CN108588157A

CN108588157A - 组合酶法降解脱脂南极磷虾粉回收多肽中间产物及制备n-乙酰葡萄糖胺的方法

Info

Publication number: CN108588157A
Application number: CN201810373432.5A
Authority: CN
Inventors: 杨青; 刘田; 褚方萌; 韩鸿宇
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2018-04-24
Filing date: 2018-04-24
Publication date: 2018-09-28

Abstract

本发明公开了组合酶法降解脱脂南极磷虾粉回收多肽中间产物及制备N‑乙酰葡萄糖胺的方法；首先涉及脱脂南极磷虾粉的预处理，通过碱性蛋白酶预处理回收脱脂南极磷虾粉中的多肽，使原料得到充分利用，并且提高了脱脂南极磷虾粉中几丁质相对含量。其次涉及三种几丁质酶的联合水解，通过联合水解使水解效率大大提高，使还原糖的产量得到提高。最后，通过混合酶体系中加入OfHex1酶得到N‑乙酰葡萄糖胺，且水解效率很高，使组合酶法利用脱脂南极磷虾粉生产N‑乙酰葡萄糖胺成为可能。

Description

组合酶法降解脱脂南极磷虾粉回收多肽中间产物及制备N-乙酰葡萄糖胺的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及组合酶法降解脱脂南极磷虾粉回收多肽中间产物以及制备N-乙酰葡萄糖胺的方法。

背景技术

N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)是一种葡萄糖衍生物，常以β-1,4糖苷键连接成高聚物存在于多种生物的结构成分中。因其具有多种生物活性，如修复关节损伤，治疗肠胃炎以及皮肤美白等，广泛应用于食品化妆品添加剂中。

工业生产N-乙酰葡萄糖胺的方法目前主要是利用化学法合成，其产量低，成本高，环境污染严重。另一种方法是通过降解几丁质(chitin)生产N-乙酰葡萄糖胺，几丁质作为自然界中储量第二大的生物质，是一种廉价易得的原料，传统几丁质降解的方法是利用强酸水解，存在对环境污染较为严重，产品存在副产物难以分离等缺点。

近年来，酶法降解几丁质生产N-乙酰葡萄糖胺因其产品质量高，生物活性好，环境污染小成为一种充满潜力的新兴工艺。然而，酶法生产目前仍存在挑战。一个是原料的选择与处理，另一个是酶的生产效率。针对以上两个问题，既要在原料的选择和运用上选择成本低的原料，又要提高酶的生产效率。已知南极磷虾含量丰富，每年在不影响生态平衡下的捕获量是5000万吨，而世界的捕获量远达不到此数量。而南极磷虾目前仅仅用于虾油的提取，而剩下的残渣还没有得到有效的利用。

发明内容

本发明为了解决背景技术中所述及的问题，公开了一种组合酶法降解脱脂南极磷虾粉多肽中间产物回收的方法，以及制备N-乙酰葡萄糖胺的方法。

首先，所述的降解脱脂南极磷虾粉回收多肽中间产物的方法，其包括下述步骤：

脱脂南极磷虾粉溶于pH7.5-8.5的缓冲液中混匀，再加入10000-15000U碱性蛋白酶，在40-45℃条件下水浴20-24h；抽滤得到预处理脱脂南极磷虾粉和含蛋白上清；用喷雾干燥法对预处理后的脱脂南极磷虾粉进行干燥处理，得到干燥样品。针对利用此方法所得的干燥样品中的多肽含量进行检测，分别对未处理样品和处理后脱脂南极磷虾粉进行凯氏定氮，计算得到预处理回收多肽含量约为40％；其中，含有包括天冬氨酸为主的至少17种氨基酸成分。

优选的情况下，对于上文所述的方法中，所述脱脂南极磷虾粉溶于缓冲液的比例为(1～2)g:(3～8)mL。进一步优选，脱脂南极磷虾粉溶于缓冲液的比例为1g：4mL。优选的情况下，对于上文所述的方法中，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、PBS缓冲液、Tris缓冲液和Bis-Tris缓冲液。

本发明所述的一种组合酶法降解脱脂南极磷虾粉制备N-乙酰葡萄糖胺的方法，其包括下述步骤：

向pH5.5-6.5的缓冲液中加入所述回收多肽中间产物的方法中得到的干燥样品，使其终浓度为15-25mg/mL，再加入终浓度为6～24μM的组合酶，40℃水浴4～24h；所述的组合酶为SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC和OfHex1；上述组合酶中四种酶的添加量分别为43～45％、35～37％、17～19％、0～1.5％。

优选的情况下，对于上文所述方法中，所述的组合酶SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC和OfHex1的添加量分别为43.90％、35.90％、18.90％、1.30％。

优选的情况下，对于上文所述的方法中，所述的组合酶SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC、OfHex1的终浓度为6μM。

优选的情况下，对于上文所述的方法中，所得到的干燥样品终浓度为20mg/mL。所述缓冲液为pH6.0。

有益效果

通过本发明上文所述方法，先对脱脂南极磷虾粉进行降解并回收多肽中间产物，获得回收多肽含量约为40％；其中，含有包括天冬氨酸为主的至少17种氨基酸成分；可见，本发明所述的组合酶法降解脱脂南极磷虾粉，能收获含量较高的多肽中间产物，使原料得到充分利用，并且提高了脱脂南极磷虾粉中几丁质相对含量。

然后再对回收多肽中间产物进行SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC的协同水解，取水解产物用酶标板测量405nm处的吸光值A405。测得协同水解得到(GlcNAc)₂的浓度为1.38mM。此水解效果是单一酶水解最大(GlcNAc)₂浓度(0.69mM)的2倍。

为了进一步提高水解效率，在原反应体系基础上，在组合酶中增加OfHex1酶，即用SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC和OfHex1协同水解，经检测，利用此方法所得产物均为GlcNAc。测得协同水解得到GlcNAc的浓度为5.63mM。进一步优化反应时间，将反应时间提高至24小时，测得GlcNAc浓度为11.57mM，水解效率达到29.7％(如图3)。为更进一步提高水解效率，在底物浓度和终体积不变的条件下，增加酶的浓度至24μM。得到GlcNAc的浓度为12.23mM，水解效率提升为34.5％(如图4)。所得产物经高效液相色谱法(HPLC)处理，检测产物的纯度，与标准品比较可以发现，所得产物均为GlcNAc(如图5A)。

附图说明

图1是SmChiA mutant、SmChiB和SmChiC三酶单一水解脱脂南极磷虾粉和三酶组合水解脱脂南极磷虾粉得到(GlcNAc)₂的浓度。从图显示的结果很明显可以看出，SmChiAmutant、SmChiB、SmChiC三酶组合后的水解效率远远高于单一酶水解的效率，是单一酶水解效率的2-4倍。图2是利用Minitab软件预测SmChiA mutant、SmChiB和SmChiC最佳配比的模拟图。脱脂南极磷虾水解过程中SmChiA mutant和SmChiB浓度高时水解效率较高，而对SmChiC浓度需求要低一些。图3是增加反应时间之后得到的GlcNAc和(GlcNAc)₂的浓度和反应时间关系变化图。SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC三酶的水解效率和SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC、OfHex1四酶的水解效率都随着时间的增加而增大，证明了该实验可以通过增加反应时间来提高水解效率。

图4是增加酶的浓度之后GlcNAc和(GlcNAc)₂的浓度和酶浓度关系变化图。从图示结果分析可知SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC三酶的水解效率和SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC、OfHex1四酶的水解效率都随着酶浓度的增加而增大，证明了该实验可以通过增加反应体系中的酶浓度来提高水解效率。

图5是水解液经高效液相色谱法检测产物的纯度。图5A是SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC和OfHex1协同水解后的产物。图5B是SmChiA mutant、SmChiB和SmChiC协同水解后的产物。从图示结果分析可知从图5A中可以看出，体系水解产物都是单糖，而图5B中可以看出，体系水解产物都是二糖，证明了该方法水解的产物都是单一产物而且纯度较高。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思进行等同替换或改变均属于本发明保护范畴。

为了方便表述，在以下实施例中，“mM”表示mmol/L；“μM”表示“μmol/L”；灭菌的条件为121℃下高压灭菌20min。

脱脂南极磷虾粉：由辽渔集团提供的，经过抽虾油处理的南极磷虾剩余物。

实施例1

1)脱脂南极磷虾粉预处理

称取100g脱脂南极磷虾粉加400mL磷酸盐缓冲液(pH为8.0)混匀，再往其中加入1000U碱性蛋白酶(购自Novozymes)，在40℃条件下水浴24h。用布氏漏斗对样品进行抽滤，得到预处理脱脂南极磷虾粉和含蛋白上清。用喷雾干燥法对预处理后的脱脂南极磷虾粉进行干燥处理，得到干燥样品。对未处理样品和处理后脱脂南极磷虾粉进行凯氏定氮，计算得到预处理回收多肽含量约为40％。

对所得上清的氨基酸成分用氨基酸分析仪分析，得到产物中各氨基酸的成分为：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、络氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸，含量分别为：9.68％、1.59％、1.36％、4.16％、1.48％、1.83％、0.59％、1.56％、1.74％、1.71％、2.66％、1.75％、1.67％、2.61％、0.94％、2.13％、1.08％。(注：其他未列出氨基酸表示未检测氨基酸，不表示不含该氨基酸)

1)SmChiA mutant、SmChiB和SmChiC的制备

SmChiA mutant的制备：取冷冻的含SmChiA mutant表达基因的大肠杆菌菌株，在37℃活化至OD₆₀₀为0.6-0.8时，添加0.5mM IPTG。随后，细胞在37℃诱导表达5h。在4℃条件下，8000rpm离心5min收集菌体，并重悬在Buffer A(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，pH7.4)中。采用高压匀质机破碎菌体，压力为800bar。在4℃条件下，10000rpm离心10min，去除未破碎的菌体以及包涵体，0.22μm滤器过滤上清。采用金属螯合层析分离纯化蛋白，蛋白在Buffer C(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，50mM咪唑，pH 7.4)下洗脱杂质蛋白，蛋白在Buffer E(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，150mM咪唑，pH 7.4)下洗脱并收集。以考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，使用SDS-PAGE检验目标蛋白的纯度。

SmChiB的制备：取冷冻的含SmChiB表达基因的大肠杆菌菌株，在37℃活化至OD₆₀₀为0.6-0.8时，添加0.05mM IPTG。随后，细胞在16℃诱导表达12-14h。在4℃条件下，8000rpm离心5min收集菌体，并重悬在Buffer A(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，pH 7.4)中。采用高压匀质机破碎菌体，压力为800bar。在4℃条件下，10000rpm离心10min，去除未破碎的菌体以及包涵体，0.22μm滤器过滤上清。采用金属螯合层析分离纯化蛋白，蛋白在Buffer E(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，150mM咪唑，pH 7.4)下洗脱杂质蛋白，蛋白在Buffer F(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，300mM咪唑，pH 7.4)下洗脱并收集。以考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，使用SDS-PAGE检验目标蛋白的纯度。

SmChiC的制备：取冷冻的含SmChiC表达基因的大肠杆菌菌株，在37℃活化至OD₆₀₀为0.6-0.8时，添加0.1mM IPTG。随后，细胞在16℃诱导表达12-14h。在4℃条件下，8000rpm离心5min收集菌体，并重悬在Buffer A(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，pH 7.4)中。采用高压匀质机破碎菌体，压力为800bar。在4℃条件下，10000rpm离心10min，去除未破碎的菌体以及包涵体，0.22μm滤器过滤上清。采用金属螯合层析分离纯化蛋白，蛋白在Buffer D(20mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠，75mM咪唑，pH 7.4)下洗脱杂质蛋白，蛋白在Buffer E(20mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，300mM咪唑，pH 7.4)下洗脱并收集。以考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，使用SDS-PAGE检验目标蛋白的纯度。

实施例2

1)标准曲线的制作

分别以几丁二糖和几丁单糖为标准品，将标准品配制成不同浓度(分别为0、0.5、1、1.5、2mM)的样品，取60μL样品加180μL铁***溶液(2g/L)，沸水浴15min，取200μL测吸光度值A405，制作还原糖标准曲线。

2)SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC组合酶分别水解脱脂南极磷虾粉

SmChiA mutant水解脱脂南极磷虾粉：反应体系为200μL，脱脂南极磷虾粉的终浓度为20mg/mL，SmChiA mutant的终浓度均为6μM，不足的体积用20mM磷酸盐缓冲液补齐。对照组各组分同上，然后沸水浴5min使酶失去活性。放入40℃水浴锅中反应8h；取出60μL加到另一个1.5mL离心管中，后加入180μL 2g/L铁***溶液，然后沸水浴煮沸15min，取出放入离心机中12000rpm离心3min；最后吸取200μL上清液加到酶标板，测量405nm处的吸光值A405。

SmChiB和SmChiC水解脱脂南极磷虾粉步骤同上。

组合酶水解脱脂南极磷虾粉：通过软件(minitab17)模拟SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC三酶水解脱脂南极磷虾粉的最佳比例为44.50％、36.30％、13.30％时，可使水解效率达到最大，再经过实验检测组合酶实际水解效率与理论值，确定最佳比例(如图2)。脱脂南极磷虾粉的终浓度约为20mg/mL，SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC的终浓度为6μM，三酶的添加比例为44.50％、36.30％、13.30％，不足的体积用磷酸盐缓冲液(pH为6.0)补齐。对照组的反应体系为200μL，三种酶的终浓度为6μM，三酶的比例同实验组，不足的体积用磷酸盐缓冲液(pH为6.0)补齐。沸水浴5-10min使酶失去活性，然后用磷酸盐缓冲液(pH为6.0)将体系补足到200μL。分别将上述实验组和对照组样品放入40℃水浴锅中反应4h后；分别取出60μL待检样品用于检测，具体为：将两组待检样品分别加到另一个1.5mL离心管中，分别加入180μL 2g/L铁***溶液，然后沸水浴煮沸15min，取出放入离心机中12000rpm离心3min；最后分别吸取200μL上清液加到酶标板，测量405nm处的吸光值A405。

结果如图1所示，从图示结果分析可知单一酶水解效率最高的组为SmChiA mutant水解脱脂南极磷虾粉组，其最大(GlcNAc)₂浓度为0.69mM，SmChiB和SmChiC分别水解脱脂南极磷虾粉产生的(GlcNAc)₂浓度为0.48mM和0.43mM，而SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC组合酶水解脱脂南极磷虾粉产生的(GlcNAc)₂浓度为1.53mM，远远高于单一酶的水解效率，是单一酶水解效率的2-4倍。。

3)SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC和OfHex1协同水解实验

脱脂南极磷虾粉的终浓度约为20mg/mL，SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC、OfHex1的终浓度为6μM，四酶的添加量为43.9％、35.9％、18.9％、1.3％，不足的体积用磷酸盐缓冲液(pH为6.0)补齐。对照组的反应体系为200μL，四种酶的终浓度为6μM，四酶的比例同实验组，不足的体积用磷酸盐缓冲液(pH为6.0)补齐。沸水浴5-10min使酶失去活性，然后用磷酸盐缓冲液(pH为6.0)将体系补足到200μL。分别将上述实验组和对照组样品放入40℃水浴锅中反应4h后；分别取出60μL待检样品用于检测，具体为：将两组待检样品分别加到另一个1.5mL离心管中，分别加入180μL 2g/L铁***溶液，然后沸水浴煮沸15min，取出放入离心机中12000rpm离心3min；最后分别吸取200μL上清液加到酶标板，测量405nm处的吸光值A405。

当OfHex1添加量为0％时，测得协同水解得到(GlcNAc)₂浓度为1.38mM。为提高水解效率，在原反应体系基础上增加反应时间。将反应时间提高至24小时，测得(GlcNAc)₂浓度为4.37mM，水解效率达到21.5％(如图3)。为进一步提高水解效率，在底物浓度和终体积不变的条件下，增加酶的浓度至24μM，同时，SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC三酶的比例也不变。得到(GlcNAc)₂的浓度为4.8mM，水解效率提升为28.4％(如图4)。将所得产物经高效液相色谱法(HPLC)处理，检测产物的纯度，与标准品比较可以发现，所得产物均为(GlcNAc)₂(如图5B)。

当OfHex1添加量为1.3％，协同水解得到的产物由(GlcNAc)₂变为GlcNAc，测得协同水解得到GlcNAc的浓度为5.63mM。为提高水解效率，在原反应体系基础上增加反应时间。将反应时间提高至24小时，测得GlcNAc浓度为11.57mM，水解效率达到29.7％(如图3)。为进一步提高水解效率，在底物浓度和终体积不变的条件下，增加酶的浓度至24μM。得到GlcNAc的浓度为12.23mM，水解效率提升为34.5％(如图4)。所得产物经高效液相色谱法(HPLC)处理，检测产物的纯度，与标准品比较可以发现，所得产物均为GlcNAc(如图5A)。

序列表

<110> 大连理工大学

<120> 组合酶法降解脱脂南极磷虾粉回收多肽中间产物及制备N-乙酰葡萄糖胺的方法

<130> 2015

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1626

<212> DNA

<213> SmChiA mutant核苷酸序列

<400> 1

atggatgccg cgccgggcaa gccgaccatc gcctggggca acaccaagtt cgccattgtt 60

gaagttgacc aggcggctac cgcttataat aatttggtga aggtaaaaaa tgccgccgat 120

gtttccgtct cctggaattt atggaatggc gacaccggca cgacggcaaa agttttatta 180

aatggcaaag aggcgtggag tggtccttca accggatctt ccggtacggc gaattttaaa 240

gtgaataaag gcggccgtta tcaaatgcag gtggcattgt gcaatgccga cggctgcacc 300

gccagtgacg ccaccgaaat tgtggtggcc gacaccgacg gcagccattt ggcgccgttg 360

aaagagccgc tgctggaaaa gaataaaccg tataaacaga actccggcaa agtggtcggt 420

tcttatttcg tcgagtgggg cgtttacggg cgcaatttca ccgtcgacaa gatcccggcg 480

caaaacctga cccacctgct gtacggcttt atcccgatct gcggcggcaa tggcatcaac 540

gacagcctga aagagattga aggcagcttc caggcgttgc agcgctcctg ccagggccgc 600

gaggacttca aagtctcgat ccacgatccg tgggccgcgc tgcaaaaagc gcagaagggc 660

gtgaccgcct gggatgaccc ctacaagggc aacttcggcc agctgatggc gctgaagcag 720

gcgcatcctg acctgaaaat cctgccgtcg atcggcggct ggacgctgtc cgacccgttc 780

ttcttcatgg gcgacaaggt gaagcgcgat cgcttcgtcg gttcggtgaa agagttcctg 840

cagacctgga agttcttcga cggcgtggat atcgactggg agttcccggg cggcaaaggc 900

gccaacccta acctgggcag cccgcaagac ggggaaacct atgtgctgct gatgaaggag 960

ctgcggacga tgctggatca gctgtcggcg gaaaccggcc gcaagtatga gctgacctcc 1020

gccatcagcg ccggtaagga caagatcgac aaggtggctt acaacgttgc gcagaactcg 1080

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gggcatcaga ccgcgctgaa tgcgccggcc tggaaaccgg acaccgccta caccacggtg 1200

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gccatgtatg gccgcggctg gaccggggtg aacggctacc agaacaatat tccgttcacc 1320

ggcaccgcca ccgggccggt taaaggcacc tgggagaacg gtatcgtgga ctaccgccaa 1380

atcgccggcc agttcatgag cggcgagtgg cagtatacct acgacgccac ggcggaagcg 1440

ccttacgtgt tcaaaccttc caccggcgat ctgatcacct tcgacgatgc ccgctcggtg 1500

caggccaaag gcaagtacgt gttggataag cagctgggcg gcctgttctc ctgggagatc 1560

gacgcggata acggcgatat tctcaacagc atgaacgcca gcctgggcaa cagcgccggc 1620

gttcaa 1626

<210> 2

<211> 563

<212> PRT

<213> SmChiA mutant氨基酸序列

<400> 2

MRKFNKPLLA LLIGSTLCSA AQAAAPGKPT IAWGNTKFAI VEVDQAATAY NNLVKVKNAA 60

DVSVSWNLWN GDTGTTAKVL LNGKEAWSGP STGSSGTANF KVNKGGRYQM QVALCNADGC 120

TASDATEIVV ADTDGSHLAP LKEPLLEKNK PYKQNSGKVV GSYFVEWGVY GRNFTVDKIP 180

AQNLTHLLYG FIPICGGNGI NDSLKEIEGS FQALQRSCQG REDFKVSIHD PWAALQKAQK 240

GVTAWDDPYK GNFGQLMALK QAHPDLKILP SIGGWTLSDP FFFMGDKVKR DRFVGSVKEF 300

LQTWKFFDGV DIDWEFPGGK GANPNLGSPQ DGETYVLLMK ELRTMLDQLS AETGRKYELT 360

SAISAGKDKI DKVAYNVAQN SMDHIFLMSY DFYGAWDLKN LGHQTALNAP AWKPDTAYTT 420

VNGVNALLAQ GVKPGKIVVG TAMYGRGWTG VNGYQNNIPF TGTATGPVKG TWENGIVDYR 480

QIAGQFMSGE WQYTYDATAE APYVFKPSTG DLITFDDARS VQAKGKYVLD KQLGGLFSWE 540

IDADNGDILN SMNASLGNSA GVQ 563

<210> 3

<211> 1836

<212> DNA

<213> SmChiB核苷酸序列

<400> 3

gaattcattc acgctgaacg ttggcacaac acataaacgc caagacaggc ggcagtaaat 60

aaaaaattca ttcttatggt gatttatttc gacttttgtt tttacgaaaa ataaacatta 120

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ttcagcctga cggtcgacgc cgccgtgcag caacacctga tgatggaagg cgtgccgagc 1020

gccaaaatcg tcatgggcgt gcccttctat ggccgcgcct tcaagggcgt cagcggcggc 1080

aacggtgggc aatacagcag ccacagcacg ccgggcgaag atccgtatcc gagcaccgac 1140

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cgccagttgg agcagatgct gcagggcaac tacggctatc agcggttgtg gaacgacaag 1260

accaaaaccc cttatctgta tcatgcgcag aacgggctgt tcgtcaccta tgacgatgcc 1320

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tggcatctgg ggcaagacaa ccgcaacggc gatctgctgg ccgcgctgga tcgctatttc 1440

aacgccgcgg actacgacga cagccagctg gatatgggca ccgggctgcg ctacaccggc 1500

gtcggccccg gcaacctgcc tatcatgacc gcgccggcct atgtgccggg caccacttac 1560

gcgcagggcg cgctggtgtc ctaccagggc tacgtctggc agaccaagtg gggttacatc 1620

acctctgcac cgggttcaga cagcgcctgg ctgaaggtgg gccgcgtagc gtaaaccata 1680

aaaaaacccc gtagccgaat gctgcggggt tttcattgag ttaaccgttt gattttcgcg 1740

tcccttcgtc tctattcctt cagttgtggc accatggata gccgccatcc cgcaccactt 1800

cgcggcccat caggctgtag acatcgcttt tacgcg 1836

<210> 4

<211> 499

<212> PRT

<213> SmChiB氨基酸序列

<400> 4

MSTRKAVIGY YFIPTNQINN YTETDTSVVP FPVSNITPAK AKQLTHINFS FLDINSNLEC 60

AWDPATNDAK ARDVVNRLTA LKAHNPSLRI MFSIGGWYYS NDLGVSHANY VNAVKTPASR 120

AKFAQSCVRI MKDYGFDGVD IDWEYPQAAE VDGFIAALQE IRTLLNQQTI TDGRQALPYQ 180

LTIAGAGGAF FLSRYYSKLA QIVAPLDYIN LMTYDLAGPW EKVTNHQAAL FGDAAGPTFY 240

NALREANLGW SWEELTRAFP SPFSLTVDAA VQQHLMMEGV PSAKIVMGVP FYGRAFKGVS 300

GGNGGQYSSH STPGEDPYPS TDYWLVGCEE CVRDKDPRIA SYRQLEQMLQ GNYGYQRLWN 360

DKTKTPYLYH AQNGLFVTYD DAESFKYKAK YIKQQQLGGV MFWHLGQDNR NGDLLAALDR 420

YFNAADYDDS QLDMGTGLRY TGVGPGNLPI MTAPAYVPGT TYAQGALVSY QGYVWQTKWG 480

YITSAPGSDS AWLKVGRVA 499

<210> 5

<211> 1862

<212> DNA

<213> SmChiC核苷酸序列

<400> 5

cccttccgtc gccgatatca ccatcttctg atgcgaccat ggcggccgcc cggccgccgt 60

tatttccttc tcccccagcg tcagtttgaa tttaattcgt tcatggccgt aaaaggtttc 120

agcctgcctg cgttaaaaat cctcattata acgttacgcc ccgccaatag ctgatattgc 180

cggcgagcgg aaaactctta cccctaatta atgaggccac catgagcaca aataacacta 240

ttaatgccgt cgccgccgat gacgcggcca ttatgccgtc tatcgccaat aaaaagatcc 300

tgatgggttt ctggcacaac tgggccgccg gcgccagtga cggctaccag caagggcagt 360

tcgccaatat gaacctgacc gacattccca ccgagtacaa cgtggtggcc gtcgccttta 420

tgaaaggcca gggcatcccg accttcaagc cttacaacct gtccgacacc gagttccgcc 480

gccaggtggg cgtgctgaac agccagggcc gcgcggtgct gatctccctc ggcggcgcag 540

acgcgcatat cgagctaaag accggcgatg aagacaagct gaaagacgag attattcgcc 600

tggtggaagt ctatggcttc gacggcctgg atatcgatct ggaacaggcg gcgatcggcg 660

ccgccaataa taaaaccgtc ttgcctgcgg cattgaaaaa agtaaaagac cattacgccg 720

cgcagggaaa aaactttatt atcagcatgg cgccggaatt cccgtattta cgcaccaacg 780

gcacctatct ggattatatc aacgccctcg aaggctatta cgactttatc gcgccgcaat 840

attacaatca gggcggcgac ggtatttggg tggatgaact caatgcctgg atcacgcaga 900

ataacgacgc catgaaagag gacttcctct actacctgac ggaaagcctg gttaccggca 960

cccgcggcta tgcgaagatc ccggcggcga aattcgtcat cggcctgccg agcaacaacg 1020

atgccgccgc caccggctac gtggtcaaca aacaggcggt gtataacgct ttctcgcgtc 1080

tcgacgccaa aaacctgtcg atcaagggcc tgatgacctg gtcaatcaac tgggataacg 1140

gcaagagcaa agccggcgtc gcctacaatt gggagttcaa aacccgctat gcgccgctga 1200

ttcagggcgg cgtcaccccg ccgccgggaa agcctaatgc gccgacggcg ctgacggtcg 1260

ccgaactggg cgccacctcg ctgaaactga gctgggccgc cgccaccggc gctttcccga 1320

tcgccagtta caccgtctac cgcaacggca acccgatcgg ccagaccgcc ggtctgtcgc 1380

tggctgacgg cggtctgacg ccggcgaccc agtacagcta cttcgttacc gcgaccgata 1440

gccagggcaa tacctcgctg ccgagcagcg cgctggcggt caaaaccgcc aacgacggca 1500

cgccgcccga tccgggggcg cccgagtggc agaacaacca cagttacaag gctggcgacg 1560

tggtgagcta taaaggcaag aaatatacct gtatccaggc gcacacctcc aacgccggct 1620

ggacgccgga cgccgccttc accctgtggc agctcatcgc ctaatcgcta atcgattgcc 1680

ggccaaactg gccggcaatc ccgccatcac gctaaaaatt gcataatcga taatttttca 1740

ggtcgataac tgaacatccg ttaaaaacca cacctaagca aacaactatt tctcaacgca 1800

tggctaaaac gcttgcatct cccgcagctt ttgacgcatt ttcataacca cagcgcagca 1860

aa 1862

<210> 6

<211> 480

<212> PRT

<213> SmChiC氨基酸序列

<400> 6

MSTNNTINAV AADDAAIMPS IANKKILMGF WHNWAAGASD GYQQGQFANM NLTDIPTEYN 60

VVAVAFMKGQ GIPTFKPYNL SDTEFRRQVG VLNSQGRAVL ISLGGADAHI ELKTGDEDKL 120

KDEIIRLVEV YGFDGLDIDL EQAAIGAANN KTVLPAALKK VKDHYAAQGK NFIISMAPEF 180

PYLRTNGTYL DYINALEGYY DFIAPQYYNQ GGDGIWVDEL NAWITQNNDA MKEDFLYYLT 240

ESLVTGTRGY AKIPAAKFVI GLPSNNDAAA TGYVVNKQAV YNAFSRLDAK NLSIKGLMTW 300

SINWDNGKSK AGVAYNWEFK TRYAPLIQGG VTPPPGKPNA PTALTVAELG ATSLKLSWAA 360

ATGAFPIASY TVYRNGNPIG QTAGLSLADG GLTPATQYSY FVTATDSQGN TSLPSSALAV 420

KTANDGTPPD PGAPEWQNNH SYKAGDVVSY KGKKYTCIQA HTSNAGWTPD AAFTLWQLIA 480

Claims

1.降解脱脂南极磷虾粉回收多肽中间产物的方法，其特征在于：所述方法包括下述步骤：

脱脂南极磷虾粉溶于pH7.5-8.5的缓冲液中混匀，再加入10000-15000U碱性蛋白酶，在40-45℃条件下水浴20-24h；抽滤得到预处理脱脂南极磷虾粉和含蛋白上清；用喷雾干燥法对预处理后的脱脂南极磷虾粉进行干燥处理，得到干燥样品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脱脂南极磷虾粉溶于缓冲液的比例为(1～2)g:(3～8)mL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述脱脂南极磷虾粉溶于缓冲液的比例为1g：4mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、PBS缓冲液、Tris缓冲液和Bis-Tris缓冲液。

5.一种组合酶法降解脱脂南极磷虾粉制备N-乙酰葡萄糖胺的方法，其特征在于：所述方法包括下述步骤：

向pH5.5-6.5的缓冲液中加入权利要求1得到的干燥样品，使其终浓度为15-25mg/mL，再加入终浓度为6～24μM的组合酶，40℃水浴4～24h；所述的组合酶为SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC和OfHex1；所述组合酶中四种酶的添加量分别为43～45％、35～37％、17～19％、0～1.5％。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的组合酶SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC和OfHex1的添加量分别为43.90％、35.90％、18.90％、1.30％。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的组合酶SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC、OfHex1的终浓度为6μM。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的权利要求1得到的干燥样品终浓度为20mg/mL。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述缓冲液为pH6.0。