CN117448450A - 用于结直肠癌筛查的标志物、探针组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于结直肠癌筛查的标志物、探针组合物及其应用，所述标志物选自44个标志物中的任一种。本申请使用所述的标志物，能够灵敏和特异地检测该基因的甲基化的状态，从而可以用于对外周血游离DNA的检测，并且，本申请所述的组合物以非侵入性的方式用于无症状人群的筛查，降低了侵入性检测造成的危害，所述的组合物具有更高的灵敏度和准确度，能够实现实时监测。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于结直肠癌筛查的标志物、探针组合物及其应用。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率均呈上升趋势，由2016年的40.1万宗确诊病例增加至2020年的45.6万宗确诊病例，复合年增长率为3.3％。预计结直肠癌的发病数将于2022年达到48.4万宗确诊病例。2020年，结直肠癌的发病数于中国在所有癌症中排名第二，同年中国结直肠癌的死亡人数达到28.6万例。根据疾病的发展阶段，结直肠癌被分为I-IV期。对于IV期结直肠癌患者，总体生存率非常低，5年生存率不足10％。而I期的患者能达到90％以上的生存率。因此，为了改善肠癌的整体预后，早期诊治显得至关重要。现阶段，中国的大肠癌筛查技术主要包括粪便隐血试验、肿瘤标记物检测和肠镜检查。目前结肠镜仍然是确诊肠癌的根本方法，但其高昂的费用、较差的可依从性以及可能的致伤性使得结肠镜难以大规模应用于无症状人群的筛查。粪便隐血试验(FOBT)和外周血癌胚抗原(CEA)虽然易被接受，但其较差的灵敏度和特异度也给肠癌早期诊治带来了挑战。
发明内容
本申请的目的在于提供了一种检测结直肠癌的标志物以及探针组合物，可以用于结直肠癌的筛查，所述的标志物以非侵入性的方式用于无症状人群的筛查，以及癌症患者的预后检测，降低了侵入性检测造成的危害，并且具有更高的灵敏度和准确性。
本申请具体技术方案如下：
1.一种用于检测结直肠癌的标志物，其特征在于，所述标志物对应的基因选自下述中的一种：ANKRD20A12P、C1orf127、HSPA7、ADRA2A、MTRNR2L8、MUS81、RIMBP2、WNK1、EDDM3A、TBPL2、ARNT2、MIR1282、FZD2、LOC339166、ANKRD62、ISOC2、LENG9、ABCG8、CDRT15P3、CDRT15P3、LAPTM4A、ADAMTS5、MIR3648、RFPL2、ANKRD18DP、FAM86HP、DUX4L8、KIAA0825、PCBD2、PCDHB3、PCDHGA1、PSORS1C2、LINC02902、LUARIS、ATAD2、NAT1、CACNA1B和UCK1。
2.根据项1所述的标志物，其特征在于，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ IDNO:1-44所示的一种，优选所述标志物为甲基化后的标志物。
3.一种探针组合物，其特征在于，所述探针组合物包含靶向项1或2所述标志物甲基化的探针。
4.根据项3所述的探针组合物，其特征在于，所述探针组合物包含高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，所述第一探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的高甲基化的区域杂交，所述第二探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的低甲基化的区域杂交；
优选地，所述第一探针组合物包括n个探针，所述n个探针与经重亚硫酸盐转化的高甲基化的区域的正义链和/或反义链的每个核苷酸杂交；
优选地，所述第二探针组合物包括m个探针，所述m个探针与经重亚硫酸盐转化的低甲基化的区域的正义链和/或反义链的每个核苷酸杂交；
优选地，n和m均是1-10中的任意整数；
优选地，第n-1个探针和第n个探针之间有x1个核苷酸重叠，优选地，x1为0-100中的任意整数；
优选地，第m-1个探针和第m个探针之间有x2个核苷酸重叠，优选地，x2为0-100中的任意整数；
进一步优选地，所述第一探针组合物包括如SEQ ID NO:45-132中的一种或两种，所述第二探针组合物包括如SEQ ID NO:133-220中的一种或两种。
5.标志物在制备用于检测结直肠癌的试剂盒中的用途，其特征在于，所述标志物对应的基因选自下述中的一种：ANKRD20A12P、C1orf127、HSPA7、ADRA2A、MTRNR2L8、MUS81、RIMBP2、WNK1、EDDM3A、TBPL2、ARNT2、MIR1282、FZD2、LOC339166、ANKRD62、ISOC2、LENG9、ABCG8、CDRT15P3、CDRT15P3、LAPTM4A、ADAMTS5、MIR3648、RFPL2、ANKRD18DP、FAM86HP、DUX4L8、KIAA0825、PCBD2、PCDHB3、PCDHGA1、PSORS1C2、LINC02902、LUARIS、ATAD2、NAT1、CACNA1B和UCK1。
6.根据项5所述的用途，其特征在于，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:1-44所示的一种，优选所述标志物为甲基化后的标志物；
优选地，所述探针组合物用于靶向结直肠癌的甲基化后的标志物；
优选地，所述探针组合物为项3或4所述的探针组合物。
7.一种用于结直肠癌检测的组合物，其特征在于，所述组合物包括用于检测选自下述标志物对应的基因中的任一种甲基化的核酸：ANKRD20A12P、C1orf127、HSPA7、ADRA2A、MTRNR2L8、MUS81、RIMBP2、WNK1、EDDM3A、TBPL2、ARNT2、MIR1282、FZD2、LOC339166、ANKRD62、ISOC2、LENG9、ABCG8、CDRT15P3、CDRT15P3、LAPTM4A、ADAMTS5、MIR3648、RFPL2、ANKRD18DP、FAM86HP、DUX4L8、KIAA0825、PCBD2、PCDHB3、PCDHGA1、PSORS1C2、LINC02902、LUARIS、ATAD2、NAT1、CACNA1B和UCK1。
8.根据项7所述的组合物，其特征在于，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ IDNO:1-44所示的一种。
9.根据项7或8所述的组合物，其特征在于，所述核酸包括项3或4所述的探针组合物；
优选地，所述核酸包括：
引物，所述引物为所述标志物的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列；
优选地，所述核酸还包括：
探针，所述探针为在中等严紧或严紧条件下与所述标志物的靶序列中的至少15个核苷酸片段杂交，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列；
优选地，所述组合物还包括将标志物的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂；
优选地，所述用于检测标志物的靶序列甲基化的核酸还包括：
优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
10.一种试剂盒，其特征在于，其包含用于检测项1或2所述的标志物的试剂或者项3或4所述的探针组合物或者项7-9中任一项所述的组合物。
11.一种芯片，其特征在于，其包含项1或2所述的标志物或者项3或4所述的探针组合物或者项7或8所述的组合物。
发明的效果
本申请的发明人利用表观基因组和生物信息学技术，通过分析结直肠癌的基因组甲基化数据，寻找到了多个与结直肠癌相关的甲基化基因，并确定了结直肠癌甲基化基因发生甲基化异常的靶序列，并且通过这个甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测该基因的甲基化的状态，从而可以用于对外周血游离DNA的检测。
本申请所述的组合物以非侵入性的方式用于无症状人群的筛查，降低了侵入性检测造成的危害，所述的组合物具有更高的灵敏度和准确度，能够实现实时监测。
具体实施方式
下面对本申请做以详细说明。虽然显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本申请提供了一种检测结直肠癌的标志物，所述标志物对应的基因选自下述中的一种：ANKRD20A12P、C1orf127、HSPA7、ADRA2A、MTRNR2L8、MUS81、RIMBP2、WNK1、EDDM3A、TBPL2、ARNT2、MIR1282、FZD2、LOC339166、ANKRD62、ISOC2、LENG9、ABCG8、CDRT15P3、CDRT15P3、LAPTM4A、ADAMTS5、MIR3648、RFPL2、ANKRD18DP、FAM86HP、DUX4L8、KIAA0825、PCBD2、PCDHB3、PCDHGA1、PSORS1C2、LINC02902、LUARIS、ATAD2、NAT1、CACNA1B和UCK1。所述对应的基因指的是标志物相对应的基因。
在一个实施方案中，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:1-44所示的一种，优选地，所述标志物为甲基化后的标志物。
其中，ANKRD20A12P的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；C1orf127的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；HSPA7的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；ADRA2A的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示；MTRNR2L8的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；MUS81的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；RIMBP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；WNK1的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；EDDM3A的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；TBPL2的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；ARNT2的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；MIR1282的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；FZD2的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；LOC339166的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；ANKRD62的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；ISOC2的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；LENG9的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；ABCG8的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；ANKRD18DP的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示；LAPTM4A的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；ADAMTS5的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；MIR3648的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；RFPL2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示；ANKRD18DP的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示；FAM86HP的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；DUX4L8的核苷酸序列如SEQ ID NO:31；KIAA0825的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示；PCBD2的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示；PCDHB3的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示；PCDHGA1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示；PSORS1C2的核苷酸序列如SEQ ID NO:37所示；LINC02902的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示；LUARIS的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示；ATAD2的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示；NAT1的核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示；CACNA1B的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:42和SEQID NO:43所示；UCK1的核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示。
其中，上述所述标志物的序列是未经重亚硫酸盐转化的序列。
本申请提供了一种探针组合物，所述探针组合物包括靶向所述标志物甲基化的探针。
所述甲基化指的是发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，作为一种对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制，DNA甲基化时，基因启动子区的甲基化可导致抑癌基因转录沉寂，因此它与肿瘤的***密切。异常甲基化包括抑癌基因和DNA修复基因的高甲基化、重复序列DNA的低甲基化、某些基因的印记丢失，其与多种肿瘤的发生有关。
本申请所述的甲基化可以为甲基化水平、甲基化程度或甲基化状态，当分析这样的靶序列的甲基化时，本领域技术人员可以使用定量测定方法来确定甲基化。
所述探针为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA，其可利用分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，能与待测样本中互补的非标记单链DNA或RNA以氢键结合(杂交)，形成双链复合物(杂交体)。将未配对结合的探针洗去后，可用放射自显影或酶联反应等检测***检测杂交反应结果。在本申请中，与探针互补结合或杂交的区域为特异性靶区域，多个探针组合成探针组合物。
在一个实施方案中，所述探针组合物包含高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，所述第一探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的高甲基化的区域杂交，所述第二探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的低甲基化的区域杂交。
所述高甲基化指的是标志物经重亚硫酸盐转化后，碱基C变成碱基U，但是如果是碱基CG，则碱基C保持不变；
所述低甲基化指的是标志物经重亚硫酸盐转化后，所有的碱基CG都没有发生甲基化，碱基C均变成碱基U。
由于每个人的甲基化状态不同，标志物经重亚硫酸盐转化得到的序列也不同，在此示出了每个标志物的一种极端情况，即该区段所有的CG都处于高甲基化状态，并示出了其互补链的高甲基化状态序列：
SEQ ID NO:1的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:221所示；
SEQ ID NO:1互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:222所示；
SEQ ID NO:2的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:223所示；
SEQ ID NO:2互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:224所示；
SEQ ID NO:3的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:225所示；
SEQ ID NO:3互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:226所示；
SEQ ID NO:4的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:227所示；
SEQ ID NO:4互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:228所示；
SEQ ID NO:5的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:229所示；
SEQ ID NO:5互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:230所示；
SEQ ID NO:6的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:231所示；
SEQ ID NO:6互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:232所示；
SEQ ID NO:7的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:233所示；
SEQ ID NO:7互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:234所示；
SEQ ID NO:8的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:235所示；
SEQ ID NO:8互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:236所示；
SEQ ID NO:9的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:237所示；
SEQ ID NO:9互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:238所示；
SEQ ID NO:10的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:239所示；
SEQ ID NO:10互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:240所示；
SEQ ID NO:11的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:241所示；
SEQ ID NO:11互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:242所示；
SEQ ID NO:12的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:243所示；
SEQ ID NO:12互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:244所示；
SEQ ID NO:13的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:245所示；
SEQ ID NO:13互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:246所示；
SEQ ID NO:14的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:247所示；
SEQ ID NO:14互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:248所示；
SEQ ID NO:15的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:249所示；
SEQ ID NO:15互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:250所示；
SEQ ID NO:16的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:251所示；
SEQ ID NO:16互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:252所示；
SEQ ID NO:17的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:253所示；
SEQ ID NO:17互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:254所示；
SEQ ID NO:18的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:255所示；
SEQ ID NO:18互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:256所示；
SEQ ID NO:19的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:257所示；
SEQ ID NO:19互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:258所示；
SEQ ID NO:20的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:259所示；
SEQ ID NO:20互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:260所示；
SEQ ID NO:21的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:261所示；
SEQ ID NO:21互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:262所示；
SEQ ID NO:22的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:263所示；
SEQ ID NO:22互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:264所示；
SEQ ID NO:23的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:265所示；
SEQ ID NO:23互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:266所示；
SEQ ID NO:24的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:267所示；
SEQ ID NO:24互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:268所示；
SEQ ID NO:25的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:269所示；
SEQ ID NO:25互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:270所示；
SEQ ID NO:26的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:271所示；
SEQ ID NO:26互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:272所示；
SEQ ID NO:27的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:273所示；
SEQ ID NO:27互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:274所示；
SEQ ID NO:28的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:275所示；
SEQ ID NO:28互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:276所示；
SEQ ID NO:29的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:277所示；
SEQ ID NO:29互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:278所示；
SEQ ID NO:30的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:279所示；
SEQ ID NO:30互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:280所示；
SEQ ID NO:31的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:281所示；
SEQ ID NO:31互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:282所示；
SEQ ID NO:32的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:283所示；
SEQ ID NO:32互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:284所示；
SEQ ID NO:33的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:285所示；
SEQ ID NO:33互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:286所示；
SEQ ID NO:34的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:287所示；
SEQ ID NO:34互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:288所示；
SEQ ID NO:35的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:289所示；
SEQ ID NO:35互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:290所示；
SEQ ID NO:36的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:291所示；
SEQ ID NO:36互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:292所示；
SEQ ID NO:37的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:293所示；
SEQ ID NO:37互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:294所示；
SEQ ID NO:38的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:295所示；
SEQ ID NO:38互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:296所示；
SEQ ID NO:39的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:297所示；
SEQ ID NO:39互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:298所示；
SEQ ID NO:40的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:299所示；
SEQ ID NO:40互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:300所示；
SEQ ID NO:41的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:301所示；
SEQ ID NO:41互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:302所示；
SEQ ID NO:42的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:303所示；
SEQ ID NO:42互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:304所示；
SEQ ID NO:43的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:305所示；
SEQ ID NO:43互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:306所示；
SEQ ID NO:44的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:307所示；
SEQ ID NO:44互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:308所示。
同理，由于每个人的甲基化状态不同，在此示出了一种极端的情况，即所有的CG都处于低甲基化状态，也示出了其互补链的低甲基化状态序列：
SEQ ID NO:1的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:309所示；
SEQ ID NO:1互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:310所示；
SEQ ID NO:2的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:311所示；
SEQ ID NO:2互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:312所示；
SEQ ID NO:3的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:313所示；
SEQ ID NO:3互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:314所示；
SEQ ID NO:4的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:315所示；
SEQ ID NO:4互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:316所示；
SEQ ID NO:5的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:317所示；
SEQ ID NO:5互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:318所示；
SEQ ID NO:6的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:319所示；
SEQ ID NO:6互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:320所示；
SEQ ID NO:7的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:321所示；
SEQ ID NO:7互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:322所示；
SEQ ID NO:8的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:323所示；
SEQ ID NO:8互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:324所示；
SEQ ID NO:9的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:325所示；
SEQ ID NO:9互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:326所示；
SEQ ID NO:10的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:327所示；
SEQ ID NO:10互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:328所示；
SEQ ID NO:11的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:329所示；
SEQ ID NO:11互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:330所示；
SEQ ID NO:12的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:331所示；
SEQ ID NO:12互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:332所示；
SEQ ID NO:13的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:333所示；
SEQ ID NO:13互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:334所示；
SEQ ID NO:14的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:335所示；
SEQ ID NO:14互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:336所示；
SEQ ID NO:15的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:337所示；
SEQ ID NO:15互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:338所示；
SEQ ID NO:16的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:339所示；
SEQ ID NO:16互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:340所示；
SEQ ID NO:17的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:341所示；
SEQ ID NO:17互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:342所示；
SEQ ID NO:18的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:343所示；
SEQ ID NO:18互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:344所示；
SEQ ID NO:19的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:345所示；
SEQ ID NO:19互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:346所示；
SEQ ID NO:20的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:347所示；
SEQ ID NO:20互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:348所示；
SEQ ID NO:21的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:349所示；
SEQ ID NO:21互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:350所示；
SEQ ID NO:22的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:351所示；
SEQ ID NO:22互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:352所示；
SEQ ID NO:23的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:353所示；
SEQ ID NO:23互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:354所示；
SEQ ID NO:24的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:355所示；
SEQ ID NO:24互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:356所示；
SEQ ID NO:25的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:357所示；
SEQ ID NO:25互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:358所示；
SEQ ID NO:26的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:359所示；
SEQ ID NO:26互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:360所示；
SEQ ID NO:27的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:361所示；
SEQ ID NO:27互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:362所示；
SEQ ID NO:28的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:363所示；
SEQ ID NO:28互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:364所示；
SEQ ID NO:29的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:365所示；
SEQ ID NO:29互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:366所示；
SEQ ID NO:30的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:367所示；
SEQ ID NO:30互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:368所示；
SEQ ID NO:31的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:369所示；
SEQ ID NO:31互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:370所示；
SEQ ID NO:32的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:371所示；
SEQ ID NO:32互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:372所示；
SEQ ID NO:33的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:373所示；
SEQ ID NO:33互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:374所示；
SEQ ID NO:34的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:375所示；
SEQ ID NO:34互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:376所示；
SEQ ID NO:35的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:377所示；
SEQ ID NO:35互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:378所示；
SEQ ID NO:36的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:379所示；
SEQ ID NO:36互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:380所示；
SEQ ID NO:37的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:381所示；
SEQ ID NO:37互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:382所示；
SEQ ID NO:38的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:383所示；
SEQ ID NO:38互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:384所示；
SEQ ID NO:39的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:385所示；
SEQ ID NO:39互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:386所示；
SEQ ID NO:40的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:387所示；
SEQ ID NO:40互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:388所示；
SEQ ID NO:41的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:389所示；
SEQ ID NO:41互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:390所示；
SEQ ID NO:42的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:391所示；
SEQ ID NO:42互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:392所示；
SEQ ID NO:43的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:393所示；
SEQ ID NO:43互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:394所示；
SEQ ID NO:44的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:395所示；
SEQ ID NO:44互补链的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:396所示。
在一个实施方案中，所述第一探针组合物包括n个探针，所述n个探针与经重亚硫酸盐转化的高甲基化的区域的正义链和/或反义链的每个核苷酸杂交。
所述第二探针组合物包括m个探针，所述m个探针与经重亚硫酸盐转化的低甲基化的区域的正义链和/或反义链的每个核苷酸杂交。
对于第一探针组合物和第二探针组合物中探针的个数，本申请不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，m和n可以为1-10中的任意整数，m和n既可以是相同的，也可以是不同的。
例如，m和n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的任意整数，优选地，m＝n＝2。
在一个实施方案中，第n-1个探针和第n个探针之间有x1个核苷酸重叠，优选地，x1为0-100中的任意整数；
优选地，第m-1个探针和第m个探针之间有x2个核苷酸重叠，优选地，x2为0-100中的任意整数。
其中，x1和x2可以是相同的，也可以是不同的，当x1为0时，表明第n-1探针的尾部与第n个探针的首部相连接，同理，当x2为0时，表明第m-1探针的尾部与第m个探针的首部相连接。
本申请通过将探针组合物与经过重亚硫酸盐转化的标志物进行杂交，其中，高甲基化的第一探针组合物与高甲基化的区域杂交，低甲基化的第二探针组合物与低甲基化的区域杂交，从而能够高效准确地检测靶序列的甲基化水平，进而能够用于结直肠癌筛查。
在一个实施方案中，所述高甲基化的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:45-132中的一种或两种。
所述低甲基化的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:133-220中的一种或两种。
其中，用于与ANKRD20A12P甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:45-46所示的核苷酸序列；
用于与C1orf127甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:47-48所示的核苷酸序列；
用于与HSPA7甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:49-50所示的核苷酸序列；
用于与ADRA2A甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:51-52所示的核苷酸序列；
用于与MTRNR2L8甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:53-54所示的核苷酸序列；
用于与MUS81甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:55-56所示的核苷酸序列；
用于与RIMBP2甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:57-58所示的核苷酸序列；
用于与WNK1甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:59-60所示的核苷酸序列；
用于与EDDM3A甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:61-62所示的核苷酸序列；
用于与TBPL2甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:63-64所示的核苷酸序列；
用于与ARNT2甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:65-66所示的核苷酸序列；
用于与MIR1282甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:67-68所示的核苷酸序列；
用于与FZD2甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:69-70所示的核苷酸序列；
用于与LOC339166甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:71-72所示的核苷酸序列；
用于与ANKRD62甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:73-74所示的核苷酸序列；
用于与ISOC2甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:75-76所示的核苷酸序列；
用于与LENG9甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:77-78所示的核苷酸序列；
用于与ABCG8甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:79-80所示的核苷酸序列；；
用于与CDRT15P3甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:81-82所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:19杂交)以及包括SEQ ID NO:83-84所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:20杂交)；
用于与LAPTM4A甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:85-86所示的核苷酸序列；
用于与ADAMTS5甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:87-88所示的核苷酸序列；
用于与MIR3648甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:89-90所示的核苷酸序列；
用于与RFPL2甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:91-92所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:24杂交)以及包括SEQ ID NO:93-94所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:25杂交)；
用于与ANKRD18DP甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:95-96所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:26杂交)、如SEQ ID NO:97-98所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:27杂交)、如SEQ IDNO:99-100所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:28杂交)以及包括如SEQ ID NO:101-102所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:29杂交)；
用于与FAM86HP甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:103-104所示的核苷酸序列；
用于与DUX4L8甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:105-106所示的核苷酸序列；
用于与KIAA0825甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:107-108所示的核苷酸序列；
用于与PCBD2甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:109-110所示的核苷酸序列；
用于与PCDHB3甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:111-112所示的核苷酸序列；
用于与PCDHGA1甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:113-114所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:35杂交)以及包括如SEQ ID NO:115-116所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:36杂交)；
用于与PSORS1C2甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:117-118所示的核苷酸序列；
用于与LINC02902甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:119-120所示的核苷酸序列；
用于与LUARIS甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:121-122所示的核苷酸序列；
用于与ATAD2甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:123-124所示的核苷酸序列；
用于与NAT1甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:125-126所示的核苷酸序列；
用于与CACNA1B甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:127-128所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:42杂交)以及包括如SEQ ID NO:129-130所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:43杂交)；
用于与UCK1甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:131-132所示的核苷酸序列；
用于与ANKRD20A12P甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:133-134所示的核苷酸序列；
用于与C1orf127甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:135-136所示的核苷酸序列；
用于与HSPA7甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:137-138所示的核苷酸序列；
用于与ADRA2A甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:139-140所示的核苷酸序列；
用于与MTRNR2L8甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:141-142所示的核苷酸序列；
用于与MUS81甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:143-144所示的核苷酸序列；
用于与RIMBP2甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:145-146所示的核苷酸序列；
用于与WNK1甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:147-148所示的核苷酸序列；
用于与EDDM3A甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:149-150所示的核苷酸序列；
用于与TBPL2甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:151-152所示的核苷酸序列；
用于与ARNT2甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:153-154所示的核苷酸序列；
用于与MIR1282甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:155-156所示的核苷酸序列；
用于与FZD2甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:157-158所示的核苷酸序列；
用于与LOC339166甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:159-160所示的核苷酸序列；
用于与ANKRD62甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:161-162所示的核苷酸序列；
用于与ISOC2甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:163-164所示的核苷酸序列；
用于与LENG9甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:165-166所示的核苷酸序列；
用于与ABCG8甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:167-168所示的核苷酸序列；
用于与CDRT15P3甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:169-170所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:19杂交)以及包括SEQ ID NO:171-172所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:20杂交)；
用于与LAPTM4A甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:173-174所示的核苷酸序列；
用于与ADAMTS5甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:175-176所示的核苷酸序列；
用于与MIR3648甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:177-178所示的核苷酸序列；
用于与RFPL2甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:179-180所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:24杂交)以及包括SEQ ID NO:181-182所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:25杂交)；
用于与ANKRD18DP甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:183-184所示的核苷酸序列其用于与SEQ ID NO:26杂交)、如SEQ ID NO:185-186所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:27杂交)、如SEQ ID NO:187-188所示的核苷酸序列(其用于与SEQ IDNO:28杂交)以及包括如SEQ ID NO:189-190所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:29杂交)；
用于与FAM86HP甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:191-192所示的核苷酸序列；
用于与DUX4L8甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:193-194所示的核苷酸序列；
用于与KIAA0825甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:195-196所示的核苷酸序列；
用于与PCBD2甲基化序列杂交的第二探针组合物包括SEQ ID NO:197-198所示的核苷酸序列；
用于与PCDHB3甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:199-200所示的核苷酸序列；
用于与PCDHGA1甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:201-202所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:35杂交)以及包括如SEQ ID NO:203-204所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:36杂交)；
用于与PSORS1C2甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:205-206所示的核苷酸序列；
用于与LINC02902甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:207-208所示的核苷酸序列；
用于与LUARIS甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:209-210所示的核苷酸序列；
用于与ATAD2甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:211-212所示的核苷酸序列；
用于与NAT1甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:213-214所示的核苷酸序列；
用于与CACNA1B甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:215-216所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:42杂交)以及包括如SEQ ID NO:217-218所示的核苷酸序列(其用于与SEQ ID NO:43杂交)；
用于与UCK1甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:219-220所示的核苷酸序列。
本申请提供了标志物在制备用于检测结直肠癌的试剂盒中的用途，所述标志物对应的基因选自下述中的一种：ANKRD20A12P、C1orf127、HSPA7、ADRA2A、MTRNR2L8、MUS81、RIMBP2、WNK1、EDDM3A、TBPL2、ARNT2、MIR1282、FZD2、LOC339166、ANKRD62、ISOC2、LENG9、ABCG8、CDRT15P3、CDRT15P3、LAPTM4A、ADAMTS5、MIR3648、RFPL2、ANKRD18DP、FAM86HP、DUX4L8、KIAA0825、PCBD2、PCDHB3、PCDHGA1、PSORS1C2、LINC02902、LUARIS、ATAD2、NAT1、CACNA1B和UCK1。
在一个实施方案中，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:1-44所示的一种，优选地，所述标志物为甲基化后的标志物。
本申请提供了探针组合物在制备用于检测结直肠癌的试剂盒中的用途，所述探针组合物用于靶向结直肠癌甲基化后的标志物。
在一个实施方案中，所述探针组合物为上述所述的探针组合物。
本申请还提供了一种用于结直肠癌检测的组合物，所述组合物包括用于检测选自下述标志物对应的基因中的任一种甲基化的核酸：ANKRD20A12P、C1orf127、HSPA7、ADRA2A、MTRNR2L8、MUS81、RIMBP2、WNK1、EDDM3A、TBPL2、ARNT2、MIR1282、FZD2、LOC339166、ANKRD62、ISOC2、LENG9、ABCG8、CDRT15P3、CDRT15P3、LAPTM4A、ADAMTS5、MIR3648、RFPL2、ANKRD18DP、FAM86HP、DUX4L8、KIAA0825、PCBD2、PCDHB3、PCDHGA1、PSORS1C2、LINC02902、LUARIS、ATAD2、NAT1、CACNA1B和UCK1。优选地，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:1-44所示的一种。
在一个实施方案中，所述核酸包括上述所述的探针组合物。
在一个实施方案中，所述核酸包括：
引物，所述引物为所述标志物的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
其中，如果使用重亚硫酸盐对待测样本NDA进行转化，则用于检测标志物的靶序列甲基化的核酸包括对标志物的靶序列进行重亚硫酸盐转化后的序列中的至少9个核苷酸的片段，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述核酸还包括：
探针，所述探针为在中等严紧或严紧条件下与所述标志物的靶序列中的至少15个核苷酸片段杂交，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述所述组合物还包括将标志物的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂，例如试剂可以为重亚硫酸盐等；优选地，所述用于检测标志物的靶序列甲基化的核酸还包括：
优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
所述阻断剂是为了提高PCR扩增引物的扩增特异性，阻断剂核苷酸序列的5’端与正向或反向引物的3’端核苷酸序列有大于或等于5个核苷酸的重叠区域，阻断剂与正向或反向引物互补与目标基因靶序列DNA的同一条链，阻断剂的解链温度高于正向或者反向引物超过(包括)5℃，阻断剂的核苷酸序列包含至少一个CpG二核苷酸序列，并与重亚硫酸盐转化后的未发生甲基化的目标基因靶序列DNA的序列互补。因此，当所要检测的生物样本的基因组DNA是处于甲基化和非甲基化状态的混合物时，尤其是处于甲基化状态的DNA远远少于处于非甲基化状态的DNA的情况下，处于非甲基化状态的DNA经重亚硫酸盐转化后，会优先与阻断剂相结合，从而以及DNA模板与PCR义务结合，因而不发生PCR扩增，而处于甲基化状态的DNA不与阻断剂相结合，因而与引物集合，发生PCR扩增，之后直接或间接地检测通过扩增获得的片段。
本申请提供了一种试剂盒，其包括用于检测上述所述的标志物的试剂或者上述所述的探针组合物或者上述所述的组合物。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含用于容纳受试者生物样品的容器。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包括使用和解释检测结果的说明。
所述生物样品例如可以为外周血全血、血浆或血清。
对于使用上述所述的试剂盒检测靶序列甲基化水平的方法，本申请不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如本申请提供了一种使用上述所述的试剂盒检测标志物靶序列甲基化水平的方法，其包括下述步骤：
采集受试者样品；
提取纯化所述样品中的DNA；
针对纯化的DNA样品构建用于测序的DNA文库；
用重亚硫酸盐转化所述构建的DNA文库；
预PCR扩增所述经重亚硫酸盐转化的DNA文库；
利用探针组合物对经预PCR扩增的样品进行杂交捕获；
利用PCR扩增经杂交捕获后的产物；
对PCR扩增后的经杂交捕获后的产物进行高通量二代测序；
对测序数据进行分析，确定样本的甲基化水平；
基于已有样本的甲基化情况计算每个标志物的阈值，基于所述样本的某个标志物甲基化水平判读所述患者的患病情况，如果样本的某个标志物的甲基化水平超过阈值为癌症样本，如果低于阈值为健康人样本。
还例如，本申请提供了一种使用上述所述的试剂盒检测标志物的靶序列甲基化水平的方法，其包括下述步骤：
(1)抽取受试者外周血，分离血浆或血清；
(2)抽取血浆或血清中的游离DNA；
(3)使用试剂处理步骤(2)所得到的游离DNA，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转为为尿嘧啶或其他碱基，即标志物的靶序列的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其他碱基，转化后的碱基在杂交性能方面不同于5位未甲基化的胞嘧啶碱基，并且是可检测的；
(4)将经步骤(3)处理过的游离DNA与DNA聚合酶和所述标志物的靶序列的引物接触，使得所述经处理的标志物的靶序列被扩增以产生扩增产物或不被扩增；所述经处理的标志物的靶序列如果发生DNA聚合反应，会产生扩增产物；所述经处理的标志物的靶序列如果不发生DNA聚合反应，则不被扩增；
(5)用探针检测扩增产物；
(6)基于所述扩增产物是否存在，确定所述标志物的靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态，从而确定标志物的靶序列的甲基化水平。
本申请提供了一种芯片，其包含上述所述的标志物或者上述所述的探针组合物或者上述所述的组合物。
所述芯片又称为基因芯片，其测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。
所述芯片的制备主要是以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。
本申请所述芯片是基于重亚硫酸盐处理后的DNA序列杂交的信号探测，重亚硫酸盐处理是将非甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，然后再将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶，最后进行芯片杂交；最后根据荧光颜色判断加入碱基的类型，进而确定该位点是否被甲基化。
本申请提供了一种结直肠癌筛查的方法，其包括：
检测标志物的甲基化水平，以及
基于所述甲基化水平来判断受试者罹患结直肠癌的风险，所述标志物对应的基因选自下述中的一种：ANKRD20A12P、C1orf127、HSPA7、ADRA2A、MTRNR2L8、MUS81、RIMBP2、WNK1、EDDM3A、TBPL2、ARNT2、MIR1282、FZD2、LOC339166、ANKRD62、ISOC2、LENG9、ABCG8、CDRT15P3、CDRT15P3、LAPTM4A、ADAMTS5、MIR3648、RFPL2、ANKRD18DP、FAM86HP、DUX4L8、KIAA0825、PCBD2、PCDHB3、PCDHGA1、PSORS1C2、LINC02902、LUARIS、ATAD2、NAT1、CACNA1B和UCK1。
实施例
本申请对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
筛选标志物
1)样本搜集：从合作的医院收集结直肠癌患者的血浆样本共58例，另外收集健康人血浆样本42例。进行如下的实验(详见1.1)。
2)候选标志物分析：针对测序数据得到的甲基化位点使用DSS软件进行健康人和结直肠癌患者的差异分析。过滤的标准：P<0.05且两组均值的差异大于0.1。最终得到561个差异甲基化区域。
3)标志物验证：针对上述的561个差异甲基化区域设计探针捕获,利用博尔诚血浆样本数据(结直肠癌样本个数＝38,健康人样本个数＝28)进行验证，最终得到44个能区分开结直肠癌与健康人的标志物。其序列分别为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:44所示。
根据所得到的靶序列区域，定制探针组合物(panel)。
然后在血浆样本中验证，实验中采用QiagenCirculating NucleicAcid Kit进行cfDNA制备，货号为55114。使用Swift的ACCEL-/>METHYL-SEQ DNALIBRARY KIT进行文库的制备，货号为30096，其实验检测方法如下，
1.1.cfDNA提取纯化：
1.1.1.血浆样本制备：
4℃、2000g离心血液样本10min,将血浆转移到一个新的离心管中。4℃、16000g离心血浆样本10min,根据使用的收集管类型，执行下一步,本实验中使用的收集管类型为其他。
1.1.2.裂解和结合：
1.1.2.1.吸取100μl、200μl、300μl、400μl、500μl QIAGEN蛋白酶K到50ml离心管中。
1.1.2.2.加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml血浆或血清到上述50ml离心管中。
1.1.2.3.加入0.8ml、1.6ml、2.4ml、3.2ml、4.0ml Buffer ACL(含1.0μg carrierRNA)，盖上盖子并涡旋30s；注意：充分混匀保证裂解充分；立即进行下一步。
1.1.2.4.在60℃孵育30min。
1.1.2.5.取出离心管置于试验台上，旋开管盖。
1.1.2.6.加入1.8ml、3.6ml、5.4ml、7.2ml、9.0ml的Buffer ACB到50ml离心管中；盖上盖子，混匀15-30s。
1.1.2.7.在冰上孵育裂解混合物5min。
1.1.2.8.在真空泵接头适配器上***QIAampMini column，将20ml tubeextender插在柱子上；注：确保tube extender牢固的插在QIAamp Mini column上，避免样本泄露。
1.1.2.9.将步骤7中的裂解物-缓冲液ACB混合物小心地加到QIAamp Mini column的tube extender中，打开真空泵；当所有裂解物完全从Mini column中抽出后，关闭真空泵，将压力释放至0mbar；小心地拆下并丢弃扩管器。
1.1.3.洗涤：
1.1.3.1.加入600μl Buffer ACW1到Mini column中，开盖状态，开启真空泵；所有液体通过柱膜后，关闭真空泵，释放压力到0mbar。
1.1.3.2.加入750μl Buffer ACW2到Mini column中，开盖状态，开启真空泵；所有液体通过柱膜后，关闭真空泵，释放压力到0mbar。
1.1.3.3.加入750μl乙醇(96-100％)到Mini column中，开盖状态，开启真空泵；所有液体通过柱膜后，关闭真空泵，释放压力到0mbar。
1.1.3.4.盖上QIAamp Mini column盖子，从适配器上取下，丢弃VacConnector。将QIAamp Mini column放到干净的2ml收集管中，高速离心(20000g；14000rpm)离心3min。
1.1.3.5.将QIAamp Mini column放到新的2ml收集管中。打开管盖，室温孵育5min使膜完全干燥。
1.1.4.洗脱cfDNA：
1.1.4.1.将QIAamp Mini column放到1.5ml洗脱管中，丢弃14步中的2ml收集管。加入20-150μl的Buffer AVE到Mini membrane的中心；盖上管盖，室温孵育3min。
1.1.4.2.离心机中全速(20000g；14000rpm)离心1min以洗脱核酸。
对于cfDNA样品，Agilent2100进行片段检测，直接Qubit用于后续的实验。
1.2.Bisulfite转化及纯化：
1.2.1..准备CT Conversion Reagent：
1.2.1.1..将700μl NF水、300μl M-Dilution Buffer和50μl M-DissolvingBuffer加入一管CT转化试剂中,室温混匀，频繁涡旋或摇晃10min。
1.2.1.2.混匀后进行分装，配置一次为10个反应量。
1.2.2.对DNA文库进行重亚硫酸盐转化，根据下表配制反应体系。
表1
1.2.3.将移液器调至100μl，轻轻吸打混匀6次，然后分成两管,置于PCR仪上。
1.2.4.设置以下程序在PCR仪上进行反应：热盖温度105℃。
表2
| 温度 | 时间 |
| 98℃ | 10min |
| 64℃ | 2.5h |
| 4℃ | ∞ |
1.2.5.取一个新的1.5ml离心管，加入600μl的M-Binding Buffer。
1.2.6.PCR结束后，简短离心将两管相同样本分别转移至上述对应的1.5ml离心管中，混匀。
1.2.7.将上述混合好的样本加入Zymo-SpinTMIC Column中，颠倒混匀，10,000x g离心30s。
1.2.8.向柱子中加入100μl的M-Wash Buffer，10,000x g离心30s。
1.2.9.向柱子中加入200μl的M-Desulphonation Buffer，室温静置15-20min，10,000x g离心30s。
1.2.10.向柱子中加入200μl的M-Wash Buffer，10,000x g离心30s。
1.2.11.重复上一步一次。
1.2.12.将柱子放入一个新的收集管中，10,000x g再次离心30s。
1.2.13.将回收柱放入一个新的1.5ml EP管中，加入15μl LOW EDTA缓冲液到柱膜中央，10,000x g离心30s。
1.3.变性：
1.3.1.将PCR仪预热至95℃。
1.3.2.设置以下程序在PCR仪上进行反应：热盖温度105℃。
表3
| 温度 | 时间 |
| 95℃ | ∞ |
| 95℃ | 2min |
| 95℃ | ∞ |
1.3.3.孵育完成后，立即将试管放在冰上2min。
1.4.接头连接及纯化：
1.4.1.参照下表配置反应体系：
表4
1.4.2.设置以下程序在PCR仪上进行反应：热盖温度105℃。
表5
| 温度 | 时间 |
| 37℃ | ∞ |
| 37℃ | 15min |
| 95℃ | 2min |
| 4℃ | ∞ |
1.5.样本延伸及纯化：
1.5.1.参照下表配置反应体系：
表6
| 组分 | 体积 |
| Reagent Y1 | 2ul |
| Enzyme Y2 | 42ul |
| totalVolume | 44ul |
1.5.2.设置以下程序在PCR仪上进行反应：热盖温度105℃。
表7
| 温度 | 时间 |
| 98℃ | ∞ |
| 98℃ | 1min |
| 62℃ | 2min |
| 65℃ | 5min |
| 4℃ | ∞ |
1.5.3.DNA保护缓冲液加入液体变成蓝色。轻轻吸打混匀，然后分成两管至于PCR仪上。
1.5.4.设置以下程序，并运行：热盖105℃。
表8
| 温度 | 时间 |
| 95℃ | 5min |
| 60℃ | 10min |
| 95℃ | 5min |
| 60℃ | 10min |
| 4℃ | ∞ |
1.5.5.根据下表制备纯化体系：
表9
1.5.6.向每个样本中加入上述比例磁珠进行回收，震荡混匀瞬离。
1.5.7.室温静置孵育5min。
1.5.8.震荡混匀瞬时离心放置在磁力架上吸附直至溶液呈请(～2min)，待溶液澄清后吸走上清。
1.5.9.加入200μl的80％乙醇清洗30s磁珠,丢弃上清液,小心地从中清除所有滴管内壁剩余的乙醇。
1.5.10.重复上述步骤。
1.5.11.加入上表推荐的low EDTA TE缓冲液最佳体积洗脱，后震荡混匀。
1.5.12.在室温下孵育2min。
1.5.13.放置磁力架上吸附直至溶液澄清(～2min)待溶液澄清后吸走上清。
1.5.14.将整个洗脱液转移到新的0.2mL PCR管中，确保洗脱液不包含磁珠。
1.6.接头连接及纯化：
1.6.1.根据下表制备文库反应体系：
表10
1.6.2.设置以下程序，并运行：热盖0℃：
表11
| 温度 | 时间 |
| 25℃ | ∞ |
| 25℃ | 15min |
| 4℃ | ∞ |
1.6.3.根据下表制备纯化体系：
表12
1.6.4.向每个样本中加入上述比例磁珠进行回收，震荡混匀瞬离。
1.6.5.室温静置孵育5min。
1.6.6.震荡混匀瞬时离心放置在磁力架上吸附直至溶液呈请(～2min)，待溶液澄清后吸走上清。
1.6.7.加入200μl的80％乙醇清洗30s磁珠,丢弃上清液,小心地从中清除所有滴管内壁剩余的乙醇。
1.6.8.重复上述步骤。
1.6.9.加入上表推荐的low EDTA TE缓冲液最佳体积洗脱，后震荡混匀。
1.6.10.在室温下孵育2min。
1.6.11.放置磁力架上吸附直至溶液澄清(～2min)待溶液澄清后吸走上清。
1.6.12.将整个洗脱液转移到新的0.2mL PCR管中，确保洗脱液不包含磁珠。
1.7.文库扩增及纯化：
1.7.1.根据下表制备文库反应体系：
表13
1.7.2.设置以下程序，并运行：热盖105℃：
表14
1.7.3.推荐循环数如下表：
表15
| 投入量 | 推荐循环数 |
| 20ng cfDNA | 10-11 |
| 100ng gDNA | 9-10 |
| 20ng gDNA | 11-12 |
1.7.4.根据下表制备纯化体系：
表16
1.7.5.将PCR产物转入1.5ml离心管中。
1.7.6.向每个样本中加入上述比例磁珠进行回收，震荡混匀瞬离。
1.7.7.室温静置孵育5min。
1.7.8.震荡混匀瞬时离心放置在磁力架上吸附直至溶液呈请(～2min)，待溶液澄清后吸走上清。
1.7.9.加入500μl的80％乙醇清洗30s磁珠,丢弃上清液,小心地从中清除所有滴管内壁剩余的乙醇。
1.7.10.重复上述步骤。
1.7.11.磁力架上放置5-10分钟，直到珠子干燥(避免过度干燥，过度干燥可能会导致DNA回收率降低)。
1.7.12.加入上表推荐的low EDTA TE缓冲液最佳体积洗脱，后震荡混匀。
1.7.13.在室温下孵育2min。
1.7.14.放置磁力架上吸附直至溶液澄清(～2min)待溶液澄清后吸走上清。
1.7.15.将整个洗脱液转移到新的0.2mL PCR管中，确保洗脱液不包含磁珠。
1.7.16.吸出1ul进行qubit标定并进行2100质检。
1.8.样本与探针杂交：
1.8.1.混合样本：
1.8.1.1.DNA文库用量参考下表，总用量可以用超过1500ng总量，但不大于4ug；
表17
1.8.1.2.计算好不同样本用量，在离心管中混合均匀。
1.8.1.3.在混合好的样本中分别加入以下预杂交试剂，混匀，尽量不要产生气泡。
表18
1.8.1.4.将以上混合好的预杂交试剂在真空浓缩仪中常温(如需加热，请用低温)烘干。
1.8.2.杂交：
1.8.2.1.将Fast Hybridization Mix在65℃孵育10min或直至所有沉淀溶解，迅速涡旋并加20ul至上步冻干的样本中重悬样本(请不要让杂交液恢复至室温)，指尖轻弹混匀，避免产生气泡。
1.8.2.2.快速离心去除气泡，加入30ul Hybridization Enhancer至以上试剂表面。
1.8.2.3.将PCR管放入预热好的PCR仪中杂交。
1.8.2.4.设置以下程序，并运行：热盖85℃。
表19
| 温度 | 时间 |
| 95℃ | ∞ |
| 95℃ | 5min |
| 60℃ | 15min-4h |
1.8.3.结合：
1.8.3.1.震荡预平衡的链霉亲和素磁珠直至完全混匀，加入100μl磁珠至1.5ml离心管中。
1.8.3.2.加入200ul结合缓冲液并用枪头吹打混匀。
1.8.3.3.将离心管置于磁力架上1min或至溶液澄清，弃去上清，取下离心管。
1.8.3.4.重复以上洗涤步骤2次，共3次。
1.8.3.5.最后一次清洗后，加入200ul结合缓冲液，震荡重悬使充分混匀。
1.8.3.6.杂交结束后，打开PCR仪盖子并迅速将杂交液全部转移至平衡好的磁珠中。
1.8.3.7.将加入了杂交液的磁珠在Shaker，rocker或rotator上室温充分混匀30min。
1.8.3.8.将离心管从混匀仪上取下，快速离心后在磁力架上放置1min,去上清，取下管子。
1.8.3.9.加入200ul预热的洗液1，混匀。
1.8.3.10.63℃或65℃孵育5min。
1.8.3.11.将离心管放置于磁力架上1min,去上清，取下管子。
1.8.3.12.重复以上步骤，再次加入200ul预热的洗液1，混匀。
1.8.3.13.在63℃或65℃孵育5min。
1.8.3.14.转移液体至一个新管子；磁力架上放置1min,去上清，取下管子。
1.8.3.15.加入200ul预热过的wash buffer 2,枪头混匀。
1.8.3.16.48℃孵育5min。
1.8.3.17.磁力架上放置1min,去上清，取下管子。
1.8.3.18.重复(步骤3.15-3.17)洗2次，共三次。
1.8.3.19.最后一次，用10ul枪头吸干净洗液。
1.8.3.20.加入45ul水，混匀，冰上孵育该溶液。
1.8.4.捕获后PCR扩增、纯化和质检：
1.8.4.1.设置以下程序，并运行：热盖105℃。
表20
1.8.4.2.混合1.3中的磁珠混合物，吸取22.5ul至0.2mlPCR管中。
1.8.4.3.将0.2mlPCR管中加入2.5ul扩增引物，25ul KAPA HiFi HotStartReadyMix，共50ul反应体系。
1.8.4.4.用枪头温和混匀，快速离心后放入PCR仪中，开始扩增。
1.8.4.5.涡旋充分混匀预平衡的DNA纯化磁珠。
1.8.4.6.在扩增后的PCR产物中加入90ul(1.8*)DNA纯化磁珠，涡旋充分混匀。
1.8.4.7.室温孵育5min。
1.8.4.8.将离心管置于磁力架上1min,待溶液澄清后去上清。
1.8.4.9.不用将离心管从磁力架上取下，直接加入现配的200ul 80％乙醇，孵育1min,弃上清；重复一次80％乙醇洗涤(共2次)，保持离心管在磁力架上。
1.8.4.10.用10ul枪头小心去除残留的乙醇，室温放置5-10min或至磁珠干燥，请注意不要使磁珠过干。
1.8.4.11.从磁力架上取下管子并加入32ul水，用枪头吹打充分混匀，室温孵育2min
1.8.4.12.将离心管置于磁力架上3min或至溶液澄清。
1.8.4.13.转移30ul上清至干净的0.2ml离心管。
1.8.4.14.取1μl文库使用Qubit进行定量，记录文库浓度。
1.8.4.15.取1μl样品使用Agilent2100进行文库片段长度测定。
1.8.4.16.使用Illumina高通量测序平台进行测序。
1.9.甲基化生信分析流程。大致如下：使用fastp质控软件查看测序质量，去除低质量的读段，然后采用Bismark比对软件将质控后的干净的数据比对到参考基因组上，采用Bismark_methylation_extractor软件提取相应的甲基化位点。最后，计算出靶区域的甲基化水平，该值结果如果超过阈值判读为癌症，如果低于阈值判读为正常。
实施例2
本实施例公开了一种用于诊断结直肠癌的甲基化特异性生物标记物，基于58例结直肠癌样本和42例正常人样本的数据集，利用实施例1所述甲基化建库方法，利用在不同组别(结直肠癌和正常)的甲基化水平差异筛选出与结直肠癌相关的生物标记物，并对位点数据在正常与结直肠癌样本中进行独立数据集的验证，一共筛选出44个最显著区分正常与癌症样本的DNA片段，该44个甲基化生物标记物(以下简称位点或者marker)及判别阈值见表21。
其中甲基化水平阈值计算方法为：根据数据集(包含每个样本的类型和甲基化水平)绘制ROC曲线，ROC曲线上的最佳阈值点所对应的混淆矩阵将是我们计算敏感度(sensitivity)、特异度(specificity)以及准确度等指标的依据。通常情况下我们会通过约登指数(Youden index)进行选择。约登指数也称正确指数，是指敏感度和特异度之和减去1：约登指数＝敏感度+特异度–1。约登指数范围取值介于0-1之间，代表分类模型发现真正病人与非病人的总能力。约登指数越大，表示分类模型性能越好，每个标志物的敏感度和特异度如表21所示。从表21可以看出，本申请所述标志物的AUC值较高。
表21 44个甲基化标记物的具体表现数据
实施例3
利用额外收集的6例人样本(S1-3为健康人样本，S4-6为结直肠癌患者样本)，采用本申请的甲基化标志物检测方法，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过Illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到每个标志物的甲基化水平，根据每个标志物的阈值，预测所述患者的患病情况，如果超过阈值为癌症样本，如果低于阈值为健康人样本，(注：SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.21,SEQ ID NO.26-SEQ ID NO.30,SEQID NO.32,SEQ ID NO.33,SEQ ID NO.37这几个较为特殊：如果超过阈值为健康人样本，如果低于阈值为癌症样本)具体结果如下表22所示：
其中判读结果，0代表分类为正常，即健康；1代表分类为异常，即肿瘤。
表22 样本的甲基化值以及判读结果
/>
综上所述，本申请的发明人获得了与结直肠癌相关的甲基化基因，并确定了结直肠癌甲基化基因发生甲基化异常的靶序列，并且，通过这些甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测该基因的甲基化的状态，从而可以用于对外周血游离DNA的检测，并且本申请所述的组合物能够实现实时监测，具有更高的灵敏度和准确度。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。
本申请使用的序列表如表23所示：
表23
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
Claims (11)
1.一种用于检测结直肠癌的标志物，其特征在于，所述标志物对应的基因选自下述中的一种：ANKRD20A12P、C1orf127、HSPA7、ADRA2A、MTRNR2L8、MUS81、RIMBP2、WNK1、EDDM3A、TBPL2、ARNT2、MIR1282、FZD2、LOC339166、ANKRD62、ISOC2、LENG9、ABCG8、CDRT15P3、CDRT15P3、LAPTM4A、ADAMTS5、MIR3648、RFPL2、ANKRD18DP、FAM86HP、DUX4L8、KIAA0825、PCBD2、PCDHB3、PCDHGA1、PSORS1C2、LINC02902、LUARIS、ATAD2、NAT1、CACNA1B和UCK1。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ IDNO:1-44所示的一种，优选所述标志物为甲基化后的标志物。
3.一种探针组合物，其特征在于，所述探针组合物包含靶向权利要求1或2所述标志物甲基化的探针。
4.根据权利要求3所述的探针组合物，其特征在于，所述探针组合物包含高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，所述第一探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的高甲基化的区域杂交，所述第二探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的低甲基化的区域杂交；
优选地，所述第一探针组合物包括n个探针，所述n个探针与经重亚硫酸盐转化的高甲基化的区域的正义链和/或反义链的每个核苷酸杂交；
优选地，所述第二探针组合物包括m个探针，所述m个探针与经重亚硫酸盐转化的低甲基化的区域的正义链和/或反义链的每个核苷酸杂交；
优选地，n和m均是1-10中的任意整数；
优选地，第n-1个探针和第n个探针之间有x1个核苷酸重叠，优选地，x1为0-100中的任意整数；
优选地，第m-1个探针和第m个探针之间有x2个核苷酸重叠，优选地，x2为0-100中的任意整数；
进一步优选地，所述第一探针组合物包括如SEQ ID NO:45-132中的一种或两种，所述第二探针组合物包括如SEQ ID NO:133-220中的一种或两种。
5.标志物在制备用于检测结直肠癌的试剂盒中的用途，其特征在于，所述标志物对应的基因选自下述中的一种：ANKRD20A12P、C1orf127、HSPA7、ADRA2A、MTRNR2L8、MUS81、RIMBP2、WNK1、EDDM3A、TBPL2、ARNT2、MIR1282、FZD2、LOC339166、ANKRD62、ISOC2、LENG9、ABCG8、CDRT15P3、CDRT15P3、LAPTM4A、ADAMTS5、MIR3648、RFPL2、ANKRD18DP、FAM86HP、DUX4L8、KIAA0825、PCBD2、PCDHB3、PCDHGA1、PSORS1C2、LINC02902、LUARIS、ATAD2、NAT1、CACNA1B和UCK1。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ IDNO:1-44所示的一种，优选所述标志物为甲基化后的标志物；
优选地，所述探针组合物用于靶向结直肠癌的甲基化后的标志物；
优选地，所述探针组合物为权利要求3或4所述的探针组合物。
7.一种用于结直肠癌检测的组合物，其特征在于，所述组合物包括用于检测选自下述标志物对应的基因中的任一种甲基化的核酸：ANKRD20A12P、C1orf127、HSPA7、ADRA2A、MTRNR2L8、MUS81、RIMBP2、WNK1、EDDM3A、TBPL2、ARNT2、MIR1282、FZD2、LOC339166、ANKRD62、ISOC2、LENG9、ABCG8、CDRT15P3、CDRT15P3、LAPTM4A、ADAMTS5、MIR3648、RFPL2、ANKRD18DP、FAM86HP、DUX4L8、KIAA0825、PCBD2、PCDHB3、PCDHGA1、PSORS1C2、LINC02902、LUARIS、ATAD2、NAT1、CACNA1B和UCK1。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ IDNO:1-44所示的一种。
9.根据权利要求7或8所述的组合物，其特征在于，所述核酸包括权利要求3或4所述的探针组合物；
优选地，所述核酸包括：
引物，所述引物为所述标志物的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列；
优选地，所述核酸还包括：
探针，所述探针为在中等严紧或严紧条件下与所述标志物的靶序列中的至少15个核苷酸片段杂交，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列；
优选地，所述组合物还包括将标志物的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂；
优选地，所述用于检测标志物的靶序列甲基化的核酸还包括：
优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
10.一种试剂盒，其特征在于，其包含用于检测权利要求1或2所述的标志物的试剂或者权利要求3或4所述的探针组合物或者权利要求7-9中任一项所述的组合物。
11.一种芯片，其特征在于，其包含权利要求1或2所述的标志物或者权利要求3或4所述的探针组合物或者权利要求7或8所述的组合物。
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