CN105247369A - 用于测定铝盐制备物的内毒素含量的方法 - Google Patents

用于测定铝盐制备物的内毒素含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于测定用于药物中的铝盐制备物中的内毒素含量的方法，其包括以下步骤：a.混合所述铝盐制备物与解吸缓冲液，由此从所述铝盐解吸任何内毒素；b.将所述铝盐与所述内毒素分离；和c.测量内毒素的量。

Description

用于测定铝盐制备物的内毒素含量的方法
发明领域
本发明提供测定用于药物中、具体而言用作疫苗中的佐剂的铝盐制备物中的内毒素含量的方法。
发明背景
肠胃外药物需要致热原或内毒素(LAL)测试。经典的内毒素测定不能用于测试铝盐的内毒素含量。添加至产品中的内毒素对照由于其与铝盐的相互作用的特性而没有回收。测定有效性标准需要回收且能够测量大量铝浓缩物(bulk aluminium concentrations)中的对照内毒素。鉴于该相互作用，通常认为标准内毒素测试不适合于铝盐佐剂中的内毒素测试。唯一适合于测定内毒素的测试是涉及将铝盐注射入兔的兔致热原测试。需要改进的方法。
发明概述
本发明提供准确地定量铝盐制备物中的内毒素的方法。本发明提供用于测定用于药物中(具体而言用作疫苗中的佐剂)的铝盐制备物中的内毒素含量的方法，其包括以下步骤：
a) 混合铝盐与解吸缓冲液，由此从铝盐解吸任何内毒素；
b) 将所述铝盐与所述内毒素分离；和
c) 测量内毒素的量。
本发明进一步提供制备用于测定用于药物中(具体而言用作疫苗中的佐剂)的铝盐制备物中的内毒素含量的方法的解吸缓冲液的方法，其包括以下步骤：
a) 混合如本文所定义的碱、如本文所定义的金属螯合剂和水；任选地
b) 搅拌混合物(具体而言持续等于或大于30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分钟)；和任选地
c) 将混合物孵育等于或大于5、10、15、20、25或30分钟。
详述
本发明提供用于测定用于药物中(具体而言用作疫苗中的佐剂)的铝盐制备物中的内毒素含量的方法，其包括以下步骤：
a) 混合铝盐与解吸缓冲液，由此从铝盐解吸任何内毒素；
b) 将所述铝盐与所述内毒素分离；和
c) 测量内毒素的量。
本发明提供用于测定用于药物中(具体而言用作疫苗中的佐剂)的铝盐制备物中的内毒素含量的方法，其包括以下步骤：
a) 混合铝盐与解吸缓冲液，由此从铝盐解吸任何内毒素；
b) 离心混合物，由此将所述铝盐与所述内毒素分离；和
c) 测量上清液的内毒素含量。
本发明进一步提供用于测定用于药物中(具体而言用作疫苗中的佐剂)的铝盐制备物中的内毒素含量的方法，其包括以下步骤：
a) 混合铝盐与解吸缓冲液，由此从铝盐解吸任何内毒素；
b) 离心混合物，由此将所述铝盐与所述内毒素分离；
c) 将上清液转移至无致热原容器；和
d) 测量所述上清液的内毒素含量。
术语“内毒素”在本文中用于指在欧洲药典5.1.10中定义的，即内毒素被视为源自革兰氏阴性细菌的脂多糖类(LPS)和/或脂寡糖类(LOS)。
混合步骤之后和分离/离心步骤之前，可以孵育铝盐制备物和解吸缓冲液，以确保解吸结合至铝盐的任何内毒素。因此，提供本发明的方法，其中将混合物铝盐和解吸缓冲液孵育大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。在具体实施方案中，孵育期为小于96或72小时，即孵育期为1小时至96小时、5小时至72小时、10小时至48小时、15小时至36小时或20小时至28小时。在一个具体实施方案中，混合物在孵育步骤过程中没有搅拌。
以1:9至9:1，例如2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:2或8:2的比率合适地混合铝盐制备物和解吸缓冲液。在具体实施方案中，以3:7、4:6、5:5、6:4 7:3之间，具体而言4:6、5:5和6:4的比率混合铝盐制备物和解吸缓冲液。
本发明的方法可以在允许从铝盐解吸内毒素的任何温度进行。合适地，提供本发明的方法，其中所述孵育在10℃至70℃，例如20℃至65℃、20℃至60℃、15℃至30℃、17℃至28℃、19℃至26℃、21℃至23℃或在约室温(约22℃)进行。
本发明的方法可以包括搅拌铝盐和解吸缓冲液的混合物以确保解吸缓冲液与铝组合物混合的步骤。合适地，提供本发明的方法，其中铝盐和解吸缓冲液的混合物在步骤a)之后搅拌多于30秒、40秒、50秒、1分钟、1分钟30秒或2分钟。
本发明的方法中可以使用促进内毒素解吸的任何缓冲液。适用于本方法中使用的解吸缓冲液可以通过以下确定：将候选缓冲液暴露于包含已知量的内毒素(例如20 EU/ml)的铝盐，在室温孵育约24小时+/-4小时，以10,000 rpm +/- 1000 rpm离心10分钟+/-1分钟，且然后对上清液进行LAL测试。解吸50至200％的内毒素的缓冲液被认为是合适的解吸缓冲液。
提供本发明的方法，其中所述解吸缓冲液包含盐和金属螯合剂。合适的盐是技术人员众所周知的，且包括但不限于Na2HPO4。Na2HPO4通常以15%至25%，例如约18％，例如17.8％的量(EDTA 0.224％，pH8.0)使用。
在一些实施方案中，具体而言其中本发明的方法用于测定氢氧化铝的内毒素含量，解吸缓冲液可以包含其他盐，例如NaCl。当使用NaCl时，通常解吸缓冲液包含5至250mM NaCl。
合适的金属螯合剂是技术人员众所周知的，且包括但不限于EDTA(乙二胺四乙酸)。EDTA通常以0.2%至0.3%，例如约0.22%，例如0.224%的量使用。
解吸缓冲液可以是促进从铝盐解吸内毒素的任何pH。在一个实施方案中，本发明的解吸缓冲液具有大于pH5.5的pH，具体而言当解吸缓冲液用于从磷酸铝解吸内毒素时。提供本发明的方法，其中所述解吸缓冲液为约pH7至pH9。在一个具体实施方案中，提供在约pH 8(例如pH7.5至8.5)的解吸缓冲液。
在一个实施方案中，本发明的解吸缓冲液具有大于pH9.5的pH，具体而言当解吸缓冲液用于从氢氧化铝解吸内毒素时。提供本发明的方法，其中所述解吸缓冲液为约pH9.5至pH10.5。在一个具体实施方案中，提供在约pH10的解吸缓冲液。在一个具体实施方案中，pH为小于pH 10.5。
解吸缓冲液可以是在防止缓冲液的一种或多种组分的沉淀的任何温度，具体而言当以浓缩的例如1.5至2倍浓缩物储存时。合适地，提供本发明的方法，其中所述解吸缓冲液储存于约30℃至45℃、35℃至40℃、36℃至38℃或约37℃的温度。
所述解吸缓冲液理想地无内毒素，合适地，提供本发明的方法，其中所述解吸缓冲液基本上无内毒素，即使用技术人员已知的任何技术无法检测到内毒素。
内毒素从铝盐解吸且合适地分离，以允许测试内毒素含量。分离可以使用技术人员已知的任何方法来进行。合适地，提供本发明的方法，其中以沉淀铝盐且使内毒素维持于上清液中所需的力离心混合物。具体而言，提供本发明的方法，其中以1000至1500 x g，例如约1118 x g离心解吸缓冲液和铝盐的混合物。
解吸的内毒素含量可以根据技术人员可用于测量内毒素的任何测试来测量。具体而言，提供本发明的方法，其中测量内毒素含量。具体而言，提供本发明的方法，其中定量内毒素含量。技术人员可用且已知的方法包括但不限于鲎变形细胞溶解物(LAL)测定、单核细胞活化测试或EndoLISA方法。具体而言，内毒素在本发明的方法中通过LAL(具体而言通过动态显色法)进行定量。
本发明的方法可以用于测定用作疫苗中的佐剂的任何铝盐的内毒素含量。合适的铝盐佐剂是技术人员众所周知的，且包括但不限于磷酸铝、氢氧化铝或其组合。合适的铝盐佐剂包括但不限于：Rehydragel™ HS、Alhydrogel™ 85、Rehydragel™ PM、Rehydragel™ AB、Rehydragel™ HPA、Rehydragel™ LV、Alhydrogel™或其组合。具体而言，本发明的方法用于测定Adjuphos、RehydragelTM HS(3％氢氧化铝/水[General Chemical])或AlhydrogelTM 85 (Brenntag BioSector [Denmark])的内毒素含量。
具体而言，本发明的方法用于测定具有2.5至3.5、2.6至3.4、2.7至3.3或2.9至3.2、2.5至3.7、2.6至3.6、2.7至3.5或2.8至3.4蛋白(BSA)/ml铝盐的蛋白吸附能力的铝盐的内毒素含量。在本发明一个具体实施方案中，本发明的方法用于测定具有2.9至3.2 mg BSA/mg铝盐的蛋白吸附能力的铝盐的内毒素含量。铝盐的蛋白吸附能力可以通过技术人员已知的任何方式来测量。在本发明的一个具体实施方案中，铝盐的蛋白吸附能力使用WO2012/136823的实施例1中所述的方法(其利用BSA)或其变型来测量。
本发明的方法用于测定本文所述的铝盐 (即具有本文所述的蛋白吸附能力) 的内毒素含量，所述铝盐具有如通过X-射线衍射测量的2.8至5.7nm，例如如通过X-射线衍射测量的2.9至5.6nm、2.8至3.5nm、2.9至3.4nm或3.4至5.6nm或3.3至5.7nm的晶体大小。X-射线衍射是技术人员众所周知的。在本发明的一个具体实施方案中，晶体大小使用WO2012/136823的实施例1中所述的方法或其变型来测量。
本发明的方法特别可用于质量控制测定中。术语“质量控制”测定在本文中用于意指质量控制(QC)是意欲确保制备的产品或进行的服务符合质量标准的定义集合或满足制造商的要求的程序或程序集合。因此，本发明的方法适合于在质量控制测定中使用。
在一个具体实施方案中，本文所述的本发明的方法用于在铝盐与其他疫苗组分配制之前测试铝盐制备物。在一个进一步实施方案中，本文所述的本发明的方法用于在铝盐与其他疫苗组分(例如特定抗原)配制之后测试铝盐制备物。在一个进一步实施方案中，本文所述的本发明的方法用于在铝盐制备物与其他疫苗组分(例如抗原，具体而言本文所述的那些)配制之前和之后测试铝盐制备物的内毒素含量。
本发明的方法可以涉及：从大量铝盐提取样品；通过本文定义的方法测试样品；且然后如果样品通过测试，则将一种或多种抗原(具体而言本文所述的那些)吸附至所述铝盐；和任选地组合所述铝盐与一种或多种其他抗原(具体而言，本文所述的那些)。
本发明的铝盐可以在测试其内毒素含量之前和/或之后与抗原配制。
可以与本发明的铝盐配制的抗原包括但不限于破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、乙型肝炎表面抗原、灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)、百日咳杆菌粘附素，丝状血凝素(FHA)百日咳类毒素和/或流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae) B型多糖(Hib)[具体而言，来自流感嗜血杆菌B型的磷酸聚核糖基核糖醇荚膜糖(PRP))、人***状瘤病毒(例如，来自HPV 6、11、16、18或其组合的病毒样颗粒)、缀合至载体蛋白(例如TT、DT和/或CRM197)的源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的多糖。
破伤风类毒素(TT)和它们的制备方法是本领域中众所周知的。TT可以通过从破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)的培养物纯化毒素、随后化学脱毒来产生，但其或者通过纯化毒素的重组或遗传脱毒的类似物来制备(例如，如EP 209281中所述)。优选的脱毒方法如下。发酵之后，在作为助滤剂的硅藻土存在的情况下在0.1-0.3µm过滤器上过滤培养液。收获物通过0.22µm过滤器澄清、浓缩且在30kD平板膜(flatsheet membrane)上针对10倍体积的磷酸盐缓冲液(20mM – pH 7.3)进行渗滤。渗滤的毒素然后在37℃在以下条件中脱毒4周：甲醛20mM - 赖氨酸3mM - 磷酸钾100mM - 初始pH 7.3 – 500 Lf/ml。所得类毒素通过硫酸铵分级纯化、浓缩且针对WFI渗滤(30KD)以去除硫酸铵。将NaCl添加至0.9％的最终浓度，将pH调节至7.3且无菌过滤纯化的破伤风类毒素。
可以使用任何合适的破伤风类毒素。‘破伤风类毒素’可以涵盖全长蛋白的免疫原性片段(例如C片段 – 参见EP 478602)。
本发明的破伤风类毒素通常吸附至铝盐上。在本发明的一个具体实施方案中，所述铝盐是氢氧化铝。在另一个实施方案中，本发明的破伤风类毒素可以吸附至铝盐诸如磷酸铝上。在一个进一步实施方案中，破伤风类毒素可以吸附至氢氧化铝和磷酸铝两者的混合物上。
将蛋白(包括破伤风类毒素)吸附至铝盐上的方法是技术人员众所周知的(例如疫苗制备通常描述于Vaccine Design “The subunit and adjuvant approach” (编辑Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York)。
白喉类毒素(DT)和它们的制备方法得到充分记录。任何合适的白喉类毒素可以在内毒素测试之后或之前与本文所述的铝盐配制。例如，DT可以通过从白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的培养物纯化毒素、随后化学脱毒来产生，但或者通过纯化毒素的重组或遗传脱毒的类似物来制备(例如，CRM197，或如US 4,709,017、US 5,843,711、US 5,601,827和US 5,917,017中所述的其他突变体)。优选的脱毒方法如下。发酵之后，白喉毒素通过TFF 0.45µm收获，通过0.22µm过滤器澄清、浓缩且在10kD平板膜上针对10倍体积的磷酸盐缓冲液(20mM – pH 7.2)进行渗滤。渗滤的毒素然后在37℃在以下条件中脱毒6周：甲醛50mM - 赖氨酸25mM - 磷酸钾50mM - 初始pH 7.2 – 300 Lf/ml。所得类毒素通过硫酸铵分级纯化、浓缩且针对WFI渗滤(30KD)以去除硫酸铵。将NaCl添加至0.9％的最终浓度，将pH调节至7.3且无菌过滤纯化的白喉类毒素。
灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV)可以包含IPV 1型或IPV 2型或IPV 3型，或IPV 1型和2型，或IPV 1型和3型，或IPV 2型和3型，或IPV 1型、2型和3型。
制备灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)的方法是本领域中众所周知的。在一个实施方案中，IPV应当包含如疫苗领域中常见的1型、2型和3型，且可以是用甲醛灭活的Salk脊髓灰质炎疫苗(参见例如，Sutter等人, 2000, Pediatr. Clin. North Am. 47:287; Zimmerman & Spann 1999, Am Fam Physician 59:113; Salk等人, 1954, Official Monthly Publication of the American Public Health Association 44(5):563; Hennesen, 1981, Develop. Biol. Standard 47:139; Budowsky, 1991, Adv. Virus Res. 39:255)。或者，IPV可以使用Sabin毒株制备(Sabin-IPV; Kersten等人 (1999), Vaccine 17:2059)。
在一个实施方案中，没有吸附IPV(例如，与其他组分混合之前)。在另一个实施方案中，本发明的IPV组分可以吸附至铝盐诸如氢氧化铝上(例如，与其他组分混合之前或之后)。在另一个实施方案中，本发明的IPV组分可以吸附至铝盐诸如磷酸铝上。在一个进一步实施方案中，IPV组分可以吸附至氢氧化铝和磷酸铝两者的混合物上。如果吸附，则一种或多种IPV组分可以分别吸附或作为混合物一起吸附。在一个进一步实施方案中，IPV如本文所述吸附至铝盐/颗粒上。
百日咳杆菌粘附素(百日咳的69 kDa抗原)是外膜蛋白，其是热稳定的并且可以通过本领域已知的方法制备(参见EP0162639)。任选地将百日咳杆菌粘附素吸附至铝盐颗粒上。在本发明的一个实施方案中，将百日咳杆菌粘附素吸附至氢氧化铝上。在本发明的一个具体实施方案中，如本文描述将百日咳杆菌粘附素吸附至铝盐上。
可以以本领域众所周知的方法制备丝状血凝素（FHA）(参见WO/1990/013313 (US7479283)中公开且引用的方法)。任选地将FHA吸附至铝盐颗粒上。在本发明的一个实施方案中，将FHA吸附至氢氧化铝上。在本发明的一个具体实施方案中，如本文描述将FHA吸附至铝盐上。
产生百日咳类毒素的方法对于技术人员是众所周知的。可以通过众所周知的甲醛处理的方法或通过突变方法(PT衍生物)将百日咳毒素脱毒。已经发现蛋白的S1亚基内的残基取代导致产生保留百日咳毒素的免疫学和保护特性但具有降低的或没有毒性的蛋白(EP 322533)。在EP322533的权利要求中讨论的脱毒突变是本发明的PT脱毒突变体的实例。任选地将百日咳类毒素吸附至铝盐颗粒上。在本发明的一个实施方案中，将百日咳类毒素吸附至氢氧化铝上。在本发明的一个具体实施方案中，如本文描述将百日咳类毒素吸附至铝盐上。
来自流感嗜血杆菌b型的磷酸聚核糖基核糖醇荚膜糖(PRP)可以缀合至载体蛋白。所述糖是核糖、核糖醇和磷酸的聚合物。如WO97/00697中所述可以任选地将Hib抗原吸附至磷酸铝上，或者如WO02/00249中所述可以是未吸附的或者可以不进行特定的吸附方法。
本文中的抗原‘未吸附至铝佐剂盐上’(“未吸附(unadsorbed)”或“没有吸附(not adsorbed)”)意指例如在组合物的配制方法中不涉及明确的或专门的抗原在新的铝佐剂盐上的吸附步骤。
Hib可以缀合至任何载体，所述载体可以提供至少一种T辅助细胞表位，并且可以是破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM-197(白喉类毒素突变体)或来自非分型流感嗜血杆菌的蛋白D(EP0594610)。
在一个进一步实施方案中，提供本发明的方法，其进一步包括配制免疫原性组合物与乙型肝炎表面抗原的步骤。
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的制备得到充分记录。参见例如Hartford等人, 1983, Develop. Biol. Standard 54:125; Gregg等人, 1987, Biotechnology 5:479; EP0226846; EP0299108。其可以如下制备。由于在HBV感染过程中，大量HBsAg在肝脏中合成且释放至血流中，所以一种方法涉及从慢性乙型肝炎携带者的血浆中纯化微粒形式的抗原。另一种方法涉及通过重组DNA方法表达蛋白。可以通过在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母、毕赤酵母、昆虫细胞(例如Hi5)或哺乳动物细胞中表达来制备HBsAg。可以将HBsAg***至质粒中，并且可以通过启动子诸如“GAPDH”启动子(来自甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)来控制其从质粒的表达。酵母可以在合成培养基中培养。然后可以通过涉及步骤诸如沉淀、离子交换层析和超滤的方法来纯化HBsAg。纯化之后，HBsAg可以进行透析(例如用半胱氨酸)。HBsAg可以以微粒形式使用。
如本文所使用，表述“乙型肝炎表面抗原”或“HBsAg”包括展示出HBV表面抗原的抗原性的任何HBsAg抗原或其片段。应当理解，除了HBsAg S抗原的226个氨基酸序列以外(参见Tiollais等人, 1985, Nature 317:489和其中的参考文献)，如果需要，如本文所述的HBsAg可以含有如以上参考文献中和EP0278940中描述的前S序列的全部或部分。具体而言，HBsAg可以包含含有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含相对于ad血清型的乙型肝炎病毒上的开放阅读框的HBsAg的L-蛋白的残基133-145和随后为残基175-400(该多肽称为L*; 见EP0414374)。在本发明的范围内，HBsAg还可以包括EP0198474 (Endotronics)中描述的前S1(preS1)-前S2(preS2)-S多肽或者其类似物诸如EP0304578 (McCormick和Jones)中描述的那些。如本文所使用的HBsAg还可以指突变体，例如WO 91/14703或EP0511855A1中描述的“逃逸突变体”，特别是其中在145位上的氨基酸取代是甘氨酸取代为精氨酸的HBsAg。
HBsAg可以是颗粒形式。所述颗粒可以包含例如单独S蛋白或者可以是复合颗粒，例如L*, S)，其中L*如上文所定义并且S表示HBsAg的S蛋白。所述颗粒有利地是其在酵母中表达的形式。
在一个实施方案中，HBsAg是用于EngerixB™(GlaxoSmithKline Biologicals S.A.)中的抗原，其进一步描述于WO93/24148中。
可以将乙型肝炎表面抗原任选地吸附至铝盐、具体而言磷酸铝上，其可以在与其他组分混合之前完成(描述于WO93/24148)。乙型肝炎组分应当基本上无硫柳汞(无硫柳汞的HBsAg的制备方法先前已经公开于EP1307473中)。
本发明进一步提供制备用于测定铝盐中的内毒素的方法的解吸缓冲液的方法，其包括以下步骤：
a) 混合如本文所定义的一种或多种盐、如本文所定义的金属螯合剂和水；任选地
b) 搅拌混合物(具体而言持续等于或大于30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分钟)；和任选地
c) 将混合物孵育等于或大于5、10、15、20、25或30分钟。
本发明进一步提供制备用于测定铝盐中的内毒素的方法的解吸缓冲液的方法，其包括以下步骤：
a) 混合盐、金属螯合剂和水；任选地
b) 在37℃+/- 1℃搅拌组合的混合物至孵育期(以溶解)；和任选地
c) 添加酸或碱以固定pH
d) 添加水以达到制备物的最终体积；任选地
e) 在37℃+/-1℃储存。
步骤a)和b)可以进行多于一次，提供制备如本文所定义的解吸缓冲液的方法，其中步骤b)和/或c)重复1次、2次或更多次。
提供制备如定义的解吸缓冲液的方法，其中水基本上无内毒素。
提供制备如定义的解吸缓冲液的方法，其中将步骤a)的水预热至约30℃至45℃、35℃至40℃、36℃至38℃或约37℃(±1℃)。
提供制备如定义的解吸缓冲液的方法，其中将pH调节至7至9，特别是约pH 8。任何酸都可以用于调节该pH，同时不影响解吸缓冲液从铝盐解吸内毒素的能力。具体而言，HCl可用于在本文所述的解吸缓冲液的制备中调节pH。具体而言，当缓冲液在约30℃至45℃、35℃至40℃、36℃至38℃或约37℃(±1℃)时，调节pH。任何合适的碱或酸都可以用于调节该pH，同时不影响解吸缓冲液从铝盐解吸内毒素的能力。
提供制备如本文所定义的解吸缓冲液的方法，其进一步包括d)在约30℃至45℃、35℃至40℃、36℃至38℃或约37℃(±1℃)储存解吸缓冲液的步骤。
在每种情况下，发明人意欲本文的术语“包含(comprising)”、“包含(comprise)”和“包含(comprises)”可以任选地分别由术语“由…组成(consisting of)”、“由…组成(consist of)”和“由…组成(consists of)”替换。
本文使用的术语“约”意指量±10％。
实施例
1. 解吸缓冲液的制备：
为了制备100ml解吸缓冲液，将17.8 g Na2HPO4、0.224 g EDTA和90ml无致热原水(如果可能，在37℃培养箱中预热)置于250ml Nunc无致热原的容器中。
通过在搅拌桌上搅拌15分钟、在37℃±1℃在培养箱中加热30分钟和重复搅拌和加热直至完全溶解而溶解盐和EDTA。
为了调节pH，添加3ml HCl 1N，测量pH，且如果必要，用HCl 1N调节至pH8.0。用无致热原水将体积补足至100ml。在1/100稀释度通过LAL分析测定内毒素的不存在。在37℃±1℃储存解吸缓冲液。
2. 内毒素的测定：
为了测定铝样品(4ml)的内毒素含量，将解吸缓冲液(6ml)添加至铝盐样品。将混合物搅拌1分钟，然后在室温孵育24小时。
孵育之后，通过将管上下颠倒5次而缓慢摇动混合物。取出样品(1.5ml)，且转移至2ml eppendorf管。将混合物以10,000 rpm离心10分钟。然后将上清液转移至无致热原管。然后在1/50稀释度使用LAL通过动态显色法定量内毒素含量。

Claims (27)

1.用于测定用于药物中(具体而言用作疫苗中的佐剂)的铝盐制备物中的内毒素含量的方法，其包括以下步骤：
a. 混合所述铝盐与解吸缓冲液，由此从所述铝盐解吸任何内毒素；
b. 将所述铝盐与所述内毒素分离；和
c. 测量内毒素的量。
2.用于测定用于药物中(具体而言用作疫苗中的佐剂)的铝盐制备物中的内毒素含量的方法，其包括以下步骤：
a. 混合所述铝盐与解吸缓冲液，由此从所述铝盐解吸任何内毒素；
b. 离心混合物，由此将所述铝盐与所述内毒素分离；和
c. 测量上清液的内毒素含量。
3.用于测定用于药物中(具体而言用作疫苗中的佐剂)的铝盐制备物中的内毒素含量的方法，其包括以下步骤：
a. 混合所述铝盐与解吸缓冲液，由此从所述铝盐解吸任何内毒素；
b. 离心混合物，由此将所述铝盐与所述内毒素分离；
c. 将上清液转移至无致热原容器；和
d. 测量所述上清液的内毒素含量。
4.根据任一前述权利要求的方法，其中以1:9至9:1，例如2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:2或8:2(具体而言3:7、4:6、5:5、6:4、7:3之间，具体而言4:6、5:5和6:4)的比率混合所述铝盐制备物和解吸缓冲液。
5.根据任一前述权利要求的方法，其中在混合之后和分离(具体而言离心)之前孵育(具体而言无搅拌)所述混合物(具体而言持续大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，具体而言小于96或72小时，例如孵育期为1至96小时、5至72小时、10至48小时、15至36小时或20至28小时)。
6.根据权利要求5的方法，其中在室温(约22℃)进行所述孵育(具体而言用于测定磷酸铝的内毒素的方法中使用)。
7.根据权利要求5的方法，其中在大于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃进行所述孵育(具体而言用于测定氢氧化铝的内毒素的方法中使用)。
8.根据任一前述权利要求的方法，其中所述混合物在步骤a)之后搅拌多于30秒、40秒、50秒、1分钟、1分钟30秒或2分钟。
9.根据任一前述权利要求的方法，其中所述解吸缓冲液包含盐(具体而言Na2HPO4 [具体而言15至20%])和金属螯合剂(具体而言EDTA [具体而言0.2至0.3%])。
10.根据任一前述权利要求的方法(具体而言用于测定氢氧化铝的内毒素的方法中使用)，其中所述解吸缓冲液包含其他盐(具体而言NaCl)。
11.根据任一前述权利要求的方法，其中所述解吸缓冲液(具体而言用于测定磷酸铝的内毒素的方法中使用的解吸缓冲液)具有等于或大于pH5.5，例如约pH7至pH9的pH。
12.根据任一前述权利要求的方法，其中所述解吸缓冲液(具体而言用于测定氢氧化铝的内毒素的方法中使用的解吸缓冲液)具有等于或大于pH9.5，例如pH9.5至pH10.5的pH。
13.根据任一前述权利要求的方法，其中所述解吸缓冲液在约30℃至45℃、35℃至40℃、36℃至38℃或约37℃的温度。
14.根据任一前述权利要求的方法，其中所述解吸缓冲液在大于35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃的温度。
15.根据任一前述权利要求的方法，其中所述解吸缓冲液基本上无内毒素和/或是无菌的。
16.根据任一前述权利要求的方法，其中以100至1500 x g离心所述混合物。
17.方法，其中通过鲎变形细胞溶解物(LAL)测定(具体而言通过动态显色法)测量/定量内毒素含量。
18.根据任一前述权利要求的方法，其中所述铝盐是磷酸铝、氢氧化铝或其组合。
19.质量控制测定，其包括权利要求1至18中任一项的方法。
20.制备用于测定铝盐中的内毒素的方法的解吸缓冲液的方法，其包括以下步骤：
a. 混合碱(具体而言Na2HPO4)、金属螯合剂(具体而言EDTA)和水；任选地
b. 搅拌混合物(具体而言持续等于或大于30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分钟)；和任选地
c. 将所述混合物孵育等于或大于5、10、15、20、25或30分钟。
21.制备用于测定铝盐中的内毒素的方法的解吸缓冲液的方法，其包括以下步骤：
a. 混合盐、金属螯合剂和水；任选地
b. 在37℃+/- 1℃搅拌组合的混合物至孵育期(以溶解)；任选地
c. 添加酸或碱以固定pH；任选地
d. 添加水以达到制备物的最终体积；和任选地
e. 在37℃+/-1℃储存。
22.根据权利要求20的方法，其中步骤b)和/或c)重复1次、2次或更多次。
23.根据权利要求20至22中任一项的方法，其中所述水基本上无内毒素。
24.根据权利要求20至23中任一项的方法，其中将步骤a)的水预热至约30℃至45℃、35℃至40℃、36℃至38℃或约37℃(±1℃)。
25.根据权利要求20至24中任一项的方法，其中将pH调节至7至9，特别是约pH8或9.5至10.5。
26.根据权利要求25的方法，其中当所述缓冲液在约30℃至45℃、35℃至40℃、36℃至38℃或约37℃(±1℃)时，调节所述pH。
27.根据权利要求20至26中任一项的方法，其进一步包括d)在约30℃至45℃、35℃至40℃、36℃至38℃或约37℃(±1℃)储存所述解吸缓冲液的步骤。
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