CN111826446A

CN111826446A - 用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物、探针和试剂盒

Info

Publication number: CN111826446A
Application number: CN202010907482.4A
Authority: CN
Inventors: 聂青; 周舒君; 刘梦豪; 薛良
Original assignee: Decipher Bioscience Shenzhen Co ltd
Current assignee: Decipher Bioscience Shenzhen Co ltd
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2020-10-27
Also published as: CN111187842A

Abstract

本发明涉及一种用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物、探针和试剂盒，该用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物，包括用于检测PCDH17基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4‑5所示；用于检测POU4F2基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7‑8所示；用于检测PENK基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10‑11所示。本发明的用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的试剂盒具有无创便捷、高敏感度以及特异性强的优点。

Description

用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物、探针和试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术，特别涉及一种用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物、探针和试剂盒。

背景技术

膀胱癌是泌尿***最常见的恶性肿瘤之一。根据2018年中国国家癌症中心公布的数据，膀胱癌位列男性癌症发病第7位。2012-2015年间，膀胱癌5年相对生存率为72.9％。膀胱癌的复发率为60-70％，居所有实体瘤的首位，其中11％的复发患者会发展为浸润性膀胱癌，患者术后通常需每年进行3-4次膀胱镜检查。有效的治疗很大程度上依赖于膀胱癌的早期发现和治疗。

FDA已经批准用于临床的尿液诊断膀胱癌检查有脱落细胞学检查、膀胱癌抗原(BTA)分析、核基质蛋白22(NMP22)分析、荧光原位杂交法(Fish)等多种方法。镜检作为临床上诊断膀胱癌的金标准，具有侵入性且价格昂贵的特点，而基于脱落细胞学检查的尿检特异性较低且敏感度差，相对于镜检来说，在早期的低分化的肿瘤敏感度只有4％-31％。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：基于上述现有的技术不足，提供一种用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物、探针和试剂盒，可提高检测特异性和敏感度。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

提供一种用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物，包括用于检测PCDH17基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；用于检测POU4F2基因的引物，其核苷酸序列如SEQID NO.7-8所示；用于检测PENK基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10-11所示。

提供一种用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的探针，包括用于检测PCDH17基因的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；用于检测POU4F2基因的探针，其核苷酸序列如SEQID NO.9所示；用于检测PENK基因的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

提供一种用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的试剂盒，该试剂盒包括包含上述的一系列用于检测膀胱癌的特异性引物和探针的反应液Ⅰ、反应所需酶的反应液Ⅱ，同时还包括阴性质控品、阳性质控品。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明针对PCDH17、POU4F2和PENK三个目的基因设计上述引物和探针，设计的引物探针序列专一性强，性能优于其它靶标基因；可采用多重qMSP技术对疑似膀胱癌病人的尿液样本进行检测以筛查膀胱癌，具有检测灵敏度和特异性高的优点。

(2)本发明的上述试剂盒不仅可以用于进行早期膀胱癌的辅助诊断，对于确诊的膀胱癌病人可进行肿瘤预后的监测，以减少膀胱癌镜检的频率。

(3)可实现完全无创检测，仅需45mL的尿液可完成检测，操作简便，适合临床检测工作的普及与应用。

附图说明

图1为本发明实施例2的用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的试剂盒用于三种目标基因检测的ΔCt值的ROC曲线分析图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明最关键的构思在于：针对PCDH17、POU4F2和PENK三个目的基因设计上述引物和探针，并基于尿液沉渣细胞的甲基化特异性荧光定量PCR技术实现膀胱癌早期筛查与辅助诊断。

本发明提供的用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物，包括用于检测PCDH17基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；用于检测POU4F2基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；用于检测PENK基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10-11所示。

进一步的，还包括用于检测β-Actin基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

本发明提供的用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的探针，包括用于检测PCDH17基因的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；用于检测POU4F2基因的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；用于检测PENK基因的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

进一步的，还包括用于检测β-Actin基因的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供的用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的试剂盒，该试剂盒包括包含上述的一系列用于检测膀胱癌的特异性引物和探针的反应液Ⅰ、反应所需酶的反应液Ⅱ，同时还包括阴性质控品、阳性质控品。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：

(1)本发明针对PCDH17、POU4F2和PENK三个目的基因设计上述引物和探针，设计的引物探针序列专一性强，性能优于其它靶标基因。可采用多重qMSP技术对疑似膀胱癌病人的尿液样本进行检测以筛查膀胱癌，具有检测灵敏度和特异性高的优点。另在检测过程中，以β-Actin基因为内参，添加内参引物和探针，通过对内参的扩增可有效避免假阴性的出现。

(2)本发明的上述试剂盒不仅可以进行早期膀胱癌的辅助诊断，对于确诊的膀胱癌病人可进行肿瘤预后的监测，以减少膀胱癌镜检的频率。

实施例1

本实施例提出一组用于检测膀胱癌的特异性引物和探针，包括β-Actin基因扩增引物和探针、PCDH17基因扩增引物和探针、POU4F2基因扩增引物和探针、PENK基因扩增引物和探针。

β-Actin基因扩增引物序列如SEQ ID NO.1-2所示；

SEQ ID.1：

5’-GGACGTAGGGAGTATATAGGTTG-3’；

SEQ ID.2：

5’-CACACAGTAACAAACACAAATTCAC-3’。

PCDH17基因扩增引物序列如SEQ ID NO.4-5所示；

SEQ ID.4：

5’-CGGGTCTTGGAGAATTTCG-3’；

SEQ ID.5：

5’-CGCGATCGATACGCTACTTA-3’。

POU4F2基因扩增引物序列如SEQ ID NO.7-8；

SEQ ID.7：

5’-AAGGGTTCTGCGAAGTTG-3’；

SEQ ID.8：

5’-AACGCGTAAGGGAAATCA-3’。

PENK基因扩增引物序列如SEQ ID NO.10-11所示；

SEQ ID.10：

5’-GGTTGTTGTTGTTGCGTTTC-3’；

SEQ ID.11：

5’-CGACCGAACGCACTAAAC-3’。

其中检测探针均为荧光标记，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。

本实施例中的检测探针如下：

β-Actin检测探针SEQ ID.3：

5’-Texas Red-AAACTTACTAAACCTCCTCCATCACCACCC-BHQ2-3’；

PCDH17检测探针SEQ ID.6：

5’-FAM-CCGCTATGTACGTCCACGTCCAACA-BQ1-3’；

POU4F2检测探针SEQ ID.9：

5’-VIC-CGTACAAAATCCGAAAACGACGACGAA-BQ1-3’；

PENK检测探针SEQ ID.12：

5’-CY5-AAGTACACGTCGCGCAATCCTAACTACAT-BQ3-3’。

本实施例还提出一种用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的试剂盒，该试剂盒包括上述的一系列用于检测膀胱癌的特异性引物和探针的反应液Ⅰ、反应所需酶的反应液Ⅱ，同时还包括阴性质控品、阳性质控品。

上述用于检测膀胱癌的特异性引物和探针浓度的选择：

优化多重反应体系内PCDH17基因、POU4F2基因、PENK基因的引物探针浓度，使各靶标检测丰度一致，提高检测灵敏度和特异性。

引物终浓度为：0.5μM；0.4μM；0.35μM；0.3μM；0.2μM；0.1μM 6个浓度进行筛选。

探针终浓度为：0.35μM；0.3μM；0.25μM；0.2μM；0.15μM；0.1μM 6个浓度进行筛选。

以膀胱癌肿瘤细胞系T24作为检测模板，根据检测的Ct值及标准曲线的扩增效率筛选浓度。筛选结果如下表1；

表1

基因	引物浓度(μM)	探针浓度(μM)
			β-Actin	0.3	0.25
PCDH17	0.35	0.3
			POU4F2	0.3	0.25
PENK	0.3	0.25

上述试剂盒包括(但不限于)：

PCR反应液Ⅰ：

0.30μMβ-actin基因的扩增引物对(SEQ ID NO.1-2)，0.25μMβ-actin基因的检测探针(SEQ ID NO.3)；

0.35μM PCDH17基因的扩增引物对(SEQ ID NO.4-5)，0.30μM PCDH17基因的检测探针(SEQ ID NO.6)；

0.30μM POU4F2基因的扩增引物对(SEQ ID NO.7-8)，0.25μM POU4F2基因的检测探针(SEQ ID NO.9)；

0.30μM PENK基因的扩增引物对(SEQ ID NO.10-11)，0.25μM PENK基因的检测探针(SEQ ID NO.12)；

0.2mM dNTP；5X probe qPCR Buffer；10X HA Buffer；

PCR反应液Ⅱ：Taq聚合酶，Taq聚合酶抗体AP；

阳性质控品：PCDH17/POU4F2/PENK三基因甲基化DNA；

阴性质控品：PCDH17/POU4F2/PENK三基因非甲基化DNA；

上述试剂盒包括用于检测人PCDH17基因、POU4F2基因、PENK基因的DNA甲基化的上游引物、下游引物及探针的反应液Ⅰ、反应液Ⅱ及质控品等。本发明的试剂盒适合于膀胱癌的早期辅助诊断及复发监控，具有高灵敏度、高特异性、操作简便，检测周期短等特点。

上述获得的膀胱癌多靶标检测试剂盒，检测疑似膀胱癌患者尿沉渣细胞中不同基因位点甲基化情况，使血尿且有临床怀疑有膀胱癌者的检出率超过80％，而特异性达到90％以上，为临床医生诊断膀胱癌提供参考。

本发明应用甲基化特异性荧光定量PCR技术，开发对膀胱癌早期辅助诊断的试剂盒。DNA甲基化是表型修饰的一种方式，与癌症的发生密切相关，尤其是CpG岛区的启动子甲基化通常会导致抑癌基因转录沉默，从而影响肿瘤的发生。由于DNA甲基化几乎在所有癌症中均被证明，而且发生在癌前或者癌症早期阶段，因此已成为癌症早期诊断的理想标志物。首先对病人尿沉渣细胞中的DNA提取后，再经亚硫酸盐处理，其中非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。通过荧光定量PCR对甲基化基因进行检测获得Ct值，采用内参基因进行归一化处理，根据各基因的ΔCt评判是否患有膀胱癌。

本发明人经过深入研究，首次揭示一种通过检测三种膀胱癌标志物的甲基化DNA辅助诊断膀胱癌的方法。所述的膀胱癌标记物为PCDH17基因、POU4F2基因及PENK基因。本发明还优化了PCR扩增反应试剂和反应程序，提升了检测性能并在此基础上完成了本发明。其中，PCDH17作为原钙黏蛋白家族的成员之一，主要编码原钙黏蛋白相关神经受体，在特异的细胞与细胞之间的连接与功能起作用。研究报道PCDH17主要通过增加细胞间的黏附、信号传导及生长控制而起到一定的抑癌作用。POU4F2是POU家族蛋白的一员，POU家族蛋白包含有POU结构域的一类转录调控因子。PENK咖啡肽原最初通过阿片途径在成熟的神经和神经内分泌***中表达，调节细胞的死亡和存活，根据报道其甲基化与胰腺癌、***癌及膀胱癌有关。

本发明人发现在临床膀胱癌患者中三种甲基化基因的联用较分别单独检测各个基因有更高的检测性能。基于该发现，提供了特异性检测人PCDH17基因、POU4F2基因、PENK基因的DNA甲基化的试剂的用途，用于制备检测膀胱癌的试剂盒。

实施例2

临床样本检测

使用实施例1中的试剂盒对32例经临床膀胱癌镜检诊断膀胱癌患者脱落细胞和18健康人尿液和非膀胱癌尿液中的脱落细胞进行检测。具体检测方法如下：

1.提取尿液沉渣细胞DNA，并对提取的DNA进行纯度和浓度的质检

(1)尿液样本的采集及离心：采集每位志愿者的第二次晨尿45mL至含有5mL的尿液保存液的50mL离心管中，混匀后以2200g离心20min，弃掉上清液。

(2)尿液沉渣细胞DNA的提取：按照微量样品基因组DNA提取试剂盒(厂家：天根，货号：DP316)说明书提取尿液沉淀DNA，Qubit定量检测DNA浓度。

2、DNA甲基化修饰

取上步提取的DNA使用无核酸酶水稀释至1ng/uL，然后进行如下操作。

取20μL至0.2mL的离心管中，添加130μL亚硫酸氢盐溶液，轻微振荡混匀后短暂离心，上PCR仪上运行如下程序：【98℃10min，64℃40min；98℃5min，64℃40min；98℃5min，64℃40min；4℃维持最多24小时】

(3)加入600μL E-Binding Buffer在吸附柱中，并将离子柱放在收集管里。

(4)将第2步处理过的样本加入第3步准备好的柱子中，颠倒混匀几次。

(5)高速离心(>10000g)30s，弃废液。

(6)加入500μL E-Wash Buffer，全速离心30s，弃废液。

(7)加入500μL E-Desulphonation Buffer，室温静置15min后全速离心30s，弃废液。

(8)加入500μL E-Wash Buffer，全速离心30s，弃废液。重复一次。

(9)12000g空柱离心2min。

(10)将柱子转移至干净的1.5mL离心管，开盖彻底晾干，加入20μL E-ElutionBuffer至吸附柱中央，室温静置2min，10000g离心30s后收集滤液。

3、qMSP反应

(1)按照下表2配制PCR反应体系：

表2

试剂成分	用量(μL)
		反应液Ⅰ	19
反应液Ⅱ	1
		DNA投入量	5
总共	25

按上表配制体系后分装于PCR八连管中，做好标记后置于ABI 7500进行反应。

(2)仪器检测通道选择：

Reporter Dye1(β-Actin)：Texas Red，Quencher Dye1：BQ2；

Reporter Dye2(PCDH17)：FAM，Quencher Dye2：BQ1；

Reporter Dye2(POU4F2)：VIC，Quencher Dye2：BQ1；

Reporter Dye2(PENK)：CY5，Quencher Dye2：BQ3。

(3)反应程序如下表3：

表3

4、检测结果如下表4。表4显示50例样本检测内参基因Ct值及靶标基因ΔCt值。

表4

注：1、“HV”表示Healthy Volunteer，即健康人样本；“BC”表示bladder cancer，即膀胱癌病人；2、“/”表示未检测到Ct值。

对各目标基因检测的ΔCt值进行ROC曲线分析(参见图1)，可得AUC(PCDH17)＝0.8316,AUC(POU4F2)＝0.8715,AUC(PENK)＝0.9375；

根据上述结果统计，内参基因满足Ct值为32以内，膀胱癌阳性评判标准分别以单基因阳性基因、多基因阳性联合评判检测样本患有膀胱癌，按照如下公式计算得到的灵敏度和特异性，结果如表5所示，其为本发明试剂盒检测膀胱癌的灵敏度和特异性数据。

灵敏度＝检测结果为阳性的膀胱癌样本数/总的膀胱癌样本数

特异性＝检测结果为阴性的非膀胱癌样本数/总的非膀胱癌样本数

表5

由表5可知，临床样本验证单基因检测性能差异较大，多基因联用灵敏度最高可达84.38％，特异性94.44％。在各靶标基因特异性较高的前提下，通过靶标基因联用的方式以提高在样本量较大的情况下该检测方法的灵敏度。

本发明中尿液沉淀细胞DNA的提取所用试剂盒为天根公司生产的微量样品基因组DNA提取试剂盒，操作流程为天根公司所提供的操作流程，但用于尿液沉淀细胞DNA提取的试剂及流程并不局限于上述。

本发明中所用的甲基化修饰试剂盒为诺唯赞厂家生产的EpiArt DNAMethylation Bisulfite Kit试剂盒，操作流程也为诺唯赞公司提供的操作流程，但用于DNA的甲基化修饰的转化试剂及流程并不局限于上述。

本发明中用于检测膀胱癌基因组PCDH17/POU4F2/PENK甲基化水平的实验方法为qMSP，但检测基因的甲基化表达水平的方法并不局限于qMSP。

综上所述，本发明提供的用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物、探针和试剂盒，具有无创便捷、高敏感度且特异性强的优点，能在低级别膀胱癌肿瘤进行监测以提高患者的生活质量，而在高级别的疾病中，能够提早发现肿瘤的复发以提高患者的生存率。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 亚能生物技术(深圳)有限公司

<120> 用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物、探针和试剂盒

<130> 2020

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggacgtaggg agtatatagg ttg 23

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacacagtaa caaacacaaa ttcac 25

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaacttacta aacctcctcc atcaccaccc 30

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgggtcttgg agaatttcg 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcgatcgat acgctactta 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgctatgta cgtccacgtc caaca 25

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aagggttctg cgaagttg 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aacgcgtaag ggaaatca 18

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgtacaaaat ccgaaaacga cgacgaa 27

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggttgttgtt gttgcgtttc 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgaccgaacg cactaaac 18

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aagtacacgt cgcgcaatcc taactacat 29

Claims

1.一种用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物，其特征在于，包括用于检测PCDH17基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；用于检测POU4F2基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；用于检测PENK基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10-11所示。

2.根据权利要求1所述的用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物，其特征在于，还包括用于检测β-Actin基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

3.一种用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的探针，其特征在于，包括用于检测PCDH17基因的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；用于检测POU4F2基因的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；用于检测PENK基因的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

4.根据权利要求3所述的用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的探针，其特征在于，还包括用于检测β-Actin基因的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求3或4所述的用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的探针，其特征在于，每条探针的5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。

6.一种用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的试剂盒，包括反应液Ⅰ，其特征在于，所述反应液Ⅰ包括权利要求1-2任意一项所述的用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物以及权利要求3-5任意一项所述的用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的探针。

7.根据权利要求6所述的用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的试剂盒，其特征在于，还包括反应液Ⅱ、阴性质控品和阳性质控品，所述反应液Ⅱ包括Taq聚合酶，Taq聚合酶抗体AP。

8.根据权利要求6所述的用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用的检测样本为尿液沉渣细胞DNA且检测样本经过甲基化修饰。

9.根据权利要求6所述的用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用甲基化特异性荧光定量PCR检测技术。