JP7123177B2 - 腫瘍マーカー、メチル化検出試薬、キット及びその使用 - Google Patents
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Description
I:配列番号1に示されるヌクレオチド配列、
II:配列番号1に示されるヌクレオチド配列において1つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、或いは配列番号1に示されるヌクレオチド配列のCpGアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、
III:与配列番号1に示されるヌクレオチド配列具有少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一性的配列又は配列番号1に示されるヌクレオチド配列のCpGアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
IV:I、II又はIIIに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか1つを有する。
上流プライマーは、
V:配列番号2に示されるヌクレオチド配列、
VI:配列番号2に示されるヌクレオチド配列において1つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
VII:配列番号2に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%の同一性を有する配列、或いは配列番号2に示されるヌクレオチド配列のCpGアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
VIII:V、VI又はVIIに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか1つを有する。
下流プライマーは、
IX:配列番号3に示されるヌクレオチド配列、
X:配列番号3に示されるヌクレオチド配列において1つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
XI:配列番号3に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%の同一性を有する配列、或いは配列番号3に示されるヌクレオチド配列のCpGアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
XII:IX、X又はXIに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか1つを有する。
前記プローブは、
XIII:配列番号4に示されるヌクレオチド配列、
XIV:配列番号4に示されるヌクレオチド配列において1つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
XV:配列番号4に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%の同一性を有する配列、或いは配列番号4に示されるヌクレオチド配列のCpGアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
XVI:XIII、XIV又はXVに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか1つを有する。
I:配列番号1に示されるヌクレオチド配列、
II:配列番号1に示されるヌクレオチド配列において1つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、或いは配列番号1に示されるヌクレオチド配列のCpGアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、
III:配列番号1に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%の同一性を有する配列、或いは配列番号1に示されるヌクレオチド配列のCpGアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
IV:I、II又はIIIに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか1つを有する。
V:配列番号2に示されるヌクレオチド配列、
VI:配列番号2に示されるヌクレオチド配列において1つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
VII:配列番号2に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%の同一性を有する配列、或いは配列番号2に示されるヌクレオチド配列のCpGアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
VIII:V、VI又はVIIに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか1つを有する。
IX:配列番号3に示されるヌクレオチド配列、
X:配列番号3に示されるヌクレオチド配列において1つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
XI:配列番号3に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%の同一性を有する配列、或いは配列番号3に示されるヌクレオチド配列のCpGアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
XII:IX、X又はXIに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか1つを有する。
XIII:配列番号4に示されるヌクレオチド配列、
XIV:配列番号4に示されるヌクレオチド配列において1つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
XV:配列番号4に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%の同一性を有する配列、或いは配列番号4に示されるヌクレオチド配列のCpGアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
XVI:XIII、XIV又はXVに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか1つを有する。
被験体のCOL4A2遺伝子のメチル化レベルを検出するステップ(1)と、
被験体のCOL4A2遺伝子のメチル化レベルと正常対照サンプルのメチル化レベルとを比較するステップ(2)と、
前記被験体のCOL4A2遺伝子のレベルが前記正常対照サンプルのメチル化レベルよりも高い場合、前記被験体が腫瘍に罹患しているか又は腫瘍に罹患するリスクがあることを示し、正常サンプルと腫瘍サンプルを区別するステップ(3)と、を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明は、COL4A2遺伝子のゲノソーム、遺伝子間領域、又はプロモーター領域及びびプロモーター領域に近い領域のメチル化レベルを検出することで正常サンプルと腫瘍サンプルを区別する。
磁気ビーズ捕捉法により被検サンプルのDNAを抽出するステップa)と、
被検サンプルのDNAを亜硫酸水素塩、重亜硫酸水素塩又はヒドラジン塩により転換するステップb)と、
メチル化特異的定量PCR(qMSP)により検出するステップc)と、
を含む。
被検サンプルを取り、保護液中で混合し、粉砕し、遠心分離した後、上清を取るステップと、
上清を再度遠心分離し、上清を取り、溶解液及び特定の相補的なオリゴヌクレオチド捕捉配列を有する磁気ビーズを上清液に入れ、インキュベートするステップと、
一部の上清を捨て、磁気ビーズを洗浄し、清潔な遠沈管に移し、洗浄液を加え、室温、100-2000rpmで0.5-5minインキュベートし、磁気スタンドに置き、上清を吸って除去し、3回繰り返すステップと、
緩衝液で標的遺伝子DNAを溶出するステップと、
を含む。
(1)COL4A2遺伝子のメチル化検出機構と、
(2)データ処理機構と、
(3)結果出力機構と、
を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記メチル化検出機構は、蛍光定量PCR装置、PCR装置、シーケンサーのうちの1種又は複数種を含む。
a.被検サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを受信し、
b.被検サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを記憶し、
c.同じタイプの被検サンプルと正常対照サンプルのテストデータを比較し、
d.比較結果に基づいて、被験体が腫瘍に罹患する確率又は可能性を判断するように配置される。
限界値に基づいて腫瘍検体及び正常検体を判断する。糞便検体においてCt値の限界値は32~42であり、好ましくは、糞便検体においてCt値の限界値は34.9である。前記糞便検体のCt値が前記Ct値の限界値以下である場合、腫瘍検体として判断され、前記糞便検体のCt値が前記Ct値の限界値より大きい場合、正常検体として判断される。組織検体においてメチル化レベル値の限界値は1~10であり、好ましくは、組織検体においてメチル化レベル値の限界値は4.9である。前記組織検体のメチル化レベル値が前記メチル化レベル値の限界値以上である場合、腫瘍検体として判断され、前記組織検体のメチル化レベル値が前記メチル化レベル値の限界値より小さい場合、正常検体として判断される。この限界値は、実際の状況に応じて調整することができる。
1、前記技術案の1つでは、COL4A2遺伝子のメチル化検出試薬は、糞便検体において特異性が95.2%である場合、85%の結腸直腸がんを検出することができ、結腸直腸がんに対する検出率は組織検体よりも高く、簡単に糞便を検出サンプルとして結腸直腸がんに対して信頼性の高い診断を行うことができる。糞便サンプルは入手され易く、サンプリングが非侵襲的で簡単であり、患者に痛みや不便を与えることはない
実施例1
163例の糞便検体(80例の結腸直腸がん、83例の正常検体;全て大腸内視鏡検査又は病理的検査により確診された)を粉砕して遠心分離し、100ul捕捉磁気ビーズ(COL4A2遺伝子の捕捉配列を含む)を加え、以下の手順に従って操作し、Bisulfiteで転換された後のDNAを15ul得た。次に、qMSPによりCOL4A2のメチル化のレベルを検出した。
1)大腸内視鏡結果を有する健常者及び結腸直腸腫瘍患者の糞便検体を収集し、1g糞便:4mL保護液で混合して粉砕した後、5000rpmで10min遠心分離し、上清を取り、沈殿を捨てた。
2)10mL上清を取り、再度遠心分離し、上清3.2mLを取り、2mL溶解液及び100ul捕捉磁気ビーズM1を加え、92℃で10minインキュベートし、その後、室温で1時間放置した。
3)磁気スタンドに置き、一部の上清を捨てた後、磁気ビーズを洗浄し、2mL遠沈管に移し、800ul洗浄液W1を加え、室温、1300rpmで1minインキュベートし、磁気スタンドに置き、上清を吸って除去し、3回繰り返した。
4)55ul溶出液を加え、92℃、1300rpmで10minインキュベートし、磁気スタンドに置き、3min内で50ul溶出液を新しいEP管に移した。
5)EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research)により前のステップにおけるDNA断片をメチル化処理し、最後の溶出液15ulをqMSP検出に使用した。
COL4A2の捕捉配列(配列番号1):5’-GCTGCTGCCCGAACGCATTGGCCCTTCCAGAAGCA-3’
COL4A2のqMSPプライマープローブ:
Forward Primer(配列番号2):5’-AGAGAGTTTAGTAAGGTCGGTC-3’
Reverse Primer(配列番号3):5’-GACTTCAAAAACTACTACCCG-3’
Probe(配列番号4):5’-TGTCGGTGTGTCGTCGGC-3’
糞便実験では、COL4A2遺伝子により結腸直腸がんを検出したROC曲線を図1に示す。
結腸直腸がんについては、COL4A2遺伝子の検出感度は85%(68/80)、特異性は95.2%(79/83)、ROC曲線下面積は0.966であった(95%CI:0.941-0.991、p<0.0001)。
糞便実験では、COL4A2遺伝子の標準曲線増幅スペクトルを図に示す。
標準曲線増幅効率は99%、線形性はR2=0.994であった。
105ペアの結腸直腸がんと傍がん正常組織検体(全て大腸内視鏡検査又は病理的検査により確診された)を選択し、Protocolに従って、それぞれQIAamp DNA Kit(QIAGEN)により組織DNAを抽出した後、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research)でDNAを転換した。
結腸直腸がんについては、COL4A2遺伝子の検出感度は80%(84/105)、特異性は95.2%(100/105)、ROC曲線下面積は0.857であった(95%CI:0.795-0.919、p<0.0001)。
QIAamp DNA Stool Mini Kit(QIAGEN)により糞便検体のDNAを抽出し、次に、メチル化特異的PCR(MSP)又は定量メチル化特異的PCR(qMSP)により検体中のマーカーのレベルを定性又は定量的に検出する研究がある。この研究では、MSPにより結腸直腸がんを検出し、電気泳動を実行する必要があるので、操作が不便であり、製品汚染のリスクがある。また、QIAamp DNA Stool Mini Kitにより抽出された糞便中のDNAは、ヒトと細菌の総DNAであり、ヒトの腫瘍DNAは極めて少なく、後続のPCR検出に不利である。
研究によりSFRP1遺伝子のメチル化は腸がんに関係があり、糞便においてこの遺伝子のメチル化の程度を検出することにより結腸直腸がんを検出できることが分かった。53例の糞便検体(29例の腸がん検体、7例の腺腫検体、17例の正常検体)実験では、特異性が86%である場合、89%の結腸直腸腫瘍を検出することができる(Zhang W, Bauer M, Croner RS,Pelz JO,Lodygin D,Hermeking H,Sturzl M,Hohenberger W,Matzel KE.DNA stool test for colorectal cancer: Hypermethylation of the secreted frizzled-related protein-1 gene.DISEASES OF THE COLON&RECTUM 2007;50(10):1618-26;discussion 1626-7.)。
結腸直腸がん組織については、SFRP1遺伝子の検出感度は89%、特異性は95%、ROC曲線下面積は0.972であった(95%CI:0.929-1、p<0.001)。
36例の糞便実験では、SFRP1遺伝子により結腸直腸がんを検出したROC曲線を図5に示す。
結腸直腸がんについては、SFRP1遺伝子の検出感度は67%、特異性は94%、ROC曲線下面積は0.892であった(95%CI:0.790-0.994、p<0.0001)。
Claims (18)
- 腫瘍検出試薬又はキットの製造におけるCOL4A2遺伝子のメチル化検出試薬の使用であって、前記COL4A2遺伝子のメチル化検出試薬はプライマーペアを含み、前記プライマーペアは配列番号2及び配列番号3に示され、
前記腫瘍は結腸直腸腫瘍であり、
検出試薬の対象となる被検サンプルは、腸組織又は糞便である、使用。 - 前記腫瘍は結腸直腸がん又は腺腫である、請求項1に記載の使用。
- 前記COL4A2遺伝子のメチル化検出試薬は、配列番号1に示される、又は配列番号1に示される配列の相補的な配列に示される、捕捉配列を、さらに含む、請求項1に記載の使用。
- 前記COL4A2遺伝子のメチル化検出試薬は、配列番号4に示される、又は配列番号4に示される配列の相補的な配列に示される、プローブを、さらに含む、請求項1に記載の使用。
- 被験体のCOL4A2遺伝子のメチル化レベルを検出するステップ(1)と、
被験体のCOL4A2遺伝子のメチル化レベルと正常対照サンプルのメチル化レベルとを比較するステップ(2)と、
前記被験体のCOL4A2遺伝子のレベルが前記正常対照サンプルのメチル化レベルよりも高い場合、前記被験体が腫瘍に罹患しているか又は腫瘍に罹患するリスクがあることを示し、正常サンプルと腫瘍サンプルを区別するステップ(3)と、
を含み、前記メチル化レベルは配列番号2及び配列番号3に示されるプライマーペアにより検出され、前記腫瘍は結腸直腸腫瘍であり、
被検サンプルは腸組織又は糞便である、
インビトロにおける腫瘍のリスクの検出方法。 - 前記腫瘍は結腸直腸がん又は腺腫である、請求項5に記載の方法。
- COL4A2遺伝子プロモーター領域及びプロモーター領域に近い領域のメチル化レベルを検出することで正常サンプルと腫瘍サンプルを区別する、請求項5に記載の方法。
- 前記メチル化レベルは、メチル化特異的PCR又はメチル化特異的定量PCRにより検出される、請求項5に記載の方法。
- 前記メチル化レベルは、メチル化特異的定量PCRにより検出される、請求項5に記載の方法。
- ステップ(1)において、被験体のCOL4A2遺伝子のメチル化レベルの検出は、
磁気ビーズ捕捉法により被検サンプルのDNAを抽出するステップa)と、
被検サンプルのDNAを亜硫酸水素塩、重亜硫酸水素塩又はヒドラジン塩により転換するステップb)と、
メチル化特異的定量PCRにより検出するステップc)と、
を含む、請求項5に記載の方法。 - ステップa)において、磁気ビーズ捕捉法による被検サンプルのDNAの抽出は、
被検サンプルを取り、保護液中で混合し、粉砕し、遠心分離した後、上清を取るステップと、
上清を再度遠心分離し、上清を取り、溶解液及び特定の相補的なオリゴヌクレオチド捕捉配列を有する磁気ビーズを上清液に入れ、インキュベートするステップと、
一部の上清を捨て、磁気ビーズを洗浄して、清潔な遠沈管に移し、洗浄液を加え、室温、100-2000rpmで0.5-5minインキュベートし、磁気スタンドに置き、上清を吸って除去し、3回繰り返すステップと、
緩衝液で標的遺伝子DNAを溶出するステップと、
を含む、請求項10に記載の方法。 - 検出基準は以下の通りであり、
限界値に基づいて腫瘍検体及び正常検体を判断し、
糞便検体においてCt値の限界値は32~42であり、前記糞便検体のCt値が前記Ct値の限界値以下である場合、腫瘍検体として判断され、前記糞便検体のCt値が前記Ct値の限界値より大きい場合、正常検体として判断され、
組織検体においてメチル化レベル値の限界値は1~10であり、前記組織検体のメチル化レベル値が前記メチル化レベル値の限界値以上である場合、腫瘍検体として判断され、前記組織検体のメチル化レベル値が前記メチル化レベル値の限界値より小さい場合、正常検体として判断される、請求項5に記載の方法。 - (1)COL4A2遺伝子のメチル化検出機構と、
(2)データ処理機構と、
(3)結果出力機構と、
を含む腫瘍の検出システムであって、
前記メチル化検出機構は、配列番号2及び配列番号3に示されるプライマーペアをさらに含み、前記腫瘍は結腸直腸腫瘍であり、
被検サンプルは、腸組織又は糞便である、システム。 - 前記腫瘍は結腸直腸がん又は腺腫である、請求項13に記載のシステム。
- 前記メチル化検出機構は、蛍光定量PCR装置、PCR装置、シーケンサーのうちの1種又は複数種を含む、請求項13に記載のシステム。
- 前記データ処理機構は、
a.被検サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを受信し、
b.被検サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを記憶し、
c.同じタイプの被検サンプルと正常対照サンプルのテストデータを比較し、
d.比較結果に基づいて、被験体が腫瘍に罹患する確率又は可能性を判断するように配置される、請求項13に記載のシステム。 - 前記結果出力機構は、被験体が腫瘍に罹患する確率又は可能性を出力するために使用される、請求項13に記載のシステム。
- 前記データ処理機構の判断基準は、以下の通りであり、
限界値に基づいて腫瘍検体及び正常検体を判断し、
糞便検体においてCt値の限界値は32~42であり、前記糞便検体のCt値が前記Ct値の限界値より小さい場合、腫瘍検体として判断され、前記糞便検体のCt値が前記Ct値の限界値以上である場合、正常検体として判断され、
組織検体においてメチル化レベル値の限界値は1~10であり、前記組織検体のメチル化レベル値が前記メチル化レベル値の限界値より大きい場合、腫瘍検体として判断され、
前記組織検体のメチル化レベル値が前記メチル化レベル値の限界値以下である場合、正常検体として判断される、請求13に記載のシステム。
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