CN111190003A - 一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，所述的试剂R1包括缓冲液、无机盐离子、加速剂、稳定剂、防腐剂，所述试剂R2包括缓冲液、无机盐离子、防腐剂、稳定剂、助悬剂和抗人视黄醇结合蛋白抗体，本发明检测试剂盒制备成本低廉，灵敏度高、准确性及精密度好，易于保存，数据重复性好，可广泛应用于临床生化分析仪。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫体外诊断领域，具体涉及一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
视黄醇结合蛋白是在肝脏内合成的一种小分子脂质运载蛋白（分子量为21000道尔顿）。视黄醇结合蛋白在肝脏中合成后将全反式视黄醇（维生素Ａ）转运至上皮组织，为视网膜提供维生素A。研究发现RBP不仅存在于视网膜中，在人体血液、尿液及其他体液中也存在有大量的RBP，其含量与巧脏、肾脏的健康情况密切相关。目前，血清RBP的检测是评价肝功能损伤和肾小球滤过功能障碍的早期指标，而尿RBP检测是评价近端肾小管功能障碍的早期标志物。目前，视黄醇结合蛋白的检测方法有酶联免疫吸附法、免疫透射比浊法、放射免疫法和免疫电泳法等。其中免疫比浊法利用全自动生化分析仪来检测，没有放射源、较环保，而且稳定性、精密度和准确性性能良好，在临床常规检测中有广泛的应用。透射免疫比浊法和散射免疫比浊法，这两种方法都可以在全自动生化分析仪上测定RBP含量，检测方法简单、快速，检测结果准确度髙，对一定程度的溶血、黄痘、血脂等常见的干扰因素有一定的抵抗能力，能满足临床检测的要求，是目前测定视黄醇结合蛋白的方法中使用最广的。
然而在体液中RBP的浓度较低，致使其特异性和敏感性不好，不便于临床上的广泛应用。由于免疫比浊法的检测原理是反应生成不溶性抗原-抗体复合物，并产生一定的浊度，浊度的高低反映样品中视黄醇结合蛋白的含量，导致现有的视黄醇结合蛋白试剂盒不可避免的出现灵敏度较低的不足。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种视黄醇结合蛋白的检测试剂盒，该试剂盒可直接应用于全自动生化分析仪上，结果准确性强、灵敏度高、使用方便，且便于大规模推广。
一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1包括的成分及相应含量为：
缓冲液 20～200 mmol/L
加速剂 10～40 g/L
稳定剂 5～15 g/L
防腐剂 0.5～1.5 g/L
无机盐离子的质量百分比含量为上述总质量的0.5％～ 10％；
所述试剂R2包括的成分及相应含量为：
缓冲液 20～200 mmol/L
防腐剂 0.5～1.5 g/L
稳定剂 5～15 g/L
助悬剂 10～50 mmol/L
抗人视黄醇结合蛋白抗体 0.5～3.0g/L
无机盐离子的质量百分比含量为上述总质量的0.5％～ 10％。
试剂R1中的防腐剂和试剂R2中的防腐剂是指可以抑制试剂中细菌和微生物污染的一类试剂，对试剂具有防腐杀菌的作用。试剂R1中的稳定剂和试剂R2中的稳定剂可以保持抗人视黄醇结合蛋白抗体活性。
优选地，所述试剂R1中的缓冲液选自MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS 缓冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼砂缓冲液中的任意一种或多种的组合，其pH为7.0～9.0；
所述试剂R2中的缓冲液选自PBS缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨酸缓冲液Hepes 缓冲液、GOODS缓冲液、MOPS缓冲液中任意一种或多种的组合，其pH为7.0～9.0。
进一步地，所述试剂R1中的缓冲液为MES缓液；所述试剂R2中的缓冲液为PBS缓冲液。
所述试剂R1中的缓冲液、试剂R2中的缓冲液可以采用本领域内公知的各种pH调节剂来进行pH调节。
优选地，所述试剂R1中的无机盐离子选自 KCl、NaCl、MgCl2、CaCl2 中的任意一种或多种的组合；
所述试剂R2中的无机盐离子选自NaCl、 KCl、Na2CO3、Na2SO4、K2SO4中的任意一种或多种的组合。
进一步地，所述试剂R1中的无机盐离子和试剂R2中的无机盐离子均为NaCl，这样可以保持体系长期稳定并且有价格低廉、原料易得的优点。
优选地，所述试剂R1和试剂R2中的防腐剂为叠氮钠、硫柳汞或者 ProClin300。
进一步地，所述试剂R1和试剂R2中的防腐剂均为叠氮钠，具有优良的防腐杀菌性能。
优选地，所述试剂R1中的加速剂为 PEG6000、PEG8000或葡聚糖。
进一步地，所述试剂R1中的加速剂为PEG6000，由于PEG6000 属于非离子型水溶性聚合物，在水中的溶解性比较大，可以调节试剂R1的粘度，促进抗原和抗体分子结合为复合物。
优选地，所述试剂R1中的稳定剂和试剂R2中的稳定剂均为牛血清白蛋白，稳定剂可以保护抗人视黄醇结合蛋白抗的活性。
优选地，所述试剂R2中的助悬剂为***胶、甘油、黄原胶或者海藻酸丙二醇酯。
进一步地，所述试剂R2中的助悬剂为海藻酸丙二醇酯，可以在加入样本后使抗原-抗体复合物悬浮，提高了反应的准确度。
优选地，所述试剂R1由MES缓冲液、NaCl、PEG6000、牛血清白蛋白和叠氮钠组成；
所述试剂R2由PBS缓冲液、NaCl、叠氮钠、牛血清白蛋白、海藻酸丙二醇酯和抗人视黄醇结合蛋白抗体组成；
所述试剂R1包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
MES缓冲液 50mmol/L
NaCl 0.5％
PEG6000 25g/L
牛血清白蛋白 10g/L
叠氮钠 1 g/L；
所述试剂R2包括的成分及相应含量为：
PBS 缓冲液 50 mmol/L
NaCl 0.5％
叠氮钠 1g/L
牛血清白蛋白 10g/L
海藻酸丙二醇酯 30mmol/L
抗人视黄醇结合蛋白抗体 3.0g/L
一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤 ：
步骤一：在20～200 mmol/L的缓冲液中依次加入0.5％～ 10％的无机盐离子、10～40g/L的加速剂、5～15 g/L的稳定剂和0.5～1.5 g/L的防腐剂，搅拌混合均匀并通过0.22微米混合纤维素膜过滤，得试剂R1；
步骤二：在20～200 mmol/L的缓冲液中依次加入0.5％～ 10％的无机盐离子、10～50mmol/L的助悬剂、5～15 g/L的稳定剂、0.5～1.5 g/L的防腐剂和0.5～3.0g/L的抗人视黄醇结合蛋白抗体搅拌混合均匀并通过0.22微米混合纤维素膜过滤，得试剂R2。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明的试剂盒具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性及精密度好，且生产成本低的优点。
2、本发明采用的视黄醇结合蛋白检测方法为免疫透射比浊法，该方法使得视黄醇结合蛋白的检测更为经济、方便和快速，适用于绝大多数医院的自动生化分析仪，特别是对急诊能实现快速定量检测。
3、本发明创新性的在试剂R2中添加了海藻酸丙二醇酯作为助悬剂，使得在样本加入后参与反应时产生的抗原-抗体复合物悬浮且分散均匀，即使在较低浓度下也可以被检测出来，极大的提高了试剂的检测灵敏度。
具体实施方式
实施例 1
一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2；
试剂R1包括的成分及相应含量为：
MES缓冲液 50mmol/L
NaCl 0.5％
PEG6000 25g/L
牛血清白蛋白 10g/L
叠氮钠 1g/L；
试剂R2包括的成分及相应含量为：
PBS 缓冲液 50mmol/L
NaCl 0.5％
叠氮钠 1g/L
牛血清白蛋白 10g/L
海藻酸丙二醇酯 30mmol/L
抗人视黄醇结合蛋白抗体 3.0g/L
实施例 2
一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2；
试剂R1包括的成分及相应含量为：
Tris-HCl缓冲液 75mmol/L
KCl 0.5％
PEG6000 25g/L
牛血清白蛋白 10g/L
叠氮钠 1g/L；
试剂R2包括的成分及相应含量为：
甘氨酸缓冲液 50mmol/L
KCl 0.5％
叠氮钠 1g/L
牛血清白蛋白 10g/L
海藻酸丙二醇酯 20mmol/L
抗人视黄醇结合蛋白抗体 2.0g/L
实施例3
一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒的制备方法及使用方法，包括如下步骤：
步骤一：在50 mmol/L的MES缓冲液中依次加入0.5％的NaCl、25 g/L的PEG6000、10 g/L的牛血清白蛋白和1g/L的叠氮钠，搅拌混合均匀并通过0.22微米混合纤维素膜过滤，得试剂R1；
步骤二：在50mmol/L的PBS缓冲液中依次加入0.5％的NaCl、1g/L的叠氮钠、10g/L的牛血清白蛋白、30mmol/L的海藻酸丙二醇酯和3.0g/L的抗人视黄醇结合蛋白抗体搅拌混合均匀并通过0.22微米混合纤维素膜过滤，得试剂R2。
2、全自动生化分析仪参数设置
a、检测温度：37℃；
b、检测波长：主波长340nm，副波长700nm；
c、反应时间 ：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1 ；
d、反应方向：正反应；
3、检测步骤
a、取200μl试剂R1与20μl待测样本混匀；
b、将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
c、加入50μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；
d、根据样本中视黄醇结合蛋白（mg/L）= CS×ΔAW/ΔAS（mg/L）计算出样本中的视黄醇结合蛋白的浓度。
实施例4
一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒的制备及使用方法，包括如下步骤：
在75 mmol/L的Tris-HCl缓冲液中依次加入0.5％的KCl、25g/L的PEG6000、10 g/L的牛血清白蛋白和1g/L的叠氮钠，搅拌混合均匀并通过0.22微米混合纤维素膜过滤，得试剂R1；
步骤二：在50 mmol/L的甘氨酸缓冲液中依次加入0.5％的KCl、1g/L的叠氮钠、10g/L的牛血清白蛋白、20mmol/L的海藻酸丙二醇酯和2.0g/L的抗人视黄醇结合蛋白抗体搅拌混合均匀并通过0.22微米混合纤维素膜过滤，得试剂R2。
2、全自动生化分析仪参数设置
a、检测温度：37℃；
b、检测波长：主波长340nm，副波长700nm；
c、反应时间 ：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂 R2后立即读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1 ；
d、反应方向：正反应；
3、检测步骤
a、取200μl试剂R1与20μl待测样本混匀；
b、将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
c、加入50μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；
d、根据样本中视黄醇结合蛋白（mg/L）= CS×ΔAW/ΔAS（mg/L）计算出样本中的视黄醇结合蛋白的浓度。
下述测试为对实施例试剂盒的性能测试
1、灵敏度
用试剂盒测试已知浓度在（20 ±2）mg/L的样品，记录在试剂盒规定参数下的吸光度变化。换算为20 mg/L视黄醇结合蛋白含量的吸光度变化。表1为实施例1所制得的测定视黄醇结合蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定视黄醇结合蛋白的试剂盒分别对样品进行测定的结果，测定结果见表1：
表1
| 第1次 （ΔA） | 第2次 （ΔA） | 第3次 （ΔA） | 均值 （ΔA） | |
| 实施例1 | 0.1396 | 0.1409 | 0.1407 | 0.1404 |
| 实施例2 | 0.1315 | 0.1332 | 0.1347 | 0.1331 |
由表1可知，本发明所制得的测定视黄醇结合蛋白的试剂盒对样品吸光度变化的测定结果ΔA较大，因此测定灵敏度高，而且实施例1为最优的选择。
2、准确度
表2为实施例1所制得的测定视黄醇结合蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定视黄醇结合蛋白的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的视黄醇结合蛋白的浓度为35mg/L，测定结果见表2：
表2
| 第1次（mg/L） | 第2次（mg/L） | 第3次（mg/L） | 均值（mg/L） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 34.03 | 35.58 | 34.15 | 34.59 | -1.18% |
| 实施例2 | 32.37 | 33.14 | 34.86 | 33.46 | -4.41% |
由表2可知，本发明所制得的测定视黄醇结合蛋白的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例1所制得的测定视黄醇结合蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定视黄醇结合蛋白的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的视黄醇结合蛋白的浓度为86mg/L，测定结果见表2：
表3
| 第1次（mg/L） | 第2次（mg/L） | 第3次（mg/L） | 均值（mg/L） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 86.04 | 85.78 | 85.89 | 85.90 | -0.11% |
| 实施例2 | 83.53 | 82.76 | 84.68 | 83.66 | -2.72% |
由表3可知，本发明所制得的测定视黄醇结合蛋白的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
3、精密度
表4为实施例3所制得的测定视黄醇结合蛋白的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定视黄醇结合蛋白的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表4
| 第1次 | 第2次 | 第3次 | 第4次 | 第5次 | 第6次 | 第7次 | 第8次 | 第9次 | 第10次 | 均值 | 标准差SD | 变异系数CV（%） | |
| 实施例3 | 50.10 | 50.32 | 50.17 | 50.75 | 50.10 | 50.25 | 49.94 | 49.96 | 50.45 | 50.60 | 50.26 | 0.268 | 0.53% |
| 实施例4 | 49.99 | 50.34 | 50.10 | 51.39 | 49.72 | 51.12 | 49.14 | 49.86 | 50.04 | 49.98 | 50.17 | 0.656 | 1.31% |
由表4可知本发明所制得的测定视黄醇结合蛋白的试剂盒的精密度比较好，而且由表1、表2和表3可知，实施例3为最优的选择。
实施例5
一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2；
试剂R1包括的成分及相应含量为：
Tris-HCl缓冲液 20mmol/L
KCl 10％
PEG6000 10g/L
牛血清白蛋白 5g/L
叠氮钠 0.5g/L；
试剂R2包括的成分及相应含量为：
甘氨酸缓冲液 20mmol/L
KCl 10％
叠氮钠 0.5g/L
牛血清白蛋白 5g/L
海藻酸丙二醇酯 10mmol/L
抗人视黄醇结合蛋白抗体 0.5g/L
实施例6
一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2；
试剂R1包括的成分及相应含量为：
Tris-HCl缓冲液 200mmol/L
KCl 5％
PEG6000 40g/L
牛血清白蛋白 15g/L
叠氮钠 1.5g/L；
试剂R2包括的成分及相应含量为：
甘氨酸缓冲液 200 mmol/L
KCl 5％
叠氮钠 1.5g/L
牛血清白蛋白 15g/L
海藻酸丙二醇酯 50mmol/L
抗人视黄醇结合蛋白抗体 0.5g/L。
Claims (8)
1.一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1包括的成分及相应含量为：
缓冲液 20～200 mmol/L
加速剂 10～40 g/L
稳定剂 5～15 g/L
防腐剂 0.5～1.5 g/L
无机盐离子的质量百分比含量为上述总质量的0.5％～ 10％；
所述试剂R2包括的成分及相应含量为：
缓冲液 20～200 mmol/L
防腐剂 0.5～1.5 g/L
稳定剂 5～15 g/L
助悬剂 10～50 mmol/L
抗人视黄醇结合蛋白抗体 0.5～3.0g/L
无机盐离子的质量百分比含量为上述总质量的0.5％～ 10％。
2.根据权利要求1所述的一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的缓冲液选自MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS 缓冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼砂缓冲液中的任意一种或多种的组合，其pH为7.0～9.0；
所述试剂R2中的缓冲液选自PBS缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨酸缓冲液Hepes 缓冲液、GOODS缓冲液、MOPS缓冲液中任意一种或多种的组合，其pH为7.0～9.0。
3.根据权利要求1所述的一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的无机盐离子选自 KCl、NaCl、MgCl2、CaCl2中的任意一种或多种的组合；
所述试剂R2中的无机盐离子选自NaCl、 KCl、Na2CO3、Na2SO4、K2SO4中的任意一种或多种的组合。
4.根据权利要求1所述的一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1和试剂R2中的防腐剂为叠氮钠、硫柳汞或者 ProClin300。
5.根据权利要求1所述的一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的加速剂为PEG6000、PEG8000或葡聚糖。
6.根据权利要求1所述的一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的稳定剂和试剂R2中的稳定剂均为牛血清白蛋白。
7.根据权利要求1所述的一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中的助悬剂为海藻酸丙二醇酯。
8.一种权利要求1所述视黄醇结合蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一：在20～200 mmol/L的缓冲液中依次加入0.5％～ 10％的无机盐离子、10～40g/L的加速剂、5～15 g/L的稳定剂和0.5～1.5 g/L的防腐剂，搅拌混合均匀并通过0.22微米混合纤维素膜过滤，得试剂R1；
步骤二：在20～200 mmol/L的缓冲液中依次加入0.5％～ 10％的无机盐离子、10～50mmol/L的助悬剂、5～15 g/L的稳定剂、0.5～1.5 g/L的防腐剂和0.5～3.0g/L的抗人视黄醇结合蛋白抗体搅拌混合均匀并通过0.22微米混合纤维素膜过滤，得试剂R2。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112129949A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-12-25 | 兰州百源基因技术有限公司 | 一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒、其制备方法和使用方法 |
| CN113777329A (zh) * | 2021-09-16 | 2021-12-10 | 何秋富 | 一种视黄醇结合蛋白测定试剂盒及其制备方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2879624A1 (en) * | 2012-07-24 | 2014-01-30 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Culture medium composition, and method for culturing cell or tissue using said composition |
| CN105486875A (zh) * | 2016-01-26 | 2016-04-13 | 宁波天康生物科技有限公司 | 视黄醇结合蛋白检测试剂盒 |
| CN106093423A (zh) * | 2016-05-31 | 2016-11-09 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定视黄醇结合蛋白的试剂盒及其制备方法 |
| CN106872718A (zh) * | 2017-04-26 | 2017-06-20 | 吉林省富生医疗器械有限公司 | 一种尿微量白蛋白检测试剂盒及其制备方法 |
| CN107490696A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-12-19 | 迈克生物股份有限公司 | 一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒及检测方法 |
| CN107533050A (zh) * | 2015-03-31 | 2018-01-02 | 美迪恩斯生命科技株式会社 | 凝血酶‑抗凝血酶复合体的测定试剂及测定方法 |
-
2020
- 2020-03-30 CN CN202010233799.4A patent/CN111190003A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2879624A1 (en) * | 2012-07-24 | 2014-01-30 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Culture medium composition, and method for culturing cell or tissue using said composition |
| CN107533050A (zh) * | 2015-03-31 | 2018-01-02 | 美迪恩斯生命科技株式会社 | 凝血酶‑抗凝血酶复合体的测定试剂及测定方法 |
| CN105486875A (zh) * | 2016-01-26 | 2016-04-13 | 宁波天康生物科技有限公司 | 视黄醇结合蛋白检测试剂盒 |
| CN106093423A (zh) * | 2016-05-31 | 2016-11-09 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定视黄醇结合蛋白的试剂盒及其制备方法 |
| CN106872718A (zh) * | 2017-04-26 | 2017-06-20 | 吉林省富生医疗器械有限公司 | 一种尿微量白蛋白检测试剂盒及其制备方法 |
| CN107490696A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-12-19 | 迈克生物股份有限公司 | 一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王宁;: "免疫比浊法测定血清视黄醇结合蛋白方法学评价" * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112129949A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-12-25 | 兰州百源基因技术有限公司 | 一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒、其制备方法和使用方法 |
| CN113777329A (zh) * | 2021-09-16 | 2021-12-10 | 何秋富 | 一种视黄醇结合蛋白测定试剂盒及其制备方法 |
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