CN1721853A - 细菌内毒素快速检测试剂盒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细菌内毒素检测技术领域， 特别是一种细菌内毒素快速检测试剂盒的制备方法。本发明克服现行细菌内毒素检测法需要花费较长的时间，不能满足生产实践的需求等缺点提供一种能缩短反应时间，建立快速测定细菌内毒素的方法，并根据这种方法制备一种新的细菌内毒素快速检测试剂盒。本发明根据试剂活性与反应时间成反比的关系，以及内毒素浓度与反应时间成反比的关系，来缩短细菌内毒素检测时间。根据此方法制备的细菌内毒素快速检测试剂盒能使凝胶法的细菌内毒素检查的反应时间由通常的60分钟缩短到20分钟甚至更短。

Description

细菌内毒素快速检测试剂盒的制备方法

技术领域

本发明涉及细菌内毒素检测技术领域，特别是一种细菌内毒素快速检测试剂盒的制备方法。

背景技术

细菌内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结构中的脂多糖成分，具有多种生物活性，是一种主要的热原物质。在医药工业上，“热原就是内毒素，控制内毒污染就控制了热原”已经成为共识。注射药品的重要检查项之一的热原检查已逐步为细菌内毒素检查所取代。

细菌内毒素检测所使用的试剂是鲎试剂(TAL或LAL)。TAL是一种生物试剂，含有能被极微量细菌内毒素激活的因子C、因子B、凝固酶原以及凝固蛋白原。在适宜条件下(温度、PH值以及无干扰物质等)，细菌内毒素能使TAL产生凝集反应，从而产生凝胶。

中国药典2000版的细菌内毒素检查法规定，取装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管，加入0.1ml供试品溶液或标准内毒素溶液，轻轻混匀后放入37±1℃恒温器中，保温60分钟土2分钟，将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者记为阳性(+)，凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者，记为阴性(-)。这就是常规凝胶法的细菌内毒素检查法。

在生产过程中，往往要对从某工序出来的半成品检测其细菌内毒素含量，并根据检测结果决定是否能够进行下一工序生产。因此，缩短检测时间，即快速的细菌内毒素检测方法显得十分重要，而常规凝胶法检测的恒温反应需要花费60分钟的时间，不能满足生产实践的需求。

发明内容

本发明的目的是为了克服现行细菌内毒素检测法需要花费较长的时间，不能满足生产实践的需求等缺点提供一种能缩短反应时间，建立快速测定细菌内毒素的方法，并根据这种方法制备一种新的细菌内毒素快速检测试剂盒。

本发明的试剂盒的制备方法按如下步骤：

(1)选定快速检测鲎试剂的灵敏度λ₀；

(2)按标示效价稀释标准内毒素至一系列浓度：2λ₀，λ₀，0.5λ₀，0.25λ₀；

(3)用灵敏度高于λ₀的常规鲎试剂与步骤(2)中稀释的标准内毒素系列按细菌内毒素检查法的方式及条件反应；

(4)根据反应结果确定当该常规鲎试剂按灵敏度为λ₀使用时的检测时间T₀；

(5)取快速检测鲎试剂、标准内毒素及细菌内毒素检查用水若干支，根据方便使用的数量搭配装入包装盒内，在包装盒上标明快速检测鲎试剂的标示灵敏度λ₀及反应时间T₀；每批快速检测鲎试剂可以同时标示多个灵敏度及相应的反应时间。

所述细菌内毒素检查法为凝胶实验法确定反应时间T₀：

(1)按常规凝胶法制备浓度为λ₀或λ₀₁，λ₀₂...的标准内毒素溶液；

(2)用灵敏度为λ，λ＜λ₀，λ₀₁，λ₀₂...的常规鲎试剂与步骤(1)制备的标准内毒素溶液按常规凝胶法进行反应，每一浓度标准内毒素的反应设多组平行，当反应进行到T₁，T₂，T₃...时，所述T₁，T₂，T₃...＜60分钟，分别取一平行组按常规凝胶法观察反应结果并记录，当反应最早出现阳性结果时，该时间值即为对应该标准内毒素浓度的反应时间T₀。

所述细菌内毒素检查法为动态实验法确定反应时间T₀

(1)选定用灵敏度为λ(λ＜λ₀，λ₀₁，λ₀₂...)的常规鲎试剂作快速检测鲎试剂；

(2)按常规凝胶法制备浓度为0.5λ，λ，λ₀(或λ₀₁，λ₀₂...)的标准内毒素溶液；

(3)用步骤(1)的鲎试剂与步骤(2)制备的标准内毒素溶液在动态反应仪上反应60分钟终止；设反应动态曲线在反应终止时的透光率(或OD值)变化值的最大值的1/2为凝胶线，则λ₀(或λ₀₁，λ₀₂...)浓度的动态曲线处于凝胶线以下(若OD值，则以上)的线段所对应的最短时间为T₀。

本发明能够提高检测效率，但对鲎试剂的抗干扰能力无影响。在图2中，曲线7及13分别为加入了0.5Eu/ml、0.25Eu/ml标准内毒素的供试品与λ₀为0.25Eu/ml，T₀为25钟的快速检测TAL反应25分钟的动态反应曲线；曲线16及21分别为加入了0.5Eu/ml、0.25Eu/ml标准内毒素的供试品与灵敏度为0.25Eu/ml的普通TAL反应60分钟的动态反应曲线。从这些动态反应曲线可看出，λ₀为0.25Eu/ml，T₀为25分钟的快速检测TAL反应25分钟的结果跟灵敏度为0.25Eu/ml的普通TAL反应60分钟的结果是完全一致的。采用本发明的新方法，可以把常规凝胶法检测需要60分钟反应时间缩短至20或25分钟，大大提高了检测的效率，能够满足生产过程细菌内毒素快速检测的需要。

本发明将检测所需鲎试剂，标准内毒素以及检测用水包装成盒，方便使用。

附图说明

图1是λ＝0.06Eu/ml鲎试剂与不同浓度的标准内毒素反应的动态反应曲线及凝胶结果图；

图2是不同浓度供试品阳性对照与相同灵敏度的常规鲎试剂和快速检测鲎试剂反应的动态曲线图；

图3是本发明快速检测试剂盒结构图。

具体实施方式

细菌内毒素快速检测试剂盒的原理如下：

鲎试剂与细菌内毒素的反应有三个重要参数：鲎试剂的活性，内毒素浓度以及反应时间。鲎试剂的活性通常以标示灵敏度(λ)表示，活性越高，λ值越小。常规凝胶法是把反应时间(T)固定为60分钟，在此条件下，鲎试剂的活性越高(λ值越小)，可检测的内毒素浓度就越低。

本发明是把内毒素浓度提高，在此条件下，鲎试剂活性越高，反应时间就越短。根据此原理，使用常规的高活性鲎试剂(λ≤0.06Eu/ml)，把它标示为低活性λ₀使用(λ₀＞λ)，即把检测内毒素浓度提高到λ₀，使反应时间T₀小于常规的反应时间T(60分钟)。要实现这一方法，关键是在选定λ₀之后，如何来确定相应的反应时间T₀。

确定T₀有两种方法：

方法一：凝胶实验法  选定λ₀，例如λ₀＝0.25Eu/ml；稀释标准内毒素至2λ₀，λ₀，0.5λ₀及0.25λ₀系列浓度；取常规的标示灵敏度为λ(λ≤0.06Eu/ml)的高活性鲎试剂与该标准内毒素系列稀释液反应。反应设多组平行。当反应进行到T₁，T₂，T₃...时(T₁，T₂，T₃...＜60分钟)，分别取一平行组观察反应结果。当出现下述反应结果时所对应的反应时间即为T₀。标准内毒素浓度(Eu/ml)：2λ₀    λ₀    0.5λ₀     0.25λ₀

凝胶状态：         ++++     ++++     ----        ----

方法二：动态实验法取一常规高活性鲎试剂(λ≤0.06Eu/ml)，与浓度为0.5，0.25，0.125，0.06，0.03Eu/ml的标准内毒素溶液在动态反应仪上反应，动态反应曲线及凝胶结果见图1。可以看到，反应到终止时间T(60分钟)时，透光率的最大变化值约为40％(100％-60％)。对于每一反应曲线，如果它的透光率变化值大于1/2最大变化值(即反应曲线终止在80％以下)，其凝胶状态为阳性(+)，如浓度为0.5，0.25，0.125及0.06Eu/ml的反应曲线；否则凝胶状态为阴性(-)，如浓度为0.03Eu/ml的反应曲线。根据这一规律，可以很方便地在图1中找出所选定的λ₀所对应的T₀值。如选定λ₀＝0.5Eu/ml，T₀为图1中的T_0.5；如选定λ₀＝0.25Eu/ml，T₀为图1中的T_0.25，等等。用凝胶实验法验证，也得到相同的实验结果(见表1)。

常规法：T＝60分钟，λ＝0.06Eu/ml  鲎试剂批号：0403222
		CSE浓度(Eu/ml)	0.125   0.06   0.03    0.015    阴性对照
反应结果	++++    ++++   ----    ----     --
		快速法：T0＝25分钟，λ0＝0.25Eu/ml  鲎试剂批号：0403222
CSE浓度(Eu/ml)	0.5     0.25   0.125   0.06     阴性对照
		反应结果	++++    ++++   ----    ----     --
快速法：T0＝20分钟，λ0＝0.5Eu/ml  鲎试剂批号：0403222
		CSE浓度(Eu/ml)	1.0     0.5    0.25    0.125    阴性对照
反应结果	++++    ++++   ----    ----     --

           表1λ＝0.06Eu/ml鲎试剂的凝胶实验法结果

实施例：

1、试验材料

标准内毒素(RSE或CSE)，鲎试剂(TAL)，细菌内毒素检查用水(W)，无热原检测器具一套，旋涡混合器一台，恒温装置一台；

2、细菌内毒素快速检测试剂盒的制备

(1)选定细菌内毒素快速检测试剂盒的标示灵敏度λ₀，如选择制备λ₀＝0.25Eu/ml的快速检测试剂盒。同一快速检测试剂盒可以有不止一个标示灵敏度，如λ₀₁＝0.25Eu/ml，λ₀₂＝0.5Eu/ml等等；

(2)确定快速检测鲎试剂的反应时间T₀

①取灵敏度为λ的鲎试剂若干，要求λ＜λ₀，最好是λ≤0.25λ₀，如λ₀＝0.25Eu/ml时，最好是λ≤0.06Eu/ml。

②取标准内毒素(RSE或CSE)一支(瓶)开启，用细菌内毒素检查用水将其制备成λ₀浓度。制备方法与常规凝胶法的要求相同。如果试剂盒有多个标示灵敏度的，则需要制备相应多个浓度标准内毒素溶液；

③取步骤①的鲎试剂与步骤②制备的标准内毒素溶液反应，除反应时间另有要求外，反应的方法及条件与常规凝胶法要求相同。反应设若干平行组。

④当步骤③的各平行组反应分别进行到T₁，T₂，T₃...时(T₁，T₂，T₃...＜60分钟)，如10，15，20，25......分钟，按时间顺序逐一将反应试管取出按常规凝胶法要求观察凝胶状态并记录结果阳性(+)或阴性(-)

⑤将反应结果为阳性且反应时间最短的时间确定为T₀。如表2中的试验数据，λ₀＝0.5Eu/ml，T₀＝25分钟；

表2

反应平行组别	1    2    3    4    5    6    7     ……
		反应时间(分钟)	10   15   20   25   30   35   40    ……
凝胶状态	---- ---- ---- ++++ ++++ ++++ +++   ……

⑥不同的标示灵敏度有对应不同的T₀值。如λ₀₁＝0.25Eu/ml，T₀₁＝25分钟；λ₀₂＝0.5Eu/ml，T₀₂＝20分钟……；

(3)装配细菌内毒素快速检测盒

细菌内毒素快速检测试剂盒的结构如图3。试剂盒4内放快速检测鲎试剂1若干支，标准内毒素2(CSE)若干支，细菌内毒素检查用水3若干支，使用说明书一张。盒面标明快速检测鲎试剂的批号，灵敏度(λ₀)，反应时间(T₀)以及有关注意事项。

3、细菌内毒素快速检测试剂盒的使用方法

(1)根据需要选择适宜灵敏度的快速检测试剂盒；

(2)按常规凝胶法的条件及要求使用试剂盒内的鲎试剂、标准内毒素及检查用水，对供试品进行细菌内毒素检测，唯一不同之处是恒温反应时间只需要T₀分钟(T₀＜60)。

Claims (3)

1、一种细菌内毒素快速检测试剂盒的制备方法，其步骤如下：

(1)选定快速检测鲎试剂的灵敏度λ；

(2)按标示效价稀释标准内毒素至一系列浓度：2λ₀，λ₀，0.5λ₀，0.25λ₀；

(3)用灵敏度高于λ₀的常规鲎试剂与步骤(2)中稀释的标准内毒素系列按细菌内毒素检查法的方式及条件反应；

(4)根据反应结果确定当该常规鲎试剂按灵敏度为λ₀使用时的检测时间T₀；

(5)取快速检测鲎试剂、标准内毒素及细菌内毒素检查用水若干支，根据方便使用的数量搭配装入包装盒内，在包装盒上标明快速检测鲎试剂的标示灵敏度λ₀及反应时间T₀；每批快速检测鲎试剂可以同时标示多个灵敏度及相应的反应时间。

2、据权利要求1所述的细菌内毒素快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述细菌内毒素检查法为凝胶实验法确定反应时间T₀：

(1)按常规凝胶法制备浓度为λ₀或λ₀₁，λ₀₂...的标准内毒素溶液；

(2)用灵敏度为λ，λ＜λ₀，λ₀₁，λ₀₂...的常规鲎试剂与步骤(1)制备的标准内毒素溶液按常规凝胶法进行反应，每一浓度标准内毒素的反应设多组平行，当反应进行到T₁，T₂，T₃...时，所述T₁，T₂，T₃...＜60分钟，分别取一平行组按常规凝胶法观察反应结果并记录，当反应最早出现阳性结果时，该时间值即为对应该标准内毒素浓度的反应时间T₀。

3.据权利要求1所述的细菌内毒素快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述细菌内毒素检查法为动态实验法确定反应时间T₀

(1)选定用灵敏度为λ，λ＜λ₀，λ₀₁，λ₀₂...的常规鲎试剂作快速检测鲎试剂；

(2)按常规凝胶法制备浓度为0.5λ，λ，λ₀或λ₀₁，λ₀₂...的标准内毒素溶液；

(3)用步骤(1)的鲎试剂与步骤(2)制备的标准内毒素溶液在动态反应仪上反应60分钟终止；设反应动态曲线在反应终止时的透光率或OD值变化值的最大值的1/2为凝胶线，则λ₀或λ₀₁，λ₀₂...浓度的动态曲线处于凝胶线以下，若为OD值则以上，的线段所对应的最短时间为T₀。

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