CN109613228A - 一种减少或消除氢氧化铝佐剂干扰细菌内毒素检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种减少或消除氢氧化铝佐剂干扰细菌内毒素检测的方法。该方法是用含有磷酸根离子的缓冲液稀释氢氧化铝佐剂，进行氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量的检测。本发明在检测氢氧化铝佐剂中的细菌内毒素含量时，磷酸根离子可以破坏氢氧化铝佐剂的胶体结构，从而降低氢氧化铝佐剂对细菌内毒素标准品和鲎试剂中蛋白的吸附作用，达到可以正常检测氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量的目的。本发明操作简单，构思巧妙，准确度高，可降低氧化铝佐剂对细菌内毒素检测的干扰作用，能准确测定氢氧化铝佐剂中细菌内毒素的含量，提高检测精度，具有广泛的应用前景。

Description

一种减少或消除氢氧化铝佐剂干扰细菌内毒素检测的方法
技术领域
本发明属于细菌内毒素检测技术领域，更具体地，涉及一种减少或消除氢氧化铝佐剂干扰细菌内毒素检测的方法。
背景技术
细菌内毒素(Endotoxin)，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，其主要化学成分为脂多糖，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。氢氧化铝佐剂含有胶体，是阴离子抗原的良好吸附剂，在应用氢氧化铝佐剂时，需要对其质量进行严格控制，氢氧化铝佐剂内控质量标准13项中有规定：内毒素含量每毫克铝<5IU。在对氢氧化铝佐剂中的细菌内毒素含量进行测定时，运用较多的方法是鲎试剂法。鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素激活的凝固酶原，凝固蛋白原。因此，采用该方法进行细菌内毒素检测之前，须进行干扰实验，排除供试品对鲎试剂实验的干扰，确保测定的细菌内毒素含量的准确性。
在检测氢氧化铝佐剂中的细菌内毒素含量时，需要用到细菌内毒素标准品和鲎试剂，而氢氧化铝佐剂会对细菌内毒素标准品和鲎试剂中的蛋白质产生吸附作用，从而对鲎实验产生强烈干扰。因此，氢氧化铝佐剂本身会对检测其含有的细菌内毒素产生强烈的干扰作用，无法满足细菌内毒素检查法的无干扰要求。
目前，在检测氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量时，用水稀释氢氧化铝佐剂，在氢氧化铝佐剂中补充Mg2+和Ca2+，调节pH值等方法都无法去除氢氧化铝佐剂本身对细菌内毒素检测的干扰作用。因此，亟需一种可以解决氢氧化铝佐剂干扰细菌内毒素检测的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服在检测氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量时，氢氧化铝佐剂本身对细菌内毒素含量的检测中存在的干扰问题，提供一种减少或消除氢氧化铝佐剂干扰细菌内毒素检测的方法，该方法能够减少或消除氢氧化铝佐剂本身对细菌内毒素检测的干扰作用，提高检测结果的精确度。
本发明的另一目的是提供磷酸根离子在减少或消除氢氧化铝佐剂干扰细菌内毒素检测中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明涉及磷酸根离子在减少或消除氢氧化铝佐剂干扰细菌内毒素检测中的应用。实验发现，磷酸根离子对铝原子的连接比氢氧根离子更强，可以破坏氢氧化铝佐剂的胶体结构，从而降低氢氧化铝佐剂在细菌内毒素检测时，对细菌内毒素标准品和鲎试剂中蛋白的吸附作用，进而降低氢氧化铝佐剂本身对细菌内毒素检测的干扰，达到提高检测精度的目的。
所述应用的方法为：用含有磷酸根离子的缓冲液稀释氢氧化铝佐剂，将稀释后的氢氧化铝佐剂与细菌内毒素工作标准品混匀，进行氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量的检测。
优选地，所述磷酸根离子选自磷酸盐缓冲液(PBS)。
所述磷酸盐缓冲液为本领域常用的磷酸盐缓冲液，对其阳离子没有限定。例如阳离子为Na+、K+等均可。
优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为大于或等于10mM。
更优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为10～50mM。
更进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为10mM。
优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.5～8.0。当磷酸盐缓冲液的pH过大或过小时，会影响鲎试剂的活性，干扰鲎试剂与内毒素的反应。
更优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0。
优选地，所述稀释后的氢氧化铝佐剂与细菌内毒素工作标准品的体积比为8～10：1。
更优选地，所述稀释后的氢氧化铝佐剂与细菌内毒素工作标准品的体积比为9：1。
优选地，所述氢氧化铝佐剂的稀释倍数为大于或等于50倍。当用1×PBS将氢氧化铝佐剂稀释至大于或等于50倍时，PBS不含有内毒素，对鲎实验无影响，且能良好的破坏氢氧化铝佐剂中的胶体结构，从而消除氢氧化铝佐剂对细菌内毒素检测的干扰。
更优选地，所述氢氧化铝佐剂的稀释倍数为50～400倍。
更进一步优选地，所述氢氧化铝佐剂的稀释倍数为50倍。
优选地，所述进行细菌内毒素检测之前，需要先进行以下处理：将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，漩涡混匀。
优选地，所述漩涡混匀的时间为10～20min。
更优选地，所述漩涡混匀的时间为15min。
另外，本发明还提供了减少或消除氢氧化铝佐剂干扰细菌内毒素检测的方法，用含有磷酸根离子的缓冲液稀释氢氧化铝佐剂，将稀释后的氢氧化铝佐剂与细菌内毒素工作标准品混匀，进行氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量的检测。
作为一种较佳的实施方案，上述检测氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量的方法，包括以下步骤：
S1.用1×PBS对氢氧化铝佐剂进行梯度稀释；
S2.用细菌内毒素检查用水溶解细菌内毒素工作标准品，漩涡混匀15min，制成标准曲线；
S3.将步骤S1梯度稀释后的氢氧化铝佐剂和步骤S2细菌内毒素工作标准品以9：1的体积比混合均匀，得到混合溶液；
S4.取动态显色法鲎试剂，开启后依动态显色法鲎试剂使用说明，加入细菌内毒素检查用水复溶；
S5.将步骤S3得到的混合溶液与步骤S4复溶后的鲎试剂等体积混合，放入细菌内毒素反应板中，然后放入酶标仪中反应，进行细菌内毒素检测。
1×PBS是指浓度为10mM的PBS。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种减少或消除氢氧化铝佐剂干扰细菌内毒素检测的方法，该方法利用磷酸根离子可以破坏氢氧化铝佐剂的胶体结构，从而降低氢氧化铝佐剂对细菌内毒素标准品和鲎试剂中蛋白吸附的原理，进行氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量的检测。该方法能够减少或消除氢氧化铝佐剂本身对细菌内毒素检测的干扰作用，达到正常检测氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量的目的。另外，本发明构思巧妙，操作简单，准确度高，解决了氢氧化铝佐剂本身在细菌内毒素检测中存在的干扰问题，满足了细菌内毒素检查法的无干扰要求，能准确测定氢氧化铝佐剂中细菌内毒素的含量，符合氢氧化铝佐剂内控质量标准，进而对氢氧化铝佐剂的质量进行严格控制，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是不同浓度PBS对细菌内毒素检测的影响。
图2是不同浓度PBS对氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量检测的影响。
图3是不同稀释倍数的氢氧化铝佐剂对细菌内毒素含量检测的干扰结果。
图4是1×PBS将氢氧化铝佐剂稀释至5倍时的细菌内毒素反应曲线。
图5是1×PBS将氢氧化铝佐剂稀释至25倍时的细菌内毒素反应曲线。
图6是用1×PBS将氢氧化铝佐剂稀释至50倍、100倍、200倍和400倍时的细菌内毒素反应曲线。
图7是硫酸镁缓冲液和Tris缓冲液稀释氢氧化铝佐剂对细菌内毒素含量检测的干扰结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明以下实施例中，10×PBS是指浓度为100mM的PBS稀释；5×PBS是指浓度为50mM的PBS稀释；1×PBS是指浓度为10mM的PBS；0.5×PBS是指浓度为5mM的PBS。
实施例1不同浓度PBS本身对细菌内毒素检测的影响
1、进行不同浓度PBS本身对细菌内毒素检测的影响实验，考察PBS单独存在时对细菌内毒素含量检测的影响
S1.分别用细菌内毒素检查用水将10×PBS稀释为5×PBS、1×PBS和0.5×PBS；
S2.将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，漩涡混匀15min，制成2EU/mL(简称“E2”)、0.2EU/mL(简称“E0.2”)、0.02EU/mL(简称“E0.02”)作为标准曲线；
S3.采用近似法制备样品阳性：分别量取0.9mL的10×PBS、5×PBS、1×PBS和0.5×PBS，加入0.1mL的E2，混合均匀，制成样品阳性10×PBS E0.2、5×PBS E0.2、1×PBS E0.2和0.5×PBS E0.2；
S4.取动态显色法鲎试剂，开启后依动态显色法鲎试剂使用说明，加入细菌内毒素检查用水复溶；
S5.量取0.1mL步骤S3得到的混合溶液，分别与0.1mL步骤S4复溶后的鲎试剂等混合，放入细菌内毒素反应板中，然后放入赛默飞ET酶标仪中反应1h，进行细菌内毒素检测，计算细菌内毒素的含量。
2、结果
结果如表1和图1所示，可以看出，10×PBS含有0.01315EU/mL的内毒素；5×PBS含有极少量的内毒素(内毒素含量为0.00955EU/mL)，而且其回收率良好，为69.19％，实际检测中可以认为5×PBS对细菌内毒素的检测没有影响；1×PBS和0.5×PBS不含内毒素(内毒素含量＜0.00417EU/mL，可忽略不计)，且回收率良好，分别为73.09％和74.02％，说明1×PBS、0.5×PBS本身对细菌内毒素的检测没有影响。
表1不同浓度PBS对细菌内毒素检测的影响
样品名称 回收率％ 变异系数CV％ 实测值EU/mL
阴性对照 NA 0.00 ＜0.00417
E<sub>0.02</sub> NA 0.63 0.01981
E<sub>0.2</sub> NA 0.76 0.20379
E<sub>2</sub> NA 1.38 1.98132
10×PBSE<sub>0.2</sub> 61.61 0.86 0.01315
5×PBSE<sub>0.2</sub> 69.19 2.67 0.00955
1×PBSE<sub>0.2</sub> 73.09 0.00 ＜0.00417
0.5×PBSE<sub>0.2</sub> 74.02 0.00 ＜0.00417
注：“NA”表示无回收率。
实施例2不同浓度PBS对氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量检测的影响
1、不同浓度PBS对氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量检测的影响实验
S1.分别用细菌内毒素检查用水将10×PBS稀释为5×PBS、1×PBS和0.5×PBS；
S2.分别用5×PBS、1×PBS和0.5×PBS将氢氧化铝佐剂稀释200倍；
S3.将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，漩涡混匀15min，制成2EU/mL(简称“E2”)、0.2EU/mL(简称“E0.2”)、0.02EU/mL(简称“E0.02”)作为标准曲线；
S4.采用近似法制备样品阳性：分别量取0.9mL的5×PBS Al(OH)3、1×PBS Al(OH)3和0.5×PBS Al(OH)3，加入0.1mL E2，混合均匀，制成样品阳性5×PBS Al(OH)3E0.2、1×PBSAl(OH)3E0.2和0.5×PBS Al(OH)3E0.2；
S5.取动态显色法鲎试剂，开启后依动态显色法鲎试剂使用说明，加入细菌内毒素检查用水复溶；
S6.量取0.1mL步骤S4得到的混合溶液，分别与0.1mL步骤S5复溶后的鲎试剂等混合，放入细菌内毒素反应板中，然后放入赛默飞ET酶标仪中反应1h，进行细菌内毒素检测，计算细菌内毒素的含量。
其中，5×PBS是指浓度为50mM的PBS稀释；1×PBS是指浓度为10mM的PBS；0.5×PBS是指浓度为5mM的PBS。
2、结果
结果如表2和图2所示，可以看出，用0.5×PBS稀释氢氧化铝佐剂，其回收率只有68.38％，而用1×PBS和5×PBS稀释氢氧化铝佐剂，其回收率为81.43％和82.38％，回收率良好，说明当PBS浓度为大于或等于1×PBS时，PBS本身对氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量检测的影响很小，可以忽略不计。
表2不同浓度PBS对氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量检测的影响
样品名称 回收率％ 变异系数CV％ 实测值EU/mL
阴性对照 NA 0.00 ＜0.00465
E<sub>0.02</sub> NA 0.85 0.01971
E<sub>0.2</sub> NA 0.06 0.20592
E<sub>2</sub> NA 0.37 1.97104
5×PBS Al(OH)<sub>3</sub>E<sub>0.02</sub> 82.38 0.18 0.01726
1×PBS Al(OH)<sub>3</sub>E<sub>0.02</sub> 81.43 2.44 0.02831
0.5×PBS Al(OH)<sub>3</sub>E<sub>0.02</sub> 68.38 0.74 0.01113
注：“NA”表示无回收率。
综合实施例1和实施例2的实验结果，发现：5×PBS、1×PBS和0.5×PBS本身对细菌内毒素的检测没有影响，同时，当PBS浓度为大于或等于1×PBS时，PBS本身对氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量检测的影响很小，可以忽略不计。
实施例3不同稀释倍数的氢氧化铝佐剂对细菌内毒素含量检测的干扰
实际中，在检测氢氧化铝佐剂中的细菌内毒素含量时，氢氧化铝佐剂本身会细菌内毒素的蛋白质产生吸附作用，从而干扰细菌内毒素的含量检测，影响结果的准确性。本实施例根据实施例1和实施例2的实验结果，用1×PBS或5×PBS稀释氢氧化铝佐剂，考察不同稀释倍数的氢氧化铝佐剂对细菌内毒素含量检测的影响。
1、不同稀释倍数的氢氧化铝佐剂对细菌内毒素含量检测的干扰实验
以1×PBS对氢氧化铝佐剂分别进行5倍、25倍、50倍、100倍、200倍、400倍梯度稀释，分析稀释不同倍数的氢氧化铝佐剂对细菌内毒素含量检测的干扰情况。
S1.用细菌内毒素检查用水将10×PBS稀释为1×PBS；
S2.用1×PBS将氢氧化铝佐剂稀释5倍(简称S5)、25倍(简称S25)、50倍(简称S50)、100倍(简称S100)、200倍(简称S200)和400倍(简称S400)；
S3.将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，漩涡混匀15min，制成2EU/mL(简称“E2”)、0.2EU/mL(简称“E0.2”)、0.02EU/mL(简称“E0.02”)作为标准曲线；
S4.采用近似法制备样品阳性：分别量取0.9mL的S5、S25、S50、S100、S200和S400，加入0.1mL E2，混合均匀，制成样品阳性S5E0.2、S25E0.2、S50E0.2、S100E0.2、S200E0.2、S400E0.2；
S5.取动态显色法鲎试剂，开启后依动态显色法鲎试剂使用说明，加入细菌内毒素检查用水复溶；
S6.量取0.1mL步骤S4得到的混合溶液，分别与0.1mL步骤S5复溶后的鲎试剂等混合，放入细菌内毒素反应板中，然后放入赛默飞ET酶标仪中反应1h，进行细菌内毒素检测，计算细菌内毒素的含量。
2、结果
用1×PBS分别将氢氧化铝佐剂稀释至5倍和25倍时的细菌内毒素反应曲线结果如图4和图5所示，根据细菌内毒素反应曲线，可以看出，用1×PBS将氢氧化铝佐剂稀释至5倍和25倍时，反应曲线不正常，说明对鲎实验干扰性强，无法正常进行内毒素检测；用1×PBS分别将氢氧化铝佐剂稀释至50倍、100倍、200倍和400倍时的细菌内毒素反应曲线如图6所示，可以看出，用1×PBS将氢氧化铝佐剂的稀释倍数为大于或等于50倍时，细菌内毒素反应曲线为规则S型特征曲线，反应曲线正常，可以消除氢氧化铝佐剂对细菌内毒素含量检测的干扰，从而能正常检测氢氧化铝佐剂中的细菌内毒素含量。
另外，由图4～6可以看出，当氢氧化铝佐剂的稀释倍数为5和25倍时，其反应曲线有异与正常的反应曲线，表明其反应曲线表现出来的特性并非鲎试剂与细菌内毒素的反应特性，得到的细菌内毒素含量结果不可靠。当氢氧化铝佐剂的稀释倍数为50～400倍时，回收率在74.20％～86.66％，回收率良好，说明氢氧化铝佐剂的稀释倍数为50～400倍时，减少或消除氢氧化铝佐剂干扰细菌内毒素含量检测的效果更好，细菌内毒素的检测结果准确度更高。
表3不同稀释倍数的氢氧化铝佐剂对细菌内毒素含量检测的干扰结果
样品名称 回收率％ 变异系数CV％ 实测值EU/mL
阴性对照 NA 0.00 ＜0.00461
E<sub>0.02</sub> NA 0.68 0.02000
E<sub>0.2</sub> NA 0.70 0.20008
E<sub>2</sub> NA 0.78 1.99962
S<sub>5</sub> 0.00 0.29 0.76525
S<sub>25</sub> 109.61 14.62 0.20626
S<sub>50</sub> 86.66 2.86 0.21554
S<sub>100</sub> 76.00 6.12 0.09641
S<sub>200</sub> 74.20 4.30 0.02799
S<sub>400</sub> 75.21 1.08 0.01010
注：“NA”表示无回收率。
对比例1硫酸镁缓冲液和Tris缓冲液稀释氢氧化铝佐剂对细菌内毒素含量检测的干扰
S1.分别用10mM硫酸镁缓冲液和10mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液将氢氧化铝佐剂稀释200倍，标记为稀释剂I S200和稀释剂II S200；
S2.用细菌内毒素检查用水溶解细菌内毒素工作标准品，漩涡混匀15min，制成标准曲线，制成2EU/mL(简称“E2”)、0.2EU/mL(简称“E0.2”)、0.02EU/mL(简称“E0.02”)作为标准曲线；
S3.采用近似法制备样品阳性：分别量取0.9mL的稀释剂I S200和稀释剂II S200，各加入0.1mL E2，混合均匀，制成样品阳性硫酸镁缓冲液I S200E0.2、Tris缓冲液II S200E0.2；
S4.取动态显色法鲎试剂，开启后依动态显色法鲎试剂使用说明，加入细菌内毒素检查用水复溶；
S5.量取0.1mL步骤S3得到的混合溶液，分别与0.1mL步骤S4复溶后的鲎试剂等混合，放入细菌内毒素反应板中，然后放入赛默飞ET酶标仪中反应1h，进行细菌内毒素检测，计算细菌内毒素的含量。
2、结果
硫酸镁缓冲液和Tris缓冲液稀释氢氧化铝佐剂对细菌内毒素含量检测的干扰实验结果如表4和图7所示，可以看出，分别使用硫酸镁缓冲液和Tris缓冲液将氢氧化铝佐剂稀释200倍时，回收率小于50％，说明对鲎实验存在强烈抑制，无法消除氢氧化铝佐剂对细菌内毒素含量检测的干扰作用，也侧面说明了硫酸根离子和Tris无法破坏氢氧化铝的凝胶结构。
表4硫酸镁缓冲液和Tris缓冲液稀释氢氧化铝佐剂对细菌内毒素含量检测的干扰实验结果
样品名称 回收率％ 变异系数CV％ 实测值EU/mL
阴性对照 NA 0.00 ＜0.00181
E<sub>0.02</sub> NA 0.31 0.01970
E<sub>0.2</sub> NA 0.22 0.20607
E<sub>2</sub> NA 0.14 1.97030
硫酸镁缓冲液IS<sub>200</sub>E<sub>0.2</sub> 43.98 0.00 ＜0.00181
Tris缓冲液IIS<sub>200</sub>E<sub>0.2</sub> 21.31 0.00 ＜0.00181
注：“NA”表示无回收率。
以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.磷酸根离子在减少或消除氢氧化铝佐剂干扰细菌内毒素检测中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：用含有磷酸根离子的缓冲液稀释氢氧化铝佐剂，将稀释后的氢氧化铝佐剂与细菌内毒素工作标准品混匀，进行氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量的检测。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述磷酸根离子选自磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为大于或等于10mM。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为10～50 mM。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.5～8.0。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述稀释后的氢氧化铝佐剂与细菌内毒素工作标准品的体积比为8～10：1。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述氢氧化铝佐剂的稀释倍数为大于或等于50倍。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述氢氧化铝佐剂的稀释倍数为50～400倍。
10.一种减少或消除氢氧化铝佐剂干扰细菌内毒素检测的方法，其特征在于，用含有磷酸根离子的缓冲液稀释氢氧化铝佐剂，将稀释后的氢氧化铝佐剂与细菌内毒素工作标准品混匀，进行氢氧化铝佐剂中细菌内毒素含量的检测。
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