CN114959030B - 检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用 - Google Patents

检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114959030B
CN114959030B CN202210542498.9A CN202210542498A CN114959030B CN 114959030 B CN114959030 B CN 114959030B CN 202210542498 A CN202210542498 A CN 202210542498A CN 114959030 B CN114959030 B CN 114959030B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chr6
methylation
region
detecting
reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210542498.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114959030A (zh
Inventor
蔡迪
张良禄
董兰兰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Original Assignee
Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd filed Critical Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority to CN202210542498.9A priority Critical patent/CN114959030B/zh
Publication of CN114959030A publication Critical patent/CN114959030A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114959030B publication Critical patent/CN114959030B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种检测HCG9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用。通过检测HCG9基因甲基化来诊断膀胱癌，具有较高的特异性，可以有效地提高早期膀胱癌的检出率，且稳定性好，准确性高，易于早期诊断，对医师技术水平的依赖性较低，且无创伤性，应用前景好。

Description

检测HCG9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测HCG9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用。
背景技术
膀胱癌是全球第九位最常见的恶性肿瘤，也是男性和女性最常见的泌尿生殖***恶性肿瘤，而且男性的发病率比女性高出4倍以上。膀胱癌包括肌肉浸润性癌和非肌肉浸润性癌。几乎80％的膀胱癌表现为非肌肉浸润性疾病。其中60％的膀胱癌局限于膀胱粘膜，30％的癌症侵入粘膜下层，10％的癌症为原位癌。膀胱癌的5年生存率与诊断时的疾病分期相关，原位癌的5年生存率高达95.8％，而转移性膀胱癌的5年生存率低至4.6％。因此，准确和及时的诊断对于膀胱癌患者的预后至关重要。
目前，膀胱镜检查和尿液脱落细胞学检查是诊断膀胱癌的两种主要方式，但尿液脱落细胞学检查的灵敏度相对较低，膀胱镜检查是膀胱癌诊断的金标准。与目前的其它方法相比，虽然膀胱镜诊断的灵敏度更高，然而，膀胱镜检查是一种侵入性操作，患者不得不承受痛苦，而且膀胱镜操作受尿道狭窄的影响，可能会造成尿道穿孔、出血或感染等。
近日也出现了一些非侵入性的诊断方法，例如检测尿液中的蛋白质标记物核基质蛋白22(NMP-22)和***抗原(BTA)等来诊断膀胱癌，但其特异性不高。
发明内容
经本申请研究发现，HCG9基因作为膀胱癌的生物标志物，通过检测其甲基化水平来诊断膀胱癌可以改善传统检测产品对膀胱癌的特异性不高的缺陷。
基于此，有必要提供一种检测HCG9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用。此外，还提供了一种诊断膀胱癌特异性高的检测试剂盒。
在其中一个实施例中，以GRCh38.p13为参考，所述试剂能够检测chr6：29975312～29975949区域的全长或部分区域的甲基化水平；
在其中一个实施例中，，所述试剂能够检测如下区域中的至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平：
Chr6：29975312～29975466的正链、Chr6：29975464～29975645的正链、Chr6：29975602～29975770的正链、Chr6：29975776～29975919的正链、Chr6：29975720～29975949的负链、Chr6：29975434～29975778的负链和Chr6：29975313～29975456的负链。
一种膀胱癌的检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测HCG9基因的甲基化水平的试剂。
在其中一个实施例中，以GRCh38.p13为参考，所述试剂用于检测chr6：29975312～29975949区域的全长或部分区域的甲基化水平；
在其中一个实施例中，所述试剂能够检测如下区域中的至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平：
Chr6：29975312～29975466的正链、Chr6：29975464～29975645的正链、Chr6：29975602～29975770的正链、Chr6：29975776～29975919的正链、Chr6：29975720～29975949的负链、Chr6：29975434～29975778的负链和Chr6：29975313～29975456的负链。
在其中一个实施例中，所述试剂盒通过下述方法中的至少一种检测HCG9基因的甲基化水平：甲基化特异性PCR法、荧光定量PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法和甲基化敏感性限制性内切酶法。
在其中一个实施例中，所述试剂包括引物对；
在其中一个实施例中，所述试剂还包括与所述引物对对应的检测探针。
在其中一个实施例中，所述引物对包括以下引物对中的至少一组：
用于检测Chr6：29975312～29975466区域内全长或部分区域的正链的甲基化水平的第一引物对、用于检测Chr6：29975464～29975645区域内全长或部分区域的正链的甲基化水平的第二引物对、用于检测Chr6：29975602～29975770区域内全长或部分区域的正链的甲基化水平的第三引物对、用于检测Chr6：29975776～29975919区域内全长或部分区域的正链的甲基化水平的第四引物对、用于检测Chr6：29975720～29975949区域内全长或部分区域的负链的甲基化水平的第五引物对、用于检测Chr6：29975434～29975778区域内全长或部分区域的负链的甲基化水平的第六引物对、用于检测Chr6：29975313～29975456区域内全长或部分区域的负链的甲基化水平的第七引物对。
在其中一个实施例中，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示或如SEQ ID NO：15～16所示；
和/或，所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示或如SEQ ID NO：18～19所示；
和/或，所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示或如SEQ ID NO：21～22所示；
和/或，所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示；
和/或，所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：9～10所示或如SEQ ID NO：24～25所示；
和/或，所述第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：11～12所示或如SEQ ID NO：27～28所示；
和/或，所述第七引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：13～14所示或如SEQ ID NO：30～31所示。
在其中一个实施例中，所述试剂还包括与所述引物对对应的检测探针，其中：
与序列如SEQ ID NO：15～16所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQID NO：17所示；和/或，与序列如SEQ ID NO：18～19所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示；和/或，与序列如SEQ ID NO：21～22所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；和/或，与序列如SEQ ID NO：24～25所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示；和/或，与序列如SEQ ID NO：27～28所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示；和/或，与序列如SEQ ID NO：30～31所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语解释
术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“膀胱癌”指发生于膀胱粘膜上的癌症，根据其组织类型可分为尿路上皮(移行)细胞癌、鳞状细胞癌、腺细胞癌以及一些少见的小细胞癌、混合型、癌肉瘤或者转移癌等，其中尿路上皮癌占膀胱癌的90％以上。
术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
术语“基因”是指编码产生氨基酸多肽链的DNA区段，它包括参与基因转录/翻译和转录/翻译调控的位于编码区和非编码区的序列，编码区包括外显子和内含子序列。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。例如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。
术语“引物对”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
术语“Taqman探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’～3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
术语“桑格尔测序”即一代测序，其反应***包含：目标片段、四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)、DNA聚合酶，引物等，还需要加入不同荧光基团标记的4种双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，通过光激发将四种光波长信号转化为电脑可识别的电信号，根据反应管中最后掺入的ddNTP的荧光信号判断目的DNA序列。
经本申请研究发现，HCG9基因可以作为诊断膀胱癌的生物标志物，通过检测其甲基化水平来诊断膀胱癌，具有较高的特异性，可以有效地提高早期膀胱癌的检出率。此外，癌症相关基因的异常甲基化通常发生在癌症的早期，且比较稳定。因此，通过检测HCG9基因的甲基化水平来诊断膀胱癌稳定性好，准确性高，易于早期诊断。另外，HCG9基因作为生物标志物制备的用于诊断膀胱癌的产品对医师技术水平的依赖性较低，且无创伤性，应用前景好。
基于上述，本申请一实施方式提供了一种检测HCG9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用。
具体地，HCG9基因位于人类6号染色体上，在NCBI数据库中，HCG9基因的Gene ID：10255。
在一些实施例中，以GRCh38.p13为参考，检测HCG9基因的甲基化水平的目标区域(简称“目标区域”)为：chr6：29975312～29975949的全长或部分区域。
可选地，目标区域为如下区域中的至少一个的全长或部分区域Chr6：29975312～29975466、Chr6：29975464～29975604、Chr6：29975602～29975770、Chr6：29975776～29975919、Chr6：29975778～29975949、Chr6：29975434～29975778、Chr6：29975313～29975456、Chr6：29975318～29975431、Chr6:29975491～29975645、Chr6:29975633～29975765、Chr6：29975720～29975823、Chr6：29975618～29975706和Chr6：29975318～29975448。
进一步地，目标区域为如下区域中的至少一个的全长或部分区域：Chr6：29975312～29975466的正链、Chr6：29975464～29975645的正链、Chr6：29975602～29975770的正链、Chr6：29975776～29975919的正链、Chr6：29975720～29975949的负链、Chr6：29975434～29975778的负链和Chr6：29975313～29975456的负链。
在其中一个实施例中，目标区域为如下区域中的至少一个的全长或部分区域：Chr6：29975312～29975466区域内的正链、Chr6：29975464～29975604区域内的正链、Chr6：29975602～29975770区域内的正链、Chr6：29975776～29975919区域内的正链、Chr6：29975778～29975949区域内的负链、Chr6：29975434～29975778区域内的负链、Chr6：29975313～29975456区域内的负链、Chr6：29975318～29975431区域内的正链、Chr6：29975491～29975645区域内的正链、Chr6:29975633～29975765区域内的正链、Chr6：29975720～29975823区域内的负链、Chr6：29975618～29975706区域内的负链和Chr6：29975318～29975448区域内的负链。
进一步地，目标区域为Chr6：29975618～29975765的全长或部分区域。更进一步地，目标区域为Chr6：29975618～29975706的全长或部分区域。
可以理解的是，染色体上的DNA是由正链和负链组成的双链结构。需要说明的是，在本文中，对于区域，如果未指明是DNA的正链还是负链，则表示既可以是该区域的DNA的正链，也可以是该区域的DNA的负链，还可以是该区域的DNA的正负两条链。例如，若区域Chr6：29975618～29975706描述为“Chr6：29975618～29975706”，则表示可以是Chr6：29975618～29975706区域内的DNA的正链，也可以是Chr6：29975618～29975706区域内的DNA的负链，还可以Chr6：29975618～29975706区域内的DNA的正负两条链。若区域Chr6：29975618～29975706描述为“Chr6：29975618～29975706区域内的正链”或“Chr6：29975618～29975706的正链”，则表示Chr6：29975618～29975706区域内的DNA的正链；若区域Chr6：29975618～29975706描述为“Chr6：29975618～29975706区域内的负链”或“Chr6：29975618～29975706的负链，则表示Chr6：29975618～29975706区域内的DNA的负链。另外，“Chr6：29975706～29975618”也表示Chr6：29975618～29975706区域的DNA的负链。
基于上述，本申请一实施方式还提供了一种膀胱癌的检测试剂盒，该试剂盒包括用于检测HCG9基因的甲基化水平的试剂。
进一步地，以GRCh38.p13为参考，用于检测HCG9基因的甲基化水平的试剂能够检测chr6：29975312～29975949区域的全长或部分区域的甲基化水平。
可选地，用于检测HCG9基因的甲基化水平的试剂能够检测如下区域中的至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平：
Chr6：29975312～29975466、Chr6：29975464～29975604、Chr6：29975602～29975770、Chr6：29975776～29975919、Chr6：29975778～29975949、Chr6：29975434～29975778、Chr6：29975313～29975456、Chr6：29975318～29975431、Chr6:29975491～29975645、Chr6：29975633～29975765、Chr6：29975720～29975823、Chr6：29975618～29975706和Chr6：29975318～29975448。
进一步地，用于检测HCG9基因的甲基化水平的试剂能够检测如下区域中的至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平：Chr6：29975312～29975466的正链、Chr6：29975464～29975645的正链、Chr6：29975602～29975770的正链、Chr6：29975776～29975919的正链、Chr6：29975720～29975949的负链、Chr6：29975434～29975778的负链和Chr6：29975313～29975456的负链。
在其中一个实施例中，用于检测HCG9基因的甲基化水平的试剂能够检测如下区域中的至少一个区域的甲基化水平：Chr6：29975312～29975466区域内的正链、Chr6：29975464～29975604区域内的正链、Chr6：29975602～29975770区域内的正链、Chr6：29975776～29975919区域内的正链、Chr6：29975778～29975949区域内的负链、Chr6：29975434～29975778区域内的负链、Chr6：29975313～29975456区域内的负链、Chr6：29975318～29975431区域内的正链、Chr6：29975491～29975645区域内的正链、Chr6:29975633～29975765区域内的正链、Chr6：29975720～29975823区域内的负链、Chr6：29975618～29975706区域内的负链和Chr6：29975318～29975448区域内的负链。
进一步地，用于检测HCG9基因的甲基化水平的试剂能够检测Chr6：29975618～29975765区域内全长或部分区域的甲基化水平。更进一步地，用于检测HCG9基因的甲基化水平的试剂能够检测Chr6：29975618～29975706区域内全长或部分区域的甲基化水平。
在一些实施例中，用于检测HCG9基因的甲基化水平的试剂包括引物对。具体地，上述引物对包括如下引物对中至少一组：用于检测Chr6：29975312～29975466区域内全长或部分区域的正链的甲基化水平的第一引物对、用于检测Chr6：29975464～29975645区域内全长或部分区域的正链的甲基化水平的第二引物对、用于检测Chr6：29975602～29975770区域内全长或部分区域的正链的甲基化水平的第三引物对、用于检测Chr6：29975776～29975919区域内全长或部分区域的正链的甲基化水平的第四引物对、用于检测Chr6：29975720～29975949区域内全长或部分区域的负链的甲基化水平的第五引物对、用于检测Chr6：29975434～29975778区域内全长或部分区域的负链的甲基化水平的第六引物对、用于检测Chr6：29975313～29975456区域内全长或部分区域的负链的甲基化水平的第七引物对。
在一些实施例中，上述的试剂盒采用桑格尔测序法测定HCG9基因的甲基化水平。具体地，该试剂盒的用于检测HCG9基因的甲基化水平的试剂包括引物对。进一步地，引物对包括以下引物对中的至少一组：
用于检测Chr6：29975312～29975466区域内全长或部分区域的正链的甲基化水平的第一引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；用于检测Chr6：29975464～29975604区域内全长或部分区域的正链的甲基化水平的第二引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示；用于检测Chr6：29975602～29975770区域内全长或部分区域的正链的甲基化水平的第三引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示；用于检测Chr6：29975776～29975919区域内全长或部分区域的正链的甲基化水平的第四引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示；用于检测Chr6：29975778～29975949区域内全长或部分区域的负链的甲基化水平的第五引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9～10所示；用于检测Chr6：29975434～29975778区域内全长或部分区域的负链的甲基化水平的第六引物对，其核苷酸序列如SEQID NO：11～12所示；用于检测Chr6：29975313～29975456区域内全长或部分区域的负链的甲基化水平的第七引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13～14所示。
在另一些实施例中，上述的试剂盒采用荧光定量PCR法测定HCG9基因的甲基化水平。具体地，该试剂盒的用于检测HCG9基因的甲基化水平的试剂包括引物对和与引物对对应的检测探针，检测探针上连接有荧光基团。
进一步地，上述引物对包括以下引物对中的至少一组：
用于检测Chr6：29975318～29975431区域内全长或部分区域的正链的甲基化水平的第一引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15～16所示；用于检测Chr6：29975491～29975645区域内全长或部分区域的正链的甲基化水平的第二引物对，其核苷酸序列如SEQID NO：18～19所示；用于检测Chr6：29975633～29975765区域内全长或部分区域的正链的甲基化水平的第三引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21～22所示；用于检测Chr6：29975720～29975823区域内全长或部分区域的负链的甲基化水平的第五引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：24～25所示；用于检测Chr6：29975618～29975706区域内全长或部分区域的负链的甲基化水平的第六引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：27～28所示；用于检测Chr6：29975318～29975448区域内全长或部分区域的负链的甲基化水平的第七引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：30～31所示。
更进一步地，与序列如SEQ ID NO：15～16所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；和/或，与序列如SEQ ID NO：18～19所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示；和/或，与序列如SEQ ID NO：21～22所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；和/或，与序列如SEQ ID NO：24～25所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示；和/或，与序列如SEQ ID NO：27～28所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示；和/或，与序列如SEQ ID NO：30～31所示的引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示。
在一些实施例中，上述的采用荧光定量PCR法测定HCG9基因的甲基化水平的试剂盒还包括内参引物对和与内参引物对对应的内参探针。可选地，内参引物对包括针对ACTB基因设计的ACTB引物对。在一个可选地具体示例中，ACTB引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO：33～34所示，与ACTB引物对对应的内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：35所示。可以理解的是，在其他实施例中，还可以选择其他基因作为内参基因，此时，内参引物对和内参探针对应设计即可。
在一个可选地具体示例中，检测探针和内参探针为Taqman探针。进一步地，检测探针和内参探针上均连接有荧光基团和淬灭基团。可选地，荧光基团位于探针的5’端，淬灭基团位于探针的3’端。可选地，检测探针和内参探针上连接有荧光基团分别独立的选自FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、Texsa Red、JOE及Quasar 705中的一种。当然，在同一个反应体系中有两种以上的探针时，不同探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是，检测探针和内参探针上连接的荧光基团不限于上述，还可以是其他荧光基团。
在一些实施例中，上述的任一实施例的试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。核酸提取试剂用于提取核酸；甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；质控试剂用于质控；PCR反应试剂用于构建PCR扩增反应体系；核酸测序试剂用于测序。
在其中一个实施例中，甲基化转化试剂为亚硫酸盐转化试剂或酶法转化试剂。
在其中一个实施例中，PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2和DNA聚合酶。
在其中一个实施例中，质控试剂包括阳性参考品和阴性参考品。
可以理解的是，在其他实施例中，上述膀胱癌的检测试剂盒检测HCG9基因甲基化水平的方法不限于荧光定量法和桑格尔测序法，还可以是其他方法，例如亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性PCR、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法或甲基化敏感性限制性内切酶法。
在一些实施例中，上述膀胱癌的检测试剂盒适用的样本包括但不限于尿液、组织样本。
经验证，上述膀胱癌的检测试剂盒的检测灵敏度可以达到90.63％，特异性可以达到94.87％，利于膀胱癌的早期诊断。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
基于桑格尔测序检测HCG9基因区域chr6:29975312～29975949的甲基化状态及该方法的灵敏度特异性评估
1.样本收集
于武汉某医院收集64例经病理检测确诊的膀胱癌患者及78例进行常规体检的健康人的尿液样本，收集到的每份尿液样本的体积大于50mL。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2.提取尿液中的DNA
利用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210740号)进行尿液样本DNA的提取，具体步骤如下所示。
1)裂解结合
准备干净的5mL离心管，向其中加入100μL蛋白酶K。尿液混匀后分装2mL至加入蛋白酶K的管子中，依次加入2mL裂解结合液，20μL磁珠，上下颠倒混匀后，置于四方混匀仪上室温裂解30min，保持磁珠处于悬浮状态。
2)洗涤
将离心管置于磁力架上，吸磁2min，至溶液澄清后，颠倒数次冲洗管盖上残留的磁珠，直至全部吸磁完成。小心吸除废液，加入2mL洗涤液，涡旋混匀10次以上，使磁珠完全分散，吸磁2min，至溶液澄清后，颠倒数次冲洗管盖上残留的磁珠，直至全部吸磁完成。
3)漂洗
小心吸除废液，先加入500μL漂洗液将磁珠洗涤至底部后将磁珠悬浮液转移至新的2mL离心管中，再加入500μL漂洗液将5mL离心管管壁上残余的磁珠完全洗涤到底部，瞬时离心后转移全部磁珠悬浮液到2mL离心管中，涡旋混匀10次以上使磁珠完全分散，吸磁2min，至溶液澄清后，颠倒数次冲洗管盖上残留的磁珠，直至全部吸磁完成。重复漂洗一次。
4)洗脱
取下离心管短暂离心收集残余的液体，置于磁力架上吸磁完成后，用小枪头吸去残余的液体。将离心管开盖放置5min使磁珠表面无光泽。加入50μL洗脱液TE，轻轻震荡使磁珠分散，置于56℃洗脱10min，每隔3min取出轻轻震荡，使磁珠处于悬浮状态。
5)收集
取出离心管，离心收集管盖及管壁上的液体，置于磁力架上吸磁1min，小心吸取上清，即得DNA溶液。
3.尿液DNA转化
加入40μL上述步骤2中获得的DNA溶液到200μL PCR管，加入110μL转化混合液，混匀后置PCR仪中设置程序：95℃10min，64℃90min，4℃～8℃1h。
4.尿液DNA纯化
1)将步骤3得到的转化产物转入2mL离心管，加入600μL结合液及10μL磁珠，混匀静置结合15min，期间每3min震荡混匀5s，使磁珠一直处于悬浮状态；短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，小心移除上清。
2)加入600μL漂洗液，涡旋混匀20s分散磁珠；短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，小心移除上清。
3)加入800μL脱硫剂，涡旋混匀20s分散磁珠，室温静置15min脱硫，期间每5min震荡混匀5s，使磁珠一直处于悬浮状态。
4)加入800μL漂洗液，涡旋混匀20s分散磁珠；短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，小心移除上清。
5)重复步骤4)一次。
6)短暂离心将液体收集至管底，将离心管置于磁力架上，小心吸尽上清；开盖室温放置约5min至磁珠表面无光泽。
7)加入20～50μL洗脱液TE，涡旋使磁珠充分悬浮于洗脱液中，56℃孵育10min，期间每3min涡旋混匀一次促进核酸充分洗脱。
8)收集：短暂离心，将离心管置于磁力架上静置2min，转移DNA溶液至新的离心管中。
5.PCR扩增及测序
以步骤4中得到的尿液样本的DNA为模板，分别以表1中的简并引物对作为引物(同时扩增甲基化和未甲基化的DNA片段)，按照表2配置PCR反应体系，按照表3展示的扩增程序进行PCR扩增以得到HCG9的各个基因区域。在PCR扩增结束后，分别使用表1中的简并引物作为测序引物对扩增产物进行桑格尔测序，测序送公司进行，同时从5’端和3’端测序。
表1HCG9基因区域1～7的测序引物
表1中的HCG9基因的区域1～7的具体信息如下：
HCG9基因区域1正链(Chr6:29975312～29975466)DNA序列：
GGCCCGCCCTGGAGCTGAGAACACGCGGACTCCAGGGAGAGGACAGGGCTTCAGGGACCCGAGAGCCGCTCTGAGCACCGGGGGATGTGACTGCCTCAGCGGCAGAGCTGGAAGGGCCCTCGAATGCCATTCACAGGAACAGCCCAGGAACCCAG。
HCG9基因区域2正链(Chr6:29975464～29975604)DNA序列：
CAGGGACTTCAGAAGGGCTGGTTTGTCCGAAAAGTGAGAGGAGGCGGAGGAGAGGTGAGGAGAGCAAGTGCAAGAAGAGACCAGAAAGTGCAGGGGGTGGGGGTGATGCGCGATCCCGAGGAGGACTGAAAAGAGACTGAA。
HCG9基因区域3正链(Chr6:29975602～29975770)DNA序列：
GAAAAGCAGGGCTGAGGAGTGGCGGCAACCGGCAGCGTCCAGCTCCCGCACCTCGCTGCACATCGCACCTGAGCCCCGCCGCGACCGCATCGCGCTCGCTGCGACCCATTCAGACCCCCCAGAAACGCCAAGCCGCTCCCGCTCTAGCCGAGGGCTAGAACAATCCTGC。
HCG9基因区域4正链(Chr6:29975776～29975919)DNA序列：
CAGCCTCCTGAGTAGTTGGGACTACAAGCGAGTGCCACCACGTCCAGCTGTCATTTACCATCTGGTACCAACCCCCATTAGACAATGAACCATCCATGATCACGAACTGTGTCCCTTCCATCTTCGTCAGCTTTAGGAGCATTT。
HCG9基因区域5负链(Chr6:29975949～29975778)DNA序列：
TAATCATAGGTGGAGTTCCATTGGGAAAAAAAATGCTCCTAAAGCTGACGAAGATGGAAGGGACACAGTTCGTGATCATGGATGGTTCATTGTCTAATGGGGGTTGGTACCAGATGGTAAATGACAGCTGGACGTGGTGGCACTCGCTTGTAGTCCCAACTACTCAGGAGGC。
HCG9基因区域6负链(Chr6:29975778～29975434)DNA序列：
CTGAGGTGGCAGGATTGTTCTAGCCCTCGGCTAGAGCGGGAGCGGCTTGGCGTTTCTGGGGGGTCTGAATGGGTCGCAGCGAGCGCGATGCGGTCGCGGCGGGGCTCAGGTGCGATGTGCAGCGAGGTGCGGGAGCTGGACGCTGCCGGTTGCCGCCACTCCTCAGCCCTGCTTTTCAGTCTCTTTTCAGTCCTCCTCGGGATCGCGCATCACCCCCACCCCCTGCACTTTCTGGTCTCTTCTTGCACTTGCTCTCCTCACCTCTCCTCCGCCTCCTCTCACTTTTCGGACAAACCAGCCCTTCTGAAGTCCCTGGGTTCCTGGGCTGTTCCTGTGAATGGCATT。
HCG9基因区域7负链(Chr6:29975456～29975313)DNA序列：
GGGCTGTTCCTGTGAATGGCATTCGAGGGCCCTTCCAGCTCTGCCGCTGAGGCAGTCACATCCCCCGGTGCTCAGAGCGGCTCTCGGGTCCCTGAAGCCCTGTCCTCTCCCTGGAGTCCGCGTGTTCTCAGCTCCAGGGCGGGC。
表2PCR反应体系
组分 用量(μL)
10×Taq buffer(Mg2+Free) 5
25mM Mg2+ 4
dNTP Mix(10mM each) 1
上游引物(10μM) 1
下游引物(10μM) 1
热启动(Hot Start)Taq DNA聚合酶 0.5
模板DNA 10
超纯水 补至50
表3PCR扩增程序
6.结果分析
对于测序成功的序列，根据测序峰图对每个样本各个扩增子中的差异CpG位点的甲基化情况进行分析。一个CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种，即非基化和甲基化，其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶，则其为非甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果仍然为胞嘧啶，则其为完全甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰)，则其为部分甲基化的。
如果一个扩增子中95％以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的，则认为此样本在该基因区域是甲基化阳性的。计算各类样本中的甲基化阳性数目和甲基化阴性数目，并计算甲基化阳性和甲基化阴性的比例。灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例。特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。HCG9基因区域1～7在64例膀胱癌患者和78例健康人尿液样本中的甲基化状态、灵敏度和特异性如表4所示。
表4HCG9基因区域1～7在尿液样本中的灵敏度和特异性
从表4可以看出，HCG9基因区域1～7检测尿液样本的效果各不相同。具体地，区域3和区域6检测膀胱癌患者尿液样本的灵敏度都高于70％，其检测健康人尿液样本的特异性都高于88％；除区域3和6以外的其它区域检测癌症样本和健康样本的灵敏度和特异性不高。综上，基于桑格尔测序的方法，用HCG9基因区域Chr6:29975434～29975778负链的甲基化水平来检测尿液样本的灵敏度和特异性更高。
实施例2
基于甲基化荧光定量PCR检测HCG9基因Chr6:29975318～29975823的甲基化状态及该方法的灵敏度特异性评估(石蜡组织样本)
在实施例1中提取尿液样本的DNA后，采用亚硫酸氢盐转化结合桑格尔测序的方法来检测HCG9基因区域Chr6:29975312～29975949的全长或部分区域的甲基化状态，考虑到这种方法操作繁琐、费时费力且严重依赖测序公司，为了提升该试剂盒在临床应用中的价值，本实施例提供了基于甲基化荧光定量PCR检测HCG9基因各区域的甲基化状态的方法，可以根据Ct值来判断样本的甲基化状态，进而判断样本是否为癌症样本。
1.样本收集
于武汉某医院收集64例经病理检测确诊为膀胱癌患者的癌组织样本和对应的癌旁组织样本64例，所有的样本均为***浸泡、石蜡包埋的组织样本。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2.石蜡组织DNA的提取
使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(56404)提取组织DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.亚硫酸氢盐的转化
将步骤2提取好的样本基因组进行亚硫酸氢盐转化和纯化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书。
4.甲基化定量PCR反应
以步骤3获得的亚硫酸氢盐转化后的样本DNA为模板，分别使用表5中的引物和探针，按照表6的配方配置反应体系，采用热启动DNA聚合酶进行甲基化定量PCR反应，PCR反应条件如表7所示。每个PCR反应可检测HCG9基因的一个区域在某一样本中的甲基化水平，即一个反应管中除加入必须的反应成分、模板以外，需加入一个目标基因区域对应的检测引物及探针，同时还需加入内参基因ACTB的检测引物及探针。检测目标区域的探针为Taqman探针，5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，ACTB探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。
表5HCG9基因区域8～13的检测引物和探针序列
需要说明的是，表5及下文中的HCG9基因区域8～13具体如下：
区域8的正链碱基序列如下(5’～3’)：
CCCTGGAGCTGAGAACACGCGGACTCCAGGGAGAGGACAGGGCTTCAGGGACCCGAGAGCCGCTCTGAGCACCGGGGGATGTGACTGCCTCAGCGGCAGAGCTGGAAGGGCCCT。区域8的引物和探针的组合可以检测区域8正链Chr6:29975335、Chr6:29975337、Chr6:29975371、Chr6:29975378、Chr6:29975390和Chr6:29975411位置胞嘧啶的甲基化。
区域9的正链碱基序列如下(5’～3’)：
CGAAAAGTGAGAGGAGGCGGAGGAGAGGTGAGGAGAGCAAGTGCAAGAAGAGACCAGAAAGTGCAGGGGGTGGGGGTGATGCGCGATCCCGAGGAGGACTGAAAAGAGACTGAAAAGCAGGGCTGAGGAGTGGCGGCAACCGGCAGCGTCCAGCT。区域9的引物与探针的组合可以检测区域9正链Chr6:29975491、Chr6:29975508、Chr6:29975572、Chr6:29975574、Chr6:29975580、Chr6:29975624、Chr6:29975631和Chr6:29975637位置胞嘧啶的甲基化。
区域10的正链碱基序列如下(5’～3’)：
GCAGCGTCCAGCTCCCGCACCTCGCTGCACATCGCACCTGAGCCCCGCCGCGACCGCATCGCGCTCGCTGCGACCCATTCAGACCCCCCAGAAACGCCAAGCCGCTCCCGCTCTAGCCGAGGGCTAGAACAAT。区域10的引物与探针的组合可以检测区域10正链Chr6:29975637、Chr6:29975648、Chr6:29975655、Chr6:29975678、Chr6:29975681、Chr6:29975683、Chr6:29975687、Chr6:29975692、Chr6:29975741和Chr6:29975750位置胞嘧啶的甲基化。
区域11的负链碱基序列如下(5’～3’)：
GCTGGACGTGGTGGCACTCGCTTGTAGTCCCAACTACTCAGGAGGCTGAGGTGGCAGGATTGTTCTAGCCCTCGGCTAGAGCGGGAGCGGCTTGGCGTTTCTGG。区域11的引物与探针的组合可以检测区域11负链Chr6:29975817、Chr6:29975805、Chr6:29975751、Chr6:29975742、Chr6:29975736和Chr6:29975728位置胞嘧啶的甲基化。
区域12的负链碱基序列如下(5’～3’)：
GTCGCAGCGAGCGCGATGCGGTCGCGGCGGGGCTCAGGTGCGATGTGCAGCGAGGTGCGGGAGCTGGACGCTGCCGGTTGCCGCCACTC。区域12的引物与探针的组合可以检测区域12负链Chr6:29975704、Chr6:29975699、Chr6:29975695、Chr6:29975693、Chr6:29975688、Chr6:29975684、Chr6:29975682、Chr6:29975679、Chr6:29975638、Chr6:29975632和Chr6:29975625位置胞嘧啶的甲基化。
区域13的负链碱基序列如下(5’～3’)：
CCTGTGAATGGCATTCGAGGGCCCTTCCAGCTCTGCCGCTGAGGCAGTCACATCCCCCGGTGCTCAGAGCGGCTCTCGGGTCCCTGAAGCCCTGTCCTCTCCCTGGAGTCCGCGTGTTCTCAGCTCCAGGG。区域13的引物与探针的组合可以检测区域13负链Chr6:29975433、Chr6:29975391、Chr6:29975379、Chr6:29975372、Chr6:29975338和Chr6:29975336位置胞嘧啶的甲基化。
表6PCR反应体系
组分 规格 体积(μL)
Platinum II PCR缓冲液 5× 5
dNTPs 各2.5mM 3
目的基因区域上游引物 10μM 0.5
目的基因区域下游引物 10μM 0.5
目的基因区域探针 10μM 0.5
ACTB上游引物 10μM 0.5
ACTB下游引物 10μM 0.5
ACTB探针 10μM 0.5
Taq酶 / 0.5
待测样本DNA / 5
纯化水 / 补至25
表7PCR扩增程序
此外，阴性对照和阳性对照：在对目的基因的不同区域分别进行检测时，阴性对照和阳性对照应进行同步检测。阴性对照为纯化水。阳性对照的制备方法为：将ACTB的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒。将完全甲基化的HCG9基因区域8～13对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒。HCG9基因区域8～13的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域8～13的人工合成质粒1：1混合而成，例如区域8的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域8的人工合成质粒1:1混合而成。
5.PCR结果分析：
1)Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1～2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
2)质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26～30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
3)结果分析和判读方法：当某一检测区域在组织样本上的Ct值≤38时，即认为该样本在此区域被检出甲基化，即为癌症阳性；若某一检测区域在组织样本上的Ct值>38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性，即为癌症阴性。根据甲基化定量PCR实验得到Ct值判断组织样本的阴阳性，结果如表8所示。
表8HCG9基因区域8～13在组织样本中的灵敏度和特异性
由表8可以看出，HCG9基因区域8～13检测膀胱癌组织样本的效果各不相同。其中，区域10和区域12检测膀胱癌组织样本的灵敏度都高于89％，其检癌旁组织样本的特异性都高于87％；除区域10和12以外的其它区域检测癌症组织样本和癌旁组织样本的灵敏度和特异性不高。而且，区域12比区域10的检测效果要稍微好些。因此，用HCG9基因区域12(Chr6:29975618～29975706)的负链的甲基化状态来区分组织样本是否发生癌变的灵敏度和特异性更高。
实施例3
基于甲基化荧光定量PCR检测HCG9基因Chr6:29975318～29975823的甲基化状态及该方法的灵敏度特异性评估(尿液样本)，具体步骤包括：
1.尿液样本的收集、尿液DNA的提取、转化和纯化步骤同实施例1。
2.将各尿液样本中经亚硫酸氢盐转化后的DNA分别进行甲基化荧光定量PCR反应以检测各个样本中HCG9基因区域8～13的甲基化水平，其中具体的检测方法同实施例2。PCR结果的分析方法如下：当某一检测区域在尿液样本上的Ct值≤45时，即认为该样本在此区域被检出甲基化，即为癌症阳性；若某一检测区域在尿液样本上的Ct值>45，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性，即为癌症阴性。
3.根据得到的Ct值判断样本的阴阳性，并计算其检测尿液样本的灵敏度和特异性，结果如表9所示。
表9HCG9基因区域8～13在尿液样本中的灵敏度和特异性
由表9可以看出，HCG9基因区域8～13检测膀胱癌患者尿液样本和健康人尿液样本的效果各不相同。其中，区域10和区域12检测膀胱癌尿液样本的灵敏度都高于85％，其检测健康人尿液样本的特异性都高于89％；除区域10和12以外的其它区域检测癌症患者尿液样本和健康人尿液样本的灵敏度和特异性较低。相比之下，HCG9基因区域12的检测灵敏度和特异性比区域10更高。因此，基于甲基化荧光定量PCR的方法，可以用HCG9基因区域12(负链，Chr6:29975618～29975706)的甲基化状态来评估受试者的尿液样本是否为膀胱癌阳性，其检测效果更好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 检测HCG9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggttcgtttt ggagttgaga ata 23
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggctaaatt cctaaactat tcctata 27
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtagggattt tagaagggtt gg 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttcaatctc ttttcaatcc tcc 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaaagtagg gttgaggagt gg 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgggacaaaa ttattctaac cct 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggtagtttt ttgagtagtt ggg 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggggaaata ctcctaaaac taac 24
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
taattatagg tggagtttta ttggg 25
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggacctccta aataattaaa actacaa 27
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttgaggtggt aggattgttt tagt 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aataccattc acaaaaacaa ccc 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gggttgtttt tgtgaatggt att 23
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acccgcccta aaactaaaaa c 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttttggagtt gagaatacgc g 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaaacccttc caactctacc g 21
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcgagagtcg ttttgagtat cgggg 25
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgaaaagtga gaggaggcg 19
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aactaaacgc taccgattac cg 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggggtgatgc gcgatttcga 20
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtagcgttta gttttcgtat ttcg 24
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
attattctaa ccctcgacta aaacg 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atttgagttt cgtcgcgatc gtatc 25
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gttggacgtg gtggtattcg 20
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccaaaaacgc caaaccg 17
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gggttttcgg ttagagcggg ag 22
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgtcgtagcg agcgcg 16
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aaataacgag aaccgacaac g 21
<210> 29
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atgcggtcgc ggcgg 15
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tttgtgaatg gtattcgagg g 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ccctaaaact taaaacacgc g 21
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cggtgtttag agcggttttc gg 22
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aataacaccc ccaccctgc 19
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggagtggttt ttgggtttg 19

Claims (6)

1.检测甲基化水平的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用；以GRCh38.p13为参考，所述试剂能够检测Chr6：29975618~29975706区域内的负链的甲基化水平；
所述试剂包括引物对和与所述引物对对应的检测探针；
所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：27~28所示；
与所述引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示。
2.一种膀胱癌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测权利要求1中所述区域的甲基化水平的试剂；
所述试剂包括引物对和与所述引物对对应的检测探针；
所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：27~28所示；
与所述引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过下述方法中的至少一种检测HCG9基因的甲基化水平：甲基化特异性PCR法、荧光定量PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法和甲基化敏感性限制性内切酶法。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取试剂和甲基化转化试剂中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述甲基化转化试剂为亚硫酸盐转化试剂或酶法转化试剂。
6.根据权利要求2~5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒适用的样本包括尿液、组织样本。
CN202210542498.9A 2022-05-18 2022-05-18 检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用 Active CN114959030B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210542498.9A CN114959030B (zh) 2022-05-18 2022-05-18 检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210542498.9A CN114959030B (zh) 2022-05-18 2022-05-18 检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114959030A CN114959030A (zh) 2022-08-30
CN114959030B true CN114959030B (zh) 2023-08-01

Family

ID=82984093

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210542498.9A Active CN114959030B (zh) 2022-05-18 2022-05-18 检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114959030B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113604563A (zh) * 2021-06-02 2021-11-05 武汉艾米森生命科技有限公司 一种肝癌诊断或辅助诊断的核酸组合、检测试剂盒及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2675290A1 (en) * 2007-01-23 2008-07-31 Centre For Addiction And Mental Health Dna methylation changes associated with major psychosis
US9670551B2 (en) * 2007-11-30 2017-06-06 Genomictree, Inc. Diagnosis kit and chip for bladder cancer using bladder cancer specific methylation marker gene
WO2012031008A2 (en) * 2010-08-31 2012-03-08 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
CN109415771A (zh) * 2016-07-08 2019-03-01 哈鲁曼有限公司 大肠癌发病可能性的判定方法
CN110872631B (zh) * 2019-12-26 2021-08-10 广州市基准医疗有限责任公司 Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113604563A (zh) * 2021-06-02 2021-11-05 武汉艾米森生命科技有限公司 一种肝癌诊断或辅助诊断的核酸组合、检测试剂盒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114959030A (zh) 2022-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113621704B (zh) 肝癌的检测和诊断的试剂及试剂盒
CN109652541B (zh) 基于甲基化修饰的肿瘤标记物stamp-ep6
CN114891886B (zh) 用于诊断膀胱癌的核酸产品、试剂盒及应用
CN114959030B (zh) 检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用
CN109988844B (zh) 基于甲基化修饰的肿瘤标记物stamp-ep7及其应用
CN115786502B (zh) 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用
CN115094139B (zh) 检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒
WO2014078913A1 (en) A method of detecting methylation
CN114941029B (zh) 肝癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒
CN115948561B (zh) 一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒及其应用
CN111088358B (zh) 结直肠癌分子标志物组合、其用途及引物组和检测试剂盒
CN117587124A (zh) 诊断胰腺癌的检测试剂和试剂盒及应用
CN115927610A (zh) 检测foxo6基因中目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用
CN115838799A (zh) 检测基因甲基化的试剂在制备诊断结直肠癌的产品中的应用
CN116083586A (zh) 诊断食管癌的核酸产品、试剂盒及用途
CN116287227A (zh) 用于诊断***癌的试剂和试剂盒
CN116179694A (zh) 检测甲基化水平的试剂在制备***癌诊断产品中的应用以及***癌诊断试剂盒
CN115838798A (zh) 检测甲基化水平的试剂在制备结直肠癌诊断产品中的应用
CN117248021A (zh) 一种用于尿路上皮癌或癌前病变检测的核酸组合、试剂盒及应用
CN117587125A (zh) 检测甲基化的试剂在制备诊断胰腺癌的产品中的应用
CN116516005A (zh) 一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品、试剂盒及应用
CN117327794A (zh) 一种用于检测肺结节良恶性的试剂、试剂盒及应用
CN117106774A (zh) 检测甲基化水平的试剂及其在制备hpv阴性的头颈鳞状细胞癌诊断产品中的应用
CN117604095A (zh) 用于食管癌诊断的甲基化检测试剂及试剂盒
CN116676384A (zh) 胃癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant