CN110343764B - 检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂的应用和试剂盒 - Google Patents

检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂的应用和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂的应用和试剂盒，涉及基因检测技术领域。本发明公开的试剂盒其包括用于检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂，其通过对SDC2基因和TFPI2基因中的特定区域进行甲基化检测，将这些区域的甲基化检测结果作为结直肠癌辅助诊断的依据，具有更高灵敏度和特异性，为结直肠癌或结直肠腺瘤的早期筛查、诊断等提供更加准确、可靠的参考依据。

Description

检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂的应用和试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂的应用和试剂盒。
背景技术
结直肠癌是世界第三大恶性肿瘤。中国近年来结直肠癌发病率逐年上升，估计每年约有40万新发病例，在我国消化***恶性肿瘤中位列第二。结直肠癌通常由癌前息肉经过一系列遗传学和表观遗传学改变及组织学与形态学的变化缓慢发展而来，大多数结直肠肿瘤生长缓慢、保持沉默或无症状，直到它们达到了一定的大小或发展阶段。因此，结直肠癌是可以通过筛查进行干预的理想靶标。早期结直肠癌患者手术5年生存率可高达90％以上，中、晚期患者5年生存率仅10％左右，而临床诊断的结直肠癌约80％为中晚期，这是导致其死亡率居高不下的关键因素之一。经有效治疗的早期结直肠癌患者其发病率降低60％，病死率降低80％，因此结直肠癌的早期发现、早期诊断及早期治疗显得尤为重要。
结直肠癌的形成机制非常复杂，其癌变过程是多步骤、多途径、多基因参与的结果。原癌基因、抑癌基因的突变与甲基化、增殖凋亡等信号通路分子的改变都在结直肠癌的发生发展中起着重要作用。
肠镜检查是结直肠癌检测和确诊的金标准，但因其需要复杂的肠道准备过程、具有一定的侵入性且需要专业的技术人员，因此在一般人群中的普及率不高。无创检测方法如粪便潜血检查(FOBT)和粪便免疫化学检查(FIT)的灵敏度不高，尤其是在检测I期结直肠癌和进展期腺瘤方面灵敏性较低。因此结直肠癌及癌前病变的检测亟需一种高灵敏性和特异性的无创检测方法。
甲基化是一种表观遗传修饰，其异常变化可引起DNA构象及DNA与蛋白质相互作用方式等发生改变，从而控制基因表达。DNA甲基化在基因表达调控、细胞增殖分化、发育和基因印记等方面起着重要作用，与肿瘤的发生与发展有密切关系。越来越多的研究表明，DNA甲基化异常是癌症发生的早期事件，在结直肠癌发生和发展中存在DNA甲基化水平和模式的改变，寻找特异性的甲基化片段，对结直肠癌的早期检测起到决定性的作用。现有结直肠癌相关的甲基化检测技术存在操作步骤繁琐、检测灵敏性不高等突出问题。
例如现有技术CN105543354A利用甲基化特异性PCR(MSP)检测SDC2基因的甲基化。该方法存在的问题和缺点是：该专利使用46例结直肠癌、46例结直肠腺瘤和46例正常粪便样本进行SDC2甲基化检测，结果显示SDC2对结直肠癌对癌症的检测灵敏度较低，只有87％。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂的应用和试剂盒。本发明的试剂盒以不同结直肠癌相关基因的不同检测区域作为甲基化的检测靶区域，可以显著提高检测的灵敏度和特异性，以实现早期、快速、准确检测结直肠癌和结直肠腺瘤的目的。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供用于检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用，上述结直肠癌相关基因选自SDC2基因和TFPI2基因中的一种和两种的组合；上述检测试剂包括用于检测SDC2基因上的第一靶区域甲基化的第一试剂或/和用于检测TFPI2基因上的第二靶区域甲基化的第二试剂；
其中，上述第一靶区域选自SDC2基因的如下区域中的任意一种或几种的组合：
区域a、区域b和区域c；
其中，区域a选自chr8:96493351-96493635的全长区域或部分区域，区域b选自chr8:96493701-96493935的全长区域或部分区域，区域c选自chr8:96494006-96494335的全长区域或部分区域；
上述第二靶区域选自TFPI2基因的如下区域中的任意一种或几种的组合：区域d和区域e；
其中，区域d选自chr7:93890026-93890319的全长区域或部分区域，区域e选自chr7:93890630-93890991的全长区域或部分区域。
本发明的研究发现，检测的灵敏度和特异性等与目标基因的检测区域密切相关，主要是因为在整个较长的基因及其调控序列中，差异化的甲基化区域(DMR)仅占很小的一部分，只有当特异性地检测这一小部分DMR时，才能对样本具有较好的区分度，大大提高检测灵敏度和特异性。
本发明的研究发现，以结直肠癌相关基因如SDC2基因或TFPI2基因作为检测的靶基因，来辅助诊断结直肠癌或癌前病变时，选择SDC2基因中的chr8:96493351-96493635的全长区域或部分区域、chr8:96493701-96493935的全长区域或部分区域和chr8:96494006-96494335的全长区域或部分区域三个区域中的任意一种或几种的组合作为甲基化检测的靶区域，或者是选择TFPI2基因的chr7:93890026-93890319的全长区域或部分区域和chr7:93890630-93890991全长区域或部分区域中的任意一种或两种的组合作为甲基化检测的靶区域，又或者是将上述选自SDC2基因的靶区域和上述选自TFPI2基因的靶区域组合作为甲基化检测的靶区域，都可以显著提高结直肠癌辅助诊断的灵敏度和特异性，为结直肠癌或结直肠腺瘤的早期筛查、诊断等提供更加准确、可靠的参考依据。
SDC2基因的位置为：Chromosome 8，NC_000008.11(96493601-96611790)，启动子区域一般位于转录起始位点的上游。
TFPI2基因的位置为：Chromosome 7，NC_000007.14(93885396-93890753,complement)，启动子区域一般位于转录起始位点的上游。
在可选的实施方式中，上述区域a选自chr8:96493393-96493629的全长区域或部分区域。
在可选的实施方式中，上述区域b选自chr8:96493701-96493900的全长区域或部分区域。
在可选的实施方式中，上述区域c选自chr8:96494006-96494327的全长区域或部分区域。
在可选的实施方式中，上述区域a选自chr8:96493393-96493581和chr8:96493456-96493629中的任意一种。
在可选的实施方式中，上述区域b选自chr8:96493701-96493858和96493770-96493900中的任意一种。
在可选的实施方式中，上述区域c选自chr8:96494006-96494166和chr8:96494140-96494327中的任意一种。
在可选的实施方式中，上述区域a选自chr8:96493456-96493581。
在可选的实施方式中，上述区域b选自96493770-96493858。
在可选的实施方式中，上述区域c选自chr8:96494140-96494166。
在可选的实施方式中，上述区域d选自chr7:93890026-93890312的全长区域或部分区域。
在可选的实施方式中，上述区域e选自chr7:93890651-93890976的全长区域或部分区域。
在可选的实施方式中，上述区域d选自chr7:93890026-93890176和chr7:93890149-93890312中的任意一种。
在可选的实施方式中，上述区域e选自chr7:93890651-93890825和chr7:93890807-93890976中的任意一种。
在可选的实施方式中，上述区域d选自chr7:93890149-93890176。
在可选的实施方式中，上述区域e选自chr7:93890807-93890825。
在可选的实施方式中，上述结直肠癌相关基因为SDC2基因和TFPI2基因的联合；上述检测试剂包括用于检测SDC2基因上的第一靶区域甲基化的第一试剂和用于检测TFPI2基因上的第二靶区域甲基化的第二试剂；
上述第一靶区域为区域c；上述第二靶区域为区域d。
本发明的研究还发现，将SDC2基因和TFPI2基因联合，即以选自SDC2基因的区域c与选自TFPI2基因的区域d联合，根据这两个区域的甲基化结果，作为结直肠癌辅助诊断的判断依据，可以明显提高诊断结果的灵敏度、特异性和AUC。
在可选的实施方式中，上述第一试剂包括用于检测上述第一靶区域甲基化的第一核酸组，上述第一核酸组包括荧光探针c和引物对c的组合或荧光探针c1和引物对c1的组合；
上述第二试剂包括用于检测上述第二靶区域甲基化的第二核酸组，上述第二核酸组包括引物对d与荧光探针d的组合或引物对d1与荧光探针d1的组合；
其中，上述引物对c的碱基序列如SEQ ID NO.11-12所示，上述荧光探针c的碱基序列如SEQ ID NO.13所示；上述引物对c1的碱基序列如SEQ ID NO.14-15所示，上述荧光探针c1的碱基序列如SEQ ID NO.16所示；
上述引物对d的碱基序列如SEQ ID NO.17-18所示，上述荧光探针d的碱基序列如SEQ ID NO.19所示；上述引物对d1的碱基序列如SEQ ID NO.20-21所示，上述荧光探针d1的碱基序列如SEQ ID NO.22所示。
需要说明的，本领域技术人员根据本发明的内容，可以容易地设计出多种针对上述靶区域甲基化检测的引物对和探针，无论是何种引物对和探针，其并不限于本发明上述的引物对和探针，其只要通过检测上述任意一靶区域中全部区段或部分区段来诊断或辅助诊断结直肠癌，均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，上述各荧光探针的5'端标记有荧光基团，上述探针3'端标记有淬灭基团。
在可选的实施方式中，荧光基团选自FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、TAMRA、RED670和NED中的任意一种，上述淬灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和结合分子沟的非荧光淬灭剂(Minor Groove Binder nonfluorescent quencher,MGB NFQ)中的任意一种。
在可选的实施方式中，上述试剂盒的检测样本为取自待测主体的血液样本、结直肠组织样本或粪便样本。
第二方面，本发明提供了一种结直肠癌辅助诊断试剂盒，其包括用于检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂；上述结直肠癌相关基因选自SDC2基因和TFPI2基因中的一种和两种的组合；上述检测试剂包括用于检测SDC2基因上的第一靶区域甲基化的第一试剂或/和用于检测TFPI2基因上的第二靶区域甲基化的第二试剂；
其中，上述第一靶区域选自SDC2基因的如下区域中的任意一种或几种的组合：区域a、区域b和区域c；
其中，区域a选自chr8:96493351-96493635的全长区域或部分区域，区域b选自chr8:96493701-96493935的全长区域或部分区域，区域c选自chr8:96494006-96494335的全长区域或部分区域；
上述第二靶区域选自TFPI2基因的如下区域中的任意一种或几种的组合：区域d和区域e；
其中，区域d选自chr7:93890026-93890319的全长区域或部分区域，区域e选自chr7:93890630-93890991的全长区域或部分区域。
在可选的实施方式中，上述区域a选自chr8:96493393-96493629的全长区域或部分区域。
在可选的实施方式中，上述区域b选自chr8:96493701-96493900的全长区域或部分区域。
在可选的实施方式中，上述区域c选自chr8:96494006-96494327的全长区域或部分区域。
在可选的实施方式中，上述区域a选自chr8:96493393-96493581和chr8:96493456-96493629中的任意一种。
在可选的实施方式中，上述区域b选自chr8:96493701-96493858和96493770-96493900中的任意一种。
在可选的实施方式中，上述区域c选自chr8:96494006-96494166和chr8:96494140-96494327中的任意一种。
在可选的实施方式中，上述区域a选自chr8:96493456-96493581。
在可选的实施方式中，上述区域b选自96493770-96493858。
在可选的实施方式中，上述区域c选自chr8:96494140-96494166。
在可选的实施方式中，上述区域d选自chr7:93890026-93890312的全长区域或部分区域。
在可选的实施方式中，上述区域e选自chr7:93890651-93890976的全长区域或部分区域。
在可选的实施方式中，上述区域d选自chr7:93890026-93890176和chr7:93890149-93890312。
在可选的实施方式中，上述区域e选自chr7:93890651-93890825和chr7:93890807-93890976。
在可选的实施方式中，上述区域d选自chr7:93890149-93890176。
在可选的实施方式中，上述区域e选自chr7:93890807-93890825。
在可选的实施方式中，上述结直肠癌相关基因为SDC2基因和TFPI2基因的联合；上述检测试剂包括用于检测SDC2基因上的第一靶区域甲基化的第一试剂和用于检测TFPI2基因上的第二靶区域甲基化的第二试剂；
上述第一靶区域为区域c；上述第二靶区域为区域d。
在可选的实施方式中，上述第一试剂包括用于检测上述第一靶区域甲基化的第一核酸组，上述第一核酸组包括荧光探针c和引物对c的组合或荧光探针c1和引物对c1的组合。
上述第二试剂包括用于检测上述第二靶区域甲基化的第二核酸组，上述第二核酸组包括引物对d与荧光探针d的组合或引物对d1与荧光探针d1的组合。
其中，上述引物对c的碱基序列如SEQ ID NO.11-12所示，上述荧光探针c的碱基序列如SEQ ID NO.13所示；上述引物对c1的碱基序列如SEQ ID NO.14-15所示，上述荧光探针c1的碱基序列如SEQ ID NO.16所示。
上述引物对d的碱基序列如SEQ ID NO.17-18所示，上述荧光探针d的碱基序列如SEQ ID NO.19所示；上述引物对d1的碱基序列如SEQ ID NO.20-21所示，上述荧光探针d1的碱基序列如SEQ ID NO.22所示。
优选地，上述试剂盒的检测样本为取自待测主体的血液样本、结直肠组织样本或粪便样本。
在可选的实施方式中，上述试剂盒包括上述试剂还包括样品保存液、核酸提取液、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品、内标对照、标准品试剂中一种或多种。
本发明的有益效果包括如下：
本发明提供的结直肠癌辅助诊断试剂盒，通过对SDC2基因和/或TFPI2基因中的特定区域进行甲基化检测(如单独检测SDC2基因的chr8:96493351-96493635、chr8:96493701-96493935、chr8:96494006-96494335，或检测这些区域的组合；再如单独检测TFPI2基因的chr7:93890026-93890319或chr7:93890630-93890991，或这两个区域的组合；再如检测SDC2基因和TFPI2基因的组合)，将这些区域的甲基化检测结果作为结直肠癌辅助诊断的依据，具有更高灵敏度和特异性，为结直肠癌或结直肠腺瘤的早期筛查、诊断等提供更加准确、可靠的参考依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中的SDC2基因中的各靶区域的位置关系示意图。
图2为本发明实施例中的TFPI2基因中的各靶区域的位置关系示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了用于结直肠癌或结直肠腺瘤辅助诊断的试剂盒，其包括：用于检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂，其中，结直肠癌相关基因为SDC2基因，检测试剂包括用于检测SDC2基因上的第一靶区域甲基化的第一试剂；
第一靶区域选自SDC2基因的如下区域中的任意一种：区域a、区域b和区域c；
其中，参考图1，区域a选自chr8:96493351-96493635的全长区域(以下简称为SDC2DMR1，需要说明的是，在其他的实施例中，区域a可以是选自chr8:96493351-96493635的部分区域，无论是检测chr8:96493351-96493635区域的全长还是其中的部分区域，均属于本发明的保护范围)；
区域b选自chr8:96493701-96493935的全长区域(以下简称为SDC2 DMR2，需要说明的是，在其他的实施例中，区域b可以是选自chr8:96493701-96493935的部分区域，无论是检测chr8:96493701-96493935区域的全长还是其中的部分区域，均属于本发明的保护范围)；
区域c选自chr8:96494006-96494335的全长区域(以下简称为SDC2 DMR 3，需要说明的是，在其他的实施例中，区域c可以是选自chr8:96494006-96494335的部分区域，无论是检测chr8:96494006-96494335区域的全长还是其中的部分区域，均属于本发明的保护范围)。
其中，SDC2 DMR1全长靶区域上的其中的一条DNA单链的碱基序列如下：
AGAAAAGCTACATACGTCTCTCGTTTCTTCACTAATTGTTCTCTAGAAAAGGGAAAGTGAAGAAGGGAAAGAGAAAAGACAACGGGGAAGAAAAGAGCATAGAGGAGAGAGGAAAAGTGGGGAGAGAAAGGAAGAAAAGGACTGAGAAAACGCAGGAGCCCTGGCTTGCCGGTGAGCAGAGCCGGCGCAGCCACAGCGCGGAGCCGCGGCGCCCACTGGTCCTCGGAGCTGCCAATCGGCGTGTAATCCTGTAGGAATTTCTCCCGGGTTTATCTGGGAGTCACA；
SDC2 DMR2全长靶区域上的其中的一条DNA单链的碱基序列如下：
AGAGGAAAAGAAGAGGAGGAGAAGGAGGAGGACCCGGGGAGGGAGGCGCGGCGCGGGAGGAGGAGGGGCGCAGCCGCGGAGCCAGTGGCCCCGCTTGGACGCGCTGCTCTCCAGATACCCCCGGAGCTCCAGCCGCGCGGATCGCGCGCTCCCGCCGCTCTGCCCCTAAACTTCTGCCGTAGCTCCCTTTCAAGCCAGCGAATTTATTCCTTAAAACCAGAAACTGAACCTCGGC；
SDC2 DMR3全长靶区域上的其中的一条DNA单链的碱基序列如下：
GAGCACCAACTCCGTGTCGGGAGTGCAGAAACCAACAAGTGAGAGGGCGCCGCGTTCCCGGGGCGCAGCTGCGGGCGGCGGGAGCAGGCGCAGGAGGAGGAAGCGAGCGCCCCCGAGCCCCGAGCCCGAGTCCCCGAGCCTGAGCCGCAATCGCTGCGGTACTCTGCTCCGGATTCGTGTGCGCGGGCTGCGCCGAGCGCTGGGCAGGAGGCTTCGTTTTGCCCTGGTTGCAAGCAGCGGCTGGGAGCAGCCGGTCCCTGGGGAATATGCGGCGCGCGTGGATCCTGCTCACCTTGGGCTTGGTGGCCTGCGTGTCGGCGGAGTCGGTGA。
其中，本实施例检测上述靶区域的所用检测试剂是本领域任何能够实现上述靶区域甲基化检测的试剂。
实施例2
本实施例提供的用于结直肠癌或结直肠腺瘤辅助诊断的试剂盒与实施例1基本相同，不同的是，本实施例中：
区域a选自SDC2 DMR 1的部分区域，具体地，参考图1，区域a选自chr8:96493393-96493581(命名为SDC2 DMR 1-a)或chr8:96493456-96493629(命名为SDC2 DMR 1-a1)；
区域b选自SDC2 DMR 2的部分区域，具体地，参考图1，区域b选自chr8:96493701-96493858(命名为SDC2 DMR 2-b)或96493770-96493900(命名为SDC2 DMR 2-b1)；
区域c选自SDC2 DMR 3的部分区域，具体地，参考图1，区域c选自chr8:96494006-96494166(命名为SDC2 DMR 3-c)或chr8:96494140-96494327(命名为SDC2 DMR 3-c1)。
进一步地，本实施例的试剂盒还包括检测上述各靶区域的引物对和荧光探针，具体序列见表1。
表1本发明实施例中检测各靶区域所用的引物对和探针序列
Figure BDA0002138661610000061
Figure BDA0002138661610000071
Figure BDA0002138661610000081
实施例3
本实施例提供了用于结直肠癌或结直肠腺瘤辅助诊断的试剂盒，其包括：用于检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂，其中，结直肠癌相关基因为TFPI2基因，检测试剂包括用于检测TFPI2基因上的第二靶区域甲基化的第二试剂；
其中，第二靶区域选自TFPI2基因如下区域中的任意一种：区域d和区域e；
其中，参考图2，区域d选自chr7:93890026-93890319的全长区域(以下简称为TFPI2 DMR1，需要说明的是，在其他的实施例中，区域d可是选自TFPI2 DMR1中的部分区域，无论是检测chr7:93890026-93890319区域的全长还是其中的部分区域，均属于本发明的保护范围)；
区域e选自chr7:93890630-93890991的全长区(以下简称为TFPI2 DMR2，需要说明的是，在其他的实施例中，区域e可是选自TFPI2 DMR2中的部分区域，无论是检测chr7:93890630-93890991区域的全长还是其中的部分区域，均属于本发明的保护范围)。
其中，TFPI2 DMR1全长靶区域上的其中一条DNA单链的碱基序列如下：
GAAATAACGCGGAGATCTGTCTCCTGCCCCTAGACTACGGACCCTGCCGGGCCCTACTTCTCCGTTACTACTACGACAGGTACACGCAGAGCTGCCGCCAGTTCCTGTACGGGGGCTGCGAGGGCAACGCCAACAATTTCTACACCTGGGAGGCTTGCGACGATGCTTGCTGGAGGATAGAAAGTAAGTGCCCTGCGCGCACCCAGGACTCTCGCGCTCCTTGCGCCGGCGGCTGGTAGCAGCTTCGCCAGTTTCCCACGTCTCGCTTTCTACAGGAAGTTTTAGCCTGGGTTT；
TFPI2 DMR2全长靶区域上的其中一条DNA单链的碱基序列如下：
ATTACTGACACAAACGCTCCCTCAGGGCGTCCCCGTCTGGACTACAGGAGAAAGTTTGGGAGGCAGGTTCAACTTTTCAACTTGGCGGGGAATTCCTCTCCCTCTTACACAGTTTGCAGCGCGGGGGCGGCGGGGTGACAGTCCCCGTGCATGAATCAGCCACCCCTCAGGCTCCGCCCCGGCGGGGGTCGGCCGGACGCTCGCCCCGCATAAAGCGGGCACCCGGGCCGCCTGGAGCAGAAAGCCGCGCACCTCCTCCCGCCAGGCGCTTTCTCGGACGCCTTGCCCAGCGGGCCGCCCGACCCCCTGCACCATGGACCCCGCTCGCCCCCTGGGGCTGTCGATTCTGCTGCTTTTCCTGA。
其中，本实施例所用的检测试剂可以是本领域任何能够实现该甲基化检测的试剂。
实施例4
本实施例提供的用于结直肠癌或结直肠腺瘤辅助诊断的试剂盒与实施例2基本相同，不同的是，本实施例中：
区域d选自TFPI2 DMR1的部分区域，具体地，参考图2，区域d选自chr7:93890026-93890176(命名为TFPI2 DMR1-d)或chr7:93890149-93890312(命名为TFPI 2 DMR 1-d1)；
区域e选自TFPI2 DMR2的部分区域，具体地，参考图2，区域e选自chr7:93890651-93890825(命名为TFPI2 DMR2-e)或chr7:93890807-93890976(命名为TFPI2 DMR2-e1)。
进一步地，本实施例的试剂盒还包括检测上述各靶区域的引物对和荧光探针，具体序列见表1。
实施例5
本实施例提供了一种使用实施例1-4的试剂盒进行结直肠癌或结直肠腺瘤辅助诊断的方法，如下：
一、DNA模板的提取：
(a)当样本是组织样本时：
用DNA提取试剂盒例如宁波有成生物医药科技有限公司的UnigeneDx，具体实验操作参见厂家说明书。
(b)当样本是粪便样本时，采用如武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(货号：AA07)进行提取，操作如下：
(1)向1-5g新鲜粪便样本加入粪便细胞裂解液，充分混匀裂解并离心转移上清至新的洁净的离心管中。
(2)向上清中加入吸附剂，涡旋振荡，使样本充分混匀。
(3)离心2-5min，将上清转移到新的离心管中。
(4)向初步处理后得到的核酸样品中，加入蛋白酶K和RNA酶完全除掉蛋白和RNA。
(5)向上一步获得上清中加入向结合液CB，上下颠倒混匀。
(6)向上述溶液中加入制备好的基因捕获试剂，颠倒混匀，室温下孵育1-2小时。
(7)孵育后将离心管转移到磁力架吸附磁珠，弃去上清。
(8)加入漂洗液WB使磁珠重悬，重复洗涤3次。
(9)加入750μL漂洗液WB使磁珠重悬，磁力架上吸附2min，去上清，重复洗涤3次(最后一次尽量将液体去除完全)。
(10)加入50μL洗脱液，震荡均匀，室温孵育3-5min，磁力架上吸附2min，转移上清至新的洁净的收集管中，收集的DNA溶液为捕获后的人源性DNA，可于4℃或者-20℃保存备用，用于后续基因检测。
二、亚硫酸盐的转化
所用核酸转化试剂盒为ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-Gold TM Kit，具体实验操作参见厂家说明书。
三、荧光定量PCR
(1)PCR反应液的配制(PCR反应体系的配制区)，见表2
表2试剂盒主要组成成分
Figure BDA0002138661610000091
说明：表2中的引物和探针即实施例1-4所述试剂盒的引物探针，根据需要检测的靶区域，选择相应的引物对和探针即可。每次PCR反应中，同时对阴性对照、阳性对照和待测样本进行检测；
1)将PCR反应液Ⅰ、PCR反应液Ⅱ、酶和阳性对照取出，解冻后，振荡30s，瞬时离心30s，防止试剂残留在管盖；
2)反应液配制：根据扩增用样本数量计算需要分装的反应液管数；
20μL的反应体系中包括：
组成 体积
PCR反应液I 19.5μL
PCR反应液Ⅱ 0.5μL
3)分装：将配制的反应液按照20μL/管分装至反应管/板中；
4)加样：向已分装好反应液的各反应管分别按顺序依次加入处理好的阴性对照NC、样本核酸转化液、阳性对照PC各5μL。加样后，确定盖好管盖或封膜后，短暂离心30s，立即进行PCR扩增反应。
5)PCR扩增(PCR扩增及结果分析区)按照表3设置PCR扩增程序并运行。
表3 PCR扩增程序
Figure BDA0002138661610000101
(2)结果判断
阴性对照、阳性对照和内控合格之后，则可按照表4-6的方法对样本检测结果进行判定。
表4检测选择单个靶基因的单个靶区域时的结果判定方法
Figure BDA0002138661610000102
表5检测来自两个不同基因的两个靶区域时的结果判定方法
Figure BDA0002138661610000103
Figure BDA0002138661610000111
表6检测来自同一基因的两个靶区域时的检测结果判定方法
Figure BDA0002138661610000112
其中，样本检测结果结果是阳性，代表患结直肠癌或结直肠腺瘤的风险较高，建议待测主体进行肠镜检查以确诊；样本检测结果是阴性，不完全排除待测主体患直肠癌或结直肠腺瘤的可能。
实验例1
分别检测SDC2基因的不同检测区域即SDC2 DMR1、SDC2 DMR2和SDC2 DMR3的甲基化，比较单个的检测区域、任意两两检测区域的结合在结直肠癌诊断效果上的差异：
入组样本：(1)302例已知临床诊断结果的组织样本，包括144例结直肠癌样本、104例腺瘤样本和54例正常样本。(2)584例已知临床诊断结果的粪便样本，包括252例癌症样本，146例腺瘤样本和186例正常样本，入组样本信息如下表7。
表7组织样本和粪便样本的临床信息
Figure BDA0002138661610000113
Figure BDA0002138661610000121
方法：使用实施例2提供的试剂盒，采用实施例5的方法进行，其中检测SDC2 DMR1、SDC2 DMR2和SDC2 DMR3所用的具体引物对分别为引物对a、引物对b1、引物对c1，探针a的荧光基团和猝灭基团为FAM和MGB-NFQ、探针b的荧光基团和猝灭基团为ROX和MGB-NFQ、探针c1的荧光基团和猝灭基团为VIC和MGB-NFQ。
将每个DMR及两个DMR组合时的检测灵敏度和特异性显示如下表8：
表8不同SDC2 DMR在组织样本和粪便样本中的检测效果
Figure BDA0002138661610000122
从表8可以看出：检测组织样本时，以单个检测区域作为靶区域检测时，SDC2基因的三个DMR对癌症样本和腺瘤样本的检测灵敏性和特异性分别为88.7％和70.2％、90.1％和71.2％、90.8％和72.1％，其中SDC2 DMR3的检测灵敏性和特异性均最好；以两个检测区域作为靶区域检测时SDC2 DMR 1-a+SDC2 DMR 2-b1组合时对两种样本的灵敏性分别为93.0％和74.0％，SDC2 DMR 1-a+SDC2 DMR 3-c1组合时的灵敏性和特异性分别为95.8％和78.8％，SDC2 DMR 2-b1+SDC2 DMR 3-c1组合时的灵敏性和特异性分别为94.4％和77.9％，其中，SDC2 DMR 1-a+SDC2 DMR 3-c1组合时的灵敏性和特异性均较优。
粪便样本的检测结果与组织样本基本一致，以单个检测区域作为靶区域检测时，SDC2 DMR 3-c1的检测灵敏性和特异性均较好；以两个检测区域作为靶区域检测时，SDC2DMR 1-a+SDC2 DMR 3-c1组合时的灵敏性和特异性较优。
实验例2
分别检测TFPI2基因的不同检测区域即TFPI2 DMR1和TFPI2 DMR2的甲基化，比较单个的检测区域、两个检测区域的结合在结直肠癌诊断效果上的差异：
入组样本：(1)302例已知临床诊断结果的组织样本，包括144例结直肠癌样本、104例腺瘤样本和54例正常样本。(2)584例已知临床诊断结果的粪便样本，包括252例癌症样本，146例腺瘤样本和186例正常样本，入组样本信息如实验例表7所示。
方法：使用实施例4提供的试剂盒，采用实施例5的方法进行，其中检测TFPI2DMR1、TFPI2 DMR2所用的具体引物对分别为引物对d1、引物对e1，探针d1的荧光基团和猝灭基团为FAM和MGB-NFQ、探针e1的荧光基团和猝灭基团为ROX和MGB-NFQ，将每个DMR及两个DMR组合时的检测灵敏度和特异性显示如下表9。
表9不同TFPI2 DMR组织样本和粪便样本中的检测效果
Figure BDA0002138661610000131
从表9可以看出：在组织样本中，TFPI 2 DMR 1-d1对癌症样本和腺瘤样本的检测灵敏性分别为90.1％和69.2％，TFPI2 DMR2-e1对癌症样本的检测灵敏性和特异性分别为88.0％和68.3％，其中TFPI 2 DMR 1-d1的检测灵敏性优于TFPI2 DMR2-e1，TFPI 2DMR 1-d1+TFPI2 DMR2-e1组合时的灵敏性分别为92.3％和74.0％，两个DMR组合时的检测灵敏性高于单个DMR；TFPI 2 DMR 1-d1和TFPI2 DMR2-e1在粪便样本中的检测结果与组织样本一致。
实验例3
将SDC2基因上的三个检测区域中的任意一个区域与TFPI2基因上的两个检测区域中的任意一个检测区域结合，比较不同组合在结直肠癌诊断效果上的差异：
入组样本：584例已知临床诊断结果的粪便样本，包括252例癌症样本，146例腺瘤样本和186例正常样本，入组样本信息如实验例表7所示。
方法：使用实施例2和4中的试剂盒，采用实施例5的方法进行，其中检测SDC2DMR1、SDC2 DMR2和SDC2 DMR3所用的具体引物对分别为引物对a、引物对b1、引物对c1，检测TFPI2 DMR1、TFPI2 DMR2所用的具体引物对分别为引物对d1、引物对e1，将每个DMR及两个DMR组合时的检测灵敏度和特异性显示如表10所示。其中这六个组合中SDC2基因的探针的荧光报告基团均为FAM，猝灭基团均为MGB-NFQ，TFPI2基因的探针的荧光报告基团均为ROX，猝灭基团均为MGB-NFQ。
表10.SDC2和TFPI2不同DMR组合在粪便样本中的检测效果
Figure BDA0002138661610000132
Figure BDA0002138661610000141
从表10可以看出：SDC2的任意一个DMR与TFPI2的任意一个DMR组合使用时，都具有较高的灵敏度和特异性，尤其是当SDC2引物对c1与TFPI2引物对d1组合使用时，灵敏性和特异性最优。其中癌症中的检测灵敏性为94.8％，在腺瘤样本中的检测灵敏性为78.8％，特异性为96.2％，AUC达0.992和0.898。
实验例4
比较采用本发明实施例5的诊断方法与对照组的诊断效果
(1)对照组：检测SDC2基因的chr8:96494146-96494214和TFPI2基因的chr7:98890723-98890795两个区域的甲基化情况，根据结果，联合诊断结直肠癌，判断方法可参考实施例5。
合成检测SDC2基因和TFPI2基因其他区域甲基化的对照引物对和探针序列，如下：
检测SDC2基因的chr8:96494146-96494214区域甲基化的引物对和探针：
SDC2-F10：GTTTGAGTCGTAATCGTTGC；
SDC2-R10：TCCTACCCAACGCTCGACG；
SDC2-P5：CGGATTCGTGTGCGC。
检测TFPI2基因的chr7:98890723-98890795区域甲基化的引物对和探针：
TFPI2-F6：ACGTTCGTTTCGTATAAAGC；
TFPI2-R4：ACGCCTAACGAAAAAAAATACG；
TFPI2-P2：CTCCAAACGACCCG。
(2)入组样本：150已知临床诊断结果的粪便样本，其中50例为癌症样本，50例为腺瘤样本，50例为正常样本。入组样本信息如表11所示。
表11. 150例粪便样本的临床信息
Figure BDA0002138661610000142
方法：采用实施例5的方法进行，其中检测SDC2 DMR1、SDC2 DMR2和SDC2 DMR3所用的具体引物对分别为引物对a、引物对b1、引物对c1，检测TFPI2 DMR1、TFPI2 DMR2所用的具体引物对分别为引物对d1、引物对e1，统计每种情况下的检测灵敏度和特异性见表12。在表12中，前三种组合中探针a、b和c1的荧光报告基团分别为FAM、ROX和VIC，第四种组合中探针d1和e1的荧光报告基团分别为FAM和ROX，组合5-10中SDC2基因的探针的荧光基团均为FAM，TFPI2基因的探针的荧光基团均为ROX，组合1-10中所有探针的猝灭基团均为MGB-NFQ。
表12.本发明与现有技术的对比结果
Figure BDA0002138661610000151
可见，本发明实施例的试剂盒所检测靶区域的癌症灵敏度远高于对照组的靶区域。
实验例6
检测使用表1中的不同引物对扩增靶区域的诊断效果
入组样本：60例已知临床诊断结果的粪便样本，其中20例为癌症样本，20例为腺瘤样本，20例为正常样本。
入组样本信息如表13所示：
表13. 60例粪便样本的临床信息
Figure BDA0002138661610000152
方法：采用实施例5的方法进行，其中探针a、b、c、c1、d、d1、e和e1的荧光报告基团分别为FAM、ROX、VIC、VIC、FAM、FAM、ROX和ROX，所有探针的荧光猝灭基团均为MGB-NFQ。统计每种引物对的检测灵敏度和特异性见表14。
表14.SDC2和TFPI2各个DMR不同引物对的检测效果
Figure BDA0002138661610000153
Figure BDA0002138661610000161
根据表14得到的灵敏性、特异性和AUC值可以看出，扩增SDC2 DMR1、SDC2 DMR2、SDC2 DMR3、TFPI2 DMR1和TFPI2 DMR2的较优的引物对分别为引物对a、引物对b1、引物对c1、引物对d1和引物对e1。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂的应用和试剂盒
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttagaaaagg gaaagtgaag aaggg 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caactccgaa aaccaataaa cg 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agagaggaaa agtggggaga gaaag 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcccaaataa acccgaaaaa aattc 25
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctataactac gccgactcta ctcacc 26
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agaggaaaag aagaggagga gaagg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acgacgaaaa cgcgcgatc 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtagtcgcgg agttagtggt tt 22
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgctaactta aaaaaaaact acgac 25
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atctaaaaaa caacgcgtcc 20
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gagtattaat ttcgtgtcgg gagtg 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
taccgcaacg attacgactc aaac 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
caactacgcc ccgaaaacgc 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgagtttgag tcgtaatcgt tgc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tccgccgaca cgcaaaccac caaacc 26
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aacaaaacga aacctcctac ccaac 25
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
atttgggagg tttgcgacga t 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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aaacccaaac taaaacttcc 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cgaaaatcct aaatacgcgc aaaac 25
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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cgcggagatt tgttttttgt 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
aacaaacatc gtcgcaaacc tc 22
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ataaaacccg acaaaatccg 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ttaggtttcg tttcggcgg 19
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
acaaccccaa aaaacgaacg aaatc 25
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tctactccaa acgacccgaa tacc 24
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
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<400> 26
gtttttttag ggcgttttcg tttgg 25
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ccgccgaaac gaaacctaaa a 21
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ttcatacacg aaaactatca ccccg 25

Claims (8)

1.用于检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述结直肠癌相关基因选自SDC2基因和TFPI2基因中的一种和两种的组合；所述检测试剂包括用于检测SDC2基因上的第一靶区域甲基化的第一试剂或/和用于检测TFPI2基因上的第二靶区域甲基化的第二试剂；
其中，所述第一靶区域选自SDC2基因的如下区域中的任意一种或几种的组合：区域a、区域b和区域c；
其中，区域a选自chr8:96493393-96493581，区域b选自chr8:96493770-96493900，区域c选自chr8:96494140-96494327；
所述第二靶区域选自TFPI2基因的如下区域中的任意一种或几种的组合：区域d和区域e；
其中，区域d选自chr7:93890149-93890312，区域e选自chr7:93890807-93890976。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌相关基因为SDC2基因和TFPI2基因的联合；所述检测试剂包括用于检测SDC2基因上的第一靶区域甲基化的第一试剂和用于检测TFPI2基因上的第二靶区域甲基化的第二试剂；
所述第一靶区域为区域c；所述第二靶区域为区域d。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，
所述第一试剂包括用于检测所述第一靶区域甲基化的第一核酸组，所述第一核酸组包括荧光探针c和引物对c的组合或荧光探针c1和引物对c1的组合；
所述第二试剂包括用于检测所述第二靶区域甲基化的第二核酸组，所述第二核酸组包括引物对d与荧光探针d的组合或引物对d1与荧光探针d1的组合；
其中，所述引物对c的碱基序列如SEQ ID NO.11-12所示，所述荧光探针c的碱基序列如SEQ ID NO.13所示；所述引物对c1的碱基序列如SEQ ID NO.14-15所示，所述荧光探针c1的碱基序列如SEQ ID NO.16所示；
所述引物对d的碱基序列如SEQ ID NO.17-18所示，所述荧光探针d的碱基序列如SEQID NO.19所示；所述引物对d1的碱基序列如SEQ ID NO.20-21所示，所述荧光探针d1的碱基序列如SEQ ID NO.22所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为取自待测主体的血液样本、结直肠组织样本或粪便样本。
5.一种结直肠癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，其包括用于检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂；所述结直肠癌相关基因选自SDC2基因和TFPI2基因中的一种和两种的组合；所述检测试剂包括用于检测SDC2基因上的第一靶区域甲基化的第一试剂或/和用于检测TFPI2基因上的第二靶区域甲基化的第二试剂；
其中，所述第一靶区域选自SDC2基因的如下区域中的任意一种或几种的组合：区域a、区域b和区域c；
其中，区域a选自chr8:96493393-96493581，区域b选自chr8:96493770-96493900，区域c选自chr8:96494140-96494327；
所述第二靶区域选自TFPI2基因的如下区域中的任意一种或几种的组合：区域d和区域e；
其中，区域d选自chr7:93890149-93890312，区域e选自chr7:93890807-93890976。
6.根据权利要求5所述的结直肠癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述结直肠癌相关基因为SDC2基因和TFPI2基因的联合；所述检测试剂包括用于检测SDC2基因上的第一靶区域甲基化的第一试剂和用于检测TFPI2基因上的第二靶区域甲基化的第二试剂；
所述第一靶区域为区域c；所述第二靶区域为区域d。
7.根据权利要求6所述的结直肠癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述第一试剂包括用于检测所述第一靶区域甲基化的第一核酸组，所述第一核酸组包括荧光探针c和引物对c的组合或荧光探针c1和引物对c1的组合；
所述第二试剂包括用于检测所述第二靶区域甲基化的第二核酸组，所述第二核酸组包括引物对d与荧光探针d的组合或引物对d1与荧光探针d1的组合；
其中，所述引物对c的碱基序列如SEQ ID NO.11-12所示，所述荧光探针c的碱基序列如SEQ ID NO.13所示；所述引物对c1的碱基序列如SEQ ID NO.14-15所示，所述荧光探针c1的碱基序列如SEQ ID NO.16所示；
所述引物对d的碱基序列如SEQ ID NO.17-18所示，所述荧光探针d的碱基序列如SEQID NO.19所示；所述引物对d1的碱基序列如SEQ ID NO.20-21所示，所述荧光探针d1的碱基序列如SEQ ID NO.22所示。
8.根据权利要求7所述的结直肠癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为取自待测主体的血液样本、结直肠组织样本或粪便样本。
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Denomination of invention: Application and Kit of Detection Reagents for Methylation of Colorectal Cancer Related Genes

Granted publication date: 20200526

Pledgee: Wuhan Optics Valley Small and Medium Duty Venture Capital Co.,Ltd.

Pledgor: WUHAN AIMISEN LIFE TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980014407