * | 2022-04-18 | 2022-05-31 | 南通大学 | 一种保湿角质活化护肤液及其制备方法 |
CN117304085A (zh) * | 2023-09-26 | 2023-12-29 | 湖北兴祥食品有限公司 | 一种利用复合酶从小龙虾废弃物中提取虾青素酯的方法 |
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