CN113862192B - 南极微小杆菌dw2及其制备几丁寡糖的方法 - Google Patents

南极微小杆菌dw2及其制备几丁寡糖的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113862192B
CN113862192B CN202111256631.6A CN202111256631A CN113862192B CN 113862192 B CN113862192 B CN 113862192B CN 202111256631 A CN202111256631 A CN 202111256631A CN 113862192 B CN113862192 B CN 113862192B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chitin
solution
chitinase
preparing
shrimp shell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111256631.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113862192A (zh
Inventor
付星
梁传祥
吕继冉
吕艾春
姚炎
郭圣楠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN202111256631.6A priority Critical patent/CN113862192B/zh
Publication of CN113862192A publication Critical patent/CN113862192A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113862192B publication Critical patent/CN113862192B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一株南极微小杆菌DW2及其制备几丁寡糖的方法，先从采集自中国渤海的海水样中筛选出一株产几丁质酶的耐冷细菌，鉴定为南极微小杆菌DW2，其保藏编号为：CCTCC NO:M2019536。该方法首先将虾壳粉经HCl溶液浸泡、NaOH溶液水解、HCl溶液浸泡、脱色、浓盐酸研磨得到虾壳胶体几丁质，然后将南极微小杆菌DW2培养得到几丁质酶粗酶液，将虾壳胶体几丁质溶于磷酸‑柠檬酸缓冲液中得到混合溶解液；向混合溶解液中添加几丁质酶粗酶液反应得到几丁寡糖成品。本发明生产中不产有毒有害物质，几丁质酶具有专一性和高效性，在生产中几乎无副反应，所得酶解几丁寡糖含量极高，产物成分较单一，便于后续分离纯化。

Description

南极微小杆菌DW2及其制备几丁寡糖的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种南极微小杆菌DW2及其制备几丁寡糖的方法。
背景技术
几丁质微生物来源的几丁质酶具有生产速度快、产量高、性能稳定等优点，已成为几丁质酶研究的主要来源。几丁质主要来源是甲壳类动物如虾、蟹等，是海洋环境最重要的营养源和能源，同时又是我国水域主要的有机污染源之一。传统几丁质相关产品的生产主要是通过化学酸水解法来获得，生产过程对环境造成了较大的污染，且降解过程难以控制，产物混杂，生物学活性难以保证。酶催化水解几丁质制备几丁寡糖等产品是一种高效、环保的制备方法。
小龙虾学名为克氏原螯虾，是一个淡水小龙虾种现广泛分布于长江中下游各省市。小龙虾壳中几丁质含量丰富，其中虾头中几丁质含量达10％～15％，鲜湿虾壳中约含5.5％的几丁质，而干虾壳中几丁质含量高达20％～30％。小龙虾壳为虾仁加工或食用后的废弃物，长期以来未得到很好的利用，既浪费了资源，又污染了环境。因此，以小龙虾壳为原料生产几丁质具有综合利用资源和保护环境的双重意义。
低温几丁质酶具有低温下高催化效率，结构高效柔顺性和热不稳定性等生物学特性，使其在应用上比中温酶、高温酶更有优势。然而，与中温几丁质酶相比，低温几丁质酶的研究开展得还很少，在国内报道也较少。目前，国外研究人员在海洋细菌(Moritellamarina)，弧菌(Vivriosp.98CJ11027)，链霉菌(Streptomycessp.DAll)，假单胞菌(Pseudomonassp.BK1)等微生物中筛选到多种不同低温几丁质酶，但是其酶活力相对较低，不能满足工业化生产要求。国内也有相关报道，2006年曾润颖等从南极分得一株具有较高产酶活性的嗜冷菌株AC167，经检测，该酶活力最高可达4.5U/mg；2014年王晓辉等从大连渤海湾的底泥样品中分离到1株高产低温几丁质酶的海洋细菌DL-06，经优化，酶活力达6.87U/mL。
关于产几丁质酶细菌的筛选及其产几丁寡糖的研究国内已有一些专利报道，如申请号为201110258893.6的中国发明专利公开了一株产几丁质酶的细菌Chitiniphilushaikoumangrovensis，并利用该菌所产的几丁质酶降解胶体几丁质制备几丁寡糖，但该专利并未涉及几丁质来源问题。关于从废弃小龙虾壳中提取几丁质并进行后续加工的研究也有一些，但鲜有应用产几丁质酶细菌的筛选及其产几丁寡糖的技术参与处理废弃小龙虾壳的相关专利报道
国内关于几丁质酶的研究起步较晚，目前还没有实现产业化。能否获得产酶量高、酶学性质优异的几丁质酶，并利用其降解几丁质产生几丁寡糖对于我国提高我国农业副产物综合利用的效率具有重要意义。在国内外尤其少见以小龙虾壳为原料制备的几丁质为原料生产几丁寡糖的研究。因此，利用低温几丁质酶降解以小龙虾壳为原料制备的几丁质生产几丁寡糖具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种南极微小杆菌DW2及其制备几丁寡糖的方法，本发明从采集自中国渤海的海水样中筛选得到一株产几丁质酶的南极微小杆菌DW2，并研究了其产生的几丁质酶的酶学性质，最后应用该酶水解小龙虾壳几丁质，制备高纯度几丁寡糖。
为实现上述目的，本发明所设计一种南极微小杆菌DW2，其分类命名为Exiguobacterium antarcticum DW2，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2019536，保藏日期为2019年7月10日，地址：中国武汉武汉大学。
本发明还提供了一种制备几丁寡糖的方法，包括以下步骤：
1)虾壳胶体几丁质的制备：
a.将新鲜小龙虾壳洗净、球磨粉碎，得到虾壳粉；
b.将虾壳粉置于HCl溶液中浸泡，期间不断搅拌除去虾壳中的矿物质，直至无气泡产生后倾去酸液，然后沉淀水洗至中性，得到酸解壳粉；
c.再用NaOH溶液水解处理步骤b)所得的酸解壳粉(水解除去虾壳中的蛋白质)，倾去NaOH溶液，然后沉淀水洗至中性，得到碱解壳粉；
d.再用HCl溶液浸泡上述步骤c)所述碱解壳粉，浸泡后倾去酸液，然后沉淀水洗至中性，即得到几丁质粗品；
e.再用超声波辅助过氧化氢(H2O2)溶液对几丁质粗品脱色处理，直至全部变成白色，水洗，干燥，即得到白色的虾壳几丁质；
f.向白色的虾壳几丁质加入浓盐酸，研磨至虾壳几丁质全部溶解成糊状，得到溶有小龙虾壳几丁质的酸液，静置，反复洗涤至pH接近中性，收集得到白色胶体状物质，即为虾壳胶体几丁质；
2)小龙虾几丁寡糖的制备：
a.将权利要求1所述南极微小杆菌DW2接入种子培养基中摇床培养，得到种子液；
b.将所述种子液接入产酶培养基中培养，将培养物离心，取上清，得到几丁质酶粗酶液，其中，几丁质酶粗酶液的酶活力为2～8U/mL；
c.将上述虾壳胶体几丁质溶于磷酸-柠檬酸缓冲液中，得到混合溶解液；
d.向混合溶解液中添加几丁质酶粗酶液，置于摇床反应，沸水浴终止反应，离心，上清液经活性炭分离、低温旋转蒸发浓缩和冷冻干燥，获得几丁寡糖成品。
进一步地，所述步骤1)第a小步中，球磨粉碎时间为30～150min。
再进一步地，所述步骤1)第a小步中，球磨粉碎时间为120min。
再进一步地，所述步骤1)第b小步中和第d小步中，HCl溶液的摩尔浓度为1.0mol/L，浸泡条件如下：
温度为室温(25℃)，浸泡时间为24h；
所述步骤1)第c小步中，NaOH溶液的摩尔浓度为2.5mol/L，处理时间为24h，处理温度为室温(25℃)。
再进一步地，所述步骤1)第e小步中，过氧化氢溶液的质量分数为10～35％，
几丁质粗品与过氧化氢溶液的固液比为1:10～1:35，
超声处理条件如下：
超声温度为45～65℃，超声时间为0.5～3.0h。
再进一步地，所述步骤1)第e小步中，过氧化氢溶液的质量分数为25％，
几丁质粗品与过氧化氢溶液的固液比为1:30，
超声处理条件如下：
超声温度为60℃，超声时间为2.5h。
再进一步地，所述步骤2)第a小步中，种子培养基的成分为葡萄糖10g，酵母粉5g，蛋白胨5g，MgCl3 0.5g，K2HPO4 0.3g，KH2PO4 0.7g，FeCl3 0.1g；
种子液条件如下：
培养温度为30℃，转速为200rpm，时间为24h。
再进一步地，所述步骤2)第b小步中，产酶培养基成分为粉末几丁质10g，酵母粉5g，蛋白胨5g，MgCl3 0.5g，K2HPO4 0.3g，KH2PO4 0.7g，FeCl3 0.1g；
接入种子液的体积百分比为5％；
产酶培养条件如下：
pH为7.0，温度为30℃，转速为200rpm，通气量为1L/min，时间为48h；
培养物离心条件如下：
离心转速为8，000rpm，温度为25℃，时间为10min；
几丁质酶粗酶液的酶活力为5U/mL。
再进一步地，所述步骤2)第c小步中，磷酸-柠檬酸缓冲液的摩尔浓度为50mmol/L，pH值为5.0；混合溶解液中，虾壳胶体几丁质的质量分数为1％；
所述步骤2)第d小步中，摇床条件如下为：
温度为35℃、转速为100rpm，反应24h；
离心条件如下：
转速为10000rpm，离心时间为10min。
本发明的有益效果：
1.本发明筛选得到南极微小杆菌DW2，其保藏编号为CCTCC NO:M 2019536，其具有较高的几丁质酶活力，可高效将胶体几丁质水解为几丁寡糖，转化生产的小龙虾几丁寡糖主要为几丁单糖、二糖和三糖，12h内的转化率超过90％。
2.本发明能对小龙虾壳高效球磨粉碎，然后用酸碱法除去矿物质、蛋白质等杂质，并采用超声波辅助过氧化氢法高效脱色，最终得到较高纯度的几丁质，应用此法在废弃小龙虾壳中提取几丁质，可达到变废为宝，节约资源，提高小龙虾原料利用率的目的。
3.本发明应用几丁质酶水解几丁质产生几丁寡糖，相对常见的化学法(包括酸解法和氧化法)降解几丁质产几丁寡糖，酶法操作更简单，作用条件更温和，便于实施；且与化学法比较，该生产过程不产有毒有害物质，是一种绿色环保的生产方案；而且几丁质酶具有专一性和高效性，在生产中几乎无副反应，所得酶解几丁寡糖含量极高，产物成分较单一，便于后续分离纯化。
附图说明
图1为南极微小杆菌的菌落形态。
图2和图3为通过单因素控制法优化南极微小杆菌相关几丁质酶的具体发酵条件的实验结果，图2包括碳源(A)、氮源(B)、发酵温度(C)、培养基pH(D)的相关分析，图3包括培养时间(A)及表面活性剂(B)分析。
图4为南极微小杆菌几丁质酶电泳图。
图5为小龙虾壳(A)和粉末(B)制备为胶体几丁质(C)及被酶解(D)的过程图。
图6为单因素控制法优化小龙虾粗几丁质脱色条件的实验结果，包括过氧化氢浓度(A)、固液比(B)、温度(C)、超声时间(D)相关分析。
图7为南极微小杆菌几丁质酶水解小龙虾胶体几丁质的TLC分析。
图8为水解小龙虾胶体几丁质的主要产物几丁单糖和几丁二糖。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1菌株筛选鉴定及发酵条件优化
1.产几丁质酶菌株的筛选
1.1原料
采用的水样采集自中国渤海。
所用各培养基成分如下：
筛选培养基(g/L)：粉末几丁质10g，酵母粉5g，蛋白胨5g，MgCl3 0.5g，K2HPO40.3g，KH2PO4 0.7g，FeCl3 0.1g，营养琼脂18g，pH值自然；
摇瓶发酵培养基(g/L)：粉末几丁质10g，酵母粉5g，蛋白胨5g，MgCl3 0.5g，K2HPO40.3g，KH2PO4 0.7g，FeCl3 0.1g，pH值自然。
1.2方法
用无菌水稀释采集自中国渤海的50多个水样，将稀释液均匀涂布于几丁质筛选培养基上，于培养箱内30℃下培养24h，筛选出周围具有透明圈的单个菌落进行划线培养。采用单菌落接入法将划线后的单菌落接入摇瓶培养基进行产酶复筛，在30℃下摇床培养4d，离心后就上清液对酶活性予以检测，保存酶活力较高的菌株，并对其进行鉴定。经适当条件培养后发现，渤海水样内存在诸多产生明显透明圈的菌株，对菌株进行分离纯复筛后，发现其中的菌株具有很强且相对稳定的产几丁质酶能力。
2.产几丁质酶菌株的鉴定
参考伯杰细菌鉴定手册和常见细菌***鉴定手册，对菌株进行形态观察与生理生化鉴定。
培养结果表明：该菌为革兰氏阳性杆状细菌，不产孢子，需氧。菌落凸起，光滑完整，产生橙色色素且在培养基中不扩散(见图1)，其生理生化特征(见表1)与南极微小杆菌(Exiguobacterium antarcticum)特征一致。
综上表明：筛选菌株为南极微小杆菌，其分类命名为Exiguobacteriumantarcticum DW2，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2019536，保藏日期为2019年7月10日，地址：中国武汉武汉大学。
表1菌株的形态及生理生化特征
Figure BDA0003323761490000071
3.产几丁质酶菌株发酵条件优化
通过单因素控制法优化南极微小杆菌DW2相关几丁质酶的具体发酵条件，包括碳源、氮源发酵温度、培养基pH、表面活性剂以及培养时间。
根据实验结果(见图2和图3)，发酵产几丁质酶的优化条件为：1％胶体几丁质、0.5％酵母抽提物和0.1％吐温-80，培养基初始pH值为7.0，30℃培养4d。
在此优化条件下，南极微小杆菌DW2产几丁质酶可达到7.2U/mL，比初始条件提高了5.8倍。
实施例2粗酶液中几丁质酶的分子量及活性分析
1.几丁质粗酶液的电泳分析
蛋白分子量测定：采用SDS-PAGE法测定，分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为4.5％，考马斯亮蓝R-250染色显示蛋白带，并利用Gel-Pro Analyzer软件分析蛋白分子量。几丁质酶酶谱：电泳分离胶中加入100mg/L乙二醇几丁质，将电泳结束的分离胶用100mmol/L的乙酸钠溶液(pH 5.0)配成的10mL/L Triton X-100复性24h，然后用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)配制的100mg/L荧光增白剂28(Fluorescent Brightener 28)染色5min，再用蒸馏水洗1h，最后将分离胶放置在紫外灯下观察，几丁质酶活性带显示为暗带，而背景为蓝色荧光。
电泳分析结果见图4，酶谱显示在67kDa，60kDa和53kDa的位置有明显的几丁质酶谱条带。
2.几丁质酶活性分析
几丁质酶酶活力的测定：取200μL处理好的胶体几丁质(1％，w/v)于2mL离心管中，45℃水浴锅预热20min后加入200μL适当稀释的酶液反应30min。反应释放出的还原糖量参照Miller等的方法测定，即在反应液中加入600μL DNS试剂终止反应，然后沸水中显色5min。显色完成后，8，000rpm离心10min，检测540nm处吸光值。几丁质酶酶活力单位(1U)定义为在上述反应条件下每分钟反应生成1μmol还原糖所需要的酶量。
蛋白含量测定：参照Lowry等的方法，以牛血清蛋白作为标准蛋白。
将粗酶液作为待测溶液，并以对应灭活的蛋白作为空白对照组，检测几丁质酶活性。
粗酶液中几丁质酶活性测定结果详见图2和图3，几丁质酶粗酶液的酶活力约为2～8U/mL。
实施例3小龙虾胶体几丁质制备
制备几丁寡糖的方法，包括以下步骤：
1)虾壳胶体几丁质的制备：
a.将新鲜小龙虾壳洗净、球磨粉碎，得到虾壳粉；
b.将虾壳粉置于HCl溶液中浸泡，期间不断搅拌除去虾壳中的矿物质，直至无气泡产生后倾去酸液，然后沉淀水洗至中性，得到酸解壳粉；
c.再用NaOH溶液水解处理步骤b)所述酸解壳粉(水解除去虾壳中的蛋白质)，倾去NaOH溶液，然后沉淀水洗至中性，得到碱解壳粉；
d.再用HCl溶液浸泡上述步骤c)所述碱解壳粉，浸泡后倾去酸液，然后沉淀水洗至中性，即得到几丁质粗品；
e.再用超声波辅助过氧化氢(H2O2)溶液对几丁质粗品脱色处理，直至全部变成白色，水洗，干燥，即得到白色的虾壳几丁质；
f.向白色的虾壳几丁质加入浓盐酸，研磨至虾壳几丁质全部溶解成糊状，得到溶有小龙虾壳几丁质的酸液，静置，反复洗涤至pH接近中性，收集得到白色胶体状物质，即为虾壳胶体几丁质；
2)小龙虾几丁寡糖的制备：
a.将权利要求1所述南极微小杆菌DW2接入种子培养基中摇床培养，得到种子液；
b.将所述种子液接入产酶培养基中培养，将培养物离心，取上清，得到几丁质酶粗酶液，其中，几丁质酶粗酶液的酶活力为2～8U/mL；
c.将上述虾壳胶体几丁质溶于磷酸-柠檬酸缓冲液中，得到混合溶解液；
d.向混合溶解液中添加几丁质酶粗酶液，置于摇床反应，沸水终止反应，离心，上清液经活性炭分离、低温旋转蒸发浓缩和冷冻干燥，获得几丁寡糖成品。
上述方法参数条件优化
1.小龙虾壳球磨条件优化
为达到较好的粉碎效果，方便后续处理，采用球磨法对小龙虾壳进行粉碎处理。
为达到高效粉碎目的，综合相关文献，决定优选球磨时间(30～150min)，通过考察不同球磨时间处理对小龙虾壳粉的影响，包括其粒径范围，平均粒径和形貌特征，来获得最佳球磨处理条件。
根据试验结果及数据分析(见表2)，在球磨时间为30～120min范围内，随球磨时间延长，所得小龙虾壳粉粒径范围变小变窄，平均粒径持续变小，形貌特征渐变为粉末形态一致，颗粒细腻，外观色泽无差异，但在较长球磨时间(120min)处理后，随球磨时间延长，小龙虾壳粉的粒径范围，平均粒径和形貌特征变化趋缓，此时延长球磨时间对小龙虾壳粉的影响较小。因此，确定最佳球磨时间为120min。
表2不同球磨时间处理对小龙虾壳粉的影响
Figure BDA0003323761490000111
综上，最佳球磨时间确定为120min，在此球磨时间下所得小龙虾壳粉末形态一致，进一步细微化，呈微小颗粒,大小均一，外观色泽基本无差异，可满足后续工艺需要。
2.小龙虾几丁质粗品脱色条件优化
为提高脱色效率，采用超声波辅助氧化剂的方法对小龙虾几丁质粗品进行氧化脱色处理。首先选择合适的脱色剂，为降低环境污染，减少脱色剂残留，简化脱色步骤，选用过氧化氢溶液作为脱色剂。然后以H2O2浓度、固液比、超声时间、超声温度作为影响因子，以所得产品蓝光白度值为鉴定指标，通过单因素控制法对超声波辅助过氧化氢脱色的工艺进行优化。
通过单因素试验优化小龙虾壳粗几丁质的脱色工艺条件，依次优选了过氧化氢浓度(10～35％)、固液比(1:10～1:35)、温度(45～65℃)、超声时间(0.5～3.0h)的条件。
根据单因素试验结果及数据分析(见图6)，对超声波辅助过氧化氢脱色的工艺进行优化。
首先优选过氧化氢浓度，如图6(A)所示，在过氧化氢浓度由10％逐渐增加到35％中，所得产品白度值逐渐提升，其中随着过氧化氢浓度由10％逐渐增加到25％，所得产品白度值明显增加，但过氧化氢浓度由25％增加到35％，所得产品白度值增加不明显，可能原因是此时反应接近饱和，因此确定优选后的过氧化氢浓度为25％，此时几丁质纯品的白度值达到38.16。
随后进一步优化固液比，如图6(B)所示，在固液比由1:10逐渐提升至1:35过程中，所得产品白度值逐渐提升，其中固液比由1:10提升至1:30，所得产品白度值提升较明显，但固液比由1:30提升至1:35，产品白度值提升不明显，可能原因是此阶段反应接近饱和。因此确定优选后固液比为1:30，此时白度值上升到44.63。
再优化温度，如图6(C)所示，随着温度由45℃逐渐提升到65℃，所得产品白度值变化明显呈先提升(45～60℃)后下降(60～65℃)趋势，由60℃提升到65℃，所得产品白度值显著下降，其原因可能是温度过高造成过氧化氢加快分解而降低了其浓度影响了脱色效果。因此确定温度的优选条件为60℃，此时白度值达到58.31。
最后优化超声时间，如图6(D)所示，随着超声时间由0.5h延长至3.0h，所得产品白度逐渐提升，但其中在超声时间由0.5h延长至2.5h，所得产品白度提升明显，而由2.5h延长至3.0h，所得产品白度提升不明显，可能原因是此阶段反应接近饱和。因此确定超声时间优选条件为2.5h，此时白度值达到65.53。
经上述优化工艺处理后，小龙虾几丁质从红色粉末转变为白色，且颜色均一，得到品相较好的小龙虾几丁质纯品。
超声波辅助过氧化氢脱色工艺的优化条件为：25％过氧化氢浓度，1:30固液比，60℃下超声波辅助脱色2.5h。在此优化条件下所得几丁质产品白度值最高，白度可达65.53，可满足需求。
实施例4几丁质酶转化小龙虾壳几丁质制备几丁寡糖
制备几丁寡糖的方法，包括以下步骤：
1)虾壳胶体几丁质的制备：
a.将新鲜小龙虾壳洗净、球磨粉碎120min，得到虾壳粉；b.将虾壳粉置于摩尔浓度为1.0mol/L的HCl溶液中，室温下浸泡24h，期间不断搅拌除去虾壳中的矿物质，直至无气泡产生后倾去酸液，然后沉淀水洗至中性，得到酸解壳粉；
c.室温下，再用摩尔浓度为2.5mol/L的NaOH溶液水解处理步骤b)所述酸解壳粉(水解除去虾壳中的蛋白质)24h，倾去NaOH溶液，然后沉淀水洗至中性，得到碱解壳粉；
d.室温下，再用摩尔浓度为1.0mol/L的HCl溶液浸泡上述步骤c)所述碱解壳粉24h，浸泡后倾去酸液，然后沉淀水洗至中性，即得到几丁质粗品；
e.在温度为60℃条件下，超声波辅助质量分数为25％的过氧化氢(H2O2)溶液对几丁质粗品脱色处理2.5h，直至全部变成白色，水洗，干燥，即得到白色的虾壳几丁质；其中，几丁质粗品与过氧化氢溶液的固液比为1:30；
f.向白色的虾壳几丁质加入浓盐酸，研磨至虾壳几丁质全部溶解成糊状，得到溶有小龙虾壳几丁质的酸液，静置，反复洗涤至pH接近中性，收集得到白色胶体状物质，即为虾壳胶体几丁质；
2)小龙虾几丁寡糖的制备：
a.将南极微小杆菌DW2接入种子培养基中，在温度为30℃，转速为200rpm，摇床培养24h，得到种子液；其中，种子培养基的成分为葡萄糖10g，酵母粉5g，蛋白胨5g，MgCl30.5g，K2HPO4 0.3g，KH2PO4 0.7g，FeCl3 0.1g；
b.将所述种子液接入产酶培养基中，在pH为7.0，温度为30℃，转速为200rpm，通气量为1L/min条件下培养48h，在转速为8，000rpm，温度为25℃条件下，将培养物离心10min，取上清，得到几丁质酶粗酶液，其中，几丁质酶粗酶液的酶活力为2～8U/mL；
产酶培养基成分为粉末几丁质10g，酵母粉5g，蛋白胨5g，MgCl3 0.5g，K2HPO40.3g，KH2PO4 0.7g，FeCl3 0.1g；
接入种子液的体积百分比为5％；
c.将上述虾壳胶体几丁质溶于摩尔浓度为50mmol/L，pH值为5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液中，得到混合溶解液；混合溶解液中，虾壳胶体几丁质的质量分数为1％；
d.向混合溶解液中添加几丁质酶粗酶液，置于温度为35℃、转速为100rpm的摇床反应24h，沸水浴5min终止反应，转速为10000rpm离心10min，上清液经活性炭分离、低温旋转蒸发浓缩和冷冻干燥，获得几丁寡糖成品(图8)。
图7结果表明，该酶水解小龙虾几丁质的终产物(12h)以单糖和几丁二糖为主。而在初始阶段(0～4h)，主要产生单糖、几丁二糖及几丁三糖，随后三糖被继续降解为单糖及二糖；
图7结果表明，小龙虾壳经过粉碎后，经过处理获得胶体几丁质，随后添加发酵粗酶液12h后有明显的水解效果，水解率可达到90％以上。
图8结果表明，几丁寡糖水解液经过活性炭分离技术、低温旋转蒸发浓缩和冷冻干燥获得几丁单糖和几丁二糖的纯品。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种南极微小杆菌(Exiguobacterium antarcticum)DW2，其特征在于：其保藏编号为：CCTCC NO:M 2019536。
2.一种制备几丁寡糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)虾壳胶体几丁质的制备：
a.将新鲜小龙虾壳洗净、球磨粉碎，得到虾壳粉；
b.将虾壳粉置于HCl溶液中浸泡，期间不断搅拌除去虾壳中的矿物质，直至无气泡产生后倾去酸液，然后沉淀水洗至中性，得到酸解壳粉；
c.再用NaOH溶液水解处理步骤b)所得的酸解壳粉，倾去NaOH溶液，然后沉淀水洗至中性，得到碱解壳粉；
d.再用HCl溶液浸泡上述步骤c)所述碱解壳粉，浸泡后倾去酸液，然后沉淀水洗至中性，即得到几丁质粗品；
e.再用超声波辅助过氧化氢溶液对几丁质粗品脱色处理，直至全部变成白色，水洗，干燥，即得到白色的虾壳几丁质；
f.向白色的虾壳几丁质加入浓盐酸，研磨至虾壳几丁质全部溶解成糊状，得到溶有小龙虾壳几丁质的酸液，静置，反复洗涤至pH接近中性，收集得到白色胶体状物质，即为虾壳胶体几丁质；
2)小龙虾几丁寡糖的制备：
a.将权利要求1所述南极微小杆菌DW2接入种子培养基中摇床培养，得到种子液；其中，种子培养基的成分为葡萄糖10g，酵母粉5g，蛋白胨5g，MgCl3 0.5g，K2HPO4 0.3g，KH2PO40.7g，FeCl3 0.1g；
b.将所述种子液接入产酶培养基中培养，将培养物离心，取上清，得到几丁质酶粗酶液，其中，几丁质酶粗酶液的酶活力为2～8U/mL；产酶培养基成分为粉末几丁质10g，酵母粉5g，蛋白胨5g，MgCl3 0.5g，K2HPO4 0.3g，KH2PO4 0.7g，FeCl3 0.1g；
c.将上述虾壳胶体几丁质溶于磷酸-柠檬酸缓冲液中，得到混合溶解液；
d.向混合溶解液中添加几丁质酶粗酶液，置于摇床反应，沸水浴终止反应，离心，上清液经活性炭分离、低温旋转蒸发浓缩和冷冻干燥，获得几丁寡糖成品。
3.根据权利要求2所述制备几丁寡糖的方法，其特征在于：所述步骤1)第a小步中，球磨粉碎时间为30～150min。
4.根据权利要求2所述制备几丁寡糖的方法，其特征在于：所述步骤1)第a小步中，球磨粉碎时间为120min。
5.根据权利要求2所述制备几丁寡糖的方法，其特征在于：所述步骤1)第b小步中和第d小步中，HCl溶液的摩尔浓度为1.0mol/L，
浸泡条件如下：
温度为室温，浸泡时间为24h；
所述步骤1)第c小步中，NaOH溶液的摩尔浓度为2.5mol/L，处理时间为24h，处理温度为室温。
6.根据权利要求2所述制备几丁寡糖的方法，其特征在于：所述步骤1)第e小步中，过氧化氢溶液的质量分数为10～35％，
几丁质粗品与过氧化氢溶液的固液比为1:10～1:35，
超声处理条件如下：
超声温度为45～65℃，超声时间为0.5～3.0h。
7.根据权利要求2所述制备几丁寡糖的方法，其特征在于：所述步骤1)第e小步中，过氧化氢溶液的质量分数为25％，
几丁质粗品与过氧化氢溶液的固液比为1:30，
超声处理条件如下：
超声温度为60℃，超声时间为2.5h。
8.根据权利要求2所述制备几丁寡糖的方法，其特征在于：所述步骤2)第a小步中，种子液条件如下：
培养温度为30℃，转速为200rpm，时间为24h。
9.根据权利要求2所述制备几丁寡糖的方法，其特征在于：所述步骤2)第b小步中，接入种子液的体积百分比为5％；
产酶培养条件如下：
pH为7.0，温度为30℃，转速为200rpm，通气量为1L/min，时间为48h；
培养物离心条件如下：
离心转速为8，000rpm，温度为25℃，时间为10min；
几丁质酶粗酶液的酶活力为5U/mL。
10.根据权利要求2所述制备几丁寡糖的方法，其特征在于：所述步骤2)第c小步中，磷酸-柠檬酸缓冲液的摩尔浓度为50mmol/L，pH值为5.0；混合溶解液中，虾壳胶体几丁质的质量分数为1％；
所述步骤2)第d小步中，摇床条件如下为：
温度为35℃、转速为100rpm，反应24h；
离心条件如下：
转速为10000rpm，离心时间为10min。
CN202111256631.6A 2021-10-27 2021-10-27 南极微小杆菌dw2及其制备几丁寡糖的方法 Active CN113862192B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111256631.6A CN113862192B (zh) 2021-10-27 2021-10-27 南极微小杆菌dw2及其制备几丁寡糖的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111256631.6A CN113862192B (zh) 2021-10-27 2021-10-27 南极微小杆菌dw2及其制备几丁寡糖的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113862192A CN113862192A (zh) 2021-12-31
CN113862192B true CN113862192B (zh) 2023-03-31

Family

ID=78998000

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111256631.6A Active CN113862192B (zh) 2021-10-27 2021-10-27 南极微小杆菌dw2及其制备几丁寡糖的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113862192B (zh)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109735471B (zh) * 2018-12-19 2021-12-07 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一株微小杆菌及其作为益生菌在水产上的应用
CN111304110B (zh) * 2019-11-12 2021-05-25 青岛科技大学 一种产蛋白酶深海微小杆菌突变株及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN113862192A (zh) 2021-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101144097B (zh) 一种制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法
JP6446141B2 (ja) 一種の微生物の発酵によるグルコサミンを生産する菌株及びその方法
CN101078023B (zh) 一种从蚕蛹、蝇蛆的皮壳中制取甲壳素/壳聚糖的方法
JP2000513925A (ja) Ｎ―アセチル―ｄ―グルコサミンの生産方法
CN101985641B (zh) 一种利用麦秆制备细菌纤维素的方法
CN101962666B (zh) 一种利用甲壳废弃物制备甲壳素、l-乳酸钙和复合氨基酸或肽的方法
CN101423855B (zh) 一种利用灵芝菌种发酵海带下脚料制备多糖的方法
Das et al. Utilization of chitinaceous wastes for the production of chitinase
CN114438144B (zh) 利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法及其应用
CN101985642B (zh) 一种利用稻秆制备细菌纤维素的方法
CN113862192B (zh) 南极微小杆菌dw2及其制备几丁寡糖的方法
CN114874925B (zh) 一种利用克鲁维毕赤酵母菌半固态发酵产蛋白饲料的方法
CN110643668B (zh) 一种利用微生物发酵从虾壳中提取甲壳素的方法
KR100625299B1 (ko) 다시마 및 미역을 분해하는 미생물 및 이를 이용한 다시마 및 미역 분해 방법
CN111349668A (zh) 一种以秸秆为原料生产高品质还原糖的方法
CN110628679B (zh) 解鸟氨酸拉乌尔菌g10及产酶方法与产品和应用
TWI408231B (zh) 稻稈纖維水解酵素之生產方法
CN115786125B (zh) 一种高耐受氨、酚类的小球藻及用途和制备方法
CN117229979B (zh) 一株产褐藻胶裂解酶的延长微泡菌及其应用
CN113717876B (zh) 一株具有木质纤维素降解功能的构树叶内生细菌
Setyahadi et al. Chitin extraction fermentation Penaeus vannamei shell wastes with high density cell by recycle culture cells
Suboh et al. Utilization of Trametes versicolor for the production of laccase and its application in oxytetracycline degradation from wastewater
KR100476744B1 (ko) 바실러스 에스피. 알케이와이3을 이용한 키토산 분해효소의 제조방법
FR2509749A1 (fr) Procede d'hydrolyse d'un substrat cellulosique et preparation cellulolytique
Shokrkar et al. Comparison of microalgae and other common nitrogen sources for cellulase production

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant