CN117304085A - 一种利用复合酶从小龙虾废弃物中提取虾青素酯的方法 - Google Patents

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CN117304085A CN202311258398.4A CN202311258398A CN117304085A CN 117304085 A CN117304085 A CN 117304085A CN 202311258398 A CN202311258398 A CN 202311258398A CN 117304085 A CN117304085 A CN 117304085A
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Abstract

本发明涉及一种利用复合酶从小龙虾废弃物中提取虾青素酯的方法，所述方法包括采用小龙虾废弃物作为原料，通过酶水解和油萃取步骤从所述原料中提取虾青素酯，其中，所述酶水解的步骤包括先后单独执行的第一酶水解步骤和第二酶水解步骤，所述第一酶水解步骤和第二酶水解步骤采用不同的霉菌。利用本发明的工艺和特定复合酶选取与独立两个水解步骤的使用，可以在工业化条件下生产出品质优异、杂质含量低，抗氧化性有效的虾青素酯。同时，可以改进龙虾提取虾青素的表面化学状态，一定程度上改善排水性，增加在水相中储存时的保存率。

Description

一种利用复合酶从小龙虾废弃物中提取虾青素酯的方法
技术领域
本发明涉及化工和分析化学领域，具体而言，本申请涉及一种利用复合酶和复合酶水解步骤从小龙虾废弃物中提取虾青素酯的方法。
背景技术
虾青素酯(又有称为“虾青素油脂”)中的主要有效成分是虾青素(Astaxanthin)，其具有良好的抗氧化性能，能够增强机体的免疫力，促进抗体生成，同时具备抗氧化和清除自由基的能力。由于其良好的着色能力和生理功能活性，近年来虾青素成为国内外水产养殖、食品、药品、化妆品等领域的研究热点。
小龙虾是近年来群众喜闻乐见的水产消费品，其特别在南方各省份如四川，湖北，湖南，广东有广泛的农产品和食品市场。然而，小龙虾可食用的部分按照原材料重量计算仅仅占到龙虾自身重量的一小部分。在食品消费后，大量的小龙虾头和壳被废弃，处理小龙虾壳与头是产业上面临的问题之一。
为提升龙虾头和壳的利用率，提升产业的附加值，可利用龙虾废弃物提取或分解得到有用的水解产物，例如甲壳素、虾蛋白。发明人已经探索尝试食用小龙虾壳制备甲壳素、虾蛋白以及虾青素。
然而，在工业化生产的进程中，虾青素通常需要有较高的保存和运输标准。现有工业上采用的虾青素保存和运输，或者混合在高比例的油相中进行运输，或者采用低温保存(例如接近0℃的冷藏条件)，再或者对虾青素本身进行改性和化学接枝。复杂的保存、运输条件不利于虾青素酯在低成本的龙虾壳处理后进一步进行产业化应用。
已有研究工作探索了虾青素的制备、分散与改性。例如，中国专利公开CN110218308A涉及了虾青素改性的工艺，其中涉及甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素酯及其制备方法。以化学合成的游离虾青素或者天然来源的游离虾青素为主体骨架，以甲氧基聚乙二醇乙酸为酰基供体及亲水基团，制备了具有高度水溶性的甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素酯。按照该公开文献制备的改性虾青素，可作为水产、畜禽等饲料添加剂；可以作为食品着色剂；可用于医药品和化妆品等行业；可作为功能性成分用于保健食品的开发。因其良好的水溶性，大大提高了虾青素的应用范围。
然而，类似的虾青素改性和进一步通过化学接枝等方法的制备工艺成本高昂，不符合大规模应用虾青素的工业化条件。并且，当虾青素进一步被改性分散在水相中后，实际上不利于虾青素在真正应用于终端产品之前的储藏与运输。这对工业化的应用和生产提出挑战。
相关技术的虾青素制备工艺还存在一个或多个相关问题有待解决。
发明内容
本发明的技术方案解决了相关技术中存在的一个或多个问题。本发明涉及一种利用复合酶从小龙虾废弃物中提取虾青素酯的方法。利用本发明的工艺和复合酶与复合水解步骤的使用，可以在工业化条件下生产出品质优异、杂质含量低，抗氧化性优异的虾青素酯，同时规模化利用了废弃的小龙虾壳。并且重要的是，发明人出人预料的发现，在本发明的单独水解工艺下，可以改进龙虾提取虾青素的表面化学状态，一定程度上改善排水性，增加在水相中储存时的保存率。
根据本发明的技术方案，提供一种利用复合酶从小龙虾废弃物中提取虾青素酯的方法，所述方法包括采用小龙虾废弃物作为原料，通过酶水解和油萃取步骤从所述原料中提取虾青素酯，其中，
所述酶水解的步骤包括先后单独执行的第一酶水解步骤和第二酶水解步骤，所述第一酶水解步骤和第二酶水解步骤采用不同的霉菌。
在可选的技术方案中，所述第一酶水解步骤采用烟曲霉菌进行水解，并且所述第二酶水解步骤采用贝莱斯芽孢杆菌进行水解。其中优选地，所述烟曲霉菌和/或所述贝莱斯芽孢杆菌采用活化后的烟曲霉菌和/或所述贝莱斯芽孢杆菌。
在可选的技术方案中，所述方法包括以下步骤：
采用小龙虾废弃物作为原料，对所述小龙虾废弃物进行粉碎，备用；
第一酶水解步骤，将粉碎的小龙虾废弃物与纯净水按照质量比1：(1-10)置于反应容器中，在反应容器中加入烟曲霉菌粉，其中烟曲霉菌粉按照每千克小龙虾废弃物1克至10克的比例加入进行水解反应，水解反应温度控制在30℃至45℃，得到第一酶解液；
第二酶水解步骤，将所得到的第一酶解液过滤、置于另外的反应容器中，按照原始小龙虾废弃物与水的重量比1：(1-5)加入纯净水；随后，在反应容器中加入贝莱斯芽孢杆菌粉，其中所述贝莱斯芽孢杆菌粉按照每千克小龙虾废弃物1克至10克的比例加入进行水解反应，水解反应温度控制在30℃至45℃，控制所述第二酶水解步骤的水解反应温度控制在30℃至45℃，得到第二酶解液；
将所述第二酶解液离心去除水分，得到虾蛋白泥浆置于消化反应容器，按照所述虾蛋白泥浆的质量与植物油的质量1:(1-5)的比例加入植物油进行萃取，同时进行搅拌，萃取的温度控制在约40℃至50℃；在所述萃取后，将获得的虾青素油状液体用纯净水清洗进一步去除杂质，再经离心处理去除水分，获得从小龙虾废弃物中提取的虾青素酯。
在本发明的第一酶水解步骤和第二酶水解步骤中，水解持续的时间控制在30分钟至120分钟的范围内，优选地控制在45分钟至90分钟的范围内。
在进一步可选的技术方案中，其中在所述第一酶水解步骤和所述第二酶水解步骤中，按每千克小龙虾废弃物的原料计算，所述烟曲霉菌粉的使用量为约2克至约5克，所述贝莱斯芽孢杆菌粉的使用量为约2克至约5克。
在进一步可选的技术方案中，所述第一酶水解反应温度控制在约32℃至38℃的范围内，优选地，控制在33至35℃的范围内；所述第二酶水解反应温度控制在约32℃至38℃的范围内，优选地，控制在33℃至35℃的范围内；并且其中
在所述第一酶水解步骤和第二酶水解步骤的反应容器外部设置冷却水套，以控制水解的反应温度在相应的范围内。
在进一步可选的技术方案中，在所述萃取步骤中，所述植物油的萃取温度控制在约42℃至48℃的范围内，更优选地，所述萃取温度控制在约45至46℃之间。
在进一步可选的技术方案中，所述植物油选自大豆油、花生油、菜籽油中的一种、或其混合物。
在进一步可选的技术方案中，其中所述第一酶水解步骤和第二酶水解步骤采用的所述不同的霉菌来自商业采购的霉菌。
在进一步可选的技术方案中，其中所述小龙虾废弃物包括含有水分的小龙虾头和小龙虾壳。
在进一步优选的方案中，所述第一酶水解中采用烟曲霉菌，所述烟曲霉菌通过以下方法进一步活化：
步骤1)培养液的制备：按照总重量1000克制备培养液，其中所述培养液中含有KH2PO4 1克-5克，Na2HPO4·7H2O 5克-10克，NaCl 0.1克-1克，酵母粉5克-20克，MgSO4·7H2O0.1克-1克，CaCl2 0.1克-0.5克，再加入粉碎后的玉米粉10克-30克，余量为纯净水；
步骤2)菌株活化：将在4-8℃下保藏的烟曲霉菌接种于马铃薯琼脂斜面培养基上，于20-30℃下活化培养1-3天；将活化后的烟曲霉放入无菌水中，振荡制得烟曲霉孢子悬浮液，烟曲霉孢子悬浮液中烟曲霉孢子浓度为1×106至5×106个/mL；以及
步骤3)第一水解酶粉的制备：向100mL-500mL培养液中加入50mL-150mL烟曲霉孢子悬浮液，于20-30℃的摇床中发酵培养24至72小时；发酵后的培养液于3-15℃环境温度下进行离心处理，所得的离心液体部分在低温干燥，粉碎，得到作为第一水解酶的烟曲霉粉。
本发明的特点和优点将进一步在具体实施方式和说明书附图、表中进行说明和阐释。
在本发明的技术方案中，可以包括上述的各个工艺步骤，同时还可包括其他相关步骤。在优选的方案中，本发明的实施方案仅由所述工艺步骤构成，而不含有其他工艺或额外的处理方法。
以下，将结合具体实施方式，对本发明的技术方案及优点做出更加详细的解释和说明。应当理解的是，说明书、具体实施方式中所呈现的内容，仅仅为了更加清楚地说明本发明的技术方案及其优点，并不对本发明的保护范围构成限制。本领域技术人员能够在说明书公开内容的基础上，针对各种合理的变换得到变化后的技术方案，只要不脱离本发明的精神，各种变化后的技术方案均应当理解为被包括在本发明的保护范围之内。
附图说明
附图用来提供对本公开技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的具体实施方式一起用于解释本公开的技术方案，并不构成对本公开技术方案的限制。
图1是本发明实施例1制备得到的虾青素样品的分光光谱测试图，其中横坐标表明扫描时间，纵坐标表明相应的吸光光度值mAu；
图2是本发明对比试验(C3)的样品表面氨基酸色谱图谱，其中图谱的横坐标表明扫描时间(刻度)，纵坐标表明各个峰值的色谱相对强度；
图3示出了根据本发明实施例1(E1)制备得到的虾青素样品的表面氨基酸色谱图谱。
图4示出了根据本发明实施例1(E1)制备得到的虾青素样品针对肺癌人类肺泡基底上皮细胞系(A549)的抗氧化和抗癌细胞特性测试图谱。
具体实施方式
在下文中更详细地描述了本发明以有助于对发明的理解。
在具体实施方案的叙述之前，需要说明的是，本说明书具体实施方式所述的原料来源是非限制性的，本领域技术人员能够根据本发明的启示和教导来选择适当的原材料以及测试设备进行相关的测试并能够获得相应的结果，对于没有说明具体生产厂商或者途径的原料，本领域技术人员能够根据本说明书的公开内容和需求选择满足相应需求的原材料作为反应起始物质。合成部分各个阶段的原料来自本发明前序步骤中合成的初次产品，这根据本发明的说明书的公开也是可以理解的。
表1中列出了本发明采用的主要原材料和相应的获得渠道或原材料产地，其中公开了相应酶菌种的采购来源和保藏编号。需要说明的是，本发明未经说明的原材料，是本领域技术人员根据普通技术知识和已有的市场产品，可以获得的原材料品种。
表1：主要原料和测试方法
*注：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在本实施方案中的第一水解酶来自表1中所示的烟曲霉菌。烟曲霉自身具备一定的发酵和脂肪水解功能。在优选的方案中，为了进一步提升烟曲霉的虾壳水解性能，在实施方案中，可以对于商业采购的烟曲霉进行以下步骤的发酵培养。
1)培养液的制备：按照总重量1000克制备培养液，其中加入KH2PO4 2克，Na2HPO4·7H2O 8克，NaCl 0.5g，酵母粉10克，MgSO4·7H2O 0.5克，CaCl2 0.1克，再加入粉碎后的玉米粉15克，余量为纯净水，各组分搅拌均匀作为培养液；
2)菌株活化：将在4-8℃下保藏的表1中的烟曲霉接种于马铃薯琼脂斜面培养基上，于30℃下活化培养2天；将活化后的烟曲霉用针刮入无菌水中，振荡制得烟曲霉孢子悬浮液，烟曲霉孢子悬浮液中烟曲霉孢子浓度为2×106至3×106个/mL。
3)活化第一水解酶粉的制备：向100mL培养液中加入50mL烟曲霉孢子悬浮液，于28℃、转速100-150rpm的摇床中发酵培养3天。发酵后的培养液于5-10℃环境温度下，3000rpm下离心2min，所得的离心液体部分在10℃左右的温度下低温烘干去除水分，可根据需要进行粉碎，得到第一水解烟曲霉粉，在10-20℃的环境温度下保存。
在以下的实施例和对比例中，可以采用来自保藏编号为CGMCC No.17045的经过上述活化以后得到的活化烟曲霉菌，作为第一水解酶使用。
在本实施方案中的第二水解酶来自表1中所示的贝莱斯芽孢杆菌。贝莱斯芽孢杆菌自身同样具备一定的发酵和脂肪酶水解功能。在本发明优选的实施方案中，可以利用表1采购的贝莱斯芽孢杆菌进行活化，得到活化的贝莱斯芽孢杆菌。在贝莱斯芽孢杆菌的活化中，按照贝莱斯芽孢杆菌与培养液的质量比1:100置于培养容器中，保持活化温度30-35℃，培养12小时至36小时。在培养液中，每1千克培养液中含有葡萄糖0.1wt％至0.3wt％，酵母粉1wt％至2wt％，MgSO4·7H2O 0.1wt％至0.5wt％，余量为纯净水。活化结束后对混合液进行离心分离，收集上清液，在常温下烘干，粉碎，得到活化后的贝莱斯芽孢杆菌粉。
在以下的实施方式中，可以在商业采购菌种的基础上，采用活化后的贝莱斯芽孢杆菌粉作为第二水解酶使用。
实施例1(E-1)
将商业采购的小龙虾废弃物(包括小龙虾头，小龙虾壳，简单冲洗滤干，不经过额外的烘干和预处理)1kg使用绞肉机充分粉碎，备用；将粉碎的小龙虾废弃物与纯净水按照粉碎的小龙虾废弃物：纯净水为1:2的比例置于反应罐中；随后，加入所述烟曲霉粉2g(经上述进一步活化的烟曲霉)，控制反应罐温度为32℃至36℃，搅拌反应持续60分钟，再停止搅拌消化30分钟，得到第一酶解液。
接下来，将上述步骤得到的第一酶解液用滤网常压下过滤，再次置于新的反应罐中，按照原始1kg的小龙虾废弃物重量1：1的质量比加入纯净水；随后，加入所述贝莱斯芽孢杆菌粉末2克(经上述活化后的贝莱斯芽孢杆菌)，同样控制温度为32℃至36℃，搅拌反应90分钟，再停止搅拌消化30分钟，自然冷却至常温；
将上述得到的反应产物用离心机(离心速度3000r/min)离心10分钟，得到虾蛋白泥浆。将所得到的虾蛋白泥浆置于消化反应容器，按照虾蛋白泥浆的质量1：2的比例加入大豆油，温度加热至45-46℃保持所述温度60分钟，期间持续搅拌对虾青素进行萃取；萃取结束后加入1kg纯净水，搅拌30分钟后进行3000r/min的离心处理，得到下层的固化物虾蛋白(沉淀相和水)和上层的虾青素酯油状液体；
将虾青素酯油状液体反复用纯净水洗涤除去杂质，再经过离心处理排除水分，最终获得纯度98％wt的虾青素酯5.2克(参见图1的分光光度计测试图谱，经归一化处理后得到样品虾青素酯含量)，其中未检出铅、汞，镉；铬仅0.02mg/kg，砷0.06mg/kg。
实施例1’(E-1’)
本实施例采用与实施例1完全相同的工艺和步骤。不同的是，第一酶水解步骤和第二酶水解步骤中采用原生采购的烟曲霉粉和贝莱斯芽孢杆菌粉，未经过活化步骤。
经过实施例1的相应工艺水解、萃取处理后，对于所述1kg的商业采购的小龙虾废弃物，最终获得虾青素酯2.9克。其中未检出铅、汞；铬仅0.04mg/kg，砷0.09mg/kg，镉含量为0.005mg/kg。
从实施例1’的实施方案对比实施例1可以看出，不经过活化或发酵处理的烟曲霉粉和贝莱斯芽孢杆菌粉在水解温度下保持一段时间后，具备一定的水解虾壳的功能，但水解功能和提取效率显著低于实施例1中的虾青素水解和提取效率。在本发明优选的方案中，优选采用活化后的第一水解酶和第二水解酶。
对比例1(C-1)
仍然采用与实施例1接近的第一阶段的步骤，将商业采购的小龙虾废弃物(包括小龙虾头，小龙虾壳，简单冲洗滤干，不经过额外的烘干和预处理)1kg使用绞肉机充分粉碎，备用；将粉碎的小龙虾废弃物与纯净水按照粉碎的小龙虾废弃物：纯净水为1:2的比例置于反应罐中；随后，加入所述烟曲霉粉2g，控制反应罐温度为32℃至36℃，搅拌反应持续60分钟，再停止搅拌消化30分钟，得到第一酶解液。
接下来，不经过贝莱斯芽孢杆菌粉末的第二阶段酶水解，而是将对比例1第一阶段的产物直接用离心机(离心速度3000r/min)离心10分钟，得到虾蛋白泥浆。将所得到的虾蛋白泥浆置于消化反应容器，按照虾蛋白泥浆的质量1：2的比例加入大豆油，温度加热至45-46℃保持所述温度60分钟，期间持续搅拌对虾青素进行萃取；萃取结束后加入1kg纯净水，搅拌30分钟后进行3000r/min的离心处理，得到下层的固化物虾蛋白(沉淀相和水)和上层的虾青素酯油状液体；
将虾青素酯油状液体反复用纯净水洗涤除去杂质，再经过离心处理排除水分，最终获得纯度98％wt的虾青素酯4.1克，其中未检出铅、汞；铬0.08mg/kg，砷0.12mg/kg；镉含量为0.002mg/kg。
对比例2(C-2)
在本试验中，实施例1中的初始原料小龙虾废弃物1kg使用绞肉机充分粉碎；
此后，不经过实施例1中第一阶段的烟曲霉预水解处理，而直接将粉碎后的原料置于反应罐中，按照1kg的小龙虾废弃物重量1：1的质量比加入纯净水；随后，加入所述贝莱斯芽孢杆菌粉末2克(g)，同样控制温度为32℃至36℃，搅拌反应120分钟，再停止搅拌消化30分钟，自然冷却至常温；
此后，将上述得到的反应产物用离心机(离心速度3000r/min)离心10分钟，得到虾蛋白泥浆。将所得到的虾蛋白泥浆置于消化反应容器，按照虾蛋白泥浆的质量1：2的比例加入大豆油，温度加热至45-46℃保持所述温度60分钟，期间持续搅拌对虾青素进行萃取；萃取结束后加入1kg纯净水，搅拌30分钟后进行3000r/min的离心处理，得到下层的固化物虾蛋白(沉淀相和水)和上层的虾青素酯油状液体；
将虾青素酯油状液体反复用纯净水洗涤除去杂质，再经过离心处理排除水分，最终获得纯度98％wt的虾青素酯2.1克，其中未检出铅、汞；铬0.09mg/kg，砷0.1mg/kg；镉含量为0.005mg/kg。
对比例3(C-3)
在本试验中，将实施例1的烟曲霉菌粉和贝莱斯芽孢杆菌粉末在相同的步骤中同时使用。具体地，将同重量的商业采购的小龙虾废弃物1kg使用绞肉机充分粉碎，备用；将粉碎的小龙虾废弃物与纯净水按照粉碎的小龙虾废弃物：纯净水为1:2的比例置于反应罐中；随后，加入所述烟曲霉粉2克以及贝莱斯芽孢杆菌粉末2克，控制反应罐温度为32℃至36℃，搅拌反应持续90分钟，再停止搅拌消化45分钟，得到酶解液。
将上述得到的反应产物用离心机(离心速度3000r/min)离心10分钟，得到一次反应后的虾蛋白泥浆。将所得到的虾蛋白泥浆置于消化反应容器，按照虾蛋白泥浆的质量1：2的比例加入大豆油，温度加热至45-46℃保持所述温度60分钟，期间持续搅拌对虾青素进行萃取；萃取结束后加入1kg纯净水，搅拌30分钟后进行3000r/min的离心处理，得到下层的固化物虾蛋白(沉淀相和水)和上层的虾青素酯油状液体；
将虾青素酯油状液体反复用纯净水洗涤除去杂质，再经过离心处理排除水分，最终获得纯度98％wt的虾青素酯4.2克，其中未检出铅、汞，镉；铬0.01mg/kg，砷0.05mg/kg。
从上述制备例可以看出，经过分别使用第一水解酶和第二水解酶先后两次水解得到和提取的虾青素酯产率，高于单独使用一种水解酶或两种水解酶同时使用时的产率，同时实施例制备得到的虾青素有害物质含量略低于对比例1-3制备得到的相关虾青素产品。
以下，发明人针对非常关心的虾青素酯产品保存期限、表面状态以及抗氧化能力等性能做出测试、表征和分析。
测试实验1
在本实验1中，对虾青素酯在储存样品中的相对含量进行标定。随后在样品以虾青素酯：纯水质量比1:10的避光环境下在大约15℃的环境温度中保存(其中保存体系中加入占总质量0.1wt％的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris)缓冲溶液维持中性的pH值)15天，根据保存前后分光仪对虾青素酯成分的测定结果，判定所保存虾青素酯的损失率(L)。
在具体的测试中，将实施例和对比例中待测试的虾青素酯样品放置于容量瓶中，用二甲基亚砜稀释到吸光度值在0.4～0.75之间。以二甲基亚砜作为空白对照，在485nm波长下测定其吸光度值，用如下公式计算样品中虾青素酯的含量：
虾青素酯相对含量C％＝(A485nm*f)/(1908*m)，其中
式中，A485nm为485nm下被测样品的吸光度值；f为稀释倍数；1908为消光系数；m为被测样品的重量(g)。
根据保存前后的样品测定虾青素酯的含量，最后计算贮藏过程中虾青素酯的损失率，以评价其稳定性。
虾青素酯的损失率L＝(Cn-C0)/C0 x 100％。
同时，对各个虾青素酯样品与纯净水的接触角进行测试(A，单位为度)。
Cn为贮藏过程后样品虾青素酯相对含量；C0为起始样品中虾青素酯相对含量。测试结果请参见以下表2：
表2：不同实验的虾青素酯保存率测试
发明人通过对实施例1，1’和对比例1比较后出人预料的发现，通过本发明制备的双步骤前后两种酶水解后得到的虾青素酯产物获得了显著更佳的储存运输条件。在模拟的长途运输或较长时间保存条件下，E-1在中性的水性环境长时间储存后，保持了超过80％的虾青素酯维持率，相比C1至C3的虾青素维持率提升超过30％(不同样品保存率之间相对的比值)。值得注意的是，在发明人实施的C-3试验中，同时在相同步骤中使用了烟曲霉菌和贝莱斯芽孢杆菌的复合菌群进行酶解，但取得的虾青素储存保持效率不如实施例E-1中采用两步分离的两步酶水解方法取得的保持率更佳。这样的现象申请人希望通过以下的虾青素表面部分的化学测试进一步做出部分的解释和说明。
测试实验2
在本测试试验中，对各个虾青素酯制备样品的表层沉积部分取样进行测试。发明人发现，在C1至C3的单种酶水解或单步骤双酶水解过程中，产生了各种杂类氨基酸，这些氨基酸由于相比虾青素酯分子链更低，在储存过程中附于虾青素酯的表面。例如，发明人对C3的虾青素酯样品通过岛津Essentia LC-16AAA色谱测量分析仪发现，C3样品表面存在大量的杂类氨基酸，该测试结果可参考下表3以及图2：
表3：对比例样品(C3)的表面氨基酸色谱分析图表
而与对比例不同，在本发明的实施例1中，采用特定的两种水解酶先后水解，使得大部分氨基酸从样品的表面消失。在对实施例1样品的测试中，仅在缬氨酸的峰位测试出缬氨酸的含量(见说明书附图“图3”)。在实施例样品1.0-2.0的扫描时间刻度内，没有出现其他氨基酸的峰值。根据色谱仪和样品的归一换算，得出实施例1中表面部分缬氨酸的含量为16.3mg/Kg。
发明人对此不希望受制于任何理论上的束缚和解释。然而，一种可能的解释是，对于本发明的实施例而言，在首个水解步骤中使用烟曲霉菌对小龙虾废弃物进行水解时，烟曲霉菌对于孤立多环芳烃和稠合多芳烃有较强的水解和分解作用，从而在第一个步骤中有效地将小龙虾壳中有机物质的高稠环芳烃进行降解。从而，在接下来的第二水解步骤中，贝莱斯芽孢杆菌的辅助增强水解作用使得多种杂氨基酸有效分解，仅保留少量的缬氨酸于样品中。而对于对比例的样品，在单个酶水解步骤中，或在两种酶同时使用的水解步骤中，高稠环芳烃没有充足的降解时间和分解条件，这导致水解后段的大分子分解较为剧烈，产生较多种类的杂类氨基酸。
对于样品的储存条件而言，对比例中大量的氨基酸属于极性分子，具有较强的亲水性。例如，苏氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸以及色氨酸等极性氨基酸基团，会破坏虾青素酯表面具有的一定的油相特性，使得表面趋向于亲水，在长期的储存过程中，不利于虾青素酯本身品质的保存。而对实施例而言，杂项氨基酸种类明显减少，而少量的缬氨酸是一种非极性氨基酸，因此缬氨酸是疏水性的。少量的但种类缬氨酸位于虾青素酯样品的表面，一定程度保护并增强了虾青素酯表面的疏水性能，这提升了虾青素酯长期在中性纯水环境中的保留率，起到了良好的协同保护作用。
值得指出的是，本发明实施方案中采用的两种脂肪水解酶，不需要更多额外的接枝、基因变异或改性处理，仅从已有保藏制备的菌种中进行筛选即可用于实验和生产，这更有利于小龙虾废物处理过程中的批量生产和工业化制造。
实施例2-4(E-2至E-4)
在另外的实验方案中，发明人执行与实施例1相同的步骤(采用活化后的相应菌种)，但对两步分段水解的技术参数进行相应的调整，并对相关的样品做出与E-1、C-1至C-3相同的测试。实验结果和测试情况如下表：
表4：不同参数下两步分段水解的虾青素实验
在实施例2至实施例4中，发明人更改了虾青素提取的工艺。在实验例E2中，发明人显著改变了所采用的复合酶的使用比例。在E-2.1中单方面增加了烟曲霉使用比例，在实验例E-2.2中，单方面相比实施例1增加了贝莱斯芽孢杆菌的使用量。从实验结果来看，增加单种脂肪水解酶的使用比例没有有效提升虾青素酯长期保留效率，并且在反应水解过程中出现泡沫显著增加，水解反应温度波动大等附加问题。因而，在本发明优选的方案中，相对于每1kg小龙虾废弃物原料，第一水解酶和第二水解酶的用量优选分别为2g-5g。即，第一水解酶和第二水解酶的用量优选分别为2g/kg原料至5g/kg原料，可以有效解决水解泡沫过多和水解温度难以调控的问题，同时能够进一步优化杂项氨基酸的去除。
在E-2.3中，当第一水解酶和第二水解酶的用量显著降低时，虾青素酯后期的保存稳定性有所下降，同时，虾青素酯的提取率有所下降，相对于实施例1的其他相同工艺而言，小龙虾废弃物1kg中提取最终获得相同的虾青素酯约为3.9克。同时，第一酶水解步骤似乎是主要酶水解步骤，第二酶水解可能相对为辅助的酶水解步骤。
在E3的实验中，当水解温度提升至40-45℃时，对于虾青素的接触角和保存储存率影响不显著。但是当针对本发明的第一水解酶和第二水解酶的水解反应温度在35℃基础上提升5℃或更高时，水解效率显著降低。在相比实施例1的其他相同制备参数的条件下，小龙虾废弃物1kg中提取最终获得相同的虾青素酯约仅为1.8克。因此，考虑到水解提取效率，在本发明烟曲霉菌与贝莱斯芽孢杆菌的组合条件下，精确控制水解温度在32-38℃，更优选地，可控制在33-35℃。如果水解过程的自然发热使得温度超过所控制的温度，本发明实施方案还可在反应罐外部增加冷却水套，控制温度在所需要的范围。
在实验例E-4.1中，发明人提高了植物油(大豆油)的萃取温度。发明人发现，单纯提高植物油的提取温度，对后续纯虾青素酯的保存率影响不显著。但在相比实施例1的其他相同制备参数的条件下，小龙虾废弃物1kg中提取最终获得相同的虾青素酯约仅为3.4克，并且检测到水解后的虾青素酯存在于水相中。因此，在本发明优选的技术方案中，植物油的萃取温度优选地为约42℃至48℃，更优选地选择约45至46℃。
测试实验3
在本实验中，对本发明制备的虾青素酯的抗氧化性和癌症细胞的毒性进行测试。
3.1实验材料
细胞模型：肺癌人类肺泡基底上皮细胞系A549，由北京中科光分析科学技术研究所(食品实验室)代为保存。培养条件：1640+10％胎牛血清、37℃、5％的CO2。
3.2.实验原理及方法
实验原理
实验采用CellTiter-GloTM(Promega)试剂盒检测样品对细胞的毒性作用，
CellTiter-Glo试剂盒通过对ATP进行定量测定来检测培养物中活细胞数目。有代谢活性细胞的呼吸作用和其他生命活动过程可以产生ATP，试剂盒中使用萤光素酶生成的稳定辉光型信号，发光过程中萤光素酶需要ATP的参与。向细胞培养基中加入CellTiter-Glo试剂测量发光值，光信号和体系中ATP量成正比，而ATP量和活细胞数呈正相关，因此光信号值可以反映活细胞的数目。
实验步骤
1)将A549细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；
2)取50ul吐温80和50ul虾青素油脂(取本申请实施例1制备得到的虾青素酯)搅拌混匀，再加900ul的PBS(作为溶剂)混匀作为5％浓度的虾青素油脂样品：
3)样品用1640培养基从2倍最高检测浓度起连续3倍梯度稀释8个梯度，双孔检测。将药物及适量培养基加入到细胞中，于37℃的5％CO2培养箱中培养。加药培养48h后，显微镜下观察药物引起的细胞病变效应(CPE)，加入CellTiter-Glo检测细胞存活率。药物对细胞的毒性以细胞的活性表示。
计算公式：细胞活性(％)＝药物组数值/细胞对照组平均值*100
测结果
虾青素油脂对A549细胞的毒性结果如表5及图4所示。
表5：虾青素油脂对癌细胞的毒性检测
样品 溶解溶剂 储存浓度 毒性最大检测浓度
虾青素油脂 吐温80加PBS 约100％ 2.5％
从图4中可以看出虾青素油脂在2.5％、0.83％、0.28％、0.09％、0.03％浓度下癌细胞被毒死，在0.01％浓度下癌细胞毒性较大，细胞存活率为54.43％，在0.003％浓度下毒性很小，细胞存活率为94.35％，在0.001％浓度下无明显细胞毒性，细胞存活率为99.1％。
从实验可以看出，本实验实施方案制备的虾青素酯能够有效地起到抗氧化作用，有效针对癌细胞进行抵抗，可以在满足适当条件下作为食品和药品的添加剂和/或原料。此外，从实施例1的技术方案的测试结果可以看出，本发明实施方案中的虾青素排除了多种杂类氨基酸，保证了虾青素酯优异的抗氧化性和对癌细胞的抵抗效果。
根据本发明说明书记载的实施方案和技术内容，本发明至少可以提供以下技术方案：虽然本公开内容包括具体的实施例，但是对本领域的技术人员明显的是在不偏离本权利要求和其等同技术方案的发明要点和范围的情况下，可以对这些实施例做出各种形式上和细节上的替换或变动。本文中描述的实施例应被认为只在说明意义上，并非为了限制的目的。在每一个实施例中的特征和方面的描述被认为适用于其它实施例中的相似特征和方面。因此，本公开的范围不应受到具体的描述的限定，而是受权利要求技术方案的限定，并且在本权利要求和其等同物的范围内的所有变化被解释为包含在本公开的技术方案之内。

Claims (10)

1.一种利用复合酶从小龙虾废弃物中提取虾青素酯的方法，所述方法包括采用小龙虾废弃物作为原料，通过酶水解和油萃取步骤从所述原料中提取虾青素酯，其中，
所述酶水解的步骤包括先后单独执行的第一酶水解步骤和第二酶水解步骤，所述第一酶水解步骤和第二酶水解步骤采用不同的霉菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一酶水解步骤采用烟曲霉菌进行水解，并且所述第二酶水解步骤采用贝莱斯芽孢杆菌进行水解；其中优选地，所述烟曲霉菌和/或所述贝莱斯芽孢杆菌采用活化后的烟曲霉菌和/或所述贝莱斯芽孢杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
采用小龙虾废弃物作为原料，对所述小龙虾废弃物进行粉碎，备用；
第一酶水解步骤，将粉碎的小龙虾废弃物与纯净水按照质量比1：(1-10)置于反应容器中，在反应容器中加入烟曲霉菌粉，其中烟曲霉菌粉按照每千克小龙虾废弃物1克至10克的比例加入进行水解反应，水解反应温度控制在30℃至45℃，得到第一酶解液；
第二酶水解步骤，将所得到的第一酶解液过滤、置于另外的反应容器中，按照原始小龙虾废弃物与水的重量比1：(1-5)加入纯净水；随后，在反应容器中加入贝莱斯芽孢杆菌粉，其中所述贝莱斯芽孢杆菌粉按照每千克小龙虾废弃物1克至10克的比例加入进行水解反应，水解反应温度控制在30℃至45℃，控制所述第二酶水解步骤的水解反应温度控制在30℃至45℃，得到第二酶解液；
将所述第二酶解液离心去除水分，得到虾蛋白泥浆置于消化反应容器，按照所述虾蛋白泥浆的质量与植物油的质量1:(1-5)的比例加入植物油进行萃取，同时进行搅拌，萃取的温度控制在约40℃至50℃；在所述萃取后，将获得的虾青素油状液体用纯净水清洗进一步去除杂质，再经离心处理去除水分，获得从小龙虾废弃物中提取的虾青素酯。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在所述第一酶水解步骤和所述第二酶水解步骤中，按每千克小龙虾废弃物的原料计算，所述烟曲霉菌粉的使用量为约2克至约5克，所述贝莱斯芽孢杆菌粉的使用量为约2克至约5克。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一酶水解反应温度控制在约32℃至38℃的范围内，优选地，控制在33至35℃的范围内；所述第二酶水解反应温度控制在约32℃至38℃的范围内，优选地，控制在33℃至35℃的范围内；并且其中
在所述第一酶水解步骤和第二酶水解步骤的反应容器外部设置冷却水套，以控制水解的反应温度在相应的范围内。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在所述萃取步骤中，所述植物油的萃取温度控制在约42℃至48℃的范围内，更优选地，所述萃取温度控制在约45至46℃之间。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述植物油选自大豆油、花生油、菜籽油中的一种、或其混合物。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一酶水解步骤和第二酶水解步骤采用的所述不同的霉菌分别来自商业采购的霉菌。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述小龙虾废弃物包括含有水分的小龙虾头和小龙虾壳。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述第一酶水解中采用烟曲霉菌，所述烟曲霉菌粉通过以下方法进一步活化：
步骤1)培养液的制备：按照总重量1000克制备培养液，其中所述培养液中含有KH2PO4 1克至5克，Na2HPO4·7H2O 5克至10克，NaCl 0.1克至1克，酵母粉5克至20克，MgSO4·7H2O 0.1克至1克，CaCl2 0.1克至0.5克，再加入粉碎后的玉米粉10克至30克，余量为纯净水，搅拌均匀得到培养液；
步骤2)菌株活化：将在4-8℃下保藏的烟曲霉菌接种于马铃薯琼脂斜面培养基上，浸泡于上述培养液中，于20-30℃下活化培养1至3天；将活化后的烟曲霉放入无菌水中，振荡制得烟曲霉孢子悬浮液，烟曲霉孢子悬浮液中烟曲霉孢子浓度为1×106至5×106个/mL；以及
步骤3)活化第一水解酶粉的制备：向100mL-500mL培养液中加入50mL-150mL烟曲霉孢子悬浮液，于20-30℃的摇床中发酵培养24至72小时；发酵后的培养液于3至15℃环境温度下进行离心处理，所得的离心液体部分干燥，粉碎，得到作为第一水解酶的活化烟曲霉粉。
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