CN109486955B - 一种用于粪便检测进展期腺瘤、结直肠癌相关基因甲基化位点的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于进展期腺瘤、结直肠癌相关基因多位点甲基化检测的粪便检测试剂盒，它包括如下的引物和探针：SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：131，还包括用于大量提取和转化粪便DNA的组合物。本发明的试剂盒，可以使用无创粪便检测肠癌甲基化相关基因，以多基因联合检测等方式进行大肠进展期腺瘤、结直肠癌患者的早期筛查。本发明试剂盒的多组合联合检测结果精确，单组合单管检测、单组合重复管检测、多组合联合甲基化检测进展期腺瘤敏感度62‑90％，结直肠癌敏感度78‑100％，特异性82‑100％，并且总体检测成本相较于乙状结肠镜检查费用低，可用于临床传统检查之前进行结直肠癌早期筛查等多用途，避免部分受检人员遭受乙状结肠镜等痛苦的检测手段。

Description

一种用于粪便检测进展期腺瘤、结直肠癌相关基因甲基化位 点的试剂盒

技术领域

本发明属于医疗技术领域，涉及检测大肠进展期腺瘤、结直肠癌早期筛查的甲基化多位点联合检测的试剂盒。

背景技术

在中国，结直肠癌发病率与死亡率均为恶性肿瘤中的第5位，结直肠癌发病率处于上升期，中国每年新发结直肠癌患者超40万人次，而每年约20万人死于结直肠癌，国内每年发病率增速为4.2％，高于国际水平的2％。结直肠癌早发现、早治疗对患者预后、复发、生存有着至关重要的作用，Ⅰ-ⅡA期结直肠癌治疗5年OS在90％以上，随着癌症的进展5年OS逐步下降，晚期结直肠癌治疗5年OS仅有13％。结直肠癌早期症状不明显，癌症早期筛查意识相对薄弱，大量结直肠癌患者在感觉不适时考虑到进行乙状结肠镜等检查时相对痛苦而存在拒绝进行检查，乙状结肠镜检查的依从性差，大部分患者确诊为结直肠癌时已是中晚期，错过了最佳治疗时间，致使患者病情进一步恶化，也增加了患者家庭后续治疗费用。

目前，医院常规检测结直肠癌的手段主要为乙状结肠镜检查、粪便隐血免疫化学检测、粪便隐血联合粪便DNA检测等手段。而市面上也存在众多甲基化检测试剂盒，可用于科学研究。

乙状结肠镜检查作为金标准，其具有95％以上的敏感度，可通过肠道镜检直观地观察到结直肠癌、腺瘤、息肉等病变。进行乙状结肠镜检测的检查费用相对较高，患者需要提前几天的时间预约乙状结肠镜检查并控制3天以上饮食，在检查前一天服用大量催泄剂进行3个小时以上的腹泻，在检查过程中需通入大量空气使肠道膨胀以便于检测，检查过程中还伴随着牵拉感部分受检者难以耐受需使用麻醉手段。其次检测过程中对检测人员具有较高要求，否则会出现肠道穿孔、漏检等风险。此外，其对于远端肠道具有漏检风险，而近端结肠又可能漏检部分息肉等癌症潜在风险，导致不同患癌部位的检出结果不一致等问题。乙状结肠镜检查虽然作为金标准，但是其检查要求高，费用高，患者检查过程繁琐且痛苦，漏检及检测结果不一致等缺点也尤为明显。

粪便隐血免疫化学检测可根据患者粪便中的血红蛋白量确定患者是否存在便隐血，具有73％的结直肠癌敏感性，此技术存在约30％的假阳。此技术干扰因素众多，饮食习惯、取材部位、口腔流血等均可直接影响最终检测结果。另外，此试剂盒市售差异明显，不同试剂盒的性能参差不齐，导致检测结果差异巨大。

目前市售粪便隐血联合粪便DNA检测为美国FDA于2014年批准的“Cologuard”产品，其针对性的检测便隐血、Kras突变、NDRG4/BMP3基因甲基化状态，具有92.3％的结直肠癌敏感性但特异性仅有86.6％。此技术也有相应的缺点导致难以大量使用。1.此试剂盒为进口试剂，在购买等方面相对困难。2.此试剂盒针对美国人群，在中国人群中检测时敏感度降低。3.此试剂盒特异性相对较低，将产生大量“假阳”，造成受检者恐慌情绪。

甲基化检测试剂盒目前市场相对复杂。有的使用血浆检测Septin 9基因甲基化，但敏感性约70％，难以满足临床要求。有的使用高通量测序，检测1000-3000个甲基化位点，具有可以媲美乙状结肠镜的敏感度，但试剂盒成本极高，不满足大量筛查的条件。有的检测单一基因的单一甲基化位点，但是无法有效解决样本人源DNA浓度偏低、降解严重等问题，致使试剂盒敏感度不稳定无法形成健全的检测体系。有的使用MS-PCR等检测手段，费用低廉，但是检测方法灵敏度差，仅适用于学院科研等使用。

调查表明，绝大多数患者拒绝进行乙状结肠镜检查而选择无创筛查的手段进行结直肠癌检测，而无创筛查中粪便核酸检测结直肠癌具有得天独厚的优势，每克正常人粪便样本中存在75-120万肠道脱落细胞，而腺瘤、结直肠癌患者脱落的细胞将更多。脱落的正常细胞与癌细胞随着***物往远端迁移并排出，期间部分脱落细胞在迁移的过程中破裂、释放出DNA并发生降解。

目前市售的粪便样本甲基化检测结直肠癌试剂盒尚有较多缺点。检测敏感度、特异性难以满足替代或接近于替代乙状结肠镜检查的功能；粪便样本的保存、提取与亚硫酸氢盐转化存在技术难点；检测试剂盒的检测内容混乱而没有明确的研究基因信息等；试剂盒检测成本高居不下，临床应用价值被降低等。

发明内容

本发明的主要目的，在于提供一种用于进展期腺瘤、结直肠癌相关基因多位点甲基化检测的粪便检测试剂盒，该试剂盒包括用于大量提取和转化粪便DNA的组合物，以及用于检测进展期腺瘤、结直肠癌相关基因多位点甲基化检测的引物和探针组合物，其中，所述大量提取和转化粪便DNA的组合物按体积比包括：

1)5-35mL Buffer SPB；

2)50～1000μL Buffer SLS；

3)1-2mL Buffer SDL；

4)100-800μL Buffer DTE；

5)100-800μL Buffer BCB；

6)10-300μL Buffer DPB；

7)20-800μL Buffer DBB；

8)500～750μL Buffer BDD；

9)500～750μL Buffer DW1；

10)500～750μL Buffer DW2；

11)30～200μL Buffer DTE。

优选地，所述Buffer SPB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、50～500mMNaCl、10～70％无水乙醇；所述Buffer SLS包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、10～20％SDS。

优选地，所述Buffer SDL包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、0.5～5％PVP10和0.5～3.5M醋酸钠；所述Buffer DTE包括10～20mM Tris，5～10mM的EDTA。

优选地，所述Buffer BCB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris及0.5～5M亚硫酸盐；所述Buffer DPB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、20～1000mM对苯二酚。

优选地，所述Buffer DBB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris及3～5.5M异硫氰酸胍；所述Buffer BDD包括20～400mM Tris，20～500mM EDTA，20～500mM NaOH，60～100％乙醇。

优选地，所述Buffer DW1包括150～400mM Tris，40～100mM EDTA，2～5M异硫氰酸胍，40～70％乙醇；所述Buffer DW2包括300～700mM Tris，0.8～1.2M NaCl，70～90％乙醇；所述Buffer DTE包括10～20mM Tris，5～10mM EDTA。

优选地，所述的引物和探针组合物包括：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：131。

优选地，所述的引物和探针组合物包括表2的组合中的至少一种或多组合联合检测，其中ACTB基因为看家基因：

表2进展期腺瘤、结直肠癌检测引物探针单组信息

进一步优选地，所述所述的引物和探针组合物包括各组合单独检测、不同组合联合检测与单组合重复检测。

进一步地，其中ACTB基因用于质控提取、转化过程中的提取浓度与评价样本“阴阳性”结果的判断依据。

进一步地，所述的ACTB基因选用相关ACTB基因的保守区域，并可区分转化前后序列差异。

在本发明中，所述的甲基化相关基因为MAL/SDC2/TFPI2/Vimentin四个基因。

本发明针对MAL/SDC2/TFPI2/Vimentin四个基因的启动子甲基化区域使用结直肠癌组织样本、进展期腺瘤组织样本、癌旁组织样本经过核酸提取与亚硫酸氢盐转化，将亚硫酸氢盐转化产物ssDNA使用测序引物进行扩增，将测序引物扩增片段进行Sanger测序，确定各个基因启动子甲基化区域中的甲基化热点区域。

针对Sanger测序结果，确定组织样本中MAL/SDC2/TFPI2/Vimentin四个基因的甲基化热点CpG位点中具有高敏感性与特异性的位点。

针对确定的MAL/SDC2/TFPI2/Vimentin四个基因甲基化热点区域，设计引物探针，用于荧光PCR实验。

本发明避免了磁珠杂交捕获等效率低下、费用昂贵的目的模板富集程序，使用粪便样本提取与转化同步进行的方法，获得更高浓度的模板DNA，提高了样本检测敏感性、检测方法的稳定性。

本发明使用时，包括了大量提取转化粪便DNA步骤，具体包括如下的粪便样本收集、裂解、沉淀、亚硫酸氢盐转化、核酸纯化与回收等步骤：

1.取5～35mL样本保护液SPB至离心管中，再取1～5g新鲜粪便样本至管中，充分振荡混匀；

2.先加入50～1000μL 20％SDS，颠倒混匀，再加入50～500μL蛋白酶K，颠倒混匀后置恒温水浴锅70℃水浴5～30min；

3.将离心管转至室温水浴3min，10000g离心1min；

4.取2～6mL上清于新的离心管中，加入1～2mL去抑制液SDL上下颠倒混匀，10000g离心2min；

5.取全部上清于新的离心管中，再加2～5mL预冷有机溶剂，上下颠倒混匀，12000g离心10min，弃上清；

6.往离心管加入100～800μL洗脱液DTE，涡旋混匀至沉淀散开；

7. 12000g离心2min，吸取全部液体至离心管，再往离心管加100～800μL转化液BCB；

8.再往离心管加入10～300μL核酸保护液DPB，混匀后瞬离；

9.将离心管放在扩增仪器上转化；

10.完成转化后，加入200～800μL结合液DBB和300～700μL无水乙醇，充分振荡混匀；

11.将混合液体加到纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

12.将剩余转移至纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

13.加入500～750μL洗涤液BDD于纯化柱中，室温静置5～20min，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

14.加入500～750μL洗涤液DW1于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

15.加入500～750μL洗涤液DW2于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

16.换用新的收集管，12000g离心2min；

17.丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；

18.小心滴加30～200μL洗脱液DTE于纯化柱膜上，60℃孵育1～5min；

19. 12000g离心2min，得到转化后的人类粪便DNA。

将纯化后回收的ssDNA使用结直肠癌相关基因MAL/SDC2/TFPI2/Vimentin四个基因的多个CpG甲基化位点进行联合检测。

本发明使用优选的引物探针组合针对结直肠癌粪便样本、进展期腺瘤粪便样本、健康人粪便样本进行检测，确定多甲基化位点联合检测的引物探针组合检测性能。

本发明试剂盒中的大量提取及转化粪便DNA组合物，可将人源粪便样本进行裂解、沉淀后用于亚硫酸氢盐转化，将转化后纯化得到的ssDNA直接用于多组合联合甲基化检测，解决了粪便样本中人源基因组含量偏低、粪便中降解的基因组经亚硫酸氢盐转化后回收量过低、提取与亚硫酸氢盐转化获得ssDNA的成本较高的问题。

本发明试剂盒的引物和探针，使用SDC2/MAL/TFPI2/Vimentin四个基因启动子甲基化联合检测的手段，解决了目前甲基化检测结直肠癌中检测不稳定、敏感度不足、特异性不足等问题。

1.本发明试剂盒检测使用的粪便样本，可提取后转化，操作简便、快速，回收的样本浓度更高。

2.本发明试剂盒检测结直肠癌、进展期腺瘤费用低廉。

3.本发明试剂盒对结直肠癌、进展期腺瘤具有很高敏感度与特异性。

4.本发明试剂盒使用四个基因的不同引物探针组合，选择不同组合可有不同的敏感度与特异性。

5.本发明试剂盒使用四个基因的不同引物探针组合，可满足早期筛查、辅助诊断等不同需求。

附图及说明

图1为不同样本Sanger测序结果。

图2为不同引物探针使用细胞系样本考察性能结果。

图3为部分粪便样本检测结果。

具体实施方式

通过以下具体实施例进一步说明本发明的具体实施方式

实施例1

本发明使用核酸提取试剂盒(厦门艾德生物医药科技股份有限公司产品，货号：ADx-FF01 c1806264)对结直肠癌组织样本、进展期腺瘤组织样本、癌旁组织样本进行DNA提取。提取步骤如下：

1.根据FFPE切片组织面积的大小，刮取1～5片FFPE样品至1.5mL离心管中，加入1mL二甲苯，振荡混匀10s；

2.室温13000×g离心2min，小心去除上清(勿吸到沉淀)；

3.加入1mL无水乙醇，振荡混匀10s，室温下13000×g离心2min，小心去除上清(勿吸到沉淀)；

4.室温开盖放置10min或37℃下开盖放置5min，使乙醇充分挥发。

5.加入180μL Buffer DTL及20μL Proteinase K Solution，振荡混匀，56℃消化1h，如样品量较多，可消化过夜；

6.加入10μL Buffer DES，混匀后放入温度已升至90℃的恒温加热器中，孵育1h；

7.掌式离心机离心5～10s。如有需要，可加入2μL 100mg/mL RNase A，室温放置5min以去除RNA；

8.加入200μL Buffer DTB和200μL无水乙醇，振荡混匀后用掌式离心机离心5～10s；

9.将全部液体转移至DNA吸附柱中，10000×g离心1min，倒掉收集管中的液体；

10.往DNA吸附柱中加入600μL Buffer DW1，10000×g离心1min，倒掉收集管中的液体；

11.往DNA吸附柱中加入600μL Buffer DW2，10000×g离心1min，丢弃收集管；

12.换用新的收集管，13000×g离心3min，丢弃收集管；

13.将吸附柱小心转移至干净的1.5mL离心管中；往DNA吸附膜中心滴加30～100μLBuffer DTE(勿碰到DNA吸附膜)，室温静置1～5min，13000×g离心1min，收集样品DNA并保存。

提取出的组织DNA样本使用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(QIAGEN公司产品，货号：59826)进行亚硫酸氢盐转化，转化操作如下：

1.将提取出的组织样本DNA稀释至50ng/uL；

2.将稀释的样本DNA 20uL、Bisulfite Solution 85uL、DNA Protect Buffer35uL进行混合于200uL离心管，掌式离心机震荡混匀15s后瞬时离心；

3.放置于普通PCR仪上运行程序：95℃5min，60℃20min，95℃5min，60℃20min，20℃保存。

4.将上述转化液转移至干净的1.5mL离心管中，加入310uL Buffer BL、250uL无水乙醇，掌式离心机震荡混匀15s后瞬时离心；

5.将以上全部液体转移至吸附柱中，13000g离心1min，倒掉收集管中的液体；

6.加入500uL Buffer BW于吸附柱中，13000g离心1min，倒掉收集管中的液体；

7.加入500uL Buffer BD于吸附柱中，室温静置15min，13000g离心1min，倒掉收集管中的液体；

8.加入500uL Buffer BW于吸附柱中，13000g离心1min，倒掉收集管中的液体；

9.重复一次第8步；

10.加入250uL无水乙醇于吸附柱中，13000g离心1min；

11.换用新的收集管，空甩13000g离心2min；

12.换用1.5mL离心管，往吸附柱膜中心滴加15uL Buffer EB，室温放置1min，15000g离心1min；

13.收集转化产物ssDNA并保存。

针对四个基因的启动子CpG位点设计测序引物，每个基因设计4-8组测序引物组合将CpG岛进行覆盖，其中CpG岛位置可能涵盖启动子区、外显子、内含子等区域。

使用PCR反应体系扩增测序引物，将扩增产物进行Sanger测序，分析测序结果，查找甲基化热点位点。具体操作步骤如下。

结直肠癌组织样本、进展期腺瘤组织样本、癌旁组织样信息如表3-5所示：

表3结直肠癌组织样本信息

表4进展期腺瘤组织样本信息

表5癌旁组织样本信息

将亚硫酸氢盐转化产物ssDNA使用以下PCR反应体系进行扩增：

组织核酸ssDNA：20-80ng

5×PCR Buffer：5-10uL

MgCL2：1-8mmol

dNTP：0.1-0.8mmol

Taq DNA聚合酶：1-5U

上游测序引物：0.1-0.8umol

上游测序引物：0.1-0.8umol

补水至总体系：25-50uL

普通PCR仪扩增组织样本，检测各基因甲基化程序如下所示：

第一阶段：95℃5min

第二阶段：95℃30s，55℃30s，72℃30s，40个循环

将测序引物扩增产物进行Sanger测序，汇总测序结果，发现四基因中甲基化热点区域，且在癌旁组织中甲基化水平相对较低，测序结果如下所示，其中“^MC”位置为建议进行检测结直肠癌甲基化位点：

分析甲基化Sanger测序结果时，根据测序结果峰图中的CpG位点中“C”碱基与“T”碱基的有无判定是否发生甲基化，根据“C”碱基与“T”碱基的峰高低占比确定甲基化比例的高低。以肉眼可见的CpG位点中的“C”存在情况进行各个甲基化位点敏感度与特异性统计，确定每个位点甲基化程度与不同类型样本的区分度。

其中MAL基因序列中结直肠癌组织敏感度74％、进展期腺瘤组织敏感度86％、癌旁组织特异性92％，“^MC”甲基化热点位点如下所示：

^MCGTT^MCGTAG^MCGGGGTTT^MCGAAGAGGTTTAGGG^MCGGTGTT^MCG^MCGG^MCGTT^MCGGGT^MCGGGTTTTT^MCGGGG^MCGTGGGG^MCGGGGGG^MCGGGGTTGGG^MCGG^MCGGT^MCGGGGTTTTTTTTTTTTTTGTTT^MCGGGTTTTTTTGTTTTTAATT^MCG^MCG^MCG^MCGGGGG^MCGTTTAGGTTATTGGGTTT^MCG^MCGGAGTTAG^MCGAGAGGTTTG^MCG^MCGGAGTTTGAG^MCGG^MCGTT^MCGTTT^MCGTTTTAAGGT^MCGA^MCGTTAGTA^MCGT^MCGTTATGGTTTT^MCGTAG^MCGG^MCGA^MCGGGGGGTAGTATTTTGTTTAGTGG

其中SDC2基因序列中结直肠癌组织敏感度84％、进展期腺瘤组织敏感度84％、癌旁组织特异性98％，“^MC”甲基化热点位点如下所示：

TAGGAGTTTTGGTTTGT^MCGGTGAGTAGAGT^MCGG^MCGTAGTTATAG^MCG^MCGGAGT^MCG^MCGG^MCGTTTATTGGTTTT^MCGGAGTTGTTAAT^MCGG^MCGTGTAATTTTGTAGGAATTTTTTTCGGGTTTATTTGGGAGTTATATTGTCGTTTTTTTTTTTTAGTCGTTTAGGGGAGTTCGGAGAAGTAGGTTTAGGAGGGAGGGAGTTAGAGGAAAAGAAGAGGAGGAGAAGGAGGAGGATTCGGGGAGGGAGGCGCGGCGCGGGAGGAGGAGGGGCGTAGTCGCGGAGTTAGTGGTTTCGTTTGGACGCGTTGTTTTTTAGATATTTT^MCGGAGTTTTAGT^MCG^MCG^MCGGAT^MCG^MCG^MCGTTTT^MCGT^MCGTTTTGTTTTTAAATTTTTGT^MCGTAGTTTTTTTTTAAGTTAG^MCGAATTTATTTTTTAAAATTAGAAATTGAATTT^MCGGTA^MCGGGAAAGGAGTT^MCG^MCGGAGGAGTAAAATTATAGTAGAGTAAGAAGAGTTTTAGAGAGTAGTTTTTTCGGAGTATTAATTTCGTGTCGGGAGTGTAGAAATTAATAAGTGAGAGGG^MCGT^MCG^MCGTTTT^MCGGGG^MCGTAGTTG^MCGGG^MCGG^MCGGGAGTAGG^MCGTAGGAGGAGGAAG^MCGAG^MCGTTTT^MCGAGTTT^MCGAGTT^MCGAGTTTT^MCGAGTTTGAGT^MCGTAAT^MCGTTG^MCGGTATTTTGTTT^MCGGATT^MCGTGTG^MCG^MCGGGTTG^MCGT^MCGAG^MCGTTGGGTAGGAGGTTT^MCGTTTTGTTTTGGTTGTAAGTAG^MCGGTTGGGAGTAGT^MCGGTTTTTGGGGAATATG^MCGG^MCG^MCG^MCGTGGATTTTGTTTATTTTGGGTTTGGTGGTTTG^MCGTGT^MCGG^MCGGAGT^MCGGTGAGTGGGTTAGG^MCGGAGGATG^MCG^MCG^MCGTT

其中TFPI2基因序列中结直肠癌组织敏感度90％、进展期腺瘤组织敏感度96％、癌旁组织特异性100％，“^MC”甲基化热点位点如下所示：

^MCG^MCGGGGG^MCGG^MCGGGGTGATAGTTTT^MCGTGTATGAATTAGTTATTTTTTAGGTTT^MCGTTT^MCGG^MCGGGGGT^MCGGT^MCGGA^MCGTT^MCGTTT^MCGTATAAAG^MCGGGTATT^MCGGGT^MCGTTTGGAGTAGAAAGT^MCG^MCGTATTTTTTTT^MCGTTAGG^MCGTTTTTT^MCGGA^MCGTTTTGTTTAG^MCGGGT^MCGTT^MCGATTTTTTGTATTATGGATTT^MCGTT^MCGTTTTTTGGGGTTGT

其中Vimentin基因序列中结直肠癌组织敏感度86％、进展期腺瘤组织敏感度80％、癌旁组织特异性96％，“^MC”甲基化热点位点如下所示：

GTTGGGATGGTAGTGGGAGGGGATTTTTTTTTTTAA^MCGGGGTTATAAAAATAG^MCGTTTT^MCGG^MCGGGGTTTAGTTTTTTGTTATTTT^MCGTTT^MCGAGGTTTT^MCG^MCGTTAGAGA^MCGTAGT^MCG^MCGTTTTTATTATTTATATTTAT^MCG^MCGTTTT^MCGTT^MCGTTTTTTTTT^MCGGGAGTTAGTT^MCG^MCGTTAT^MCGT^MCGT^MCGTTTAGGTTAT^MCGTTATTTTT^MCGTAGTTATGTTTATTAGGTT^MCGTGTTTT^MCGTTTTTTTAT^MCGTAGGATGTT^MCGG^MCGGTT^MCGGGTAT^MCG^MCGAGT^MCGGT^MCGAGTTTTAGT^MCGGAGTTA^MCGTGATTA^MCGTTTATT^MCGTATTTATAGTTTGGGTAG^MCG^MCGTTG^MCGTTTTAGTATTAGT

实施例2

针对MAL/SDC2/TFPI2/Vimentin四个基因启动子甲基化区域设计引物探针，引物探针位置针对实施例1所述甲基化热点区域重点设计，所述设计引物探针序列SEQ IDNO.1-131如表6所示：

表6引物探针信息

使用核酸提取试剂盒(厦门艾德生物医药科技股份有限公司产品，货号：ADx-TI01c1814560)对结直肠癌细胞系HCT15/HCT116进行DNA提取，提取DNA步骤如下所示：

1.取20-60mg细胞系样本加入1mL生理盐水，震荡混匀，1200g离心2min，小心去除上清；

2.加入180uL Buffer DTL，加入20uL Proteinase K Solution，震荡混匀，56℃消化至获得较清澈的溶解液，可消化过夜；

3.取出样品管，用掌式离心机离心5-10s；

4.加入200uL Buffer DTB和200uL无水乙醇，震荡混匀后用掌式离心机离心5-10s。

5.将全部液体转移至DNA吸附柱中，8000g离心1min，倒掉收集管中的液体；

6.往DNA吸附柱中加入600uL Buffer DW1，8000g离心1min，倒掉收集管中的液体；

7.往DNA吸附柱中加入600uL Buffer DW2，8000g离心1min，倒掉收集管中的液体；

8.换用新的收集管，12000g离心3min，丢弃收集管；

9.将吸附柱小心转移至干净的1.5mL离心管中，往DNA吸附柱膜中心滴加100uLBuffer DTE，室温静置1-5min，12000g离心1min，收集样品DNA并保存。

将提取出的细胞系DNA样本使用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(QIAGEN公司产品，货号：59826)进行亚硫酸氢盐转化，亚硫酸氢盐转化步骤如下所示：

1.将提取出的组织样本DNA稀释至50ng/uL；

2.将稀释的样本DNA 20uL、Bisulfite Solution 85uL、DNA Protect Buffer35uL进行混合于200uL离心管，掌式离心机震荡混匀15s后瞬时离心；

3.放置于普通PCR仪上运行程序：95℃5min，60℃20min，95℃5min，60℃20min，20℃保存。

4.将上述转化液转移至干净的1.5mL离心管中，加入310uL Buffer BL、250uL无水乙醇，掌式离心机震荡混匀15s后瞬时离心；

5.将以上全部液体转移至吸附柱中，13000g离心1min，倒掉收集管中的液体；

6.加入500uL Buffer BW于吸附柱中，13000g离心1min，倒掉收集管中的液体；

7.加入500uL Buffer BD于吸附柱中，室温静置15min，13000g离心1min，倒掉收集管中的液体；

8.加入500uL Buffer BW于吸附柱中，13000g离心1min，倒掉收集管中的液体；

9.重复一次第8步；

10.加入250uL无水乙醇于吸附柱中，13000g离心1min；

11.换用新的收集管，空甩13000g离心2min；

12.换用1.5mL离心管，往吸附柱膜中心滴加15uL Buffer EB，室温放置1min，15000g离心1min；

13.收集转化产物ssDNA并保存。

转化后的ssDNA使用PCR反应体系检测不同引物探针扩增性能，确定各个组合在细胞系样本中的扩增效率，PCR扩增体系如下：

细胞系核酸ssDNA：20-80ng

5×PCR Buffer：5-10uL

MgCL2：1-8mmol

dNTP：0.1-0.8mmol

Taq DNA聚合酶：1-5U

上游扩增引物：0.1-0.8umol

上游扩增引物：0.1-0.8umol

PCR检测探针：0.1-0.8umol

补水至总体系：25-50uL

荧光PCR仪扩增细胞系样本，检测各基因引物探针性能程序如下所示：

第一阶段：95℃5min

第二阶段：95℃30s，65℃30s，72℃30s，15个循环

第三阶段：95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环，60℃时收集荧光信号

实验结果中，以下引物探针使用细胞系样本具有优异的扩增效率，可正常扩增的引物探针具有良好的“S”型扩增曲线，且能特异性的扩增目的区段，扩增曲线图形如图2所示，较优引物探针序列如表7所示：

表7扩增效率优异引物探针信息

实施例3

比较直接使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(QIAGEN产品，货号：51604)提取粪便样本DNA后，再使用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(QIAGEN公司产品，货号：59826)进行亚硫酸氢盐转化，与本发明在提取过程中完成提取、亚硫酸氢盐转化、洗涤纯化与回收两种样本处理方式。使用Quantus检测样本浓度，使用PCR反应体系检测不同样本提取与亚硫酸氢盐转化后的样本回收量。比较各自优缺点，具体操作步骤如下所示。

先进行提取粪便DNA后再进行亚硫酸氢盐转化法：先使用QIAamp Fast DNA StoolMini Kit(QIAGEN产品，货号：51604)提取粪便样本DNA，提取操作如下所示：

1.取1g粪便样本于10mL InhibitEx Buffer于15mL蓝盖离心管中，震荡仪震荡1min；

2.取2mL悬浊液至5mL离心管中，离心机12000rpm 1min；

3.取上清分成两支2.0mL EP管，分别600uL；

4.两支600uL离心上清液，分别加入25uL蛋白酶K、加入600uL Buffer AL震荡混匀、瞬时离心；

5. 56℃裂解10min，将裂解产物转移至2mL离心管中；

6.往裂解产物中加入600uL无水乙醇，震荡混匀、瞬时离心；

7.取以上两支产物过同一只离心柱，每次700uL，13000rpm 1min；

8.使用500uL Buffer AW1，13000rpm 1min。换用新的收集管；

9.使用500uL Buffer AW2，13000rpm 3min。换用新的收集管；

10.空甩13000rpm 3min。使用EP管替换收集管；

11.使用50uL纯化水洗脱产物，静置5min后13000rpm 1min；

12.收集提取产物，保存，待用。

再使用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(QIAGEN公司产品，货号：59826)进行亚硫酸氢盐转化，获取最终亚硫酸氢盐转化后的样本ssDNA，操作步骤如下所示：

1.将提取出的组织样本DNA稀释至50ng/uL；

2.将稀释的样本DNA 20uL、Bisulfite Solution 85uL、DNA Protect Buffer35uL进行混合于200uL离心管，掌式离心机震荡混匀15s后瞬时离心；

3.放置于普通PCR仪上运行程序：95℃5min，60℃20min，95℃5min，60℃20min，20℃保存。

4.将上述转化液转移至干净的1.5mL离心管中，加入310uL Buffer BL、250uL无水乙醇，掌式离心机震荡混匀15s后瞬时离心；

5.将以上全部液体转移至吸附柱中，13000g离心1min，倒掉收集管中的液体；

6.加入500uL Buffer BW于吸附柱中，13000g离心1min，倒掉收集管中的液体；

7.加入500uL Buffer BD于吸附柱中，室温静置15min，13000g离心1min，倒掉收集管中的液体；

8.加入500uL Buffer BW于吸附柱中，13000g离心1min，倒掉收集管中的液体；

9.重复一次第8步；

10.加入250uL无水乙醇于吸附柱中，13000g离心1min；

11.换用新的收集管，空甩13000g离心2min；

12.换用1.5mL离心管，往吸附柱膜中心滴加15uL Buffer EB，室温放置1min，15000g离心1min；

13.收集转化产物ssDNA并保存。

将收集的亚硫酸氢盐转化产物ssDNA使用Quantus的ssDNA检测试剂盒进行核酸浓度定量，使用荧光PCR仪测定产物浓度Cq值。

进行粪便样本裂解沉淀DNA后直接进行亚硫酸氢盐转化法：一次性从粪便样本进行保护、裂解、沉淀获得的DNA直接用于亚硫酸氢盐转化，进而获得转化后的ssDNA。进行样本DNA浓度质控。使用以下步骤进行粪便样本的提取与亚硫酸氢盐转化同步进行：

1.取6mL Buffer SPB(50mM EDTA、50mM Tris、100mM NaCl、30％无水乙醇)至离心管中，再取1g粪便样本至管中，充分振荡混匀；

2.先加入500μL Buffer SLS(50mM EDTA、50mM Tris、20％SDS)，颠倒混匀，再加入50μL蛋白酶K，颠倒混匀后置恒温水浴锅70℃水浴10min；

3.将离心管转至室温水浴3min，10000g离心1min；

4.取5mL上清于新的离心管中，加入1mL Buffer SDL(50mM EDTA、50mM Tris、2％PVP10和1M醋酸钠)上下颠倒混匀，10000g离心2min；

5.取全部上清于新的离心管中，再加3mL异丙醇，上下颠倒混匀，12000g离心10min，弃上清；

6.往离心管加入250μL Buffer DTE(20mM Tris，10mM EDTA)，涡旋混匀至沉淀散开；

7.12000g离心2min，吸取全部液体至离心管，再往离心管加500μL Buffer BCB；

8.再往离心管加入50μL Buffer DPB(50mM EDTA、50mM Tris、100mM对苯二酚)，混匀后瞬离；

9.将离心管放在扩增仪器上转化；

10.完成转化后，加入600μL Buffer DBB(50mM EDTA、50mM Tris及4.5M异硫氰酸胍)和600μL无水乙醇，充分振荡混匀；

11.将混合液体加到纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

12.将剩余液体全部转移至纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

13.加入700μL Buffer BDD(50mM Tris，50mM EDTA，50mM NaOH，90％乙醇)于纯化柱中，室温静置15min，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

14.加入700μL Buffer DW1(50mM Tris，50mM EDTA，2M异硫氰酸胍，50％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

15.加入700μL Buffer DW2(50mM Tris，0.8M NaCl，80％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

16.换用新的收集管，12000g离心2min；

17.丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；

18.滴加50μL Buffer DTE(20mM Tris，10mM EDTA)于纯化柱膜上，60℃孵育2min；

19. 12000g离心2min，得到转化后的人类粪便DNA。

将收集的亚硫酸氢盐转化产物ssDNA使用Quantus的ssDNA检测试剂盒进行核酸浓度定量，使用荧光PCR仪测定产物浓度Cq值。

比较两种获得亚硫酸氢盐转化后产物ssDNA的质控数据如表8所示：

表8不同获得产物方法实验结果

比较两种获得亚硫酸氢盐转化后ssDNA方法的结果，其中使用Quantus的ssDNA检测试剂盒进行样本回收浓度质控，其中：先提取DNA再进行亚硫酸氢盐转化的方法获得10例样本终浓度均值30.4ng/uL，qPCR检测Cq均值19.54；进行粪便样本裂解、沉淀DNA后直接进行亚硫酸氢盐转化法获得10例样本终浓度均值76.5ng/uL，qPCR检测Cq均值16.67。即使用粪便样本裂解、沉淀DNA后直接进行亚硫酸氢盐转化法可获得更大量的DNA总量，相比传统获得转化后的ssDNA的方法具有简便、快速、高效等优点，且相比链霉亲和素磁珠杂交捕获法，可将提取费用降低至1/5以下，甚至1/10以下。可减轻受检人员经济负担，对将粪便样本检测结直肠癌甲基化试剂盒用于早筛提供经济支持。

实施例4

将结直肠癌粪便样本、大肠进展期腺瘤粪便样本、健康人粪便样本进行裂解、沉淀DNA后直接进行亚硫酸氢盐转化法，将获得的亚硫酸氢盐转化后ssDNA进行荧光PCR检测，操作步骤如下所示：

1.取5～35mL样本保护液SPB(10～500mM EDTA、10～500mM Tris、50～500mMNaCl、10～70％无水乙醇)至离心管中，再取1～5g新鲜粪便样本至保护液的管中，充分振荡混匀；

2.先加入50～1000μL 20％SDS，颠倒混匀，再加入50～500μL蛋白酶K，颠倒混匀后置恒温水浴锅70℃水浴5～30min；

3.将离心管转至室温水浴3min室温平衡，10000g离心1min；

4.取2～6mL上清于新的离心管中，加入1～2mL去抑制液SDL(10～500mM EDTA、10～500mM Tris、0.5～5％PVP10和0.5～3.5M醋酸钠)上下颠倒混匀，10000g离心2min；

5.取全部上清于新的离心管中，再加2～5mL预冷有机溶剂(异丙醇或乙醇)，上下颠倒混匀，12000g离心10min，弃上清；

6.往离心管加入100～800μL洗脱液DTE(10～20mM Tris，5～10mM EDTA)，涡旋混匀至沉淀散开；

7. 12000g离心2min，吸取全部液体至离心管，再往离心管加100～800μL转化液BCB(10～500mM EDTA、10～500mM Tris及0.5～5M亚硫酸盐，至少含亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、焦亚硫酸钠和亚硫酸氢铵中的一种，溶液pH4.0～7.0)；

8.再往离心管加入10～300μL核酸保护液DPB(10～500mM EDTA、10～500mM Tris、20～1000mM对苯二酚)，混匀后瞬离；

9.将离心管放在扩增仪器上转化；

10.完成转化后，加入200～800μL结合液DBB(10～500mM EDTA、10～500mM Tris及3～5.5M异硫氰酸胍)和300～700μL无水乙醇，充分振荡混匀；

11.将混合液体加到纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

12.将剩余转移至纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

13.加入500～750μL洗涤液BDD(20～400mM Tris，20～500mM EDTA，20～500mMNaOH，60～100％乙醇)于纯化柱中，室温静置5～20min，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

14.加入500～750μL洗涤液DW1(150～400mM Tris，40～100mM EDTA，2～5M异硫氰酸胍，40～70％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

15.加入500～750μL洗涤液DW2(300～700mM Tris，0.8～1.2M NaCl，70～90％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

16.换用新的收集管，12000g离心2min；

17.丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；

18.小心滴加30～200μL洗脱液DTE(10～20mM Tris，5～10mM EDTA)于纯化柱膜上，60℃孵育1～5min；

19. 12000g离心2min，得到转化后的人类粪便DNA。

使用荧光PCR法检测实施例2中选出的引物探针组合，其中样本信息如表9-11所示：

表9结直肠癌粪便样本信息

表10进展期腺瘤粪便样本信息

表11肠癌特异性人群粪便样本信息

使用荧光PCR法检测以上结直肠癌粪便样本、进展期腺瘤粪便样本、肠癌特异性人群群粪便样本，PCR反应体系如下所示：

结直肠癌、进展期腺瘤、肠癌特异性人群群粪便样本ssDNA：20-80ng

5×PCR Buffer：5-10uL

MgCL2：1-8mmol

dNTP：0.1-0.8mmol

Taq DNA聚合酶：1-5U

上游扩增引物：0.1-0.8umol

上游扩增引物：0.1-0.8umol

PCR检测探针：0.1-0.8umol

补水至总体系：25-50uL

荧光PCR仪扩增细胞系样本，检测各基因引物探针性能程序如下所示：

第一阶段：95℃5min

第二阶段：95℃30s，65℃30s，72℃30s，15个循环

第三阶段：95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环。60℃时收集荧光信号。

使用筛选出的引物探针组合进行检测结直肠癌粪便样本、进展期腺瘤粪便样本、肠癌特异性人群群粪便样本提取转化后进行荧光PCR检测，将每组目的甲基化相关基因检测组合Cq值减去该样本的ACTB基因检测Cq值以获得不同组合的ΔCq值，以不同ΔCq的cut-off值进行判定不同基因的检出性能，检测结果如图3所示。检测结果中以下单组合检测结果较优，检测结果如表12-13所示：

表12单组合引物探针单管检测粪便样本性能信息

表13单组合引物探针重复2管检测粪便样本性能信息

4个基因组合结直肠癌粪便样本、进展期腺瘤粪便样本、肠癌特异性人群粪便样本，使用多组合联合检测时，检测结果如表14-16所示：

表14两组合引物探针检测粪便样本性能

表15三组合引物探针检测粪便样本性能

表16四组合引物探针检测粪便样本性能

即有组合越多时检测敏感度越高，但同时特异性有下降表现。

序列表

<110> 厦门艾德生物医药科技股份有限公司

<120> 一种用于粪便检测进展期腺瘤、结直肠癌相关基因甲基化位点的试剂盒

<160> 131

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtttaggtt attgggtttc gc 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttaggttatt gggtttcgc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggggcgtt taggttattg 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgagaggttt gcgcggagt 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagttagcga gaggtttgc 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgggtttcgc ggagttagc 19

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgttcgtttc gttttaaggt cgac 24

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcgttcgttt cgttttaagg tc 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgttcgtttc gttttaaggt c 21

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgagaggttt gcgc 14

<210> 12

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgaaacgaac gccg 14

<210> 13

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgtcgttatg gttttc 16

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaacgccgct caaactc 17

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cttaaaacga aacgaacgcc g 21

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acgtcgacct taaaacgaaa cg 22

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cataacgacg tactaacgtc g 21

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aaaccataac gacgtactaa cgtcg 25

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaaaaccata acgacgtact aacg 24

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

actacccccc gtcgccg 17

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

acaaaatact accccccgtc g 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

accactaaac aaaatactac 20

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gtcggtgagt agagtcggc 19

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

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<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cgcgttgttt tttagatatt ttc 23

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

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<210> 27

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

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<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tgagagggcg tcgcgttttc 20

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

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<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gtaggaggag gaagcgagc 19

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cgagtttgag tcgtaatcgt tgc 23

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gtttgagtcg taatcgttgc 20

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cgagtttgag tcgtaatcgt tgc 23

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cgtggatttt gtttattttg ggtttg 26

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

cgcgtggatt ttgtttattt tg 22

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cgttgttcgt tggcgttatt tc 22

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

agaaaagcgt tgttcgttgg c 21

<210> 38

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

cgcgactccg cgc 13

<210> 39

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

tccgcgcgac taa 13

<210> 40

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ctcccgccgc ccg 13

<210> 41

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

cgaaaactcg aactcg 16

<210> 42

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

cggattcgtg tgcgc 15

<210> 43

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

tgcgtgtcgg cgg 13

<210> 44

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

ttcccgcgaa ccg 13

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

acaactccga aaaccaataa acg 23

<210> 46

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

cgccgattaa caactccg 18

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

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<210> 48

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

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<210> 49

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

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<210> 50

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

cgaaactcga aaacgctcg 19

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

acaaaatacc gcaacgatta cg 22

<210> 52

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

gaaacaaaat accgcaacga ttacg 25

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

acgaaacctc ctacccaacg 20

<210> 54

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

tcctacccaa cgctcgacg 19

<210> 55

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

ctacttacaa ccaaaacaaa acg 23

<210> 56

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

tcctccgcct aacccactc 19

<210> 57

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

cgactaaacc aaaccgcaat tctcg 25

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

cctctacgac taaaccaaac cg 22

<210> 59

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

cgtttcggcg ggggtc 16

<210> 60

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

gtttcggtgg gggtcg 16

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

attttttagg tttcgtttcg gc 22

<210> 62

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

agttattttt taggtttcg 19

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

ttatttttta ggtttcgttt c 21

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

acgttcgttt cgtataaagc 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

gtcggtcgga cgttcgtttc 20

<210> 66

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

cggtcggatg ttcgtttcg 19

<210> 67

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

gggtcggtcg gatgtttgtt tc 22

<210> 68

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

gggggtcggt cggacgt 17

<210> 69

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

gggtattcgg gtcgtttgga gt 22

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

cgggtatttg ggtcgtttgg 20

<210> 71

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

tcgtataaag cgggtattcg ggtc 24

<210> 72

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

agcgggtatt tgggtcgt 18

<210> 73

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

cgtataaagt gggtattcgg gtc 23

<210> 74

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

agtgggtatt tgggtcgttt gg 22

<210> 75

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

cgttcgtttc gtataaagc 19

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

tggttcgttg cgtttttttc 20

<210> 77

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

cggggtttta tggttcgttg c 21

<210> 79

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

tcgattttgt tgtttttttt gac 23

<210> 81

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

tgtttaggag ttaataggta tttggtc 27

<210> 82

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

tcgttttttt taggtttttg tc 22

<210> 83

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

cggacgttcg tttcg 15

<210> 84

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

ctccaaacga cccg 14

<210> 85

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

cgcgtatttt ttttcg 16

<210> 86

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

cttctctccc caaccg 16

<210> 87

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

aggttgtatt gggcg 15

<210> 88

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

cggagagggc gtag 14

<210> 89

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

tcccccctac caacg 15

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

ccaaacgacc cgaatacccg 20

<210> 91

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

cgcgactttc tactccaaac g 21

<210> 92

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

tctactccaa acgaccc 17

<210> 93

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

acgcctaacg aaaaaaaata cg 22

<210> 94

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

gaaaaaacgc ctaacgaaaa aaaatacg 28

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

acaaaacgtc cgaaaaaacg 20

<210> 96

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

ctaaacaaaa cgtccgaaaa aacg 24

<210> 97

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

cccgctaaac aaaacgtccg 20

<210> 98

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

gacccactaa acaaaacgtc cg 22

<210> 99

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

accaacaaat atctaaccg 19

<210> 100

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

acgaccaaat acctattaac tcct 24

<210> 101

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

cgattaaaaa aaaaaactcc taaaacg 27

<210> 102

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 102

acgcctacac gaaaccccat aacc 24

<210> 103

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 103

acgaaactta aaaaacgcct acacg 25

<210> 104

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 104

aaattctatc cccttccgaa cg 22

<210> 105

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 105

ccttccgaac gaaaaaacct ctac 24

<210> 106

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 106

ggaggggatt ttttttttta ac 22

<210> 107

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 107

gatggtagtg ggaggggatt 20

<210> 108

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 108

ttgggatggt agtgggaggg 20

<210> 109

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 109

gtttttatta tttatattta tcgcgttttc 30

<210> 110

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 110

cgcgttttta ttatttatat ttatcgc 27

<210> 111

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 111

tcgcgttaga gacgtagtcg c 21

<210> 112

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 112

aggatgttcg gcggttc 17

<210> 113

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 113

ttatcgtagg atgttcggc 19

<210> 114

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 114

aggttcgtgt tttcgttttt ttatc 25

<210> 115

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 115

agtattagtc gtagttttta cgtttc 26

<210> 116

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 116

cgttttagta ttagtcgtag tttttac 27

<210> 117

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 117

gcgcgttgcg ttttagtatt agtc 24

<210> 118

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 118

cgccgaaaac gct 13

<210> 119

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 119

cgggagttag ttcgc 15

<210> 120

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 120

cgcgagtcgg tcg 13

<210> 121

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 121

catacacgcc gcccg 15

<210> 122

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 122

cgaaaacctc gaaacgaaaa taac 24

<210> 123

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 123

tctctaacgc gaaaacctcg aaacg 25

<210> 125

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 125

ctctaacgcg aaaacctcg 19

<210> 126

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 126

acgataacct aaacgacgac g 21

<210> 127

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 127

cgaaaaataa cgataaccta aacgac 26

<210> 128

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 128

cgaataaacg taatcacgta actccg 26

<210> 129

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 129

acgaataaac gtaatcacgt aactccg 27

<210> 130

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 130

acgaataaac gtaatcacg 19

<210> 131

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 131

gcgcacaaca aaaaaacgcg 20

<210> 132

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 132

cgcaggcgca caacaaaaaa ac 22

<210> 133

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 133

tgaggttaag tgtgattttg tggtgt 26

<210> 134

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 134

acccccaacc caacc 15

<210> 135

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 135

cctcctacaa aattcaccct ctact 25

Claims (7)

1.用于进展期腺瘤、结直肠癌相关基因多位点甲基化检测的粪便检测试剂盒，包括用于大量提取和转化粪便DNA的组合物，以及用于检测进展期腺瘤、结直肠癌相关基因多位点甲基化检测的引物和探针组合物，其中，所述大量提取和转化粪便DNA的组合物按体积比包括：

1)5-35mL Buffer SPB；

2)50～1000μL Buffer SLS；

3)1-2mL Buffer SDL；

4)100-800μL Buffer DTE；

5)100-800μL Buffer BCB；

6)10-300μL Buffer DPB；

7)20-800μL Buffer DBB；

8)500～750μL Buffer BDD；

9)500～750μL Buffer DW1；

10)500～750μL Buffer DW2；

11)30～200μL Buffer DTE；

所述Buffer SPB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、50～500mM NaCl、10～70％无水乙醇；

所述Buffer SLS包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、10～20％SDS；

所述Buffer SDL包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、0.5～5％PVP10和0.5～3.5M醋酸钠；

所述Buffer DTE包括10～20mM Tris，5～10mM的EDTA；

所述Buffer BCB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris及0.5～5M亚硫酸盐；

所述Buffer DPB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、20～1000mM对苯二酚；

所述Buffer DBB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris及3～5.5M异硫氰酸胍；

所述Buffer BDD包括20～400mM Tris，20～500mM EDTA，20～500mM NaOH，60～100％乙醇；

所述Buffer DW1包括150～400mM Tris，40～100mM EDTA，2～5M异硫氰酸胍，40～70％乙醇；

所述Buffer DW2包括300～700mM Tris，0.8～1.2M NaCl，70～90％乙醇；

所述Buffer DTE包括10～20mM Tris，5～10mM EDTA。

2.根据权利要求1所述的一种粪便检测试剂盒的使用方法，包括了大量提取转化粪便DNA步骤，所述步骤包括：

1)取5～35mL Buffer SPB至离心管中，再取1～5g粪便样本至管中，充分振荡混匀；

2)先加入50～1000μL Buffer SLS，颠倒混匀，再加入50～500μL蛋白酶K，颠倒混匀后置恒温水浴锅56～75℃水浴5～30min；

3)将离心管转至室温水浴1～5min，8000～12000g离心1～3min；

4)取2～6mL上清于新的离心管中，加入1～2mL Buffer SDL，上下颠倒混匀，8000～12000g离心1～3min；

5)取全部上清于新的离心管中，再加2～5mL异丙醇或乙醇，上下颠倒混匀，10000～14000g离心5～15min，弃上清；

6)往离心管加入100～800μL Buffer DTE，涡旋混匀至沉淀散开；

7)10000～14000g离心1～5min，吸取全部液体至离心管，再往离心管加100～800μLBuffer BCB；

8)再往离心管加入10～300μL Buffer DPB，混匀后瞬离；

9)将离心管放在扩增仪器上转化；

10)完成转化后，加入200～800μL Buffer DBB和300～700μL无水乙醇，充分振荡混匀；

11)将混合液体加到纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；

12)将剩余液体全部转移至纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；

13)加入500～750μL Buffer BDD于纯化柱中，室温静置5～20min，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；

14)加入500～750μL Buffer DW1于纯化柱中，10000～14000g离心10～60s，倒去收集管中液体，

15)加入500～750μL Buffer DW2于纯化柱中，10000～14000g离心10～60s，倒去收集管中液体；

16)换用新的收集管，10000～14000g离心1～5min；

17)丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；

18)滴加30～200μL Buffer DTE于纯化柱膜上，50～70℃孵育1～5min；

19)10000～14000g离心1～5min，得到转化后的粪便DNA。

3.如权利要求1所述的一种用于进展期腺瘤、结直肠癌相关基因多位点甲基化检测的粪便检测试剂盒，其特征在于：所述的相关基因为MAL/SDC2/TFPI2/Vimentin四个基因。

4.如权利要求1所述的一种用于进展期腺瘤、结直肠癌相关基因多位点甲基化检测的粪便检测试剂盒，其特征在于：

所述的引物和探针组合物包括：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：131。

5.如权利要求1所述的一种用于进展期腺瘤、结直肠癌相关基因多位点甲基化检测的粪便检测试剂盒，其特征在于，所述的引物和探针组合物包括如表1的组合中的至少一种或多组合联合检测：

表1进展期腺瘤、结直肠癌检测引物探针单组信息

6.如权利要求5所述的一种用于进展期腺瘤、结直肠癌相关基因多位点甲基化检测的粪便检测试剂盒，其特征在于：检测结果判读涉及到检测基因与ACTB基因的Cq值差值大小，根据差值大小确定样本的阴阳性不同检测结果。

7.如权利要求5所述的一种用于进展期腺瘤、结直肠癌相关基因多位点甲基化检测的粪便检测试剂盒，其特征在于：每个目的基因组合与ACTB基因组合的Cq值差值根据各基因性能差值数值不完全一致。

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