CN110951872A - 一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因dna甲基化水平的方法及其应用 - Google Patents
一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因dna甲基化水平的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法及其应用。本发明用核酸质谱技术，检测结直肠癌相关的5个基因15个区域的特定组合，定量分析这15区域中近120个CpG位点的DNA甲基化程度，建立CRC病人特征性的DNA甲基化谱。本发明通过核酸质谱技术对基因甲基化进行检测，相比于TaqMan‑PCR和二代平台测序，该检测方法具有简便、灵活性强，高通量大、成本低等特点。本发明除可用于CRC的早期评估和大规模筛查，为CRC患病风险评估、诊断提供重要参考依据，以实现对结直肠癌疾病的早期预警。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法及其应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是消化道最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，大城市的情况尤其严峻，结直肠癌早已超越胃癌成为消化***的首要恶性肿瘤，在所有恶性肿瘤中，结直肠癌的发病率和死亡率均仅次于肺癌居第2位。虽然结直肠癌的治疗在近年有了长足的进步，但总体疗效并没有很大的改善，手术后的5年生存率在50％左右。而结直肠癌的早期患者治疗效果较好，5年生存率可在90％以上。导致CRC发病的因素主要包括环境和遗传。通过对CRC的基因突变进行检测，可以提前预知CRC患病的风险，对CRC的早期诊断和有效预防具有重大的指导意义。在早期的CRC中，肿瘤细胞可能脱落进入肠腔，并与粪便混合，由于肠道是碱性环境，有利于DNA的保存，因此从粪便样本中提取DNA稳定性和敏感性更高。
CRC有多种早期检测的方法，包括以粪便为基础的检查如粪便隐血试验(FOBT)、粪便免疫化学试验(FIT)；内镜检查如柔性乙状结结肠镜检查、结肠镜和胶囊内镜检查；影像检查如结肠气钡双重造影、结肠CT成像等。结肠镜检查是CRC筛查的“金标准”，但是在检查前需要对患者做禁食、服用泻药等准备，检查过程又属于侵入性的检查方式，过程长且痛苦，还有穿孔等高风险的并发症可能，因此不易被患者接受，也难以作为CRC的早期筛查手段。FOBT及FIT试验属于无创检测手段，但是其敏感性和特异性均较低，需要重复试验的验证，且检查结果易受药物等因素的影响而产生假阳性，只能作为初筛手段。
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。因此通过甲基化检测可判断CRC患病的风险。
与CRC的发生明确相关的DNA甲基化基因标志物有多个，本发明选择其中BMP3、NDRG4、SDC2、SFRP2、VIM等，分别检测各基因中的3个区域的DNA甲基化模式，鉴别结直肠癌。
目前常用的检测DNA甲基化的方法主要是采用TaqMan-PCR及其二代平台测序，但是其存在诸如设计的灵活性不够、检测容量小、成本高的问题。本项目选择在MassRRAY飞行质谱仪(MALDI-TOF)技术平台上开发一套检测粪便基因DNA甲基化的方法，早期发现CRC和CRC的癌前病变腺瘤。
发明内容
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种基于核酸质谱技术，利用基因DNA甲基化模式，鉴别结直肠癌的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其包括如下步骤：
(1)筛选出用于评估个体罹患结直肠癌风险相关的基因和基因中的DNA甲基化区域；
(2)设计步骤(1)中结直肠癌基因的特异性扩增引物，设计引物扩增的DNA片段不超过200bp；
(3)对待测DNA样本进行重亚硫酸盐转化；
(4)将步骤(2)中，所有引物由7位编号表示，编号由字母和数字组成，第1到6位数字和字母相同的引物为一对，第7位是字母F或者R，每对引物的上下游引物等摩尔混合，得到相应的扩增引物混合液，每对扩增引物混合液的最终工作浓度为1μM；
(5)以重亚硫酸盐转化后的DNA样本为模板，利用步骤(4)中的扩增引物分别进行PCR扩增反应，获得目的基因的PCR产物片段；
(6)SAP反应消化步骤(5)反应体系中剩余的dNTP；
(7)对步骤(6)完成SAP消化后的DNA样本进行T Cleavage转录及T切；
(8)洁净树脂脱盐纯化步骤(7)完成T Cleavage转录及T切的产物；
(9)MassARRAY平台对结直肠癌风险相关性基因的DNA甲基化位点定量检测，确定每个CpG位点的甲基化程度。
其中，步骤(1)中，可用来评估个体罹患结直肠癌风险相关性的基因为BMP3、NDRG4、SDC2、SFRP2、VIM。
步骤(2)中，所述个体罹患结直肠癌风险相关性基因的DNA甲基化位点定量检测的PCR特异性扩增引物对为：M00101F，M00101R；M00102F，M00102R；M00103F，M00103R；M00201F，M00201R；M00202F，M00202R；M00203F，M00203R；M00301F，M00301R；M00302F，M00302R；M00303F，M00303R；M00401F，M00401R；M00402F，M00402R；M00403F，M00403R；M00501F，M00501R；M00502F，M00502R；M00503F，M00503R。
步骤(3)中，所述的重亚硫酸盐转化的循环条件为：(95℃30s→50℃15min)×20cycles→4℃Hold。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。
步骤(5)中，所述的PCR扩增条件为：95℃4min→(95℃20s→56℃30s→72℃1min)×45cycles→72℃3min→4℃Hold。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。
步骤(6)中，所述的SAP消化的循化条件为：37℃20min→85℃5min→4℃Hold。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。
步骤(7)T Cleavage转录及T切的循化条件为：37℃3h→4℃Hold。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。
上述基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法在制备用于诊断受试者是否患有结直肠癌或者是否具有形成结直肠癌的风险的制剂中的用途。
分析检测到的CRC患者粪便DNA样本和正常志愿者样本各CpG位点的甲基化程度，两个群体各CpG位点甲基化程度的不同，构成的CRC患者和正常志愿者各自的DNA甲基化模式，可以鉴别出CRC患者。
本发明技术方案使用核酸质谱检测技术，选择5个结直肠癌相关基因，各基因选择中等数量的CpG位点，检测各CpG位点甲基化程度。一个样本各CpG位点的甲基化程度构成该样本的DNA甲基化谱。该方法简便，检测位点样本量大，准确率高，并且成本低。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。
实施例：通过本发明技术检测结直肠癌易感性相关基因的DNA甲基化特征
一、检测对象
从50例病理已经诊断为结直肠癌患者，以及30例健康志愿者的粪便中，检测一组结直肠癌早期诊断相关基因的突变位点。
二、使用Qiagen QIAamp Fast DNA Stool Mini试剂盒，提取粪便样本DNA，得粪便人
DNA提取液
1.取2.0ml离心管，加入干粪便样本约200mg，置于冰盒上。
2.在每个粪便样本中加入1ml InhibitEX缓冲液。连续漩涡1分钟，直至粪便样品完全均匀。
3.将混匀后的样本于14500rpm(约20000×g)离心1min。
4.取干净的2.0ml离心管，加入25μl蛋白酶K。
5.取第3步离心产物的上清液600μl加入已装好蛋白酶K的离心管中。
6.加入600μl Buffer AL并涡旋15s。
7.将混匀后的样本置于70℃金属浴中孵育10min。
8.再加入600μl无水乙醇，上下颠倒混匀。
9.取离心柱，加入第8步下混合液600μl，14500rpm离心1min，丢弃含有滤液的收集管。
10.更换干净的2.0ml收集管，重复第9步操作，直至所有的混合液均转移完毕(共需转移3次)。
11.更换干净的2.0ml收集管，加入500μl Buffer AW1，14500rpm离心1min，弃去含有滤液的收集管。
12.更换干净的2.0ml收集管，加入500μl Buffer AW2，14500rpm离心3min，弃去含有滤液的收集管。
13.更换干净的2.0ml离心管(非试剂盒提供)，14500rpm离心3min，弃去含有滤液的离心管。
14.更换干净的1.5ml离心管(非试剂盒提供)，加入200μl Buffer ATE，室温放置2min，然后14500rpm离心1min，1.5ml离心管中即为提取完成的DNA样本溶液，可直接用于下一步操作，若暂不使用可密封并置于-20℃保存。
三、检测样本质量
1.打开NANO DROP2000仪器的上盖，用无尘纸擦干净仪器检测小孔外缘。
2.用移液枪吸取Buffer ATE约2μl，仔细滴到检测仪器的小孔中，盖上检测仪器的上盖。
3.在电脑操作软件中输入待测样本名称，点击Blank，后点击Measure键读取实验结果。
4.打开检测仪器的上盖，用无尘纸擦干净仪器检测小孔外缘。
5.用移液枪吸取DNA样本约2μl，仔细滴到检测仪器的小孔中，盖上检测仪器的上盖。
6.在电脑操作软件中输入待测样本名称，点击Measure键读取实验结果。
7.检测完毕后DNA样品可直接用于下一步操作，若暂不使用可密封并置于-20℃保存。
四、重亚硫酸盐转化
1.配制CT Conversion Regent(CT转换试剂)：加入750μl水和210μl M-DilutionBuffer到一瓶CT Conversion Regent里，然后涡旋震荡10min。
2.取1.5ml离心管，每管加入5μl M-Dilution Buffer+DNA样本(2μg)，总量不足50μl者，加水补足。
3.放置混合后的样本于37℃金属浴15min。
4.每个样本加入100μl已配制好的CT Conversion Regent，用移液枪上下抽打混匀。
5.放入PCR扩增仪。进行如下程序：
(95℃30s→50℃15min)×20cycles→4℃∞。
6.样本放置于冰盒中10min。
7.加入400μl M-Binding Buffer到样本里，用移液枪上下抽打混匀。
8.将样本全部转移到Zymo-Spin I Column(离心柱)里，将离心柱放入2ml收集管里。
9.以14500rpm(≥10000g)离心30s，丢弃滤液。
10.加入200μl M-Wash Buffer到离心柱里，14500rpm离心30s，丢弃滤液。
11.加入200μl M-Desulphonation Buffer到离心柱里，在室温(24℃)放置15min，然后14500rpm离心30s。
12.加入200μl M-Wash Buffer到离心柱里，14500rpm离心30s。
13.加入200μl M-Wash Buffer到离心柱里，14500rpm离心1min。
14.更换新的1.5ml离心管作为收集管，用60μl水洗脱DNA，洗脱下来的即为亚硫酸盐转化后的DNA样本，可直接用于下一步操作，若暂不使用可密封并置于-20℃保存。
五、PCR扩增
以重亚硫酸盐转化后的DNA样本为模板，将每对扩增引物的上游引物和下游引物等摩尔混合，得到扩增引物混合液，每条引物的终浓度为1μM，进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR产物片段。
1.PCR扩增反应体系(5μl)为
2.PCR反应程序
95℃4min→(95℃20s→56℃30s→72℃1min)×45cycles→72℃3min→4℃∞。表1：待测基因位点的特异性扩增引物序列对
六、PCR产物SAP酶处理
1.处理上步所获得的PCR产物，消除反应体系中剩余的dNTP。
SAP酶处理反应体系为7μl(每一个反应)：
2.消化反应条件为：
37℃20min→85℃5min→4℃∞。
七、T Cleavage转录及T切
在SAP酶处理结束后，对目标产物的位点进行T Cleavage转录及T切。
1.按以下顺序加入各试剂，配制成适量的T转录/RNase A混合液：
2.取一块新的384孔样品板，每孔分别加入5μL T转录/RNase A混合液。
3.将DNA样品板(经PCR/SAP处理后)以540×g离心1min。
4.分别从DNA样品板(经PCR/SAP处理后)的每孔中转移2μLDNA样本，对应放置于新转录样品板的各孔中，每次转移需更换新的移液枪头。
5.用平板密封膜将转录样品板封好，确保样品板边缘密封性良好。
6.将转录样品板以540×g离心1min。
7.将转录样品板放入PCR扩增仪于37℃孵育3h。
8.完成后，将板从PCR扩增仪中取出来，可直接用于下一步操作，若暂不使用可密封并置于-20℃保存过夜。
八、树脂纯化
向上一步的产物中加入树脂，对延伸产物进行脱盐纯化，避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰。具体步骤为：
向384孔板的每孔产物中加入20μl水和干燥后的洁净树脂6mg。用封板膜将板密封，低速垂直旋转15min,使树脂与反应物充分接触；3200g离心5min，准备点样。
九、芯片点样
启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。
十、质谱分析
将点样后的Spectro CHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted laserdesorption/ionization-time offligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用EpiTyper软件(sequenom)分析并输出结果。
十一、结论
结果显示，本实施例检测的50例病理已经诊断为结直肠癌患者，以及30例健康志愿者，共80例样本粪便，结直肠癌患者的DNA甲基化谱和健康志愿者的DNA甲基化谱不同。使用结直肠癌患者粪便DNA中特征性的甲基化谱，可以明确区分结直肠癌患者样本和正常志愿者的对照样本。说明本发明技术能够有效地检测到结直肠癌患者特征性的DNA甲基化谱。
Claims (8)
1.一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)筛选出用于评估个体罹患结直肠癌风险相关的基因和基因中的DNA甲基化区域；
(2)设计步骤(1)中结直肠癌基因的特异性扩增引物，设计引物扩增的DNA片段不超过200bp；
(3)对待测DNA样本进行重亚硫酸盐转化；
(4)将步骤(2)中，所有引物由7位编号表示，编号由字母和数字组成，第1到6位数字和字母相同的引物为一对，第7位是字母F或者R，每对引物的上下游引物等摩尔混合，得到相应的扩增引物混合液，每对扩增引物混合液的最终工作浓度为1μM；
(5)以重亚硫酸盐转化后的DNA样本为模板，利用步骤(4)中的扩增引物分别进行PCR扩增反应，获得目的基因的PCR产物片段；
(6)SAP反应消化步骤(5)反应体系中剩余的dNTP；
(7)对步骤(6)完成SAP消化后的DNA样本进行T Cleavage转录及T切；
(8)洁净树脂脱盐纯化步骤(7)完成T Cleavage转录及T切的产物；
(9)MassARRAY平台对结直肠癌风险相关性基因的DNA甲基化位点定量检测，确定每个CpG位点的甲基化程度。
2.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其特征在于：步骤(1)中，可用来评估个体罹患结直肠癌风险相关性的基因为BMP3、NDRG4、SDC2、SFRP2、VIM。
3.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述个体罹患结直肠癌风险相关性基因的DNA甲基化位点定量检测的PCR特异性扩增引物对为：M00101F，M00101R；M00102F，M00102R；M00103F，M00103R；M00201F，M00201R；M00202F，M00202R；M00203F，M00203R；M00301F，M00301R；M00302F，M00302R；M00303F，M00303R；M00401F，M00401R；M00402F，M00402R；M00403F，M00403R；M00501F，M00501R；M00502F，M00502R；M00503F，M00503R。
4.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的重亚硫酸盐转化的循环条件为：(95℃30s→50℃15min)×20cycles→4℃Hold。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。
5.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述的PCR扩增条件为：95℃4min→(95℃20s→56℃30s→72℃1min)×45cycles→72℃3min→4℃Hold。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。
6.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其特征在于：步骤(6)中，所述的SAP消化的循化条件为：37℃20min→85℃5min→4℃Hold。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。
7.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法，其特征在于：步骤(7)T Cleavage转录及T切的循化条件为：37℃3h→4℃Hold。以上扩增条件中每个步骤的温度是一个范围的中间值，在此中间值高低2℃均是本权利要求的范围。
8.权利要求1-7任意之一所述基于核酸质谱技术检测结直肠癌基因DNA甲基化水平的方法在制备用于诊断受试者是否患有结直肠癌或者是否具有形成结直肠癌的风险的制剂中的用途。
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