CN115537464B - 一种结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断试剂、核酸组合、试剂盒及应用 - Google Patents

一种结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断试剂、核酸组合、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断试剂、核酸组合、试剂盒及应用，涉及肿瘤检测技术领域。以人DOK6基因CpG岛的甲基化作为标志物，通过检测样本中DOK6基因的CpG岛的甲基化水平的增加可以对结直肠癌或癌前病变进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性。采用本发明提供的检测试剂和试剂盒能有效地提高结直肠癌的检出率，从而满足结直肠癌/癌前病变早筛早诊的临床需求。本发明提供的基因检测产品也可以为体检人群提供更好的肠道健康评估服务，实现对肠道病变的早发现、早诊断、早治疗，有利于节约家庭的医疗负担成本。

Description

一种结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断试剂、核酸组合、 试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及肿瘤检测技术领域，具体而言，涉及一种结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断试剂、核酸组合、试剂盒及应用。
背景技术
结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，主要包括结肠癌与直肠癌两大类。结直肠癌的预后与疾病诊断时的严重程度相关，美国结直肠癌患者5年生存率为67％。2004年至2013年，美国结直肠癌的发病率每年下降3％，整体死亡率平均每年下降2.7％，早期筛查在其中的贡献率超过50％。由于结直肠癌在早期缺少症状，目前结直肠癌的早期诊断率仅为10％左右，超过80％患者确诊时已到中晚期。
因此，提高腺瘤的检出率对于降低结直肠癌的发病率和死亡率极为重要。而结直肠癌传统的筛查方法包括粪便潜血试验、粪便免疫试验、结肠钡剂灌肠检查、乙状结肠镜检查以及结肠镜检查。其中，粪便潜血试验和粪便免疫试验具有一定的特异性和灵敏性，但前提是患者已存在明显的肿瘤大小，因此不适用于结直肠癌的早期检测。内窥镜检查提高了高危人群中结直肠癌的检出率，但患者接受度低、且操作不够灵活。
近期分子生物学方面的进展为开发简便、有效的早期诊断方法提供了新的方向，结直肠癌组织中存在多基因、多位点的甲基化，并且在结直肠癌发生的早期即出现DNA甲基化的改变，因此，甲基化改变可以作为食管癌早期诊断的标志物，从DNA甲基化角度探索结直肠癌诊断策略已成为一种新的思路。
结直肠肿瘤一般发生在结直肠上皮组织中，在其生长过程中，不断地有肿瘤细胞脱落至肠腔内并随着粪便排出。肿瘤细胞由于增生异常更容易从肠道脱落，因此肠道肿瘤患者的粪便中包含有大量的病变细胞和病变成分，检测粪便中的肿瘤细胞成分就可以提供一种无创的辅助诊断结直肠肿瘤方法。另外，肿瘤细胞也会释放DNA到血液中(cfDNA,circulating free DNA)，也可通过检测血液中的肿瘤DNA对结直肠癌进行检测，但cfDNA具有含量少、半衰期短的特点，使其在提取过程中容易丢失，因此检测难度巨大。
现有技术中公开的一些检测标记物对结直肠癌具有良好的检测效果，但对结直肠癌前病变的检测灵敏性和特异性较差，另外，目前尚缺少在粪便和血液中均具有优异检测效果的标记物。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断试剂、核酸组合、试剂盒及应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断试剂在制备结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断产品中的应用，诊断或辅助诊断试剂为用于检测DOK6基因上的靶区域的甲基化的试剂，靶区域选自DOK6基因的如下至少一种区域中的全长区域或部分区域：区域I、区域II和区域III；
其中，区域I选自Chr18:69400274-69401932正链或Chr18:69401932-69400274负链，区域II选自Chr18:69402698-69402935正链或Chr18:69402935-69402698负链，区域III选自Chr18：69469672-69470012正链或Chr18：69470012-69469672负链。
以GRCh38.p13为参考基因组，DOK6基因位于人18号染色体的负义链上，具***置为69400888-69849087bp。需要说明的是，本发明所提到的位点或区域的位置均是以GRCh38.p13为参考。
DOK6基因编码停泊蛋白6(Docking Protein 6,DOK6)，现有的研究表明DOK6蛋白与NS1蛋白(流感病毒非结构蛋白1)存在相互作用，NS1能够与DOK6蛋白的PTB结构域发生相互作用。DOK6属于Dok家族，该家族包括DOK1、DOK2、DOK3、DOK4、DOK5、DOK6和DOK7，其中DOK1、DOK2、DOK3为第一大类，主要分布在血液***组织和细胞中，而且均为负调控因子，而其他的四个成员为第二大类，主要分布在非血液***组织和细胞中。其中，在2004年由Crowder R.J.等人克隆了人的dok6基因，并证明其参与c-Ret信号通路，促进GDNF诱导的Neuro2A细胞的突起生长，之后有研究人员证明了DOK6作为TrkC受体的底物，参与了NT-3介导的原代培养的小鼠大脑皮层神经元的神经突起生长过程(李玮琪，北京协和医学院基础学院)。需要说明的是，本发明中的靶区域包括不限于DOK6基因的启动子区、编码区、非编码区和调控区。
而发明人发现，以DOK6基因作为标志物，通过检测其CpG岛区域(即靶区域)甲基化水平的增加可以对结直肠癌或其腺瘤进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性，有助于提高结直肠癌或其腺瘤的检出率。
CpG岛是富含CpG二核苷酸的区域，长度在200-3000bp之间，G+C的含量超过50％，DOK6的CpG岛区域包括Chr18:69400274-69401932区域、Chr18:69402698-69402935区域和Chr18：69469672-69470012区域。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述靶区域选自DOK6基因的如下至少一种区域中的全长区域或部分区域：
区域1、区域2、区域3、区域4、区域5、区域6、区域7、区域8、区域9、区域10、区域11、区域12、区域13、区域14、区域15、区域16、区域17、区域18、区域19和区域20；
其中，区域1选自Chr18：69400290-69400480正链，区域2选自Chr18:69400531-69400649正链，区域3选自Chr18:69400739-69400893正链，区域4选自Chr18:69400997-69401110正链，区域5选自Chr18:69401156-69401286正链，区域6选自Chr18:69401302-69401453正链，区域7选自Chr18:69401500-69401649正链，区域8选自Chr18:69401777-69401902正链，区域9选自Chr18:69402740-69402896正链，区域10选自Chr18:69469693-69469908正链，区域11选自Chr18:69401868-69401735负链，区域12选自Chr18:69401755-69401590负链，区域13选自Chr18:69401564-69401424负链，区域14选自Chr18:69401261-69401139负链，区域15选自Chr18:69401085-69400981负链，区域16选自Chr18:69400934-69400749负链，区域17选自Chr18:69400729-69400630负链，区域18选自Chr18:69400577-69400468负链，区域19选自Chr18:69402905-69402736负链，区域20选自Chr18:69469992-69469868负链。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述靶区域选自DOK6基因的如下至少一种区域中的全长区域或部分区域：区域2、区域4、区域9、区域13、区域14、区域18和区域19。
区域1-8位于所述区域I的Chr18:69400274-69401932正链上，区域9位于所述区域II的Chr18:69402698-69402935正链上，区域10位于所述区域III的Chr18：69469672-69470012正链上，区域11-18位于所述区域I的Chr18:69401932-69400274负链上，区域19位于所述区域II的Chr18:69402935-69402698负链上，区域20位于所述区域III的Chr18：69470012-69469672负链上。
发明人发现：区域1-20均能对结直肠腺瘤样本、结直肠癌症样本和正常样本实现较好区分。其中，区域2、区域4、区域9、区域13、区域14、区域18和区域19的检测灵敏度和特异性均显著优于其他区域，在粪便样本和血浆样本中，检测这几个区域的甲基化水平的增加对结直肠腺瘤的检测灵敏度均超过60％，对结直肠癌的检测灵敏度均超过90％，特异性均大于90％。
区域2选自Chr18:69400531-69400649正链，区域4选自Chr18:69400997-69401110正链，区域9选自Chr18:69402740-69402896正链，区域13选自Chr18:69401564-69401424负链，区域14选自Chr18:69401261-69401139负链，区域18选自Chr18:69400577-69400468负链，区域19选自Chr18:69402905-69402736负链。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域1正链上的Chr18:69400301、Chr18:69400306、Chr18:69400310、Chr18:69400338、Chr18:69400341、Chr18:69400344、Chr18:69400348、Chr18:69400461和Chr18:69400479至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域2正链上的Chr18:69400539、Chr18:69400545、Chr18:69400587、Chr18:69400601、Chr18:69400631和Chr18:69400634至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域3正链上的Chr18:69400751、Chr18:69400753、Chr18:69400787、Chr18:69400874、Chr18:69400879和Chr18:69400891至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域4正链上的Chr18:69401001、Chr18:69401011、Chr18:69401047、Chr18:69401054、Chr18:69401061、Chr18:69401099、Chr18:69401102和Chr18:69401110至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域5正链上的Chr18:69401159、Chr18:69401166、Chr18:69401168、Chr18:69401176、Chr18:69401196、Chr18:69401202、Chr18:69401209、Chr18:69401262和Chr18:69401283至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域6正链上的Chr18:69401321、Chr18:69401341、Chr18:69401344、Chr18:69401348、Chr18:69401352、Chr18:69401357、Chr18:69401433和Chr18:69401442至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域7正链上的Chr18:69401518、Chr18:69401545、Chr18:69401556、Chr18:69401560、Chr18:69401633和Chr18:69401645至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域8正链上的Chr18:69401780、Chr18:69401783、Chr18:69401785、Chr18:69401787、Chr18:69401796、Chr18:69401818、Chr18:69401821、Chr18:69401827、Chr18:69401833和Chr18:69401902至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域9正链上的Chr18:69402751、Chr18:69402755、Chr18:69402761、Chr18:69402778、Chr18:69402792、Chr18:69402876、Chr18:69402884和Chr18:69402896至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域10正链上的Chr18:69469702、Chr18:69469711、Chr18:69469740、Chr18:69469887和Chr18:69469905至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域11负链上的Chr18:69401866、Chr18:69401848、Chr18:69401828、Chr18:69401822、Chr18:69401819、Chr18:69401813、Chr18:69401754和Chr18:69401736至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域12负链上的Chr18:69401754、Chr18:69401736、Chr18:69401705、Chr18:69401703、Chr18:69401699、Chr18:69401607和Chr18:69401600至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域13负链上的Chr18:6940562、Chr18:6940558、Chr18:6940554、Chr18:6940543、Chr18:6940534、Chr18:6940516、Chr18:6940443和Chr18:6940434至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域14负链上的Chr18:69401238、Chr18:69401222、Chr18:69401217、Chr18:69401215、Chr18:69401210、Chr18:69401160、Chr18:69401150、Chr18:69401146和Chr18:69401143至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域15负链上的Chr18:69401083、Chr18:69401071、Chr18:69401068、Chr18:69401042、Chr18:69401040、Chr18:69401035、Chr18:69401033、Chr18:69400995、Chr18:69400992、Chr18:69400990和Chr18:69400981至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域16负链上的Chr18:69400933、Chr18:69400927、Chr18:69400915、Chr18:69400898、Chr18:69400895、Chr18:69400892、Chr18:69400880、Chr18:69400765、Chr18:69400761、Chr18:69400754和Chr18:69400752至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域17负链上的Chr18:69400723、Chr18:69400717、Chr18:69400714、Chr18:69400711、Chr18:69400676、Chr18:69400665、Chr18:69400658、Chr18:69400635和Chr18:69400632至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域18负链上的Chr18:69400559、Chr18:69400557、Chr18:69400546、Chr18:69400540、Chr18:69400486、Chr18:69400484和Chr18:69400480至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域19负链上的Chr18:69402897、Chr18:69402885、Chr18:69402810、Chr18:69402793、Chr18:69402756和Chr18:69402752至少一个位置上胞嘧啶的甲基化；
诊断或辅助诊断试剂用于检测DOK6基因上的区域20负链上的Chr18:69469985、Chr18:69469971、Chr18:69469963、Chr18:69469947和Chr18:69469888至少一个位置上胞嘧啶的甲基化。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂选自如下核酸组合中的至少一种：
用于检测区域1的核酸组合1、用于检测区域2的核酸组合2、用于检测区域3的核酸组合3、用于检测区域4的核酸组合4、用于检测区域5的核酸组合5、用于检测区域6的核酸组合6、用于检测区域7的核酸组合7、用于检测区域8的核酸组合8、用于检测区域9的核酸组合9、用于检测区域10的核酸组合10、用于检测区域11的核酸组合11、用于检测区域12的核酸组合12、用于检测区域13的核酸组合13、用于检测区域14的核酸组合14、用于检测区域15的核酸组合15、用于检测区域16的核酸组合16、用于检测区域17的核酸组合17、用于检测区域18的核酸组合18、用于检测区域19的核酸组合19和用于检测区域20的核酸组合20；
核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，核酸组合2的碱基序列如SEQ IDNO.4-6所示，核酸组合3的碱基序列如SEQ ID NO.7-9所示，核酸组合4的碱基序列如SEQ IDNO.10-12所示，核酸组合5的碱基序列如SEQ ID NO.13-15所示，核酸组合6的碱基序列如SEQ ID NO.16-18所示，核酸组合7的碱基序列如SEQ ID NO.19-21所示，核酸组合8的碱基序列如SEQ ID NO.22-24所示，核酸组合9的碱基序列如SEQ ID NO.25-27所示，核酸组合10的碱基序列如SEQ ID NO.28-30所示，核酸组合11的碱基序列如SEQ ID NO.31-33所示，核酸组合12的碱基序列如SEQ ID NO.34-36所示，核酸组合13的碱基序列如SEQ ID NO.37-39所示，核酸组合14的碱基序列如SEQ ID NO.40-42所示，核酸组合15的碱基序列如SEQ IDNO.43-45所示，核酸组合16的碱基序列如SEQ ID NO.46-48所示，核酸组合17的碱基序列如SEQ ID NO.49-51所示，核酸组合18的碱基序列如SEQ ID NO.52-54所示，核酸组合19的碱基序列如SEQ ID NO.55-57所示，核酸组合20的碱基序列如SEQ ID NO.58-60所示；
优选地，试剂选自如下核酸组合中的至少一种：
用于检测区域2的核酸组合2、用于检测区域4的核酸组合4、用于检测区域9的核酸组合9、用于检测区域13的核酸组合13、用于检测区域14的核酸组合14、用于检测区域18的核酸组合18和用于检测区域19的核酸组合19。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断产品选自如下产品中的至少一种：试剂盒、芯片和测序文库。需要说明的是，上述结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断产品可以是任意一种的体外诊断产品形式，并不限于上述的试剂盒、芯片和测序文库的产品类型，只要能满足结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的需求均在本发明的保护范围内。
本发明提供了一种检测DOK6基因CpG岛的甲基化水平的核酸组合，检测DOK6基因CpG岛的核酸组合选自如下核酸组合中的至少一种：核酸组合1、核酸组合2、核酸组合3、核酸组合4、核酸组合5、核酸组合6、核酸组合7、核酸组合8、核酸组合9、核酸组合10、核酸组合11、核酸组合12、核酸组合13、核酸组合14、核酸组合15、核酸组合16、核酸组合17、核酸组合18、核酸组合19和核酸组合20；
核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，核酸组合2的碱基序列如SEQ IDNO.4-6所示，核酸组合3的碱基序列如SEQ ID NO.7-9所示，核酸组合4的碱基序列如SEQ IDNO.10-12所示，核酸组合5的碱基序列如SEQ ID NO.13-15所示，核酸组合6的碱基序列如SEQ ID NO.16-18所示，核酸组合7的碱基序列如SEQ ID NO.19-21所示，核酸组合8的碱基序列如SEQ ID NO.22-24所示，核酸组合9的碱基序列如SEQ ID NO.25-27所示，核酸组合10的碱基序列如SEQ ID NO.28-30所示，核酸组合11的碱基序列如SEQ ID NO.31-33所示，核酸组合12的碱基序列如SEQ ID NO.34-36所示，核酸组合13的碱基序列如SEQ ID NO.37-39所示，核酸组合14的碱基序列如SEQ ID NO.40-42所示，核酸组合15的碱基序列如SEQ IDNO.43-45所示，核酸组合16的碱基序列如SEQ ID NO.46-48所示，核酸组合17的碱基序列如SEQ ID NO.49-51所示，核酸组合18的碱基序列如SEQ ID NO.52-54所示，核酸组合19的碱基序列如SEQ ID NO.55-57所示，核酸组合20的碱基序列如SEQ ID NO.58-60所示。
需要说明的是，若一种核酸组合与上述核酸组合(核酸组合1-20)所示的碱基序列具有至少具有85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等)以上的序列一致性，且该核酸组合同样具有一定的结直肠癌或癌前病变的诊断功能(特异性或灵敏度与本申请核酸组合1-20相比，相当或略有下降或略有提高或大幅提高等)，也在本发明的保护范围内。
需要说明的是，上述核酸组合1-20分别对应与区域1-20的检测。
本发明提供了一种结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂，其包括上述的检测DOK6基因CpG岛的甲基化水平的核酸组合。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测试剂为检测DOK6基因的CpG岛的甲基化状态的试剂，甲基化状态的检测手段包括如下至少一种的方法：甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法、荧光定量法和flap endonuclease法；
优选地，癌前病变为结直肠腺瘤，例如管状腺瘤、绒毛状腺瘤和绒毛管状腺瘤。在其他实施方式中，癌前病变还包括腺瘤病、炎症性肠病相关异型增生、传统锯齿状腺瘤和广基锯齿状腺瘤/息肉等。癌前病变包括不限于其他的肠道疾病。
本发明提供了一种结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其包括上述的检测DOK6基因CpG岛的甲基化水平的核酸组合或上述的结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的检测试剂。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒的检测样本为血液样本、粪便样本或组织样本。
在其他实施方式中，上述的检测试剂盒还包括PCR缓冲液，水，扩增酶等物质。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断试剂、检测试剂盒以及核酸组合物是以人DOK6基因CpG岛的甲基化作为标志物，本发明发现，DOK6基因CpG岛在结直肠癌/癌前病变样本中的甲基化水平显著高于正常样本。通过检测样本中DOK6基因的CpG岛的甲基化水平的增加可以对结直肠癌或癌前病变进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性。采用本发明提供的检测试剂和试剂盒能有效地提高结直肠癌/癌前病变的检出率，从而满足结直肠癌/癌前病变早筛早诊的临床需求。本发明提供的基因检测产品也可以为体检人群提供更好的肠道健康评估服务，实现对肠道病变的早发现、早诊断、早治疗，有利于节约家庭的医疗负担成本。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合1，核酸组合1包括SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合1可检测DOK6基因上Chr18:69400290-69400480(区域1)正链的甲基化；
区域1正链碱基序列(5’-3’)如下：
AATAACCACTCGGGTCGGTCGGTCTTCTCCACTCCTTCAGCAGAGGACGTCGGCGCCCGGCTGCCTCGCCCGCCTGCCTGTCTCTAGGCTGCGGGAGGATTAGACACATGCGCACGATTGGTCTCTTTGTGTGCACCAGGAAGGGTCTGGCGTCGATTTACACTTCCTAACGGGGCAGAGACCTGGAACG。
完全甲基化的区域1经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
AATTAATTATTCGGGTCGGTCGGTTTTTTTTATTTTTTTAGTAGAGGACGTCGGCGTTCGGTTGTTTCGTTCGTTTGTTTGTTTTTAGGTTGCGGGAGGATTAGATATATGCGTACGATTGGTTTTTTTGTGTGTATTAGGAAGGGTTTGGCGTCGATTTATATTTTTTAACGGGGTAGAGATTTGGAACG。
SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr18:69400301、Chr18:69400306、Chr18:69400310、Chr18:69400338、Chr18:69400341、Chr18:69400344、Chr18:69400348、Chr18:69400461和Chr18:69400479位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例2
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合2，核酸组合2包括SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合2可检测DOK6基因上Chr18:69400531-69400649(区域2)正链的甲基化；
区域2正链碱基序列(5’-3’)如下：
AAGTGTCTCGCTCCCGCTGGCCTTCCGCGTTGGAAGTGTCCCCACTGCCCTTTCCCCGCTGCACAGCTTGCGAGTGGAGATTTAGAGCCCGGGAATGAGGCGCCGTGTCCTTAGGAATC。
完全甲基化的区域2经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
AAGTGTTTCGTTTTCGTTGGTTTTTCGCGTTGGAAGTGTTTTTATTGTTTTTTTTTCGTTGTATAGTTTGCGAGTGGAGATTTAGAGTTCGGGAATGAGGCGTCGTGTTTTTAGGAATT。
SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr18:69400539、Chr18:69400545、Chr18:69400587、Chr18:69400601、Chr18:69400631和Chr18:69400634位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例3
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合3，核酸组合3包括SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合3可检测DOK6基因上Chr18:69400739-69400893(区域3)正链的甲基化；
区域3正链碱基序列(5’-3’)如下：
AGAGGGATGGAGCGCGTCTTGCGAGCGTCTCCGAGCCCAGCCACCCCACGGGCCAGGGGGAGGGAGCGGGGCCGGCGCATCAGCCCGCCCCCCCCGGCCCGCCCCCTCCCCCCGCGCCGGGGAGCCGCGGTGGTGCGCTCCGGCCAGCTGTGCGC。
完全甲基化的区域3经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
AGAGGGATGGAGCGCGTTTTGCGAGCGTTTTCGAGTTTAGTTATTTTACGGGTTAGGGGGAGGGAGCGGGGTCGGCGTATTAGTTCGTTTTTTTCGGTTCGTTTTTTTTTTTCGCGTCGGGGAGTCGCGGTGGTGCGTTTCGGTTAGTTGTGCGT。
SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr18:69400751、Chr18:69400753、Chr18:69400787、Chr18:69400874、Chr18:69400879和Chr18:69400891位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例4
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合4，核酸组合4包括SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合4可检测DOK6基因上Chr18:69400997-69401110(区域4)正链的甲基化；
区域4正链碱基序列(5’-3’)如下：
GGAGCGAAGGTGAGCGCCAGAACGCGGAGGGCTGGCGCGGCTCGCGGCGCCGGGCCCCGTTCCCCGTCCGCGGCGGCCCTGCAGGCGACCCCGCGTCCCCACCGGCGGGAGCTC。
完全甲基化的区域4经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
GGAGCGAAGGTGAGCGTTAGAACGCGGAGGGTTGGCGCGGTTCGCGGCGTCGGGTTTCGTTTTTCGTTCGCGGCGGTTTTGTAGGCGATTTCGCGTTTTTATCGGCGGGAGTTC。
SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr18:69401001、Chr18:69401011、Chr18:69401047、Chr18:69401054、Chr18:69401061、Chr18:69401099、Chr18:69401102和Chr18:69401110位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例5
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合5，核酸组合5包括SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合5可检测DOK6基因上Chr18:69401156-69401286(区域5)正链的甲基化；
区域5正链碱基序列如下(5’-3’)：
ATGCGAGACCCGCGCAGACCCGGCGGCGGACGGCGGCTCTCGACTCCGGAGAGCGGATCGCGGGGCGCAGGAGCCCGATCGCGCTGGCCATGGCCTCCAACTTTAACGACATAGTCAAGCAGGGCTACGTG。
完全甲基化的区域5经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
ATGCGAGACCCGCGCAGACCCGGCGGCGGACGGCGGCTCTCGACTCCGGAGAGCGGATCGCGGGGCGCAGGAGCCCGATCGCGCTGGCCATGGCCTCCAACTTTAACGACATAGTCAAGCAGGGCTACGTG。
SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr18:69401159、Chr18:69401166、Chr18:69401168、Chr18:69401176、Chr18:69401196、Chr18:69401202、Chr18:69401209、Chr18:69401262和Chr18:69401283位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例6
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合6，核酸组合6包括SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合6可检测DOK6基因上Chr18:69401302-69401453(区域6)负链的甲基化；
区域6正链碱基序列如下(5’-3’)：
AAGCTTGGGGTGAGTGGCTCGCTCGGCTTGCTCCTTCCCCGGCGCTCGTTCGGCCCGGCTGGCTGCCTGGGGGGGGGGCAGGGAGAGGTGACCCGTGCGGGTACAGGGCAGAGAGGGACCCGGCCCTTAGGCGGATGGCCCGCTTGTTGCTT。
完全甲基化的区域6经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
AAGTTTGGGGTGAGTGGTTCGTTCGGTTTGTTTTTTTTTCGGCGTTCGTTCGGTTCGGTTGGTTGTTTGGGGGGGGGGTAGGGAGAGGTGATTCGTGCGGGTATAGGGTAGAGAGGGATTCGGTTTTTAGGCGGATGGTTCGTTTGTTGTTT。
SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr18:69401321、Chr18:69401341、Chr18:69401344、Chr18:69401348、Chr18:69401352、Chr18:69401357、Chr18:69401433和Chr18:69401442位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例7
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合7，核酸组合7包括SEQ ID NO.19-21所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合7可检测DOK6基因上Chr18:69401500-69401649(区域7)正链的甲基化；
区域7正链碱基序列如下(5’-3’)：
ATTTGGGGATTTTAGGAGCGCCTGAGTCCCCATCCTCGAGTGCACCGGGCTGTCTTCGACCGTGCGGGGAAGTCAGTAGACGAAAGGGGTTGTCAGTTCCAACGAGGAACGTGCCTTGGAGGAGGTTTCTTTGCGGTGCTATCCACGATGGTC。
完全甲基化的区域7经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
ATTTGGGGATTTTAGGAGCGTTTGAGTTTTTATTTTCGAGTGTATCGGGTTGTTTTCGATCGTGCGGGGAAGTTAGTAGACGAAAGGGGTTGTTAGTTTTAACGAGGAACGTGTTTTGGAGGAGGTTTTTTTGCGGTGTTATTTACGATGGTT。
SEQ ID NO.19-21所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr18:69401518、Chr18:69401545、Chr18:69401556、Chr18:69401560、Chr18:69401633和Chr18:69401645位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例8
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合8，核酸组合8包括SEQ ID NO.22-24所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合8可检测DOK6基因上Chr18:69401777-69401902(区域8)正链的甲基化；
区域8正链碱基序列如下(5’-3’)：
CAGCGCCGCGCGTCCCTGCCGGCTGTAGTTTAGGGCGCCTTCGCCGTGGCCGAGGGCGGCTCCCGCGCCCCGCAAGTGCTCCCCTACCCGGGGACCCGCGCCCGCGTGCAGGCAGGTGTGTGCCCC。
完全甲基化的区域8经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
TAGCGTCGCGCGTTTTTGTCGGTTGTAGTTTAGGGCGTTTTCGTCGTGGTCGAGGGCGGTTTTCGCGTTTCGTAAGTGTTTTTTTATTCGGGGATTCGCGTTCGCGTGTAGGTAGGTGTGTGTTTC。
SEQ ID NO.22-24所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr18:69401780、Chr18:69401783、Chr18:69401785、Chr18:69401787、Chr18:69401796、Chr18:69401818、Chr18:69401821、Chr18:69401827、Chr18:69401833和Chr18:69401902位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例9本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合9，核酸组合13包括SEQ ID NO.25-27所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合9可检测DOK6基因上Chr18:69402740-69402896(区域9)正链的甲基化；
区域9正链碱基序列如下(5’-3’)：
CCTGGAGCCAACGTGCGCTGCCGTGAGCCCCACCAAGGCGAGAGAGAGCAGGCGCCAGAGTCAGATCCTCGGCCAGGTTTCAAGGGCTTTTCTTGGGTAGAAGAAAGCGCCTCATTCTTTTCCAGGCATATAAGGACGAACCCACGGGAAAAGCTGC。
完全甲基化的区域9经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
TTTGGAGTTAACGTGCGTTGTCGTGAGTTTTATTAAGGCGAGAGAGAGTAGGCGTTAGAGTTAGATTTTCGGTTAGGTTTTAAGGGTTTTTTTTGGGTAGAAGAAAGCGTTTTATTTTTTTTTAGGTATATAAGGACGAATTTACGGGAAAAGTTGC。
SEQ ID NO.25-27所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr18:69402751、Chr18:69402755、Chr18:69402761、Chr18:69402778、Chr18:69402792、Chr18:69402876、Chr18:69402884和Chr18:69402896位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例10
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合10，核酸组合10包括SEQ ID NO.28-30所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合10可检测DOK6基因上Chr18:69469693-69469908(区域10)正链的甲基化；
区域10正链碱基序列如下(5’-3’)：
TGGGGATGCCGTGAACTTCGTGGCCAAGAACATGAGAGGGCAGGACACGAGAGGCCAGGACGCCATCGGCGAGGTTGGACAGGAGCCAGAGGCGGATGGAGCGCGGCAGAGGCGCCCCCACTGTCTCCCGTGCCACTGGCTCCTGCAGCTGCCCCTTTAAGGACTGTTTGTGCCGACCCTTCCCCAGGAAGTGACGGCATCTGCTTCTGGGTCGCT。
完全甲基化的区域10经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
TGGGGATGTCGTGAATTTCGTGGTTAAGAATATGAGAGGGTAGGATACGAGAGGTTAGGACGTTATCGGCGAGGTTGGATAGGAGTTAGAGGCGGATGGAGCGCGGTAGAGGCGTTTTTATTGTTTTTCGTGTTATTGGTTTTTGTAGTTGTTTTTTTAAGGATTGTTTGTGTCGATTTTTTTTTAGGAAGTGACGGTATTTGTTTTTGGGTCGTT。
SEQ ID NO.28-30所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr18:69469702、Chr18:69469711、Chr18:69469740、Chr18:69469887和Chr18:69469905位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例11
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合11，核酸组合11包括SEQ ID NO.31-33所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合11可检测DOK6基因上Chr18:69401868-69401735(区域11)负链的甲基化；
区域11负链碱基序列如下(5’-3’)：
CCCGGGTAGGGGAGCACTTGCGGGGCGCGGGAGCCGCCCTCGGCCACGGCGAAGGCGCCCTAAACTACAGCCGGCAGGGACGCGCGGCGCTGGGAGGGCATCAGACGGGAATTTCGAATTGAGCTTGGGAAGCG。
完全甲基化的区域11经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
TTCGGGTAGGGGAGTATTTGCGGGGCGCGGGAGTCGTTTTCGGTTACGGCGAAGGCGTTTTAAATTATAGTCGGTAGGGACGCGCGGCGTTGGGAGGGTATTAGACGGGAATTTCGAATTGAGTTTGGGAAGCG。
SEQ ID NO.31-33所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr18:69401866、Chr18:69401848、Chr18:69401828、Chr18:69401822、Chr18:69401819、Chr18:69401813、Chr18:69401754和Chr18:69401736位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例12
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合12，核酸组合12包括SEQ ID NO.34-36所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合12可检测DOK6基因上Chr18:69401755-69401590(区域12)负链的甲基化；
区域12负链碱基序列如下(5’-3’)：
TCGAATTGAGCTTGGGAAGCGGAGACCAGAAAATGGTGATTCTAAACACACGCGAGCGTCGCCACACACAGCAGTTCCACCCGAAAGGCGCACACTTTTGAGAACAGACCATCGTGGATAGCACCGCAAAGAAACCTCCTCCAAGGCACGTTCCTCGTTGGAACTG。
完全甲基化的区域12经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
TCGAATTGAGTTTGGGAAGCGGAGATTAGAAAATGGTGATTTTAAATATACGCGAGCGTCGTTATATATAGTAGTTTTATTCGAAAGGCGTATATTTTTGAGAATAGATTATCGTGGATAGTATCGTAAAGAAATTTTTTTTAAGGTACGTTTTTCGTTGGAATTG。
SEQ ID NO.34-36所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr18:69401754、Chr18:69401736、Chr18:69401705、Chr18:69401703、Chr18:69401699、Chr18:69401607和Chr18:69401600位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例13
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合13，核酸组合13包括SEQ ID NO.37-39所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合13可检测DOK6基因上Chr18:69401564-69401424(区域13)负链的甲基化；
区域13负链碱基序列如下(5’-3’)：
CCCGCACGGTCGAAGACAGCCCGGTGCACTCGAGGATGGGGACTCAGGCGCTCCTGGAGTCCCCAGGTCCGTCTGCGGAGCCCCCCGGCAGGTGTGGGCCCCCACCTGGCCAAGCAACAAGCGGGCCATCCGCCTAAGGGC。
完全甲基化的区域13经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
TTCGTACGGTCGAAGATAGTTCGGTGTATTCGAGGATGGGGATTTAGGCGTTTTTGGAGTTTTTAGGTTCGTTTGCGGAGTTTTTCGGTAGGTGTGGGTTTTTATTTGGTTAAGTAATAAGCGGGTTATTCGTTTAAGGGT。
SEQ ID NO.37-39所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr18:6940562、Chr18:6940558、Chr18:6940554、Chr18:6940543、Chr18:6940534、Chr18:6940516、Chr18:6940443和Chr18:6940434位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例14
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合14，核酸组合14包括SEQ ID NO.40-42所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合14可检测DOK6基因上Chr18:69401261-69401139(区域14)负链的甲基化；
区域14负链碱基序列如下(5’-3’)：
TTAAAGTTGGAGGCCATGGCCAGCGCGATCGGGCTCCTGCGCCCCGCGATCCGCTCTCCGGAGTCGAGAGCCGCCGTCCGCCGCCGGGTCTGCGCGGGTCTCGCATCCAGCCGGCCGCCGCCA。
完全甲基化的区域14经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
TTAAAGTTGGAGGTTATGGTTAGCGCGATCGGGTTTTTGCGTTTCGCGATTCGTTTTTCGGAGTCGAGAGTCGTCGTTCGTCGTCGGGTTTGCGCGGGTTTCGTATTTAGTCGGTCGTCGTTA。
SEQ ID NO.40-42所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr18:69401238、Chr18:69401222、Chr18:69401217、Chr18:69401215、Chr18:69401210、Chr18:69401160、Chr18:69401150、Chr18:69401146和Chr18:69401143位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例15
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合15，核酸组合15包括SEQ ID NO.43-45所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合15可检测DOK6基因上Chr18:69401085-69400981(区域15)负链的甲基化；
区域15负链碱基序列如下(5’-3’)：
GTCGCCTGCAGGGCCGCCGCGGACGGGGAACGGGGCCCGGCGCCGCGAGCCGCGCCAGCCCTCCGCGTTCTGGCGCTCACCTTCGCTCCCCGCCGCGAGCCCAGC。
完全甲基化的区域15经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
GTCGTTTGTAGGGTCGTCGCGGACGGGGAACGGGGTTCGGCGTCGCGAGTCGCGTTAGTTTTTCGCGTTTTGGCGTTTATTTTCGTTTTTCGTCGCGAGTTTAGC。
SEQ ID NO.43-45所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr18:69401083、Chr18:69401071、Chr18:69401068、Chr18:69401042、Chr18:69401040、Chr18:69401035、Chr18:69401033、Chr18:69400995、Chr18:69400992、Chr18:69400990和Chr18:69400981位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例16
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合16，核酸组合16包括SEQ ID NO.46-48所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合16可检测DOK6基因上Chr18:69400934-69400749(区域16)负链的甲基化；
区域16负链碱基序列如下(5’-3’)：
CCGCCCCCGGCAGCACCCACGGGCTGGCGCCTCGCTCGGCGGCGCACAGCTGGCCGGAGCGCACCACCGCGGCTCCCCGGCGCGGGGGGAGGGGGCGGGCCGGGGGGGGCGGGCTGATGCGCCGGCCCCGCTCCCTCCCCCTGGCCCGTGGGGTGGCTGGGCTCGGAGACGCTCGCAAGACGCGCT。
完全甲基化的区域16经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
TCGTTTTCGGTAGTATTTACGGGTTGGCGTTTCGTTCGGCGGCGTATAGTTGGTCGGAGCGTATTATCGCGGTTTTTCGGCGCGGGGGGAGGGGGCGGGTCGGGGGGGGCGGGTTGATGCGTCGGTTTCGTTTTTTTTTTTTGGTTCGTGGGGTGGTTGGGTTCGGAGACGTTCGTAAGACGCGTT。
SEQ ID NO.46-48所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr18:69400933、Chr18:69400927、Chr18:69400915、Chr18:69400898、Chr18:69400895、Chr18:69400892、Chr18:69400880、Chr18:69400765、Chr18:69400761、Chr18:69400754和Chr18:69400752位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例17
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合17，核酸组合17包括SEQ ID NO.49-51所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合17可检测DOK6基因上Chr18:69400729-69400630(区域17)负链的甲基化；
区域17负链碱基序列如下(5’-3’)：
TGGGAGCGCCTCCGCCGCCGGGCGCCCCGAGGCCCGCTCCCCACCCGGCTCCCCGGTCCCTCAGCGCTCCCCGGGCGCGAGATTCCTAAGGACACGGCGC。
完全甲基化的区域17经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
TGGGAGCGTTTTCGTCGTCGGGCGTTTCGAGGTTCGTTTTTTATTCGGTTTTTCGGTTTTTTAGCGTTTTTCGGGCGCGAGATTTTTAAGGATACGGCGT。
SEQ ID NO.49-51所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr18:69400723、Chr18:69400717、Chr18:69400714、Chr18:69400711、Chr18:69400676、Chr18:69400665、Chr18:69400658、Chr18:69400635和Chr18:69400632位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例18
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合18，核酸组合18包括SEQ ID NO.52-54所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合18可检测DOK6基因上Chr18:69400577-69400468(区域18)负链的甲基化；
区域18负链碱基序列如下(5’-3’)：
CAGTGGGGACACTTCCAACGCGGAAGGCCAGCGGGAGCGAGACACTTATTTCATTGGCCTTGTTTACAGTACATTTTTATTCCCAAGCACTCGCGGCCGTTCCAGGTCTC。
完全甲基化的区域18经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
TAGTGGGGATATTTTTAACGCGGAAGGTTAGCGGGAGCGAGATATTTATTTTATTGGTTTTGTTTATAGTATATTTTTATTTTTAAGTATTCGCGGTCGTTTTAGGTTTT。
SEQ ID NO.52-54所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr18:69400559、Chr18:69400557、Chr18:69400546、Chr18:69400540、Chr18:69400486、Chr18:69400484和Chr18:69400480位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例19
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合19，核酸组合19包括SEQ ID NO.55-57所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合19可检测DOK6基因上Chr18:69402905-69402736(区域19)负链的甲基化；
区域19负链碱基序列如下(5’-3’)：
TGGAGAACCGCAGCTTTTCCCGTGGGTTCGTCCTTATATGCCTGGAAAAGAATGAGGCGCTTTCTTCTACCCAAGAAAAGCCCTTGAAACCTGGCCGAGGATCTGACTCTGGCGCCTGCTCTCTCTCGCCTTGGTGGGGCTCACGGCAGCGCACGTTGGCTCCAGGCTGG。
完全甲基化的区域19经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
TGGAGAATCGTAGTTTTTTTCGTGGGTTCGTTTTTATATGTTTGGAAAAGAATGAGGCGTTTTTTTTTATTTAAGAAAAGTTTTTGAAATTTGGTCGAGGATTTGATTTTGGCGTTTGTTTTTTTTCGTTTTGGTGGGGTTTACGGTAGCGTACGTTGGTTTTAGGTTGG。
SEQ ID NO.55-57所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr18:69402897、Chr18:69402885、Chr18:69402810、Chr18:69402793、Chr18:69402756和Chr18:69402752位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例20
本实施例提供用于结直肠癌或腺瘤的诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合20，核酸组合20包括SEQ ID NO.58-60所示的核苷酸，具体序列表1。该核苷酸组合20可检测DOK6基因上Chr18:69469992-69469868(区域20)负链的甲基化；
区域20负链碱基序列如下(5’-3’)：
TACCCAGCGGGTAGGGGAGATCGGACACTCGGTTCAAGTAGGCCACGATGAGATAAGGTTGGAGCCCAGGCTGAAGAGCACCCGAGCGACCCAGAAGCAGATGCCGTCACTTCCTGGGGAAGGGT。
完全甲基化的区域20经亚硫酸氢盐转化后的序列为(5’-3’)：
TATTTAGCGGGTAGGGGAGATCGGATATTCGGTTTAAGTAGGTTACGATGAGATAAGGTTGGAGTTTAGGTTGAAGAGTATTCGAGCGATTTAGAAGTAGATGTCGTTATTTTTTGGGGAAGGGT。
SEQ ID NO.58-60所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr18:69469985、Chr18:69469971、Chr18:69469963、Chr18:69469947和Chr18:69469888位置上胞嘧啶的甲基化。
表1各核酸组合的序列表。
Figure BDA0003139847450000111
/>
Figure BDA0003139847450000121
实施例21
本实施例提供使用实施例1-20任意一种试剂盒进行结直肠癌或腺瘤癌诊断的方法，其包括如下步骤：
1、DNA模板的提取：
结直肠癌患者粪便、结直肠腺瘤患者粪便和正常人粪便均由武汉大学中南医院收集，患者均签署知情同意书，对每份样本进行匿名化处理。当所用样本是粪便样本时，采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20200225号)提取粪便中的人源DOK6基因，该试剂盒采用捕获探针对粪便中的目的片段进行捕获，捕获探针上标记有生物素，正链区域和负链区域分开进行捕获提取，即提取正链基因组时加入正链捕获探针，提取负链区域时加入负链捕获探针。正链和负链的捕获探针序列参见表2，提取时用表2中的捕获探针替换试剂盒中原有的捕获探针，具体操作步骤参见试剂盒说明书。
表2探针序列表。
Figure BDA0003139847450000131
所用样本是血液样本，采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作参见试剂盒说明书。
2、亚硫酸盐的转化
将上述步骤1提取好的基因组进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20500843)，具体实验操作参见试剂盒说明书。
3、甲基化特异性PCR反应
将亚硫酸氢盐转化后的DNA进行甲基化特异性PCR反应以检测DOK6基因区域1-20的甲基化状态，每个区域单独进行检测，即一个PCR管中每次只加入一个区域的检测引物和探针，同时加入内参基因的检测探针。以ACTB作为内参基因，PCR反应体系如表3所示。ACTB作为内参基因，其中ACTB上游引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.75)；ACTB下游引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.76)；ACTB探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQID NO.77)。
检测目标区域的探针5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，ACTB探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。
表3 PCR反应体系。
Figure BDA0003139847450000132
Figure BDA0003139847450000141
如表3所示，在检测DOK6区域1-区域20任一区域在样本中的甲基化水平时，只需将某一区域对应的引物探针、ACTB引物探针、缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和样本DNA等按照表中的体积加入到反应体系中，其中缓冲液、dNTP和DNA聚合酶为常规市售商品。
对于粪便样本，检测区域1-10时，加入的待测样本DNA是前述捕获提取到的正链DNA经亚硫酸氢盐转化而成，检测区域11-20时，加入的待检样本DNA是前述捕获提取到的负链DNA经亚硫酸氢转化而成；对于血液样本，检测区域1-20时，加入的待检样本DNA是提取到的cfDNA经转化而成。
PCR反应条件如下表4所示。
表4 PCR反应条件。
Figure BDA0003139847450000142
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
质量控制：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测。
阴性对照为纯化水。
阳性对照的制备方法为：将ACTB的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒。将完全甲基化的区域1-20对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列进行人工合成，并克隆至人工合成质粒。区域1-20的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域1-20的人工合成质粒1：1混合而成，如区域1的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域1的人工合成质粒1：1混合而成。
阴性对照要无扩增，阳性对照Ct值应在26-30之间，待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
结果分析和判读方法：若某一检测区域在样本上的Ct值≤38.5，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阳性，若某一检测区域在样本上的Ct值>38.5，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性。将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲基化检测的敏感性和特异性。敏感性为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
实施例22
本实施例提供了一种结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断试剂，其包括用于检测区域3的核酸组合3(同实施例3)和用于检测区域4的核酸组合4(同实施例4)。
实施例23
本实施例提供了一种结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断试剂，其包括用于检测区域9的核酸组合9(同实施例9)、用于检测区域14的核酸组合14(同实施例14)。
实施例24
本实施例提供了一种结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断试剂，其包括用于检测区域13的核酸组合13(同实施例13)、用于检测区域18的核酸组合18(同实施例18)和用于检测区域19的核酸组合19(同实施例19)。
实验例1
于武汉大学中南医院收集经肠镜和组织活检确诊为结直肠癌患者、腺瘤患者和健康人的粪便样本，每人收集一份粪便，收集装置为武汉艾米森粪便标本采集保存管(鄂汉械备20191654号)，共收集到结直肠癌粪便样本78例、结直肠腺瘤样本104例、正常的粪便样本127例。按照实施例21提供的方法进行DNA提取提取和亚硫酸氢盐转化、选用实施例1-20中的针对DOK6基于20个区域的特异性引物和探针组合进行PCR检测，PCR检测结果如表5所示。
表5区域1-20在粪便样本中的检测灵敏度和特异性
Figure BDA0003139847450000151
由表5可以看出，在粪便样本中，区域1-20均能对结直肠腺瘤样本、结直肠癌症样本和正常样本实现较好区分，但各个区域的检测效果略有不同，整体来看，区域1-20对结直肠腺瘤的检测灵敏性均大于40％，对结直肠癌样本的检测灵敏性均大于80％，特异性均大于80％。区域2、区域4、区域9、区域13、区域14、区域18和区域19的检测灵敏度和特异性均显著优于其他区域，在粪便样本中，检测这几个区域的甲基化水平的增加对结直肠腺瘤的检测灵敏度均超过60％，对结直肠癌的检测灵敏度均超过90％，特异性均大于90％。
实验例2
于武汉大学中南医院收集经肠镜和组织活检确诊为结直肠癌患者、腺瘤患者和健康人的血浆样本，每人收集5mL，共收集到结直肠癌血浆样本108例、结直肠腺瘤血浆样本130例、正常的血浆样本90例。按照实施例10提供的方法进行血浆DNA提取和重亚硫酸盐转化、选用实施例1-9中的针对DOK6基于20个区域的特异性引物和探针组合进行PCR检测，PCR检测结果如表6所示。
表6区域1-20在血浆样本中的检测灵敏度和特异性。
Figure BDA0003139847450000161
由表6可以看出，在血浆样本中的检测结果与粪便检测的结果一致。区域1-20均能对结直肠腺瘤样本、结直肠癌症样本和正常样本实现较好区分，但各个区域的检测效果略有不同，整体来看，区域1-20对结直肠腺瘤的检测灵敏性均大于45％，对结直肠癌样本的检测灵敏性均大于80％，特异性均大于80％。区域2、区域4、区域9、区域13、区域14、区域18和区域9的检测灵敏度和特异性均显著优于其他区域，在血浆样本中，检测这几个区域的甲基化水平的增加对结直肠腺瘤的检测灵敏度均超过60％，对结直肠癌的检测灵敏度均超过90％，特异性均大于90％。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 一种结直肠癌或癌前病变的诊断或辅助诊断试剂、核酸组合、试剂盒及应用
<160> 77
<170> PatentIn version 3.5
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tcgcgagtcg cgttagtttt tc 22
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tcgttttcgg tagtatttac gggtt 25
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aacgcgtctt acgaacgtct cc 22
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ttcggcggcg tatagttggt c 21
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tgggagcgtt ttcgtcgtc 19
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acgccgtatc cttaaaaatc tcg 23
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tcggtttttt agcgtttttc gg 22
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tagtggggat atttttaacg cg 22
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aaaacctaaa acgaccgcga 20
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aaggttagcg ggagcgagat attta 25
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tggagaatcg tagttttttt cgtgg 25
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ccaacctaaa accaacgtac gct 23
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atttggtcga ggatttgatt ttggc 25
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tatttagcgg gtaggggaga tc 22
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acccttcccc aaaaaataac ga 22
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ttcggtttaa gtaggttacg atgag 25
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ttgagaacag accatcgtgg atagcaccgc 30
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aaggagcaag ccgagcgagc cactcacccc aa 32
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ttctggcgct caccttcgct ccccgcc 27
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agacgctcgc aagacgcgct ccatccctct c 31
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acccaagaaa agcccttgaa acctggccga 30
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ggagtggttt ttgggtttg 19

Claims (8)

1.一种试剂在制备结直肠癌或结直肠腺瘤的诊断或辅助诊断产品中的应用，其特征在于，所述试剂为用于检测DOK6基因上的靶区域内至少包含一个CpG位点的甲基化水平的试剂，所述靶区域选自DOK6基因的区域1、区域2、区域3、区域4、区域5、区域14、区域15、区域16、区域17和区域18中的至少一个区域,以GRCh38.p13为参考，所述区域1选自Chr18：69400290-69400480正链，所述区域2选自Chr18：69400531-69400649正链，所述区域3选自正链Chr18：69400739-69400839，所述区域4选自Chr18:69400997-69401110正链，所述区域5选自Chr18:69401156-69401286正链，所述区域14选自Chr18:69401261-69401139负链，所述区域15选自Chr18:69401085-69400981负链，所述区域16选自Chr18:69400934-69400749负链，所述区域17选自Chr18:69400729-69400630负链，所述区域18选自Chr18: 69400577-69400468负链；用于检测所述区域1的核酸组合1、用于检测所述区域2的核酸组合2、用于检测所述区域3的核酸组合3、用于检测所述区域4的核酸组合4、用于检测所述区域5的核酸组合5、用于检测所述区域14的核酸组合14、用于检测所述区域15的核酸组合15、用于检测所述区域16的核酸组合16、用于检测所述区域17的核酸组合17、用于检测所述区域18的核酸组合18；
所述核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，所述核酸组合2的碱基序列如SEQID NO.4-6所示，所述核酸组合3的碱基序列如SEQ ID NO.7-9所示，所述核酸组合4的碱基序列如SEQ ID NO.10-12所示，所述核酸组合5的碱基序列如SEQ ID NO.13-15所示，所述核酸组合14的碱基序列如SEQ ID NO.40-42所示，所述核酸组合15的碱基序列如SEQ IDNO.43-45所示，所述核酸组合16的碱基序列如SEQ ID NO.46-48所示，所述核酸组合17的碱基序列如SEQ ID NO.49-51所示，所述核酸组合18的碱基序列如SEQ ID NO.52-54所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶区域选自如下至少一种区域：区域2、区域4、区域14、区域18；
所述区域2选自Chr18:69400531-69400649正链，所述区域4选自Chr18:69400997-69401110正链，所述区域14选自Chr18:69401261-69401139负链，所述区域18选自Chr18:69400577-69400468负链。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂选自如下核酸组合中的至少一种：
用于检测所述区域2的核酸组合2、用于检测所述区域4的核酸组合4、用于检测所述区域14的核酸组合14、用于检测所述区域18的核酸组合18。
4.一种检测DOK6基因CpG岛的甲基化水平的核酸组合，其特征在于，所述检测DOK6基因CpG岛的核酸组合选自如下核酸组合中的至少一种：核酸组合1、核酸组合2、核酸组合3、核酸组合4、核酸组合5、核酸组合14、核酸组合15、核酸组合16、核酸组合17、核酸组合18；
所述核酸组合1的碱基序列如SEQ ID NO.1-3所示，所述核酸组合2的碱基序列如SEQID NO.4-6所示，所述核酸组合3的碱基序列如SEQ ID NO.7-9所示，所述核酸组合4的碱基序列如SEQ ID NO.10-12所示，所述核酸组合5的碱基序列如SEQ ID NO.13-15所示，所述核酸组合14的碱基序列如SEQ ID NO.40-42所示，所述核酸组合15的碱基序列如SEQ IDNO.43-45所示，所述核酸组合16的碱基序列如SEQ ID NO.46-48所示，所述核酸组合17的碱基序列如SEQ ID NO.49-51所示，所述核酸组合18的碱基序列如SEQ ID NO.52-54所示。
5.一种结直肠癌或结直肠腺瘤的诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，其包括权利要求4所述的检测DOK6基因CpG岛的甲基化水平的核酸组合。
6. 根据权利要求5所述的结直肠癌或结直肠腺瘤的诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂为检测DOK6基因的CpG岛的甲基化状态的试剂，所述甲基化状态的检测手段包括如下至少一种的方法：甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法、荧光定量法和flapendonuclease 法。
7.一种结直肠癌或结直肠腺瘤的诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求4所述的检测DOK6基因CpG岛的甲基化水平的核酸组合或权利要求5-6任一项所述的结直肠癌或结直肠腺瘤的诊断或辅助诊断的检测试剂。
8.根据权利要求7所述的结直肠癌或结直肠腺瘤的诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为血液样本、粪便样本或组织样本。
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