CN111944787B - 一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶及其制备方法与应用，属于生物工程技术领域。所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶，包括将带有连接肽的碳水化合物结合模块与几丁质酶Chit46的C端串联构成的融合几丁质酶。本发明首次成功将融合了CBM的几丁质酶Chit46‑CBM3、Chit46‑CBM6和Chit46‑CBM26应用于虾壳废弃物回收。融合了CBM后，虾壳中的几丁质能够直接被融合几丁质酶水解，避免了传统工艺中强碱试剂的使用以及复杂的预处理步骤。

Description

一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶及其制备方法与应用。
背景技术
广东省是中国的水产大省，据统计，2016年广东水产品生产总量达到882万吨，其中包括了多种虾蟹等，仅虾产量就近100万吨。虾可食用部分不到50％，虾仁加工过程中会产生大量的虾头、虾壳等废弃物，虾头就占全虾重量的三分之一以上，每年广东省的虾加工下脚料就达数十万吨。而随着我国海产业及人工养殖虾、蟹业的发展，这些废弃物数量将越来越大，造成了严重的环境污染(Ferraro et al.,2010,Valorisation of naturalextracts from marine source focused on marine by-products:A review)。另一方面，它们又是一类宝贵的生物资源，废弃虾壳中含有丰富的生物资源，如几丁质、蛋白质、虾青素等，具有很高的开发利用价值(Shahidi and Synowiecki,1991)。因此，如何实现对废弃虾壳的综合利用，回收其中的活性成分已经成为了研发的热点。
尽管几丁质酶可以有效地水解几丁质，但大多数几丁质酶不能直接水解虾壳，其中顽强的高度有序的几丁质蛋白质结构是它们接近几丁质的主要障碍。完整的几丁质生物质表皮形成不可渗透的包膜，以防止其自身被酶降解。Chit46在虾壳经过蛋白酶预处理和脱蛋白后可以有效地水解回收虾壳几丁质，但却几乎不水解完整的虾壳。来自柯达喀尔热球菌的Tk-ChiA可以降解虾壳，但最大还原糖产量仅为3.12％(Chen L.,et al.AnArchaeal Chitinase With a Secondary Capacity for Catalyzing Cellulose and ItsBiotechnological Applications in Shell and Straw Degradation,Frontiers inMicrobiology,10.doi:10.3389/fmicb.2019.01253)，维罗纳气单胞菌的重组ChiB565(Zhang Y.,et al.High-yield production of a chitinase from Aeromonas veroniiB565 as a potential feed supplement for warm-water aquaculture,Appl MicrobiolBiotechnol(2014)98:1651-1662.DOI 10.1007/s00253-013-5023-6)和Chitinibactersp.GC72的几丁质酶(Gao C.,et al.Characterization of extracellular chitinasefrom Chitinibacter sp.GC72 and its application in GlcNAc production fromcrayfish shell enzymatic degradation,Biochemical Engineering Journal,97(2015)59-64.https://doi.org/10.1016/j.bej.2015.02.010)报道可以直接水解虾壳，但他们几丁质酶的产量却很低。
因此，开发更高效的几丁质酶是一种最有希望、最经济、最节能的绿色战略，增强几丁质酶对虾壳的底物亲和力是实现这一目标的最可行方法之一。
目前为止，尚未见有人将融合碳水化合物结合模块的几丁质酶用于虾壳直接水解。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶。
本发明的又一目的在于提供上述融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的制备方法。
本发明的又一目的在于提供上述融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶，包括将带有连接肽的碳水化合物结合模块与几丁质酶Chit46的C端串联构成的融合几丁质酶。
所述的几丁质酶Chit46为中国专利申请CN201910064040.5所记载的几丁质酶Chit46。
所述的碳水化合物结合模块优选包括枯草芽孢杆菌糖苷酶的碳水化合物结合模块(CBM)。
来自动物，植物和细菌的大多数几丁质酶在距其催化结构域一段距离的N或C末端具有一个或多个碳水化合物结合模块(CBM)，而来自真菌的许多几丁质酶则没有CBM。本发明人意外发现，添加CBM可以提高几丁质酶对虾壳底物的亲和力。
CBM可分为三种类型：A型，可识别有序结晶多糖的表面；B型，结合在多聚糖链的内部(内切型)；C型，结合多聚糖链的末端(外切型)。这些CBM可以直接结合底物，并引起糖苷酶的多重攻击或持续性攻击，从而确保长时间的接触并显著增加多糖表面的有效浓度以增强其活性。此外，一些CBM可以破坏结晶多糖的结构，导致底物结合位点增加。
所述的枯草芽孢杆菌糖苷酶的碳水化合物结合模块(CBM)优选为枯草芽孢杆菌168菌株的碳水化合物结合模块(CBM)；更优选为枯草芽孢杆菌168菌株的碳水化合物结合模块中的CBM3、CBM6和CBM26中的至少一种；
所述的CBM3的氨基酸序列来源于序列Genbank：CAA82317；
所述的CBM6的氨基酸序列来源于序列Genbank：CAB13699；
所述的CBM26的氨基酸序列来源于序列Genbank：CAA23437。
所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.1～3所示的任一氨基酸序列。
编码所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的核苷酸序列优选如SEQ IDNO.4～6所示的任一核苷酸序列。
一种重组载体，含有上述融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的核苷酸序列。
一种重组基因工程菌株，含有上述重组载体；是将上述重组载体转入基因工程菌株获得。
一种利用基因工程技术生产融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)获得包含上述融合碳水化合物结合模块的几丁质酶编码基因的重组载体；
(2)将步骤(1)获得的重组载体转入基因工程菌株中，得到重组表达菌株；发酵培养重组表达菌株，收集发酵液；
(3)分离步骤(2)收集的发酵液，取上清得到粗酶液，即得融合碳水化合物结合模块的几丁质酶酶液。
步骤(2)中所述的基因工程菌株选自细菌、酵母和真菌；优选为酵母；更优选为毕赤酵母GS115。
步骤(2)中所述的发酵培养的培养基优选为BMMY液体培养基；所述的发酵培养基(总体积1000mL)优选由以下成分组成：酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，YNB 13.4g，甲醇15mL，1M磷酸钾(pH6.0)100mL。
步骤(3)中所述的纯化优选通过镍柱亲和层析和Sephadex G-75柱层析纯化。
所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶在虾壳废弃物的新型绿色回收工艺和/或食品中的应用。
所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶可以以粗酶液的形式也可以将粗酶液纯化后用于虾壳废弃物的新型绿色回收工艺和/或食品中。
所述的食品优选为动物饲料；更优选为用于动物饲料中的虾风味食品添加剂。
一种虾壳废弃物的新型绿色回收工艺，通过将上述融合碳水化合物结合模块的几丁质酶与虾壳废弃物混合然后加入溶剂进行水解，固液分离后得到虾壳几丁质水解产物和虾壳残余物。
所述的虾壳废弃物为甲壳类动物的壳；优选包括虾、蟹和贝中的一种或至少两种。
所述的虾壳废弃物可以为虾壳废弃物粉末，也可以为未粉碎处理的虾壳废弃物；优选为虾壳废弃物粉末；更优选为过50目筛的虾壳废弃物粉末。
所述的溶剂优选包括50mM pH6.0的磷酸钠缓冲液和水中的至少一种；所述的水优选为蒸馏水。
所述的虾壳废弃物在水解体系中的终浓度为10％(w/v)。
所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的加酶量优选为90～110U/g虾壳废弃物粉末；更优选为100U/g虾壳废弃物粉末。
所述的水解的温度优选为30～60℃；进一步优选为40～50℃；更优选为40℃。
所述的水解的时间优选为10～14h；更优选为12h。
所述的固液分离方法优选为离心法。
所述的固液分离的条件优选为5000rpm离心10min。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.目前尚未有人将融合碳水化合物结合模块的几丁质酶用于虾壳废弃物直接水解。本发明首次成功将融合了CBM的几丁质酶Chit46-CBM3、Chit46-CBM6和Chit46-CBM26应用于虾壳废弃物回收。
2.本发明所用的融合几丁质酶Chit46-CBM3、Chit46-CBM6和Chit46-CBM26能直接水解虾壳，且几丁质回收效果也好于其他报道(如An Archaeal Chitinase With aSecondary Capacity for Catalyzing Cellulose and Its BiotechnologicalApplications in Shell and Straw Degradation一文中报道的来自柯达喀尔热球菌的Tk-ChiA可以降解虾壳，但其最大还原糖产量仅为3.12％。)
3.融合了CBM后，虾壳中的几丁质能够直接被融合几丁质酶水解，避免了传统工艺中强碱试剂的使用以及复杂的预处理步骤。
4.融合几丁质酶Chit46-CBM3、Chit46-CBM6和Chit46-CBM26的水解活性好，且水解产物稳定，脱乙酰度低，几丁寡糖分布丰富，能得到聚合度在5～7的几丁寡糖(活性最好，与相关受体的亲和力最强)。
5.本申请所述的虾壳废弃物的新型绿色回收工艺能够使虾壳废弃物通过融合几丁质酶直接水解，而无需任何复杂的预处理。虾壳水解产物含有几丁寡糖和可溶性蛋白，可以很好地支持微生物的生长，并且残留物易于被哺乳动物消化，为虾壳废弃物的处理和利用提供了一种简单，清洁，经济的方法。
附图说明
图1是融合几丁质酶的融合和表达图；图A为不同几丁质酶的结构域示意图；图B为纯化的几丁质酶的SDS-PAGE凝胶分析结果图，泳道M代表标准蛋白质；图C为发酵液(粗酶液)的几丁质酶活性结果图；图D为几丁质酶的比酶活结果图。
图2是几丁质酶的酶学性质结果图；图A为几丁质酶的最适温度结果图；图B为几丁质酶的热稳定性结果图；图C为几丁质酶的最适pH结果图；图D为几丁质酶的pH稳定性结果图；图E为几丁质酶的底物结合活性结果图。
图3是融合几丁质酶对虾壳的影响结果图；其中，EP代表上表皮，EX代表外表皮，EN代表内表皮；图A为虾壳废弃物加工处理中几丁寡糖和可溶性蛋白回收处理率结果图；图B为经热变性几丁质酶处理的虾壳显微结构图；图C为经Chit46处理的虾壳显微结构图；图D为经Chit46-CBM3处理的虾壳显微结构图；图E为经Chit46-CBM6处理的虾壳显微结构图；图F为经Chit46-CBM26处理的虾壳显微结构图。
图4是虾壳几丁质水解产物的HPLC分析结果图；其中：DP1代表GlcNAc；DP2代表(GlcNAc)2；DP3代表(GlcNAc)3；DP4代表(GlcNAc)4；DP5代表(GlcNAc)5；DP6代表(GlcNAc)6；DP6*代表(GlcNAc)6*，表示假定部分脱乙酰基(GlcNAc)6；DP7 #代表(GlcNAc)7 #，表示为假定(GlcNAc)7。
图5是融合几丁质酶处理的虾壳几丁质水解产物的脱乙酰度和FT-IR分析结果图；图A为不同几丁质酶水解虾壳粉得到的虾壳几丁质水解产物和未处理的虾壳粉(对照)的脱乙酰度结果图；图B为不同虾壳几丁质水解产物中的含有乙醇的几丁寡糖溶液冷冻干燥后得到的样品和对照的FT-IR分析结果图；其中对照为热变性几丁质酶水解虾壳粉得到的虾壳几丁质水解产物中的含有乙醇的几丁寡糖溶液冷冻干燥后得到的样品。
图6是虾壳几丁质水解产物对微生物生长和残留物的体外消化率结果图；图A为虾壳几丁质水解产物对大肠杆菌DH5α生长的影响结果图；图B为虾壳几丁质水解产物对枯草芽孢杆菌WB600生长的影响结果图；图C为虾壳几丁质水解产物对巴斯德毕赤酵母GS115生长的影响结果图；图D为被Chit46-CBM3水解的虾壳残留物根据重量减少量计算的体外消化率和消化液中可溶性肽或氨基酸含量结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：虾壳废弃物各项成分测定
虾壳废弃物购买于湛江国联水产开发股份有限公司，粉碎过50目筛子，得到虾壳废弃物粉末，4℃保存备用。测定虾壳废弃物中的蛋白质、灰分、几丁质和水分的方法如下：
(1)蛋白质：因几丁质中含有氮元素，为排除干扰，先用1M NaOH溶液40℃处理虾壳粉3h，上清液使用凯氏定氮法测定蛋白质浓度(GB 50095-2010)，测得虾壳中蛋白质含量为48.84％；
(2)灰分：使用食品安全国家标准(GB5009.4-2016)中的“第一法食品中总灰分的测定”，测得虾壳中灰分含量为20.75％；
(3)几丁质：先用1M NaOH溶液40℃处理虾壳粉3h除去蛋白质，沉淀再用1M HCl溶液室温处理3h，得到白色几丁质沉淀，测得虾壳中几丁质含量为18.9％；
(4)水分：使用直接干燥法(GB5009.3-2016)，测得虾壳中水分含量为4.9％。
实验中所用的新鲜虾壳为南美白对虾；购自湛江国联水产开发股份有限公司。
实施例2：CBM与几丁质酶Chit46的融合
以中国专利申请CN201910064040.5公开的哈茨木霉cDNA为模板，设计引物F1(5’-CTGCGAATTCAGCCCCCTGGCCACAG-3’)和R1
(5’-ACTTACGCGTAACTGGGCCCGTTCAGACCGTTCCTGATGTT-3’)(下划线的序列分别表示EcoRI酶切位点、MluI酶切位点和ApaI酶切位点)，通过PCR方法获得Chit46-C片段(Chit46的氨基酸和核苷酸序列分别如中国专利申请CN201910064040.5中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)；以枯草芽孢杆菌168菌株的cDNA为模板，设计引物F3(5’-AACTGGGCCCCAGGAATCATCCTCAGCT-3’)和R3(5’-ACTTACGCGTATTTGGTTCTGTTCCCCA-3’)(下划线的序列分别表示ApaI酶切位点和MluI酶切位点)，通过PCR方法获得带有连接肽的CBM3(来源于序列Genbank：CAA82317)；以枯草芽孢杆菌168菌株的cDNA为模板，设计引物F6
(5’-AACTGGGCCCATTTCCAATTTAAACCCAT-3’)和R6(5’-ACTTACGCGTTTGCGTAAACTGCCAGTAA-3’)(下划线的序列分别表示ApaI酶切位点和MluI酶切位点)，通过PCR方法获得带有连接肽的CBM6(来源于序列Genbank：CAB13699)；以枯草芽孢杆菌168菌株的cDNA为模板，设计引物F26
(5’-AACTGGGCCCGCAAAAGCGCCTCATGTT-3’)和R26(5’-ACTTACGCGTATTCTGACCGGGCACTTG-3’)(下划线的序列分别表示ApaI酶切位点和MluI酶切位点)，通过PCR方法获得带有连接肽的CBM26(来源于序列Genbank：CAA23437)。使用EcoRI和MluI核酸内切酶处理纯化回收的Chit46-C片段，酶切产物纯化回收后在16℃反应12h条件下连接到pIC9BM载体上(已在文献Deng J.J.,et al.Biocontrol activity ofrecombinant aspartic protease from Trichoderma harzianum against pathogenicfungi,Enzyme and Microbial Technology,112(2018)35-42.中记载)，将得到的重组载体命名为pIC9BM-Chit46-C；连接反应体系如表1所示：
表1：连接体系
Figure BDA0002609718510000041
Figure BDA0002609718510000051
分别用ApaI和MluI处理用于C端融合的CBM片段和pIC9BM-Chit46-C，然后把各酶切后的CBM连接到酶切后的pPICBM-Chit46-C上，将得到的重组载体命名为pIC9BM-Chit46-CBM；将含有融合基因的重组载体pIC9BM-Chit46-CBM转化到大肠杆菌DH5α中，在含有氨苄的平板上挑选阳性单菌落，提取其质粒进行双酶切鉴定，并且对该菌株也进行菌液和质粒测序鉴定，确定成功构建表达质粒。用于测序鉴定的引物是：F：5’AOX；R：3’AOX。
采用质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)从阳性克隆菌株的菌悬液中提取表达质粒载体，然后对表达质粒载体用BglII内切酶酶切，将表达质粒载体线性化，酶切体系如表2所示：
表2：
Figure BDA0002609718510000052
酶切之后，用回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)回收质粒并测定浓度。
毕赤酵母GS115感受态制备
(1)将-80℃冻存的毕赤酵母GS115菌株(购于Invitrogen，下同；)于YPD平板(20g胰蛋白胨、10g酵母提取物、20g葡萄糖、20g琼脂粉，蒸馏水定容至1000mL；下同)上划线接种，30℃培养3天；
(2)挑取毕赤酵母GS115菌株的单菌落接种至含有25mL YPD液体培养基(20g胰蛋白胨、10g酵母提取物、20g葡萄糖，蒸馏水定容至1000mL；下同)的250mL三角瓶中，30℃、220rpm振荡培养2天；
(3)取1mL步骤(2)最终得到的菌悬液接种至另一瓶含有50mL YPD液体培养基的三角瓶中，30℃、220rpm振荡培养4-6小时，直至菌悬液的OD600达到2.0；
(4)将菌悬液转移已灭菌的50mL离心管中，5000rpm，4℃离心5分钟，去上清，用预冷的无菌水10mL将菌体重悬，然后转移至15mL离心管中；
(5)5000rpm，4℃离心2分钟，去上清，加入200mM DTT和醋酸锂溶液，冰上放置10min；
(6)5000rpm，4℃离心2分钟，去上清，用预冷的1M山梨醇10mL将菌体重悬；重复步骤一次；
(7)5000rpm，4℃离心2分钟，去上清，用1-2mL 1M山梨醇重悬菌体，置于冰上用于电转化；
使用电转化法把上述线性化的质粒转入毕赤酵母GS115中，电击条件为1500V，2mm电转杯，10ng线性化质粒，3.5-4.5ms。把电转化后的菌液涂布MD平板，30℃培养2天，挑选5个单菌落分别接种YPD液体培养基，然后用Lysis Buffer for Microorganism to DirectPCR试剂盒(购于Takara，依据试剂盒说明书进行裂解操作)裂解毕赤酵母转化子细胞，取少量上清即可进行PCR鉴定，鉴定引物为：F：5’AOX；R：3’AOX。即可确定得到阳性重组毕赤酵母菌株。菌落PCR反应体系如表3所示：
表3：菌落PCR体系
Figure BDA0002609718510000061
挑选阳性重组毕赤酵母菌株划线MD平板，30℃培养2天，挑取单菌落接种于装有50mL BMGY液体培养基(酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，YNB 13.4g，甘油10mL，1M磷酸钾(pH6.0)100mL，蒸馏水定容至1000mL)的三角瓶中，30℃250rpm振荡培养至OD600≈5.0。然后离心收集菌体，等量转移菌体沉淀至装有100mL BMMY液体培养基(酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，YNB 13.4g，甲醇15mL，1M磷酸钾(pH6.0)100mL，蒸馏水定容至1000mL)的三角瓶中28℃，250rpm振荡培养，每天添加1.5％(v/v)的甲醇溶液进行诱导表达，诱导7天，最终得到发酵液，发酵液5000rpm，4℃离心10min取上清液即为粗酶液，测定粗酶液酶活；采用DNS法(中国专利申请CN201910064040.5实施例1中记载的Ghose的DNS法)测定融合碳水化合物结合模块的几丁质酶粗酶液(以下简称融合几丁质酶粗酶液)酶活。
3个融合几丁质酶表现出几丁质酶活性，分别为融合了CBM3，CBM6和CBM26的几丁质酶，把它们分别命名为Chit46-CBM3，Chit46-CBM6和Chit46-CBM26。发酵上清液中(即粗酶液)，Chit46-CBM3的酶活为36.0U/mL，高于Chit46(31.4U/mL)，而Chit46-CBM6和Chit46-CBM26的酶活分别为17.3U/mL和21.0U/mL(图1C)，表明Chit46-CBM3在酶活方面的产量获得了提升。
然后使用镍柱亲和层析和Sephadex G-75柱层析纯化目的蛋白，其中镍柱亲和层析上样量为100mL，所用洗脱液为0.01M咪唑、0.5M NaCl、0.02M磷酸缓冲液(pH 7.4)；Sephadex G-75柱层析上样量为100mL，冲洗液为0.05M NaCl、0.02M磷酸缓冲液(pH 6.0)。以转化空载体pIC9BM的毕赤酵母GS115菌株作为实验对照。
纯化后，采用DNS法(中国专利申请CN201910064040.5实施例2中记载的Ghose的DNS法)测定融合碳水化合物结合模块的几丁质酶(以下简称融合几丁质酶)酶活；采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(生工)测定纯酶液的蛋白浓度，以此计算融合几丁质酶的比酶活。三个融合几丁质酶Chit46-CBM3(75.8U/mg)，Chit46-CBM6(47.0U/mg)和Chit46-CBM26(38.8U/mg)的比酶活均高于Chit46(34.5U/mg)(图1D)。这些结果表明CBM的添加增强了几丁质酶的活性。
利用SDS-PAGE凝胶电泳确定上述纯化后的融合几丁质酶Chit46-CBM3，Chit46-CBM6和Chit46-CBM26的表达情况、纯度和分子质量的大小。SDS-PAGE凝胶电泳的检测方法根据中国专利申请CN201910064040.5实施例3的记载进行。
结果如图1B所示，Chit46-CBM3，Chit46-CBM6和Chit46-CBM26的分子量分别约为68.59kDa、60.83kDa和65.03kDa，三种嵌合几丁质酶都被成功纯化。在每个几丁质酶的SDS-PAGE凝胶上都发现了两个条带，分子量较低的条带可能是未糖基化的几丁质酶。
根据NCBI的Conserved Domain Search Service工具分析，融合几丁质酶由N端信号因子-α前体，GH18催化结构域和CBM组成(图1A)。
发明人团队在研究过程中，曾将其他CBM(如分别将来源于Genbank：AAA98735.1、BAA19695.1、BAA05252.1、AAC25975.1、AAC24912.1、AAC17860.1或AAC00283.1糖苷酶的CBM)融合到Chit46的N端，结果发现检测不到几丁质酶活。通过3D建模分析发现：N端添加的CBM破坏了Chit46的催化结构域保守结构。同样，发明人将本申请的CBM3、CBM6、CBM26融合到Chit46的中间位置，发现所得融合酶无酶活。
与壳聚糖相反，由于商业几丁质酶的低效率和高价格，几丁质在工业上的开发非常不充分，因此开发具有高效率和高产量的几丁质酶具有重要的意义。在来自哈茨木霉的几丁质酶中，Chit46已被证明是该菌株大多数几丁质酶活性的部分，尽管它不包含CBM。在这项研究中，融合几丁质酶比Chit46表现出更高的比酶活，并且Chit46-CBM3的产量高于许多以前关于几丁质酶异源表达的报道，表明其在商业应用中具有潜力。
根据几丁质酶的酶活测定方法，将纯化的融合几丁质酶置于不同的50mM pH缓冲液中(乳酸钠缓冲盐pH3.0，乙酸钠缓冲液pH4.0～5.0，磷酸钠缓冲盐pH为6.0～7.0；Tris-HCl缓冲液为pH 8.0～9.0，硼砂-氢氧化钠缓冲液pH为10.0～11.0)，然后分别测定其酶活，根据试验结果绘制pH-相对酶活曲线来确定融合几丁质酶的最适反应pH。在pH6.0时都检测到4个几丁质酶的最大几丁质酶活性，所有三个融合几丁质酶在pH4.0或5.0时均显示出比Chit46更高的活性(图2C)。可见，添加CBM的融合几丁质酶拓宽了几丁质酶的pH作用范围。
将融合几丁质酶酶液放置于不同pH的上述缓冲液中，25℃静置1h，然后分别在各融合几丁质酶最适pH条件下，测定融合几丁质酶残余的酶活，绘制pH-相对酶活曲线来确定不同pH对酶稳定性的影响。结果发现，Chit46和融合几丁质酶的pH耐受性之间没有显著差异(图2D)。
根据几丁质酶的酶活测定方法，分别在不同的温度(30～60℃)下测定融合几丁质酶的活性，确定温度对融合几丁质酶活性的影响。根据试验结果绘制温度-相对酶活曲线图，由此确定融合几丁质酶的最适作用温度。结果表明，尽管所有融合几丁质酶在55℃时均显示出比Chit46更高的活性，但Chit46和融合几丁质酶的最佳温度没有区别，均为45℃(图2A)。
在几丁质酶的稳定pH条件下，将融合几丁质酶的酶液分别置于不同温度(30～60℃)中保温60min，然后在各融合几丁质酶最适温度下测定处理后余下的酶活，以考察温度对融合几丁质酶稳定性的影响。结果表明：在45℃孵育1小时后，四个几丁质酶仍保持原始活性的60％以上(图2B)。此外，Chit46-CBM3在30～60℃时比Chit46表现出更高的活性，表明Chit46-CBM3比Chit46更稳定。添加CBM3的融合几丁质酶获得了更强的热稳定性。
根据测定几丁质酶活性的方法，配制不同浓度的胶体几丁质溶液，具体浓度为：0g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、4.0g/L、6.0g/L、8.0g/L、10.0g/L、12.0g/L、16.0g/L和20.0g/L。分别在不同融合几丁质酶的最适pH值下，以配制的不同浓度的胶体几丁质溶液为融合几丁质酶的底物，测定融合几丁质酶的活性，同时以几丁质酶作对照；由此确定融合几丁质酶活性与胶体几丁质底物浓度的关系。根据实验结果，使用origin 9.1的非线性拟合确定融合几丁质酶的米氏方程，并计算融合几丁质酶的Vmax值和Km值。结果如下表4所示。
从表4可知，三个融合几丁质酶的Km值均低于Chit46，这表明CBM的添加显著提高了几丁质酶对胶体几丁质的亲和力。与融合CBM后的几丁质酶相比，几丁质酶Chit46的Vmax略有增加，可能是CBM由于几丁质酶的存在更容易与底物接触。同时，融合几丁质酶的催化效率远高于Chit46。
表4：几丁质酶的米氏常数
Figure BDA0002609718510000071
在两组20mL经50mM pH6.0磷酸钠缓冲液稀释的融合几丁质酶液(40mg)中分别加入几丁质粉末(0.2g)和虾壳粉(1g)进行吸附能力研究，其中，虾壳粉中几丁质的含量为0.189g；并将混合物在200rpm和25℃下摇动1min，接下来以5000g离心10分钟来收集被几丁质吸附的融合几丁质酶，将吸附的融合几丁质酶悬浮在适量的蒸馏水中，并测量其活性以确定被吸附的几丁质酶量(测定酶活的方法为中国专利申请CN201910064040.5实施例2中记载的Ghose的DNS法)，另以几丁质酶为对照进行上述实验。
结果如图2E所示。结果发现：CBM的添加增强了融合几丁质酶对几丁质粉和虾壳粉的底物结合活性，表明它们在虾壳废弃物加工中的潜在应用。
由ExPaSy-ProtParam工具预测，三个融合几丁质酶的理论等电点(CBM3为9.6，CBM6为6.5，CBM26为9.5)均比Chit46(5.4)高。三个融合几丁质酶较高的等电点表明，CBM比Chit46表现出更强的正电性，因此可能使CBM接近带负电荷的几丁质。
实施例3几丁质酶水解虾壳粉及水解产物分析
(1)为了比较不同融合几丁质酶对虾壳废弃物水解的效率，在40℃，将100U融合几丁质酶Chit46-CBM3、Chit46-CBM6和Chit46-CBM26分别与1g虾壳粉混合，然后加入50mMpH6.0磷酸钠缓冲液至混合液总体积为10mL，水解12h后，5000rpm离心10min，得到虾壳几丁质水解产物和虾壳残余物，同时以几丁质酶为对照。
向虾壳几丁质水解产物中加入同等体积的95％(v/v)乙醇于12000rpm离心1min，沉淀即为蛋白质，剩余的溶液中含有几丁寡糖(以下简称：含有乙醇的几丁寡糖溶液)。将沉淀的蛋白质重新溶于与虾壳几丁质水解产物同等体积的无菌水中，并通过BCA法测定蛋白质含量。
经检测，Chit46-CBM3水解虾壳粉后，虾壳几丁质水解产物中的蛋白质浓度为11.3g/L。Chit46水解虾壳粉后，虾壳几丁质水解产物中的蛋白质浓度为1.3g/L；Chit46-CBM6水解虾壳粉后，虾壳几丁质水解产物中的蛋白质浓度为11.0g/L；Chit46-CBM26水解虾壳粉后，虾壳几丁质水解产物中的蛋白质浓度为9.1g/L。
将含有乙醇的几丁寡糖溶液在65℃下干燥30分钟除去乙醇后，得到不含乙醇的几丁寡糖溶液，将不含乙醇的几丁寡糖溶液在37℃下用1％蜗牛酶(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)消化1h，并以蒸馏水作为空白对照通过DNS方法(中国专利申请CN201910064040.5实施例2中记载的Ghose的DNS法)确定总还原糖量。
Chit46-CBM3还原糖含量为8.8mg/mL，几丁质回收率为46.5％；Chit46-CBM6还原糖含量为7.9mg/mL，几丁质回收率为41.8％；Chit46-CBM26还原糖含量为8.2mg/mL，几丁质回收率为43.3％；Chit46还原糖含量为1.2mg/mL，几丁质回收率为6.5％。
本申请发明人意外发现，在Chit46-CBM3水解虾壳的反应体系中用蒸馏水代替磷酸钠缓冲液也可获得相似的效果(几丁质回收率45.8％)。
(2)按照步骤(1)的相同方法分离虾壳几丁质水解产物中的蛋白质和含有乙醇的几丁寡糖溶液；向1mL含有乙醇的几丁寡糖溶液中加入乙腈使乙腈浓度达70％(v/v)，过滤得滤液，取滤液通过Shimadzu-LC-20A高效液相色谱检测产物，色谱柱为Shodex AsahipakNH2P-50 4E色谱柱(4.6mm×250mm)，流动相为70％(v/v)乙腈，流速0.7mL/min，温度30℃，在210nm处检测产物。
经检测发现，被融合几丁质酶处理组的水解产物主要由(GlcNAc)5，(GlcNAc)6，部分脱乙酰化的(GlcNAc)6*，(GlcNAc)7 #和少量(GlcNAc)2和GlcNAc组成，但Chit46-CBM26组不含(GlcNAc)2(图4)。可见，通过本发明所述的虾壳废弃物的新型绿色回收工艺能得到聚合度在5～7的几丁寡糖(活性较好，与相关受体的亲和力最强)。
(3)采用国标中《GB 29941-2013食品安全国家标准食品添加剂脱乙酰甲壳素(壳聚糖)》A.3.2碱量法来测定融合几丁质酶水解底物及水解产物的脱乙酰度。将样品(水解前的虾壳粉和按步骤(1)所述方法分别经Chit46-CBM3、Chit46-CBM6和Chit46-CBM26水解虾壳粉得到的虾壳几丁质水解产物)在65℃下干燥24小时，然后将0.2000g样品溶于30mL0.1M HCl标准溶液中，并在25℃下搅拌3h，加入两滴0.1％的甲基橙-苯胺蓝(1:2，V/V)溶液作为指示剂，用0.1M NaOH标准溶液滴定混合物。脱乙酰度(DA)的计算公式为：
DA(％)＝(30–V)×0.0016/(m×0.0994)×100％
其中：
V是滴定终点处消耗NaOH的体积，mL；
m是样品质量，g。
结果发现，在不同的融合几丁质酶水解前后，它们的脱乙酰化程度没有差异，表明在酶促水解过程中未发生脱乙酰化作用(图5A)，由此可推测融合几丁质酶水解虾壳粉得到的几丁寡糖活性较好。
(4)按照步骤(1)的相同方法分离Chit46-CBM3、Chit46-CBM6和Chit46-CBM26分别水解虾壳粉得到的虾壳几丁质水解产物中的蛋白质和含有乙醇的几丁寡糖溶液，同时以热变性几丁质酶(即沸水浴灭活处理的几丁质酶)水解虾壳粉得到的虾壳几丁质水解产物中的含有乙醇的几丁寡糖溶液为对照；各液体样品检测前通过冷冻干燥制备成固体样品。通过Thermo Nicolet Nexus红外光谱仪测定几丁质及几丁寡糖固体样品在500～4000cm-1的吸收波长。在FT-IR分析中(图5B)，位于900～1100cm-1和1658cm-1的峰分别对应于几丁质中β-糖苷键的C-O-C和乙酰基的C═O。由不同的几丁质酶制备的水解产物之间没有明显差异，在1658cm-1处检测到明显与几丁质粉末一样的峰，表明在几丁质酶加工过程中未进行脱乙酰化。经融合几丁质酶处理后，位于1020cm-1处的峰变小了，表明虾壳几丁质中的β-1,4糖苷键被水解了。此外，该峰的大小趋势与HPLC分析的几丁寡糖聚合度占比相一致。
(5)取新鲜虾壳各1g分别与10U几丁质酶(Chit46、Chit46-CBM3、Chit46-CBM6或Chit46-CBM26)混合，然后加入50mM pH6.0磷酸钠缓冲液至终体积为10mL，40℃水解处理4小时，以热变性几丁质酶(即沸水浴灭活处理的几丁质酶)处理的虾壳作为阴性对照；分别将不同酶处理后的虾壳样品用石蜡切片和苏木精-伊红染色技术处理，然后用光学显微镜观察切片。
结果如图3所示。Chit46-CBM3对虾壳水解表现出最高活性，其次是Chit46-CBM6和Chit46-CBM26，而Chit46几乎不水解虾壳粉(图3A)。随着几丁质的水解，虾壳中的部分蛋白质也被释放。显微镜观察表明，用Chit46处理后，三层虾壳的结构仍然完整，说明Chit46几乎不水解完整的虾壳(图3C)。在所有融合几丁质酶处理组中，虾壳的上表皮都变得膨胀，其与外表皮的连接变得疏松。经Chit46-CBM3和Chit46-CBM26处理后，内表皮完全消失，外表皮变得松弛(图3D，3F)，而Chit46-CBM6处理的虾壳中有少量残留的内表皮核外表皮交织在一起(图3E)，这表明外表皮和内表皮中的几丁质已被转化为可溶的几丁寡糖。该观察结果与之前描述的融合几丁质酶的几丁质回收率高的结果一致。
尽管对几丁质酶的研究已经进行了很长时间，但据报道几乎没有几丁质酶能直接水解完整的虾壳，除了来自维氏假单胞菌的ChiB565，来自T.kodakarensis的Tk-ChiA(ChenL.,et al.An Archaeal Chitinase With a Secondary Capacity for CatalyzingCellulose and Its Biotechnological Applications in Shell and StrawDegradation,Frontiers in Microbiology,10.doi:10.3389/fmicb.2019.01253)和Chitinibacter sp.GC72的几丁质酶(Gao C.,et al.Characterization ofextracellular chitinase from Chitinibacter sp GC72 and its application inGlcNAc production from crayfish shell enzymatic degradation,BiochemicalEngineering Journal,97(2015)59-64.https://doi.org/10.1016/j.bej.2015.02.010)，但它们要么酶活不高，要么水解效率不高。虾壳的完整表皮可能形成不可渗透的包膜，以防止其自身的酶促降解，这可能是许多几丁质酶无法水解虾壳中几丁质的原因。几丁质与甲壳动物的蛋白质紧密结合，高度矿化的几丁质-蛋白质复合物是虾壳的基本结构。为了获得几丁质，虾壳通常用HCl和NaOH处理以分别去除矿物质和蛋白质，而一些研究则报道了通过蛋白酶或发酵进行的脱蛋白作用。在本项研究中，CBM显著提高了Chit46的水解效率，并且利用Chit46-CBM3处理可以通过一步处理直接从虾壳废弃物水解得到的水解液中制备几丁寡糖，几丁质的回收率达到46.5％，表明它适用于虾壳废弃物加工行业。通过减少废物流的体积和污染物负荷，融合的几丁质酶Chit46-CBM3将使虾壳废弃物得到最大程度上的利用，并将对环境的影响最小化。
由于几丁质酶的缺乏，几丁质主要通过浓NaOH转化为壳聚糖，然后进一步降解为壳寡糖。尽管几丁质是第二丰富的天然生物聚合物，而且几丁寡糖具有许多壳寡糖所不具备的生理功能，但其产量仍然很低，并且其可用性受到很大限制。几丁寡糖的生物活性不仅与N-乙酰基有关，而且与聚合度有关。(GlcNAc)6与较小分子量的几丁寡糖相比，显示出更强的生物学活性和对受体的更高亲和力。在一些报道中，部分脱乙酰的几丁寡糖显示出比完全脱乙酰化或完全乙酰化的寡糖更强的诱导苯丙氨酸氨裂合酶和过氧化物酶的活性。在本项研究中，聚合度为5、6或更高的几丁寡糖以及可能的部分脱乙酰基(GlcNAc)6*是虾壳水解产物的主要组成部分，有望应用于功能性食品行业。
实施例4水解产物用于微生物生长及虾壳残余的消化率
基于3个融合几丁质酶水解虾壳的效率和产物组成均比较相似，而Chit46-CBM3的酶活最高，因此以下试验均使用Chit46-CBM3水解虾壳粉得到的几丁质水解产物和虾壳残余物进行应用研究实验。向1g虾壳粉中加入100U Chit46-CBM3，加入50mM pH6.0磷酸钠缓冲液至混合液的总体积为10mL，在40℃水解虾壳粉12小时，5000rpm离心10min，得到虾壳几丁质水解产物和虾壳残余物。分别取虾壳几丁质水解产物，研究虾壳几丁质水解产物对大肠杆菌DH5α(购于Takara)，枯草芽孢杆菌WB600(上海柯雷生物科技有限公司)和巴斯德毕赤酵母GS115(购于Invitrogen)生长的影响。
将细菌和酵母培养24小时，然后以5％(v/v)的接种量转移到以下不同的培养基中。虾壳几丁质水解产物以5倍稀释度添加到培养基中。
其中：
LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，5mol/L NaOH调节pH至7.0，去离子水定容至1L。
YPD培养基：10g酵母膏，20g胰蛋白胨于900ml水中，如制平板加入20g琼脂粉，高压115℃15min，加入100mL灭菌后的含20g葡萄糖水溶液。
分别将大肠杆菌DH5α和枯草芽孢杆菌WB600在LB培养基，LB+20％H(即：添加5倍稀释虾壳几丁质水解产物的LB培养基)，LB-T(即：去除胰蛋白胨的LB培养基)，LB-T+20％H(即：去除胰蛋白胨和添加5倍稀释虾壳几丁质水解产物的LB培养基)和H(即：虾壳几丁质水解产物)培养基组中在37℃和220rpm下培养。
巴斯德毕赤酵母GS115在YPD培养基，YPD+20％H(即：添加5倍稀释虾壳几丁质水解产物的YPD培养基)，YPD-T(即：去除胰蛋白胨的YPD培养基)，YPD-T+20％H(即：去除胰蛋白胨和添加5倍稀释虾壳几丁质水解产物的YPD培养基)和H(即：虾壳几丁质水解产物)培养基组中在30℃和250rpm下培养。
每小时取样并检测培养液的OD600。
总的来说，经Chit46-CBM3处理后23.1％(m/m)的虾壳粉转化为可溶组分(含几丁寡糖和可溶性蛋白的虾壳几丁质水解产物)。虾壳几丁质水解产物中的几丁寡糖和蛋白质含量分别为8.8mg/mL和11.3mg/mL。几丁寡糖由35.8％(GlcNAc)6，28.4％(GlcNAc)5，15.6％的假定(GlcNAc)7，13.0％的假定部分脱乙酰基(GlcNAc)6，4.1％(GlcNAc)2和2.9％的GlcNAc组成。如图6A所示，尽管虾壳几丁质水解产物对大肠杆菌菌体的最大生物量没有影响，但是虾壳几丁质水解产物的添加增加了大肠杆菌的生长速率。此外，大肠杆菌可以直接在虾壳几丁质水解产物中生长，但生长速率培养基和最大生物量比LB培养基稍低。与大肠杆菌DH5α不同，除了去除胰蛋白胨的组外，不同组之间枯草芽孢杆菌的生长速率和最大生物量没有明显差异(图6B)。至于毕赤酵母GS115，添加虾壳几丁质水解产物可以显著提高其生长速率和最大生物量，而在用20％H替代了胰蛋白胨组合只有虾壳几丁质水解产物的培养基组表现出了与YPD培养相似的生长速率和更低的最大生物量(图6C)。几丁质是海洋生态***的重要氮源和碳源，几丁寡糖可能可以被代谢并进一步被许多微生物用作氮和碳的唯一来源。在这项研究中，虾壳水解产物是一个能够支持微生物生长的良好碳源和氮源。
在体外消化率模拟的口腔期，将1g干燥样品(分别是未处理虾壳粉、被融合几丁质酶Chit46-CBM3水解得到的虾壳残余物)与12.5μL的0.3M CaCl2、0.488mL的水和2mL含唾液α-淀粉酶(187.5U/mL)的模拟唾液混合，然后在37℃下孵育2分钟。在胃期，将口腔期处理后得到的混合物与2.5μL的0.3M CaCl2、4.55mL的模拟胃液(包含胃蛋白酶(4400U/mL)和0.37mM卵磷脂)和适量的1M HCl混合，以达到pH3.0，在37℃孵育2h。在肠期，将经胃期处理后得到的混合物与1.25mL胆汁盐(25g/L)，20μL 0.3M CaCl2和8mL含胰酶的模拟肠液混合(基于胰蛋白酶活性为250U/mL)，加入适量1M的NaOH溶液达到pH 7.0，在37℃下孵育2小时，离心后，得消化液和未消化的残留物；将未消化的残留物在65℃下干燥，并通过测量重量的减少量计算消化率。用BCA试剂盒(购于生工生物工程(上海)有限公司，依据说明书进行操作)和茚三酮法分别测定消化液中释放的肽和氨基酸。
消化率是动物消化和吸收的食物占食物总摄入量的百分比，是评估食物营养价值的重要指标之一。被Chit46-CBM3水解的虾壳残余物(消化率43.8％)显示出比虾壳粉(消化率13.4％)高得多的体外消化率(图6D)。由于未消化的残留物中的矿物质和几丁质在模拟胃肠道环境中仍很难被消化，因此大部分水解部分可能是虾壳蛋白。被Chit46-CBM3水解得到的虾壳残余物经体外消化后，消化液残留物中释放的可溶性肽和氨基酸的量分别为19.4mg/mL和2.8mg/mL，显著高于虾壳粉中的可溶性肽和氨基酸(分别为7.9mg/mL和0.7mg/mL)，表明消化液残留物比虾壳粉更易消化。该方法有望提高资源利用率，减少动物蛋白的消化负担，回收虾壳废料。
虾壳废弃物被认为是高质量蛋白质的潜在来源，先前的研究表明虾壳蛋白在用作饲料的氨基酸组成上具有很好的平衡性。发酵的虾皮或头已被用作虾和罗非鱼的饲料成分，而蛋白质是发酵产品的主要成分，而大多数几丁质仍未开发。但是，未经处理的虾壳废料不易被动物，植物甚至微生物利用。在这项研究中，虾壳废弃物可以通过融合几丁质酶直接水解，而无需任何复杂的预处理。虾壳水解产物含有几丁寡糖和可溶性蛋白，可以很好地支持微生物的生长，并且残留物易于被哺乳动物消化，为虾壳废弃物的处理和利用提供了一种简单，清洁，经济的方法。此外，具有高营养价值和生物学功能的包含蛋白质和几丁寡糖的虾壳水解物有望被开发为功能性饮料和食品。
内源几丁质酶已在少量海洋鱼类中发现，例如Rachycentron canadum，但其酶促活性不足以有效地处理虾壳。在动物饲料中直接添加几丁质酶是一个有希望的提议，因为它可以改善甲壳类动物壳中蛋白质和几丁质的消化率。与大多数以前的几丁质酶相比，融合几丁质酶Chit46-CBM3可以直接降解完整的虾壳，而无需复杂的预处理。用Chit46-CBM3处理，可以从1g虾壳中获得0.231g可溶组分(含几丁寡糖和可溶性蛋白的水解产物)，经试验发现剩下的虾壳残留物可被哺乳动物消化43.8％，即消化其中0.34g的虾壳残留物；而未处理虾壳粉，仅能被消化0.13g。可见，融合几丁质酶在虾壳废弃物加工中拥有用作动物饲料的潜力。此外，据报道，摄入合适的几丁寡糖可改善养殖家禽和鱼类的生长，并改善其免疫状态和抗病性。融合几丁质酶可用作饲料添加剂，以改善家禽和鱼类的生长并提高宿主抵抗病原体的免疫力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 1
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Gly Ser Glu Phe Ser Pro Leu
85 90 95
Ala Thr Glu Glu Arg Ser Val Glu Lys Arg Ala Asn Gly Tyr Ala Asn
100 105 110
Ser Val Tyr Phe Thr Asn Trp Gly Ile Tyr Asp Arg Asn Phe Gln Pro
115 120 125
Ala Asp Leu Val Ala Ser Asp Val Thr His Val Ile Tyr Ser Phe Met
130 135 140
Asn Leu Gln Ala Asp Gly Thr Val Val Ser Gly Asp Thr His Ala Asp
145 150 155 160
Phe Glu Lys His Tyr Ala Asp Asp Ser Trp Asn Asp Val Gly Thr Asn
165 170 175
Ala Tyr Gly Cys Ala Lys Gln Leu Phe Lys Val Lys Lys Ala Asn Arg
180 185 190
Gly Leu Lys Val Leu Leu Ser Ile Gly Gly Trp Thr Trp Ser Thr Asn
195 200 205
Phe Pro Ser Ala Ala Ser Thr Asp Ala Asn Arg Lys Asn Phe Ala Lys
210 215 220
Thr Ala Ile Thr Phe Met Lys Asp Trp Gly Phe Asp Gly Ile Asp Val
225 230 235 240
Asp Trp Glu Tyr Pro Ala Asp Ala Thr Gln Ala Ser Asn Met Val Leu
245 250 255
Leu Leu Lys Glu Val Arg Ser Gln Leu Asp Ala Tyr Ala Ala Gln Tyr
260 265 270
Ala Pro Gly Tyr His Phe Leu Leu Thr Ile Ala Ala Pro Ala Gly Lys
275 280 285
Asp Asn Tyr Ser Lys Leu Arg Leu Ala Asp Leu Gly Gln Val Leu Asp
290 295 300
Tyr Ile Asn Leu Met Ala Tyr Asp Tyr Ala Gly Ser Phe Ser Pro Leu
305 310 315 320
Thr Gly His Asp Ala Asn Leu Phe Ala Asn Pro Ser Asn Pro Asn Ala
325 330 335
Thr Pro Phe Asn Thr Asp Ser Ala Val Lys Asp Tyr Ile Asn Gly Gly
340 345 350
Val Pro Ala Asn Lys Ile Val Leu Gly Met Pro Ile Tyr Gly Arg Ser
355 360 365
Phe Gln Asn Thr Ala Gly Ile Gly Gln Thr Tyr Asn Gly Val Gly Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ser Trp Glu Ala Gly Ile Trp Asp Tyr
385 390 395 400
Lys Ala Leu Pro Lys Ala Gly Ala Thr Ile Gln Tyr Asp Ser Val Ala
405 410 415
Lys Gly Tyr Tyr Ser Tyr Asn Ala Gly Thr Lys Glu Leu Ile Ser Phe
420 425 430
Asp Thr Pro Asp Met Ile Asn Thr Lys Val Ala Tyr Leu Lys Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Gly Gly Ser Met Phe Trp Glu Ala Ser Ala Asp Lys Lys Gly
450 455 460
Ala Asp Ser Leu Ile Gly Thr Ser His Arg Ala Leu Gly Gly Leu Asp
465 470 475 480
Thr Thr Gln Asn Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Ser Lys Tyr Asp Asn Ile
485 490 495
Arg Asn Gly Leu Asn Gly Pro Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys Pro
500 505 510
Gly Ala Ser Lys Thr Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala Ser
515 520 525
Gly Thr Phe Val Arg Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr Lys
530 535 540
Asp Ile Pro Glu Thr Pro Ser Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn Gly
545 550 555 560
Ile Ser Val Gln Tyr Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn Gln
565 570 575
Ile Arg Pro Gln Leu Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val Asp
580 585 590
Leu Lys Asp Val Thr Ala Arg Tyr Trp Tyr Lys Ala Lys Asn Lys Gly
595 600 605
Gln Asn Phe Asp Cys Asp Tyr Ala Gln Ile Gly Cys Gly Asn Val Thr
610 615 620
His Lys Phe Val Thr Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr Tyr
625 630 635 640
Leu Glu Leu Gly Phe Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr
645 650 655
Gly Asn Ile Gln Leu Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr Ala
660 665 670
Gln Ser Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr Thr
675 680 685
Lys Lys Ile Thr Leu Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr Glu
690 695 700
Pro Asn Thr Arg His His His His His His
705 710
<210> 2
<211> 649
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> Chit46-CBM6
<400> 2
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Gly Ser Glu Phe Ser Pro Leu
85 90 95
Ala Thr Glu Glu Arg Ser Val Glu Lys Arg Ala Asn Gly Tyr Ala Asn
100 105 110
Ser Val Tyr Phe Thr Asn Trp Gly Ile Tyr Asp Arg Asn Phe Gln Pro
115 120 125
Ala Asp Leu Val Ala Ser Asp Val Thr His Val Ile Tyr Ser Phe Met
130 135 140
Asn Leu Gln Ala Asp Gly Thr Val Val Ser Gly Asp Thr His Ala Asp
145 150 155 160
Phe Glu Lys His Tyr Ala Asp Asp Ser Trp Asn Asp Val Gly Thr Asn
165 170 175
Ala Tyr Gly Cys Ala Lys Gln Leu Phe Lys Val Lys Lys Ala Asn Arg
180 185 190
Gly Leu Lys Val Leu Leu Ser Ile Gly Gly Trp Thr Trp Ser Thr Asn
195 200 205
Phe Pro Ser Ala Ala Ser Thr Asp Ala Asn Arg Lys Asn Phe Ala Lys
210 215 220
Thr Ala Ile Thr Phe Met Lys Asp Trp Gly Phe Asp Gly Ile Asp Val
225 230 235 240
Asp Trp Glu Tyr Pro Ala Asp Ala Thr Gln Ala Ser Asn Met Val Leu
245 250 255
Leu Leu Lys Glu Val Arg Ser Gln Leu Asp Ala Tyr Ala Ala Gln Tyr
260 265 270
Ala Pro Gly Tyr His Phe Leu Leu Thr Ile Ala Ala Pro Ala Gly Lys
275 280 285
Asp Asn Tyr Ser Lys Leu Arg Leu Ala Asp Leu Gly Gln Val Leu Asp
290 295 300
Tyr Ile Asn Leu Met Ala Tyr Asp Tyr Ala Gly Ser Phe Ser Pro Leu
305 310 315 320
Thr Gly His Asp Ala Asn Leu Phe Ala Asn Pro Ser Asn Pro Asn Ala
325 330 335
Thr Pro Phe Asn Thr Asp Ser Ala Val Lys Asp Tyr Ile Asn Gly Gly
340 345 350
Val Pro Ala Asn Lys Ile Val Leu Gly Met Pro Ile Tyr Gly Arg Ser
355 360 365
Phe Gln Asn Thr Ala Gly Ile Gly Gln Thr Tyr Asn Gly Val Gly Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ser Trp Glu Ala Gly Ile Trp Asp Tyr
385 390 395 400
Lys Ala Leu Pro Lys Ala Gly Ala Thr Ile Gln Tyr Asp Ser Val Ala
405 410 415
Lys Gly Tyr Tyr Ser Tyr Asn Ala Gly Thr Lys Glu Leu Ile Ser Phe
420 425 430
Asp Thr Pro Asp Met Ile Asn Thr Lys Val Ala Tyr Leu Lys Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Gly Gly Ser Met Phe Trp Glu Ala Ser Ala Asp Lys Lys Gly
450 455 460
Ala Asp Ser Leu Ile Gly Thr Ser His Arg Ala Leu Gly Gly Leu Asp
465 470 475 480
Thr Thr Gln Asn Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Ser Lys Tyr Asp Asn Ile
485 490 495
Arg Asn Gly Leu Asn Gly Pro Ile Ser Asn Leu Asn Pro Tyr Asn Arg
500 505 510
Val Glu Ala Glu Thr Phe Ala Trp Asn Gly Arg Ile Leu Thr Glu Lys
515 520 525
Ser Thr Ala Pro Gly Gly Pro Val Asn Asn Gln His Val Thr Ser Ile
530 535 540
Gln Asn Gly Asp Trp Ile Ala Val Gly Asn Ala Asp Phe Gly Ala Gly
545 550 555 560
Gly Ala Arg Ser Phe Lys Ala Asn Val Ala Ser Thr Leu Gly Gly Lys
565 570 575
Ile Glu Val Arg Leu Asp Ser Ala Asp Gly Lys Leu Val Gly Thr Leu
580 585 590
Asn Val Pro Ser Thr Gly Gly Ala Gln Thr Trp Arg Glu Ile Glu Thr
595 600 605
Ala Val Ser Gly Ala Thr Gly Val His Lys Val Phe Phe Val Phe Thr
610 615 620
Gly Thr Gly Thr Gly Asn Leu Phe Asn Phe Asp Tyr Trp Gln Phe Thr
625 630 635 640
Gln Thr Arg His His His His His His
645
<210> 3
<211> 680
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> Chit46-CBM26
<400> 3
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Gly Ser Glu Phe Ser Pro Leu
85 90 95
Ala Thr Glu Glu Arg Ser Val Glu Lys Arg Ala Asn Gly Tyr Ala Asn
100 105 110
Ser Val Tyr Phe Thr Asn Trp Gly Ile Tyr Asp Arg Asn Phe Gln Pro
115 120 125
Ala Asp Leu Val Ala Ser Asp Val Thr His Val Ile Tyr Ser Phe Met
130 135 140
Asn Leu Gln Ala Asp Gly Thr Val Val Ser Gly Asp Thr His Ala Asp
145 150 155 160
Phe Glu Lys His Tyr Ala Asp Asp Ser Trp Asn Asp Val Gly Thr Asn
165 170 175
Ala Tyr Gly Cys Ala Lys Gln Leu Phe Lys Val Lys Lys Ala Asn Arg
180 185 190
Gly Leu Lys Val Leu Leu Ser Ile Gly Gly Trp Thr Trp Ser Thr Asn
195 200 205
Phe Pro Ser Ala Ala Ser Thr Asp Ala Asn Arg Lys Asn Phe Ala Lys
210 215 220
Thr Ala Ile Thr Phe Met Lys Asp Trp Gly Phe Asp Gly Ile Asp Val
225 230 235 240
Asp Trp Glu Tyr Pro Ala Asp Ala Thr Gln Ala Ser Asn Met Val Leu
245 250 255
Leu Leu Lys Glu Val Arg Ser Gln Leu Asp Ala Tyr Ala Ala Gln Tyr
260 265 270
Ala Pro Gly Tyr His Phe Leu Leu Thr Ile Ala Ala Pro Ala Gly Lys
275 280 285
Asp Asn Tyr Ser Lys Leu Arg Leu Ala Asp Leu Gly Gln Val Leu Asp
290 295 300
Tyr Ile Asn Leu Met Ala Tyr Asp Tyr Ala Gly Ser Phe Ser Pro Leu
305 310 315 320
Thr Gly His Asp Ala Asn Leu Phe Ala Asn Pro Ser Asn Pro Asn Ala
325 330 335
Thr Pro Phe Asn Thr Asp Ser Ala Val Lys Asp Tyr Ile Asn Gly Gly
340 345 350
Val Pro Ala Asn Lys Ile Val Leu Gly Met Pro Ile Tyr Gly Arg Ser
355 360 365
Phe Gln Asn Thr Ala Gly Ile Gly Gln Thr Tyr Asn Gly Val Gly Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ser Trp Glu Ala Gly Ile Trp Asp Tyr
385 390 395 400
Lys Ala Leu Pro Lys Ala Gly Ala Thr Ile Gln Tyr Asp Ser Val Ala
405 410 415
Lys Gly Tyr Tyr Ser Tyr Asn Ala Gly Thr Lys Glu Leu Ile Ser Phe
420 425 430
Asp Thr Pro Asp Met Ile Asn Thr Lys Val Ala Tyr Leu Lys Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Gly Gly Ser Met Phe Trp Glu Ala Ser Ala Asp Lys Lys Gly
450 455 460
Ala Asp Ser Leu Ile Gly Thr Ser His Arg Ala Leu Gly Gly Leu Asp
465 470 475 480
Thr Thr Gln Asn Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Ser Lys Tyr Asp Asn Ile
485 490 495
Arg Asn Gly Leu Asn Gly Pro Ala Lys Ala Pro His Val Phe Leu Glu
500 505 510
Asn Tyr Lys Thr Gly Val Thr His Ser Phe Asn Asp Gln Leu Thr Ile
515 520 525
Thr Leu Arg Ala Asp Ala Asn Thr Thr Lys Ala Val Tyr Gln Ile Asn
530 535 540
Asn Gly Pro Asp Asp Arg Arg Leu Arg Met Glu Ile Asn Ser Gln Ser
545 550 555 560
Glu Lys Glu Ile Gln Phe Gly Lys Thr Tyr Thr Ile Met Leu Lys Gly
565 570 575
Thr Asn Ser Asp Gly Val Thr Arg Thr Glu Lys Tyr Ser Phe Val Lys
580 585 590
Arg Asp Pro Ala Ser Ala Lys Thr Ile Gly Tyr Gln Asn Pro Asn His
595 600 605
Trp Ser Gln Val Asn Ala Tyr Ile Tyr Lys His Asp Gly Ser Arg Val
610 615 620
Ile Glu Leu Thr Gly Ser Trp Pro Gly Lys Pro Met Thr Lys Asn Ala
625 630 635 640
Asp Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Leu Pro Ala Asp Thr Asp Thr Thr Asn
645 650 655
Ala Lys Val Ile Phe Asn Asn Gly Ser Ala Gln Val Pro Gly Gln Asn
660 665 670
Thr Arg His His His His His His
675 680
<210> 4
<211> 2142
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> Chit46-CBM3核苷酸序列
<400> 4
atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgga tccgaattca gccccctggc cacagaagag 300
cgctctgttg agaagagagc caacggatac gcaaactccg tctatttcac caactggggc 360
atttacgacc gcaacttcca gcctgccgat ttggtggcat cagatgtcac tcatgtcatc 420
tactcattca tgaacctcca ggcagacggc acagttgtct ctggcgatac ccacgctgat 480
ttcgagaagc actatgccga tgattcttgg aatgatgtcg gcaccaatgc ctacggctgt 540
gccaagcagc tgttcaaggt caagaaggcc aaccgaggcc tcaaggttct gctctccatc 600
ggtggctgga cctggtccac caacttccct tctgcagcaa gcacggatgc caaccgaaag 660
aactttgcga aaactgccat taccttcatg aaggattggg gtttcgatgg cattgacgtc 720
gactgggagt accctgcaga cgccacccag gcctccaaca tggttcttct gctgaaggaa 780
gtccgatctc agctggatgc ttatgctgcc cagtacgccc ctggctacca cttcctcctc 840
accattgccg ccccagctgg caaggataac tactccaagc tgcgcctggc tgatctcggc 900
caagtcctcg actacatcaa cctcatggcc tacgactacg ctggatcctt cagccccctc 960
accggtcacg acgccaacct gtttgccaac ccgtccaacc ccaatgccac acccttcaac 1020
accgattctg ctgtcaagga ttatatcaat ggaggtgttc ccgccaacaa gattgttctc 1080
ggcatgccca tctacggacg atcattccag aacaccgctg gcattggcca gacttacaac 1140
ggagttggag gtggcggtgg tggctccact ggaagctggg aggccggtat ctgggattac 1200
aaggctcttc ccaaggccgg cgccaccatc cagtacgact ctgtcgcaaa gggttactac 1260
agctacaacg ccggcaccaa ggagctcatc tctttcgata cccctgacat gatcaacacc 1320
aaggttgcct acctcaagtc tctcggccta ggaggtagca tgttctggga agcctcagcc 1380
gacaagaagg gagctgactc gctgattgga acaagccaca gagctcttgg aggcctggac 1440
acgactcaga acttgctgag ctaccccaac tccaagtatg ataacatcag gaacggtctg 1500
aacgggcccc aggaatcatc ctcagcttta aagccggggg catctaaaac aggcggctgg 1560
cggttgtcag atttatctgc ttcaggaaca ttcgttagag aaaacattct cggcaccaaa 1620
gattcgacga aggacattcc tgaaacgcca tcaaaagata aacccacaca ggaaaatggt 1680
atttctgtac agtacagagc aggggatggg agtatgaaca gcaaccaaat ccgtccgcag 1740
cttcaaataa aaaataacgg caataccacg gttgatttaa aagatgtcac tgcccgttac 1800
tggtataaag cgaaaaacaa aggccaaaac tttgactgtg actacgcgca gattggatgc 1860
ggcaatgtga cacacaagtt tgtgacgttg cataaaccaa agcaaggtgc agatacctat 1920
ctggaacttg gatttaaaaa cggaacgttg gcaccgggag caagcacagg gaatattcag 1980
ctccgtcttc acaatgatga ctggagcaat tatgcacaaa gcggcgatta ttcctttttc 2040
aaatcaaata cgtttaaaac aacgaaaaaa atcacattat atgatcaagg aaaactgatt 2100
tggggaacag aaccaaatac gcgtcatcat catcatcatc at 2142
<210> 5
<211> 1947
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> Chit46-CBM6核苷酸序列
<400> 5
atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgga tccgaattca gccccctggc cacagaagag 300
cgctctgttg agaagagagc caacggatac gcaaactccg tctatttcac caactggggc 360
atttacgacc gcaacttcca gcctgccgat ttggtggcat cagatgtcac tcatgtcatc 420
tactcattca tgaacctcca ggcagacggc acagttgtct ctggcgatac ccacgctgat 480
ttcgagaagc actatgccga tgattcttgg aatgatgtcg gcaccaatgc ctacggctgt 540
gccaagcagc tgttcaaggt caagaaggcc aaccgaggcc tcaaggttct gctctccatc 600
ggtggctgga cctggtccac caacttccct tctgcagcaa gcacggatgc caaccgaaag 660
aactttgcga aaactgccat taccttcatg aaggattggg gtttcgatgg cattgacgtc 720
gactgggagt accctgcaga cgccacccag gcctccaaca tggttcttct gctgaaggaa 780
gtccgatctc agctggatgc ttatgctgcc cagtacgccc ctggctacca cttcctcctc 840
accattgccg ccccagctgg caaggataac tactccaagc tgcgcctggc tgatctcggc 900
caagtcctcg actacatcaa cctcatggcc tacgactacg ctggatcctt cagccccctc 960
accggtcacg acgccaacct gtttgccaac ccgtccaacc ccaatgccac acccttcaac 1020
accgattctg ctgtcaagga ttatatcaat ggaggtgttc ccgccaacaa gattgttctc 1080
ggcatgccca tctacggacg atcattccag aacaccgctg gcattggcca gacttacaac 1140
ggagttggag gtggcggtgg tggctccact ggaagctggg aggccggtat ctgggattac 1200
aaggctcttc ccaaggccgg cgccaccatc cagtacgact ctgtcgcaaa gggttactac 1260
agctacaacg ccggcaccaa ggagctcatc tctttcgata cccctgacat gatcaacacc 1320
aaggttgcct acctcaagtc tctcggccta ggaggtagca tgttctggga agcctcagcc 1380
gacaagaagg gagctgactc gctgattgga acaagccaca gagctcttgg aggcctggac 1440
acgactcaga acttgctgag ctaccccaac tccaagtatg ataacatcag gaacggtctg 1500
aacgggccca tttccaattt aaacccatat aaccgggtag aagctgaaac gtttgcttgg 1560
aatggacgca ttttgacaga gaagtccaca gcacccggcg ggccagtaaa taatcagcat 1620
gtaacaagca ttcaaaatgg agactggatt gctgtaggaa atgcagactt cggagcgggc 1680
ggtgccaggt catttaaagc aaatgtagca tccactttag gcgggaaaat agaagtgcgc 1740
ctcgacagtg cagacggtaa gcttgttgga actctgaatg tgccttcaac aggcggagcg 1800
caaacgtgga gggaaataga aactgcggta agcggggcaa ccggtgtgca caaagtattc 1860
tttgtattta ccggaacagg tacaggaaac ttgtttaatt ttgattactg gcagtttacg 1920
caaacgcgtc atcatcatca tcatcat 1947
<210> 6
<211> 2040
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> Chit46-CBM26核苷酸序列
<400> 6
atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgga tccgaattca gccccctggc cacagaagag 300
cgctctgttg agaagagagc caacggatac gcaaactccg tctatttcac caactggggc 360
atttacgacc gcaacttcca gcctgccgat ttggtggcat cagatgtcac tcatgtcatc 420
tactcattca tgaacctcca ggcagacggc acagttgtct ctggcgatac ccacgctgat 480
ttcgagaagc actatgccga tgattcttgg aatgatgtcg gcaccaatgc ctacggctgt 540
gccaagcagc tgttcaaggt caagaaggcc aaccgaggcc tcaaggttct gctctccatc 600
ggtggctgga cctggtccac caacttccct tctgcagcaa gcacggatgc caaccgaaag 660
aactttgcga aaactgccat taccttcatg aaggattggg gtttcgatgg cattgacgtc 720
gactgggagt accctgcaga cgccacccag gcctccaaca tggttcttct gctgaaggaa 780
gtccgatctc agctggatgc ttatgctgcc cagtacgccc ctggctacca cttcctcctc 840
accattgccg ccccagctgg caaggataac tactccaagc tgcgcctggc tgatctcggc 900
caagtcctcg actacatcaa cctcatggcc tacgactacg ctggatcctt cagccccctc 960
accggtcacg acgccaacct gtttgccaac ccgtccaacc ccaatgccac acccttcaac 1020
accgattctg ctgtcaagga ttatatcaat ggaggtgttc ccgccaacaa gattgttctc 1080
ggcatgccca tctacggacg atcattccag aacaccgctg gcattggcca gacttacaac 1140
ggagttggag gtggcggtgg tggctccact ggaagctggg aggccggtat ctgggattac 1200
aaggctcttc ccaaggccgg cgccaccatc cagtacgact ctgtcgcaaa gggttactac 1260
agctacaacg ccggcaccaa ggagctcatc tctttcgata cccctgacat gatcaacacc 1320
aaggttgcct acctcaagtc tctcggccta ggaggtagca tgttctggga agcctcagcc 1380
gacaagaagg gagctgactc gctgattgga acaagccaca gagctcttgg aggcctggac 1440
acgactcaga acttgctgag ctaccccaac tccaagtatg ataacatcag gaacggtctg 1500
aacgggcccg caaaagcgcc tcatgttttc cttgagaatt acaaaacagg tgtaacacat 1560
tctttcaatg atcaactgac gattaccttg cgtgcagatg cgaatacaac aaaagccgtt 1620
tatcaaatca ataatggacc agacgacagg cgtttaagga tggagatcaa ttcacaatcg 1680
gaaaaggaga tccaatttgg caaaacatac accatcatgt taaaaggaac gaacagtgat 1740
ggtgtaacga ggaccgagaa atacagtttt gttaaaagag atccagcgtc ggccaaaacc 1800
atcggctatc aaaatccgaa tcattggagc caggtaaatg cttatatcta taaacatgat 1860
gggagccgag taattgaatt gaccggatct tggcctggaa aaccaatgac taaaaatgca 1920
gacggaattt acacgctgac gctgcctgcg gacacggata caaccaacgc aaaagtgatt 1980
tttaataatg gcagcgccca agtgcccggt cagaatacgc gtcatcatca tcatcatcat 2040
<210> 7
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> 引物F1
<400> 7
ctgcgaattc agccccctgg ccacag 26
<210> 8
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> 引物R1
<400> 8
acttacgcgt aactgggccc gttcagaccg ttcctgatgt t 41
<210> 9
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> 引物F3
<400> 9
aactgggccc caggaatcat cctcagct 28
<210> 10
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> 引物R3
<400> 10
acttacgcgt atttggttct gttcccca 28
<210> 11
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> 引物F6
<400> 11
aactgggccc atttccaatt taaacccat 29
<210> 12
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> 引物R6
<400> 12
acttacgcgt ttgcgtaaac tgccagtaa 29
<210> 13
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> 引物F26
<400> 13
aactgggccc gcaaaagcgc ctcatgtt 28
<210> 14
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> 引物R26
<400> 14
acttacgcgt attctgaccg ggcacttg 28

Claims (9)

1.一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶，其特征在于，所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1～3所示的任一氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述几丁质酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.4～6所示的任一核苷酸序列。
3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述的基因。
4.一种重组基因工程菌株，其特征在于，含有权利要求3所述的重组载体。
5.一种利用基因工程技术生产融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）获得包含权利要求2所述基因的重组载体；
（2）将步骤（1）获得的重组载体转入基因工程菌株中，得到重组表达菌株；发酵培养重组表达菌株，收集发酵液；
（3）分离步骤（2）收集的发酵液，取上清得到粗酶液，即得融合碳水化合物结合模块的几丁质酶酶液。
6.权利要求1所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶在虾壳、蟹壳或贝壳废弃物的回收和/或食品中的应用。
7.一种虾壳、蟹壳或贝壳废弃物的回收方法，其特征在于，通过将权利要求1所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶与虾壳、蟹壳或贝壳废弃物混合然后加入溶剂进行水解，固液分离后得到虾壳、蟹壳或贝壳几丁质水解产物和虾壳、蟹壳或贝壳残余物；
所述的水解的温度为30～60℃。
8.根据权利要求7所述的虾壳、蟹壳或贝壳废弃物的回收方法，其特征在于，
所述的溶剂包括50mM pH6.0的磷酸钠缓冲液和水中的至少一种；
所述的虾壳、蟹壳或贝壳废弃物在水解体系中的终浓度为10%。
9.根据权利要求7所述的虾壳、蟹壳或贝壳废弃物的回收方法，其特征在于，所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的加酶量为90～110 U/g虾壳、蟹壳或贝壳废弃物粉末；
所述的水解的时间为10～14 h。
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