CN109679938A

CN109679938A - 一种几丁质酶Chit46及其表达纯化方法与应用

Info

Publication number: CN109679938A
Application number: CN201910064040.5A
Authority: CN
Inventors: 罗晓春; 邓俊劲; 李志伟; 史丹; 茅和花; 梁爽
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2019-01-23
Filing date: 2019-01-23
Publication date: 2019-04-26
Anticipated expiration: 2039-01-23
Also published as: CN109679938B

Abstract

本发明提供了一种几丁质酶Chit46及其表达纯化方法与应用。所述的几丁质酶Chit46来源于哈茨木霉，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该几丁质酶的发酵液酶活为31.4U/mL，比酶活为34.5U/mg，高于同类报道的几丁质酶。本发明还提供了所述的几丁质酶Chit46的表达纯化方法，大幅度提高了几丁质酶的产量，粗酶液产蛋白量可达1.26g/L，纯化后蛋白量达0.77g/L。所述的几丁质酶可用于胶体几丁质水解，水解活性好，且水解产物稳定，绝大部分为几丁二糖，免去了后续繁杂的各聚合度纯化分离工艺，具有良好的应用前景。

Description

一种几丁质酶Chit46及其表达纯化方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种几丁质酶Chit46及其表达纯化方法与应用。

背景技术

几丁质是地球上含量仅次于纤维素的天然高分子化合物，富含于虾蟹壳中(Arcidiacono and Kaplan,1992)。虾壳中几丁质的含量在20％左右，而目前每吨干虾壳的价格仅为450元，从虾蟹壳中提取出来的甲壳素的价格达到每吨5万至10万元。但几丁质的难溶性使其应用大受限制，而其水解产生的可溶性寡糖有巨大的应用价值。近期众多的研究发现，几丁质的水解产物几丁寡糖(多聚β-1,4-N-乙酰葡萄糖胺)，因其保留了几丁质天然原有的乙酰基，而比壳寡糖(多聚β-1,4葡萄糖胺)都有更为显著的生物学效应及应用前景。几丁寡糖易被肠道粘膜吸收，并且能竞争性阻断病原微生物对肠黏蛋白(N-乙酰葡萄糖胺修饰糖蛋白)的粘附，而阻断肠道病原的入侵，调节肠道健康；几丁寡糖具有显著的抗肿瘤作用，能激活人巨噬细胞、淋巴细胞、NK细胞和补体***，并诱导许多细胞因子产生，提高机体免疫机能；它还具有抗氧化、植物防御诱导和治疗老年痴呆症等生物活性。除此以外，几丁寡糖作为一种低分子量的有机物，而且其中含有氮元素，可以作为一种很好的氮源。近年来对几丁寡糖的研究热度逐年激增。通过获得高产和高酶活的几丁质酶来制备几丁寡糖具有重大的应用前景。从虾蟹贝昆虫等甲壳类动物外壳中制备几丁寡糖具有巨大的经济价值。

几丁寡糖的制备一直是产业界的一个难题，目前国内尚未有几丁寡糖生产大规模产业化的企业。现有研究的技术，几丁寡糖的制备方法主要有化学降解法、壳寡糖乙酰化法和酶降解法。化学降解法一般用浓酸水解几丁质，常用浓盐酸，虽然其工艺简单，开展较早，但是该方法存在反应条件苛刻、不易控制、产量低、设备要求高和污染环境等缺点，且几丁寡糖产物聚合度都在4以下；壳寡糖乙酰化法(专利CN201110409312.4)步骤复杂费时费力，成本高昂，产业化的可能性很低；酶降解法是目前最有潜力的方法，然而现有酶降解法中所用到的专一性酶，如几丁质酶(专利CN2011102588936)和壳聚糖酶(专利CN200610080091X)，普遍都存在酶活力不够高和酶产量低的问题，且商品几丁质酶价格相对昂贵；而采用非专一性酶如纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶等约三十多种酶混合，对几丁质和壳聚糖可实现部分或完全水解，但非专一性酶相互之间需要协同作用，在实验中往往是多种酶的复合应用，不同批次水解产物均一性和稳定性低，产品质量无法控制，即使是同一种酶，不同批次或厂家的酶效果相差很大，不利于建立固定的实验工艺。因而获得高产和高酶活的几丁质酶，是制备几丁寡糖及其产业化的关键技术。获得高表达的几丁质酶以及其在几丁质回收中的使用具有重大的研究价值和应用潜力。

目前为止，尚未有人重组表达分离纯化过哈茨木霉的Chit46几丁质酶，更未有人将其用于胶体几丁质水解；进一步获得更高产量和高酶活的新几丁质酶仍是本领域的研究方向之一。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种哈茨木霉几丁质酶Chit46；该几丁质酶的发酵液酶活为31.4U/mL，比酶活为34.5U/mg，粗酶液产蛋白量为1.26g/L，纯化后蛋白量为0.77g/L，高于同类报道的几丁质酶。

本发明的另一目的提供所述的哈茨木霉几丁质酶Chit46表达及纯化方法，以哈茨木霉为来源，采用了基因工程的技术方法，利用所述的几丁质酶基因chit46构建重组质粒，然后在毕赤酵母中重组表达，通过亲和层析对发酵液中的几丁质酶组分进行纯化，首次成功表达纯化了哈茨木霉几丁质酶Chit46。

本发明的再一目的在于提供一种重组表达载体、重组工程细胞。

本发明的又一目的在于提供所述的几丁质酶Chit46在胶体几丁质水解中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种哈茨木霉几丁质酶Chit46，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码所述的哈茨木霉几丁质酶Chit46的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。

所述的几丁质酶Chit46的表达纯化方法，包括如下步骤：

(1)构建含有所述的几丁质酶基因片段chit46的重组表达载体；

(2)将所述的重组表达载体转化细胞；

(3)对阳性细胞进行发酵诱导及纯化。

步骤(1)中所述的表达载体优选为质粒pPIC9BM，该质粒通过将质粒pPIC9K的多酶切位点改造依次为BamHI，EcoRI，ApaI和MluI得到。

所述的几丁质酶基因片段chit46和pPIC9BM载体片段优选按摩尔比为1：5的比例进行连接。

步骤(1)中所述的几丁质酶基因片段chit46优选通过提取哈茨木霉总RNA，反转录得到哈茨木霉cDNA，再以所述的哈茨木霉cDNA为模板，设计特异性引物通过PCR扩增得到。

所述的特异性引物优选正向引物F(5’-CTGCGAATTCAGCCCCCTGGCCACAG-3’)和反向引物R(5’-ACTTACGCGTGTTCAGACCGTTCCTGATGTT-3’)，下划线的序列分别表示EcoR I酶切位点和MluI酶切位点。

所述的哈茨木霉优选为哈茨木霉GIM 3.442。

所述的哈茨木霉优选培养于改良PDA固体培养基中，30℃培养2天。

所述的改良PDA固体培养基的配方为马铃薯粉滤过液200mL，胶体几丁质4g，硫酸镁0.75g，磷酸二氢钾0.75g，琼脂粉4g。

步骤(2)中所述的细胞优选为毕赤酵母GS115。

步骤(2)中所述的转化优选为将所述的重组表达载体线性化后通过电转化法转入细胞。

所述的线性化的操作优选为用BglII内切酶酶切所述的重组表达载体。

步骤(2)中将所述的重组表达载体转化细胞的具体步骤进一步优选为：

①构建并提取pMD18-T-chit46克隆载体质粒，以之为模板进行PCR扩增，鉴定产物后用纯化回收，得到回收产物；

②把表达载体pPIC9K多酶切位点改造为BamHI，EcoRI，ApaI和MluI，构建得到表达载体pPIC9BM；

③使用EcoRI和MluI对步骤①的回收产物和步骤②得到的pPIC9BM载体进行双酶切后，分别纯化回收，得到双酶切后的几丁质酶基因片段chit46和pPIC9BM载体；

④将步骤③中得到的几丁质酶基因片段chit46和pPIC9BM载体进行体外连接，构建得到表达质粒pPIC9BM-chit46；

⑤对表达质粒pPIC9BM-chit46，用BglII内切酶酶切，将表达质粒载体线性化；

⑥制备毕赤酵母GS115感受态；使用电转化法把步骤⑤得到的线性化质粒转入毕赤酵母中。

步骤①中所述的鉴定优选为通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

步骤①所述的构建pMD18-T-chit46克隆载体质粒的具体操作为：将几丁质酶基因片段chit46与pMD18-T载体连接，T载体连接体系如下：pMD18-T为0.5μL、chit46为4.5μL、Solution I为5μL。

步骤④中所述的几丁质酶基因片段和pPIC9BM载体优选按摩尔比为1：5配比进行体外连接。

步骤(3)中所述的纯化优选通过镍柱亲和层析进行纯化，洗脱液优选为0.15M咪唑、0.5M NaCl、0.02M磷酸缓冲液(pH7.4)。

步骤(3)中所述的发酵诱导的条件优选为在BMMY培养液中，28℃，250rpm振荡培养，每24小时添加1.5％的甲醇溶液进行诱导表达；诱导的时间优选为7天。

所述的BMMY培养液的配方优选为酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，YNB13.4g，甲醇10mL，1M磷酸钾(pH 6)100mL，蒸馏水定容至1000mL。

一种重组表达载体，含有所述的几丁质酶Chit46的核苷酸序列。

一种重组工程细胞，含有所述的重组表达载体；该重组工程细胞可以表达所述的几丁质酶Chit46。

所述的几丁质酶Chit46在胶体几丁质水解中的应用。

所述的几丁质来源优选为虾、蟹、贝和昆虫等甲壳类动物中的一种或至少两种。

所述的几丁质酶在胶体几丁质水解中的应用的条件优选为pH为6.0，温度为45℃。

所述应用中水解产物的测定方法为DNS法测定还原糖和脱乙酰度测定。

所述应用中水解产物的检测方法为HPLC法，色谱柱为Asahipak NH2P-504E，色谱***为Shimadzu-LC-20A。

所述的应用中水解产物的检测条件优选为：流动相70％乙腈，上样量20μL，流速0.7mL/min，温度为30℃，洗脱时间40min，检测波长210nm。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明首次成功表达纯化了一种新的哈茨木霉几丁质酶Chit46。

2.本发明的Chit46发酵液蛋白酶活为每毫升31.4个单位，比酶活为每毫克34.5个单位，高于现有技术中几丁质酶，如Zhikui Hao等Chitinolyticbacter meiyuanensisSYBC-H1最高酶活达9.6U/mL；缑敬轩等优化微杆菌Z4产几丁质酶的发酵条件，最高酶活达到4.13U/mL；郝之奎等在慢生根瘤菌科芽生杆菌属菌株SYBC-H2发酵分泌几丁质酶的研究中发现，用玉米浆与几丁质的产酶交互作用较好，酶活达到5.70U/mL；Shaoqing Yang等用大肠杆菌重组表达巴伦葛兹类芽孢杆菌几丁质酶的酶活为2.14U/mL。

3.本发明的方法大幅度提高了几丁质酶的产量，本发明的几丁质酶Chit46粗酶液产蛋白量高达1.26g/L，纯化后蛋白量可达0.77g/L，高于同类报道的几丁质酶。

4.目前尚未有人重组表达分离纯化过哈茨木霉的Chit46几丁质酶，更未有人将其用于胶体几丁质水解。本发明在首次成功表达纯化了一种新的哈茨木霉几丁质酶Chit46的基础上，首次将其应用于胶体几丁质水解。

5.几丁质酶Chit46的水解活性好，且水解产物稳定，绝大部分为几丁二糖，免去了后续繁杂的各聚合度纯化分离工艺。

附图说明

图1是重组表达载体pPIC9BM-chit46的质粒图谱图。

图2是N-乙酰葡萄糖胺浓度-吸光值标准曲线图。

图3是重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图，其中，M表示标准分子量蛋白，泳道1是经过7天诱导的转化空载体的毕赤酵母上清液，泳道2是经过7天发酵诱导后得到的粗酶液，泳道3是经过7天发酵诱导后纯化后的样品。

图4是标准品和几丁质酶Chit46水解胶体几丁质的产物HPLC分析图；其中，上方图片是标准品，下方图片为几丁质酶Chit46水解胶体几丁质的产物。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1几丁质酶Chit46的异源表达及纯化

(一)哈茨木霉培养

将哈茨木霉GIM 3.442(购于广东省微生物菌种保藏中心)接种至改良PDA固体培养基(马铃薯粉滤过液200mL，胶体几丁质4g，硫酸镁0.75g，磷酸二氢钾0.75g，琼脂粉4g)中，30℃培养2天。

所述的胶体几丁质的制备方法为：称取10.0g几丁质(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号A500659)，加入100mL浓度为36％的浓盐酸，不停搅拌直至全部溶解，加入100mL乙醇和300mL蒸馏水，此时可见大量絮状物出现，然后用水冲洗所得絮状物直至中性，烘干称重放置4℃保存备用。

(二)哈茨木霉总RNA提取

(1)用高压蒸汽灭菌后的镊子摄取约100mg的菌丝体放入液氮预冷的研钵中，加入少量液氮，用研钵快速研磨，再加入少量液氮，继续研磨，反复3次，直至全部菌丝体彻底变成白色粉末。

(2)向研钵中加入2mL RNAiso Plus(购于大连宝生物工程有限公司)，尽量将粉末完全覆盖，然后室温静置，直至RNAiso Plus完全融化，用研钵继续研磨至裂解液呈透明状。将所得的裂解液等量转移至1.5mL离心管中，室温静置5分钟。12000rpm，4℃离心5分钟，小心吸取上清液，移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)。

(3)向步骤(2)中得到的上清液加入400μL氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡15秒。待溶液充分乳化后，再室温静置数分钟后12000rpm，4℃离心15分钟。

(4)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，无色的上清液、中间的白色蛋白层和带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中；

(5)向步骤(4)得到的上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置10分钟后，12000rpm，4℃离心10分钟。

(6)离心之后，试管底部有沉淀。小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入1mL 75％的乙醇(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒，洗涤离心管管壁，12000rpm，4℃离心5分钟后小心弃去乙醇。

(7)打开离心管盖子，倒置管子，室温干燥沉淀5分钟，加入20μL的RNase-free水溶解沉淀，待沉淀完全溶解后，将溶解液转移至RNase-free离心管中，置于-80℃保存。

(三)RT-PCR克隆Chit46编码序列

(1)使用PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit试剂盒(大连宝生物工程有限公司)进行反转录，按表1将下列组分加入到一个无核酶的PCR管中：

表1 RT-PCR体系

(2)65℃保温上述混合物5分钟后迅速置于冰上，再加入4μL 5×First-Strandbuffer，2μL 0.1M DTT，1μL 40U/mL RNase抑制剂于上述混合物中，轻轻混合并在37℃培养2分钟；

(3)加入1μL反转录酶，轻轻混合后在37℃培养50分钟；

(4)70℃培养15分钟灭活反转录酶，置于-20℃保存；

(5)设计正向引物F(5’-CTGCGAATTCAGCCCCCTGGCCACAG-3’)和反向引物R(5’-ACTTACGCGTGTTCAGACCGTTCCTGATGTT-3’)。以上一步获得的哈茨木霉cDNA为模板，按照以下PCR体系及程序，进行PCR反应获得目的DNA片段；

表2 PCR体系

PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30秒；51℃退火30秒；72℃延伸2分钟；32个循环；最后72℃延伸10分钟；然后将产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖浓度为1.5％，电泳条件为120V，25min，琼脂糖凝胶电泳的操作过程参见《分子克隆实验指南》。得到几丁质酶基因条带大小约为1200bp，使用凝胶回收试剂盒回收目的基因。

(四)TA克隆与重组质粒的筛选鉴定

(1)高保真酶产物经切胶回收后，利用Ex-taq酶进行加A反应，按以下体系将步骤(三)得到的目的基因片段(chit46)与pMD18-T载体(购于大连宝生物工程有限公司)连接，连接条件16℃，2h；

表3 T载体连接体系

然后42℃热击70秒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购买于大连宝生物工程有限公司)，涂布含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1000mL)中，37℃培养过夜。然后使用2×Taq PCR Mix进行菌落PCR筛选阳性菌落，反应体系及程序如下：

表4菌落PCR体系

菌落PCR反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒；51℃退火30秒；72℃延伸1分钟；32个循环；最后72℃延伸10分钟；然后将产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖浓度为1％，电泳条件为120V，25min，得到几丁质酶基因条带大小约为1200bp；

(2)挑取阳性克隆加入到含氨苄抗性的LB液体培养基于37℃，220rpm摇床上扩大培养12h。取扩大培养的菌液于离心管中，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，经过测序测得克隆基因长度为1224bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(五)基因chit46转化毕赤酵母GS115：

(1)提取克隆有几丁质酶基因的pMD18-T-chit46克隆载体质粒，以之为模板进行PCR扩增，PCR体系参照前文表2，然后将产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，用试剂盒纯化回收。把表达载体pPIC9K(购买于Invitrogen公司)多酶切位点改造，依次为BamH I，EcoR I，ApaI和Mlu I，并命名为pPIC9BM(图1)。构建载体使用RF克隆，引物为5’-GAAGCTGGATCCGAATTCCCGCTCGAGGGGCCCACGCGTCATCATCATCATC-3’(下划线的序列分别表示EcoRI酶切位点和MluI酶切位点)，反应体系为：

表5 RF克隆体系

反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10秒；58℃退火15秒；72℃延伸8分钟；32个循环；最后72℃延伸10分钟；产物测序鉴定；

使用EcoR I和Mlu I对回收产物和pPIC9BM载体按照说明书进行双酶切(双酶切体系如表6)，用普通DNA回收试剂盒对酶切后的DNA分别进行纯化回收，然后用核酸浓度检测仪检测DNA浓度；

表6双酶切体系

酶切条件37℃，4h；

(2)将纯化回收的几丁质酶基因片段chit46和pPIC9BM载体片段按摩尔比为1：5的比例利用T4连接酶进行体外连接，连接条件22℃，8h，连接体系如下表。

表7 T4连接酶连接体系

将连接后的重组质粒42℃热击70秒转化至大肠杆菌DH5α菌株中。在含有氨苄的平板上挑选阳性单菌落，提取其质粒进行双酶切鉴定，并且对该菌株也进行菌液和质粒测序鉴定；对构建成功的表达质粒命名为pPIC9BM-chit46。

(3)采用质粒小提试剂盒从阳性克隆菌株的菌悬液中提取表达质粒载体，然后对表达质粒载体用BglII内切酶酶切，将表达质粒载体线性化，酶切体系如下：

表8单酶切体系

酶切之后，用回收试剂盒回收质粒并测定浓度。

(4)制备毕赤酵母GS115感受态，具体步骤如下：

a.将-80℃冻存的毕赤酵母GS115菌株(购于Invitrogen)于YPD平板(胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，蒸馏水定容至1000mL)上划线接种，30℃培养3天；

b.挑取毕赤酵母GS115菌株的单菌落接种至含有25mL YPD培养液(胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL)的250mL三角瓶中，30℃、220rpm振荡培养2天；

c.取1mL步骤b最终得到的菌悬液接种至另一瓶含有50mL YPD培养液三角瓶中，30℃、220rpm振荡培养数小时，至菌悬液的OD600达到2.0；

d.将菌悬液转移已灭菌的50mL离心管中，5000rpm，4℃离心5分钟，去上清，用预冷的无菌水10mL将菌体重悬，然后转移至15mL离心管中；

e.5000rpm，4℃离心5分钟，去上清，用预冷的1M山梨醇10mL将菌体重悬，重复一次；

f.5000rpm，4℃离心5分钟，去上清，用1mL 1M山梨醇重悬菌体，置于冰上用于电转化；

(5)使用电转化法把步骤(3)得到的线性化质粒转入毕赤酵母中，电击条件为1.5kV，2mm电转杯，10ng线性化质粒。把电转化后的菌液涂布MD平板，30℃培养2天，挑选5个单菌落分别接种YPD液体培养基，然后低温裂解毕赤酵母转化子细胞，

裂解方法如下：

a.从MD平板(葡萄糖20g，YNB 13.4g，琼脂粉20g，蒸馏水定容至1000mL)上，挑取10个毕赤酵母转化子单菌落分别接种至2mL YPD培养液中，30℃，220rpm振荡培养2天；

b.分别将1mL菌液转移至离心管中，8000rpm离心2min，弃上清；

c.加入1mL TE buffer重悬菌体，8000rpm离心2min，弃上清，重复一次；

d.沸水浴30min后转移至-80℃冰箱放置一个小时，然后沸水浴10min；

e.8000rpm离心2min，所得上清置于-20℃保存；

使用2×Taq PCR Mix进行菌落PCR鉴定，反应体系及程序参照表4。

实施例2几丁质酶Chit46的发酵诱导、纯化与酶活测定

(1)挑选实施例1得到的阳性重组毕赤酵母菌株划线MD平板，30℃培养2天，挑取单菌落接种于装有50mL BMGY培养液(酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，YNB 13.4g，甘油10mL，1M磷酸钾(pH6.0)100mL，蒸馏水定容至1000mL)的三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养至OD600≈5.0。然后离心收集菌体沉淀，等量转移菌体沉淀至装有100mL BMMY培养液(酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，YNB 13.4g，甲醇10mL，1M磷酸钾(pH6.0)100mL，蒸馏水定容至1000mL)的三角瓶中28℃，250rpm振荡培养，每24小时添加1.5％的甲醇溶液进行诱导表达，诱导7天，最终获得发酵液。

(2)发酵液5000rpm，4℃离心10min取上清液得到粗酶液。

(3)通过镍柱亲和层析纯化目的蛋白获得纯酶液，其中镍柱亲和层析上样量为150mL，所用洗脱液为0.15M咪唑、0.5M NaCl、0.02M磷酸缓冲液(pH7.4)。

(4)采用Ghose的DNS法测定几丁质酶酶活。

分别配制浓度为0、200、400、600、800、1000μg/mL的N-乙酰葡萄糖胺溶液，加入相同体积的蒸馏水和3倍体积的DNS溶液(Ghose法配制)沸水浴反应10分钟，在12000rpm离心2分钟后吸取上清在540nm波长下测定吸光值，得到标准N-乙酰葡萄糖胺梯度浓度溶液-吸光值曲线，如图2所示。

把1mL用pH 6的50mM磷酸钠缓冲液适当稀释的酶液(以在保证底物过量条件下反应得到的检测产物浓度在所作标准曲线范围内)与1mL含有2％胶体几丁质的pH 6.0的50mM磷酸钠缓冲液分别在45℃预热5分钟，充分混匀后在45℃水浴反应30分钟，马上加入2mL蒸馏水和6mL DNS试剂(Ghose法配制)终止反应，沸水浴10分钟，在12000rpm离心2分钟后吸取上清在540nm波长下测量吸光值，通过前述的标准N-乙酰葡萄糖胺梯度浓度溶液-吸光值曲线计算几丁质酶酶活，以100℃沸水浴10分钟的酶液作为空白对照。以在pH 6.0、45℃下每分钟水解生产1μmol N-乙酰葡萄糖胺当量的还原糖所需的酶量为1个酶活单位(U)。

以转化空载体pPIC9BM的GS115菌株作为实验对照。

测得本发明所得的发酵液几丁质酶活为31.4U/mL，纯化后酶液的比酶活为34.5U/mg。与现有报道的几丁质酶相比处于较高水平，如缑敬轩等优化微杆菌Z4产几丁质酶的发酵条件，最高产酶量达到4.13U/mL；郝之奎等在慢生根瘤菌科芽生杆菌属菌株SYBC-H2发酵分泌几丁质酶的研究中发现，用玉米浆与几丁质的产酶交互作用较好，产酶量达到5.70U/mL；Xin Niu等用毕赤酵母重组表达灰盖鬼伞菌几丁质酶产酶量为0.151U/mL；ShaoqingYang等用大肠杆菌重组表达巴伦葛兹类芽孢杆菌几丁质酶的产酶量为2.14U/mL。

通过生工生物工程(上海)股份有限公司的BCA蛋白浓度试剂盒对粗酶液和纯化后的蛋白酶的产量进行测定，粗酶液产蛋白量为1.26g/L，纯化后蛋白量为0.77g/L。

进一步的，本发明的几丁质酶Chit46与现有技术中报道的几丁质酶的酶学特性对比如表9所示；由此可见，本发明获得了酶活显著高于现有技术的一种新几丁质酶。

表9

备注：

1.*ND:未测定

2.相关几丁质酶的文献出处：

[1]Alias,N.；Mahadi,N.M.；Murad,A.M.A.；Bakar,F.D.A.；Mahmood,N.A.N.；Illias,R.M.,Expression and characterization of Trichodermavirens UKM-1endochitinase in Escherichia coli.World J.Microbiol.Biotechnol.2009,25(4),561-572.

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实施例3重组蛋白的SDS-PAGE检测

利用SDS-PAGE凝胶电泳来确认实施例2得到的重组几丁质酶的表达情况、纯度和分子质量的大小。采用的浓缩胶浓度为12％以及分离胶浓度为5％，上样量为20μL，以标准分子量的标准蛋白作为Marker。SDS-PAGE凝胶电泳的操作过程参见《蛋白质电泳实验技术》。对于发酵液样品的制备，诱导表达产生的重组几丁质酶的量较高，可以直接将发酵液稀释1倍后与上样缓冲液混匀，沸水煮沸10min后，12000rpm离心1min，上样后进行电泳。

粗酶液(指未经过镍柱亲和层析纯化的发酵液)与纯化后酶液的SDS-PAGE电泳图如图3所示，M表示标准分子量蛋白，泳道1是经过7天诱导的转化空载体的毕赤酵母上清液，泳道2是经过7天发酵诱导的粗酶液，泳道3是经过7天发酵诱导后通过亲和层析纯化的样品。由图中可以看出，转化空载体的毕赤酵母并无蛋白表达，而未经纯化的阳性诱导(即泳道2)的上清液中均有一深一浅两个蛋白条带，其中深色条带大小接近45kDa，与预期结果相符；由泳道3可看出，经过纯化处理后有一深一浅两个蛋白条带，有文献推测分子量较小的条带为未糖基化的蛋白条带，结果表明已经成功获得电泳纯级别的几丁质酶Chit46。

实施例4几丁质酶Chit46水解胶体几丁质

以pH 6.0的50mM磷酸钠缓冲液重悬获得4％的胶体几丁质(制备方法同实施例1)，加入等量用pH 6.0的50mM磷酸钠缓冲液30U/g的几丁质酶Chit46纯酶液，充分混匀后在40℃振荡反应12小时，在12000rpm离心2分钟，获得的上清即为几丁质酶Chit46水解胶体几丁质的产物。

实施例5几丁质酶Chit46水解胶体几丁质产物的测定

采用Ghose的DNS法测定水解产物还原糖含量。取1mL以蒸馏水适当稀释的实施例4得到的水解产物，加入1mL蒸馏水和3mL DNS试剂，沸水浴10分钟，在12000rpm离心2分钟后吸取上清在540nm波长下测量吸光值，并根据实验前作好的标准N-乙酰葡萄糖胺梯度浓度溶液-吸光值曲线计算还原糖含量，以蒸馏水作为空白对照。测得水解产物还原糖含量为8.24mg/mL。

采用《GB 29941-2013食品安全国家标准食品添加剂脱乙酰甲壳素(壳聚糖)》A.3.2碱量法测定水解产物的脱乙酰度，测得其脱乙酰度为8.71％，表明水解产物绝大部分确实为几丁寡糖。

实施例6几丁质酶Chit46水解胶体几丁质产物的检测

实施例4得到的水解产物加入3倍体积的乙醇以除去产物中的酶，在12000rpm离心2分钟，上清于65℃烘箱中放置1小时以除去乙醇，所得产物用HPLC检测，其中色谱柱为Asahipak NH2P-50 4E，色谱***为Shimadzu-LC-20A。检测条件为流动相70％乙腈，上样量20μL，流速0.7mL/min，温度为30℃，洗脱时间40min，检测波长210nm。结果如图4所示，检测结果表明产物中由N-乙酰葡萄糖胺、几丁二糖、几丁三糖和几丁四糖组成，其中几丁二糖占其中的绝大部分，达94.79％，其他N-乙酰葡萄糖胺、几丁三糖和几丁四糖分别占1.55％，2.8％和0.87％，总含量为15.92mg/mL，回收率达79.6％。

上述结果表明几丁质酶Chit46具备水解胶体几丁质制备高纯度几丁二糖的应用潜力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种几丁质酶Chit46及其表达纯化方法与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 408

<212> PRT

<213> 哈茨木霉GIM 3.442(T. harzianum GIM 3.442)

<400> 1

Ser Pro Leu Ala Thr Glu Glu Arg Ser Val Glu Lys Arg Ala Asn Gly

1 5 10 15

Tyr Ala Asn Ser Val Tyr Phe Thr Asn Trp Gly Ile Tyr Asp Arg Asn

20 25 30

Phe Gln Pro Ala Asp Leu Val Ala Ser Asp Val Thr His Val Ile Tyr

35 40 45

Ser Phe Met Asn Leu Gln Ala Asp Gly Thr Val Val Ser Gly Asp Thr

50 55 60

His Ala Asp Phe Glu Lys His Tyr Ala Asp Asp Ser Trp Asn Asp Val

65 70 75 80

Gly Thr Asn Ala Tyr Gly Cys Ala Lys Gln Leu Phe Lys Val Lys Lys

85 90 95

Ala Asn Arg Gly Leu Lys Val Leu Leu Ser Ile Gly Gly Trp Thr Trp

100 105 110

Ser Thr Asn Phe Pro Ser Ala Ala Ser Thr Asp Ala Asn Arg Lys Asn

115 120 125

Phe Ala Lys Thr Ala Ile Thr Phe Met Lys Asp Trp Gly Phe Asp Gly

130 135 140

Ile Asp Val Asp Trp Glu Tyr Pro Ala Asp Ala Thr Gln Ala Ser Asn

145 150 155 160

Met Val Leu Leu Leu Lys Glu Val Arg Ser Gln Leu Asp Ala Tyr Ala

165 170 175

Ala Gln Tyr Ala Pro Gly Tyr His Phe Leu Leu Thr Ile Ala Ala Pro

180 185 190

Ala Gly Lys Asp Asn Tyr Ser Lys Leu Arg Leu Ala Asp Leu Gly Gln

195 200 205

Val Leu Asp Tyr Ile Asn Leu Met Ala Tyr Asp Tyr Ala Gly Ser Phe

210 215 220

Ser Pro Leu Thr Gly His Asp Ala Asn Leu Phe Ala Asn Pro Ser Asn

225 230 235 240

Pro Asn Ala Thr Pro Phe Asn Thr Asp Ser Ala Val Lys Asp Tyr Ile

245 250 255

Asn Gly Gly Val Pro Ala Asn Lys Ile Val Leu Gly Met Pro Ile Tyr

260 265 270

Gly Arg Ser Phe Gln Asn Thr Ala Gly Ile Gly Gln Thr Tyr Asn Gly

275 280 285

Val Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ser Trp Glu Ala Gly Ile

290 295 300

Trp Asp Tyr Lys Ala Leu Pro Lys Ala Gly Ala Thr Ile Gln Tyr Asp

305 310 315 320

Ser Val Ala Lys Gly Tyr Tyr Ser Tyr Asn Ala Gly Thr Lys Glu Leu

325 330 335

Ile Ser Phe Asp Thr Pro Asp Met Ile Asn Thr Lys Val Ala Tyr Leu

340 345 350

Lys Ser Leu Gly Leu Gly Gly Ser Met Phe Trp Glu Ala Ser Ala Asp

355 360 365

Lys Lys Gly Ala Asp Ser Leu Ile Gly Thr Ser His Arg Ala Leu Gly

370 375 380

Gly Leu Asp Thr Thr Gln Asn Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Ser Lys Tyr

385 390 395 400

Asp Asn Ile Arg Asn Gly Leu Asn

405

<210> 2

<211> 1224

<212> DNA

<213> 哈茨木霉GIM 3.442(T. harzianum GIM 3.442)

<400> 2

agccccctgg ccacagaaga gcgctctgtt gagaagagag ccaacggata cgcaaactcc 60

gtctatttca ccaactgggg catttacgac cgcaacttcc agcctgccga tttggtggca 120

tcagatgtca ctcatgtcat ctactcattc atgaacctcc aggcagacgg cacagttgtc 180

tctggcgata cccacgctga tttcgagaag cactatgccg atgattcttg gaatgatgtc 240

ggcaccaatg cctacggctg tgccaagcag ctgttcaagg tcaagaaggc caaccgaggc 300

ctcaaggttc tgctctccat cggtggctgg acctggtcca ccaacttccc ttctgcagca 360

agcacggatg ccaaccgaaa gaactttgcg aaaactgcca ttaccttcat gaaggattgg 420

ggtttcgatg gcattgacgt cgactgggag taccctgcag acgccaccca ggcctccaac 480

atggttcttc tgctgaagga agtccgatct cagctggatg cttatgctgc ccagtacgcc 540

cctggctacc acttcctcct caccattgcc gccccagctg gcaaggataa ctactccaag 600

ctgcgcctgg ctgatctcgg ccaagtcctc gactacatca acctcatggc ctacgactac 660

gctggatcct tcagccccct caccggtcac gacgccaacc tgtttgccaa cccgtccaac 720

cccaatgcca cacccttcaa caccgattct gctgtcaagg attatatcaa tggaggtgtt 780

cccgccaaca agattgttct cggcatgccc atctacggac gatcattcca gaacaccgct 840

ggcattggcc agacttacaa cggagttgga ggtggcggtg gtggctccac tggaagctgg 900

gaggccggta tctgggatta caaggctctt cccaaggccg gcgccaccat ccagtacgac 960

tctgtcgcaa agggttacta cagctacaac gccggcacca aggagctcat ctctttcgat 1020

acccctgaca tgatcaacac caaggttgcc tacctcaagt ctctcggcct aggaggtagc 1080

atgttctggg aagcctcagc cgacaagaag ggagctgact cgctgattgg aacaagccac 1140

agagctcttg gaggcctgga cacgactcag aacttgctga gctaccccaa ctccaagtat 1200

gataacatca ggaacggtct gaac 1224

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgcgaattc agccccctgg ccacag 26

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acttacgcgt gttcagaccg ttcctgatgt t 31

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaagctggat ccgaattccc gctcgagggg cccacgcgtc atcatcatca tc 52

Claims

1.一种哈茨木霉几丁质酶Chit46，其特征在于：

所述的哈茨木霉几丁质酶Chit46的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的哈茨木霉几丁质酶Chit46，其特征在于：

编码所述的哈茨木霉几丁质酶Chit46的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1或2任一项所述的哈茨木霉几丁质酶Chit46的表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建含有所述的几丁质酶基因片段chit46的重组表达载体；

(2)将所述的重组表达载体转化细胞；

(3)对阳性细胞进行发酵诱导及纯化。

4.根据权利要求3所述的哈茨木霉几丁质酶Chit46的表达纯化方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的表达载体为质粒pPIC9BM，该质粒通过将质粒pPIC9K的多酶切位点改造依次为BamHI，EcoRI，ApaI和MluI得到；

所述的几丁质酶基因片段chit46和pPIC9BM载体片段按摩尔比为1：5的比例进行连接；

所述的哈茨木霉为哈茨木霉GIM 3.442；

步骤(2)中所述的细胞为毕赤酵母GS115；

步骤(2)中所述的转化为将所述的重组表达载体线性化后通过电转化法转入细胞；

所述的线性化的操作为用BglII内切酶酶切所述的重组表达载体。

5.根据权利要求3所述的所述的哈茨木霉几丁质酶Chit46的表达纯化方法，其特征在于，步骤(2)中将所述的重组表达载体转化细胞的具体步骤为：

6.根据权利要求3～5任一项所述的哈茨木霉几丁质酶Chit46的表达纯化方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的纯化通过镍柱亲和层析进行纯化；洗脱液为0.15M咪唑、0.5M NaCl、0.02M的pH7.4的磷酸缓冲液；

步骤(3)中所述的发酵诱导的条件为在BMMY培养液中，28℃，250rpm振荡培养，每24小时添加1.5％的甲醇溶液进行诱导表达；诱导的时间为7天；

所述的BMMY培养液的配方为酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，YNB 13.4g，甲醇10mL，1MpH为6的磷酸钾100mL，蒸馏水定容至1000mL。

7.一种重组表达载体，其特征在于：

含有权利要求1或2任一项所述的哈茨木霉几丁质酶Chit46的核苷酸序列。

8.一种重组工程细胞，其特征在于：

含有权利要求7所述的重组表达载体。

9.权利要求1或2任一项所述的哈茨木霉几丁质酶Chit46在胶体几丁质水解中的应用。

10.根据权利要求9所述的哈茨木霉几丁质酶Chit46在胶体几丁质水解中的应用，其特征在于：

所述的几丁质来源为虾、蟹、贝和昆虫甲壳类动物中的一种或至少两种；

所述的几丁质酶在胶体几丁质水解中的应用的条件为：pH为6.0，温度为45℃。